1 Transferencia de embriones y sus indicaciones en yeguas. Los

Transferencia de embriones y sus indicaciones en yeguas.
Los caballos siempre han estado unidos al hombre desde la antigüedad.
Primeramente fueron de ayuda a la hora de los trabajos, como animales
de carga o medio de transporte. Sin embargo, a día de hoy, en los
países desarrollados, está asociado a un uso lúdico.
El sector equino mueve muchos millones de euros al año, y por ello, se
están comenzando a utilizar técnicas de reproducción que ya llevan
muchos años utilizándose en el ganado bovino, como es el caso de la
transferencia de embriones.
Está técnica, fue descrita por primera vez en 1972, aunque no fue
comercializada hasta los años ochenta. No obstante, en España es una
técnica minoritaria, algo que no ocurre en el resto de países europeos o
estadounidenses.
Como su propio nombre indica, esta técnica se basa en obtener
embriones de una yegua donante e introducírselo a la yegua
receptora. Esta actividad tiene ventajas que lo justifican, como son:
Se pueden obtener potros de yeguas que están compitiendo, ya que
una yegua que está en temporada de competición no puede
permitirse una gestación, interrumpiendo su competición. Es una técnica
de alto valor económico, ya que nos permite tener una yegua
compitiendo (de alto valor económico) y, además tener una yegua
gestante (corriente) con un potro de la yegua en competición.
Obtenemos un mayor número de potros por año y yegua.
Podemos obtener descendencia de una yegua a partir de los dos años
de edad
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Las yeguas con problemas de fertilidad pero gran valor, pueden tener
descendencia con esta técnica. Al igual que las yeguas con problemas
de salud no reproductivos, pero que si tuvieran una gestación, no la
podrían llevar a término.
Por último, evitaremos los riesgos de gestación y parto en yeguas de alto
valor.
1. Elección de donantes y receptoras
La yegua es poliéstrica estacional. La actividad reproductiva es
primariamente regulada por el fotoperiodo, pero también por la
nutrición y el clima.
En la yegua donante, es necesario realizar un estudio reproductivo
donde se valorará el estado del útero y la fase reproductiva en la que
se encuentra, para saber si esa yegua puede ser usada en un programa
de transferencia embrionaria.
Si se identifican en el examen anormalidades que necesitan tratamiento
deben de ser tratadas antes de utilizar a la yegua para transferencia
embrionaria.
La yegua será correctamente vacunada y desparasitada. A
continuación en el recelo se monitorizara la conducta reproductiva.
Mediante palpación rectal y ultrasonido se monitorizara la actividad
folicular durante el ciclo estral. Durante el celo, la donante es
examinada diariamente para evaluar el crecimiento folicular que
permite saber el momento óptimo de la inseminación con semen fresco,
refrigerad o congelado. Se induce la ovulación (gonadotrofinas
coriónica humana o GnRH). El día de la ovulación es detectado y
designado como Día 0.
Una de las técnicas asociadas a la transferencia de embriones es la
superovulación. Esta técnica nos permite elevar la eficiencia
reproductiva y económica en los programas de transferencia
embrionaria, puesto que se multiplica el número de ovulaciones y por
tanto, habrá mayor número de óvulos de la yegua donadora.
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Produciendo un número mayor de descendientes. Además, este
proceso puede aumentar la tasa de fertilidad en los reproductores
subfertiles y de yeguas subfértiles proporciona un número mayor de
ovulaciones y, consecuentemente, una mayor expectativa para la
fertilización.
Los fármacos que se utilizan rutinariamente en otras especies, no son
efectivas en la especie equina. Solo el extracto de hipófisis equina EHE y
la aplicación de FSH de origen porcino son los únicos que lo pueden
hacer. No obstantes, los últimos estudios nos muestran que la aunque
aplicación de EHE induce a la múltiple ovulación, la administración del
FSH de origen porcino aumenta la velocidad de crecimiento folicular,
pero no estimula la superovulación como ocurre en la especie bovina.
El factor más importante que afecta el éxito del programa es la
selección y el manejo de la yegua receptora. Estás tienen que tener
ciclos estrales normales, que hayan tenido dos o más celos normales y
estar libres de anormalidades uterinas y ováricas y con un peso de 450 a
550 kg, al igual que las yeguas donantes. La edad óptima de las yeguas
varía según la información, no obstante, la media es entre 3 y 10 años.
Dependiendo del protocolo que se use, hay diferentes formas de la
sincronización del celo, que más adelante se explica.
Al igual que las yeguas donantes, al detectar que están en celo, se las
examina diariamente por palpación rectal y ultrasonidos para
monitorizar el crecimiento folicular y detectar la ovulación.
Es preferible que al menos dos receptoras estén disponibles para cada
yegua donante. Las yeguas receptoras deben ser alimentadas para
mantener buen peso condición corporal. Se utilizan yeguas que han
ovulado un día antes o de 0 a 3 días después de la yegua donante.
También hay que tener en cuenta el tamaño de la yegua receptora, ya
que como los experimentos de “Walton y Hammond” donde nos
muestran que son indicativos en que el tamaño y la salud del útero
determina el tamaño del potro a término.
Con el objetivo de eliminar la necesidad de sincronizar yeguas donantes
y receptoras, se han utilizado yeguas ovariectomizadas tratadas con
progestágenos como receptoras sin embargo, el éxito obtenido varía y
el método no ha sido ampliamente adoptado
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2. Sincronización de celos.
Para realizar una sincronización de celos entre las yeguas de una
explotación podemos actuar de forma distintas en diferentes puntos de
su ciclo reproductivo.
Utilizaremos un método u otro dependiendo de que en fase se
encuentren las yeguas que vamos a tratar. Para ello debemos llevar un
control continuo de las yeguas y conocer que hormona está actuando
en cada momento del ciclo reproductivo.
Es necesario conocer el eje hipotálamo-hipofisis-ovario.
Prostaglandinas:
encargadas de
romper el cuerpo
lúteo.
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Métodos de inducción de celo:
La hormona más utilizada en el manejo del ciclo estral es la
gonadotropina coriónica humana o HCG. Con esta hormona lo que
pretendemos es acortar la fase lutea e inducir una regresión prematura
del cuerpo luteo. La hCG es principalmente luteinizante y luteotropica y
tiene poca actividad FSH. Se encuentra tanto en sangre como en orina
de los primates.
Una dosis única de esta hormona es suficiente para inducir la ovulación.
Debe de ser empleada en el estro y su uso puede ser como única
hormona
o
combinada
con
progestágenos,
estrógenos
y
prostaglandinas. Esto es especialmente importante cuando se sincroniza
para inseminación, usando semen congelado o enfriado, debido al alto
grado de predictibilidad de ovulación después del tratamiento.
Los resultados de este tratamiento indican que la ovulación ocurre
dentro de las 48 horas siguientes en la mayoría de las yeguas. Los
tiempos para la inyección de la hCG son entre 4 y 6 dias despues de la
aplicación de prostaglandinas, de este modo, mitigamos el problema
de variabilidad en la sincronización entre la ovulación y el estro.
Uno de los problemas asociados a la utilización de la hCG es la falta de
respuesta atribuida a la producción de anticuerpos, cuando son
tratados con esta hormona más de una vez en una misma época
reproductiva. Esta producción de anticuerpos puede ser la causa de
que las yeguas se vuelvan refractarias al efecto de la hCG.
Es necesario realizar un seguimiento ecográfico de estas yeguas, puesto
que no podemos realizar la inducción a la ovulación si el folículo
presente es menor de 35 mm.
Podemos actuar utilizando prostaglandinas en el caso de que exista en
la yegua un cuerpo lúteo. El cuerpo lúteo actúa en la yegua como
productor de progesterona, y estos niveles mantenido en sangre de
progesterona impiden la liberación de las gonadotropinas y por lo tanto
impiden la foliculogenesis y la aparición de un nuevo ciclo y una nueva
ovulación.
Lo que pretendemos con el uso de las prostaglandinas es romper ese
cuerpo lúteo y que se produzca una caída en la producción de
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progesterona que estimulara la liberación de gonadotropinas y por lo
tanto se empezara un nuevo ciclo.
Las prostaglandinas naturales (5 mg. de Dinaprost) o las sintéticas (250 a
500 microg. de cloprostenol, 0,150 mg. de Tiaprost) son altamente
efectivas para inducir a la actividad sexual a las yeguas acíclicas como
consecuencia de la persistencia de un cuerpo lúteo.
Otro método utilizado es la inoculación de progestágenos, se utiliza con
el fin de alargar la fase lútea o producir una artificia, los progestágenos
actúan inhibiendo la liberación de gonadotropinas por un mecanismo
de feedback negativo y en el momento que retiramos la progesterona
exógena se produce una caída de los niveles de progesterona a nivel
sanguíneo que estimula la liberación de Gnrh y por lo tanto de
gonadotropinas que provocaran el inicio de un nuevo ciclo.
Podemos usar progesterona (P4) natural de cerdo inyectable (muy
irritante) o los progestágenos orales (27,5 mg. de Allyltrembolona)
diariamente durante unos 10 días. También se utilizan implantes de
progestágenos que duran 15 días.
Este tratamiento se puede combinar con el uso de prostaglandinas al
final de tratamiento con progestágenos en el caso de que exista un
cuerpo lúteo para asegurarnos de la regresión de este.
Otro método que se puede utilizar es la variación de las horas de luz con
luz artificial.
Con esto pretendemos acortar el tiempo de la yegua en anestro para
que ovule lo antes posible.
La luz actúa sobre las yeguas como un estimulo para la reproducción así
como la temperatura, el clima y la nutrición. Por eso lo anestros serán
más cortos en temporadas con mas horas de luz donde la temperatura
sea más alta y si la hembra esta correctamente alimentada y todas
estas medidas de manejo nos sirven tanto para adelantar el celo como
para alargar la temporada reproductiva de la yegua.
Por lo tanto las medidas de manejo las combinamos siempre con el
resto de métodos de inducción de celo.
Otro método para sincronizar los celos puede ser la utilización de factor
liberador de gonadotropinas o Gnrh.
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El factor liberador de gonadotropinas (0,004 mg. de Buserelina) ha sido
utilizado para estimular el ciclo estral, aunque los resultados son muy
pobres si se los compara con los obtenidos por medio de la iluminación
artificial. Por ello se utilizan en forma complementaria.
Lo que sucede es que dosis elevadas no son fisiológicas y pueden
ocasionar una supresión de la liberación de las gonadotropinas
endógenas. Suelen ser más efectivas dosis menores a intervalos de 24
horas durante un periodo de 30 días.
Ponemos de conclusión por lo tanto que disponemos de varios métodos
para poder realizar una buena sincronización entre las yeguas, y que
debemos conocer primero el estado en que se encuentran las yeguas a
las que vamos a sincronizar porque no todos los métodos pueden ser
utilizados en todos los momentos del ciclo.
Importante recordar también que debemos combinar nuestros métodos
de inducción de celo con unas correctas pautas de manejo de la
yeguas.
3. Técnica: inseminación, recuperación de embriones y envasado
para su transporte.
Nos vamos a centra en la inseminación artificial y no en la monta natural
puesto que generalmente cuando hacemos trasplante de embriones lo
usamos entre un yegua y un semental de gran valía y generalmente no
solemos tenemos a ambos animales en la explotación para realizar una
monta natural y aunque así fuese hay veces que se prefiere hacer IA
para prevenir que el semental sufra patadas o algún altercado con la
yegua.
• Inseminación artificial: La IA es una técnica reproductiva que
consiste en depositar esperma en el aparato reproductor de la
hembra sin la intervención del macho.
Ayuda a mejorar la fertilidad, reduce el riesgo de trasmisión de
enfermedades, facilita los programas de selección y mejora
genética y nos permite poder disponer de esperma de buena
calidad en zonas alejadas de donde se localizan los donantes,
con lo cual se reduce el riesgo de accidente en el transporte de
animales.
La inseminación artificial tiene diversas modalidades según que el
esperma que utilicemos sea refrigerado o congelado.
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En la realización de una inseminación artificial hay unos pasos que
se deben seguir:
1. Determinación del momento de la inseminación: es
necesario determinar en qué momento se encuentra la
hembra y cuando se va a producir la ovulación. Si vamos a
realizar la IA con semen refrigerado debemos coordinar el
momento de la pedida de las pajuelas con el momento de
la ovulación, en caso de usar semen congelado esto no es
necesario puesto que lo descongelamos en el momento de
ser usado.
La exploración rectal mediante ecografía de sus ovarios y
útero, repetida durante el tiempo del celo, es necesaria
para determinar el momento más indicado de la IA,
valorando el aspecto del folículo preovulatorio, midiendo su
tamaño y forma, grosor de sus paredes y ecogenicidad del
sedimento del líquido folicular.
Podemos predecir la ovulación con un seguimiento
ecográfico por la morfología del folículo.
2. Técnica: tradicionalmente se realiza la inseminación con
catéteres largos a través de la vagina y cuello del útero y se
deposita la dosis seminal en el útero. Pero actualmente
existe una nueva corriente de inseminación que consiste en
realizar una IA intrauterina profunda.
Las ventajas de esta última es que requieren
concentraciones muchos menores de espermatozoides por
pajuela y que tiene un porcentaje de éxito reproductivo
mayor a la forma tradicional.
Esta técnica de inseminación intrauterina profunda se utiliza
más cuando el semen que vamos a utilizar es semen
congelado, puesto que este semen ya por el hecho de
estar congelado ha reducido su capacidad fecundante.
Esta técnica se puede realizar con endoscopio regando
con el semen la papila tubarica o con catéteres largos
depositan las dosis de forma intrauterina. La utilización de
los endoscopios encarece el proceso.
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Tras la inseminación se realiza un seguimiento ecográfico para confirmar la fecundación del ovocito.
• Recuperación de embriones: Los embriones equinos son
selectivamente transportados a través del oviducto hacia el útero
entre los día 5 a 6 postovulación, estando en estadios de
desarrollo de mórula compacta a blastocito temprano después
de entrar al lumen uterino, el tamaño del embrión crece
exageradamente hasta blastocito expandido .Aunque los
embriones pueden ser recuperados entre los días 6 y 9 después de
la ovulación, los días óptimos son el séptimo o el octavo. La
principal indicación para recuperar embriones en el día 6 es para
realizar el congelamiento de dichos embriones. Los embriones no
son recuperados en el día 9 porque el porcentaje de
transferencia exitosa es generalmente más bajo que para los
embriones recuperados en los días 7 u 8.
 Lavado uterino: se realiza un lavado uterino transcervical, se
coloca la yegua en el potro de contención y se hace un lavado
del periné con un detergente suave, se enjuaga con agua limpia
y se seca.
Un operario se coloca un guante estéril en un brazo, lo lubrica de
forma estéril e introduce un catéter también estéril que cuenta
con un balón. Se introduce el catéter a través del cérvix hasta
llegar al cuerpo del útero, se infla el balón y se tracciona
caudalmente para que quede comprimido en el agujero del
cérvix y así evitar la pérdida de liquido.
Una vez colocado el catéter, el útero es lavado tres a cuatro
veces con solución salina amortiguada con fosfatos puro o
modificado (DPBS) previamente entibiado (30 - 35º C)
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conteniendo 1% de suero fetal bovino, penicilina (100
unidades/ml) y estreptomicina (100 µg/ml). El útero es llenado con
1 a 2 litros de DPBS en cada lavado (4 a 8 litros son usados durante
todo el proceso de recolección). Después de llenado el útero se
le permite al líquido salir y pasar a través de un filtro para
embriones de 0.75µ. Es importante que el filtro de embriones no
rebase o quede sin líquido, los filtros son ahora diseñados para
prevenir ambos problemas. El líquido que pasa por el filtro es
recolectado para evaluar cuanto se recuperó. Después del primer
lavado el útero es masajeado a través del recto durante los
subsiguientes lavados, y esto puede ayudar a que el embrión
quede suspendido en el medio y además aumentar la
recuperación total del líquido. La mayoría (> 90%) del líquido de
lavado debería ser recuperado y estar libre de restos celulares o
de sangre. La recuperación de líquido de lavado opaco indica
que la yegua tiene un proceso de endometritis activa en el
momento del lavado, y necesitará una evaluación diagnóstica
futura. La presencia de sangre es asociada con un masajeo
vigoroso del útero y o la manipulación del catéter.
 Recuperación de embriones: El líquido recuperado es revisado
utilizando un microscópio estereoscópico a un aumento de 15x.
Los embriones de 8 días usualmente se ven a simple vista. Cuando
un embrión es identificado, es lavado como mínimo por 3 pasajes
sucesivos en gotas de un mililitro de medio DPBS con 10% de suero
fetal bovino, después del lavado el embrión se coloca en el
mismo medio en una placa de Petri de 35 x 10 mm.
El embrión es evaluado a mayor aumento (40 - 80x) y calificado
usando la escala de 1 (excelente) a 4 (pobre). Los embriones
pueden ser tomados utilizando pajuelas de 0,25 o 0,5 cc, pipetas
capilares de vidrio de 25 µl, o cualquier otro instrumento adosado
a una jeringa.
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El proceso de levantar y depositar un embrión debería ser
realizado bajo lupa estereoscópica.
Una vez que los embriones son colocados en el medio de
mantenimiento, estos deben ser rápidamente envasados para el
transporte o transferidos a una hembra receptora.
 Envasado de embriones: Los embriones equinos son refrigerados y
transportados utilizando el método desarrollado por Carnevale et
al.
Este método consiste en la utilización del medio F-10 de Ham para
su conservación y refrigeración.
Debido a que el medio F-10 de Ham debe ser gaseado antes de
ser usado y esto requiere de un tanque de la mezcla de gases
con su válvula reguladora, muchos veterinarios solicitan que el
centro de transferencia embrionaria les envíe el medio F-10 de
Ham ya gaseado antes de la recuperación del embrión.
4. Transferencia embrionaria
Al principio, la transferencia de embriones se realizaba de forma
quirúrgica, realizando una laparotomía del flanco .En las últimas
décadas, los resultados que se han obtenido con la transferencia no
quirúrgica han superado las tasas de éxito con el método no quirúrgico.
El enfoque de esta técnica se resume como el uso de una técnica
aséptica, con un daño mínimo al cérvix al depositar el embrión en útero
del receptor adecuado.
Como ya se ha explicado antes, las yeguas receptoras deben de estar
en sincronizadas con la yegua donante. Por ello, se utilizan yeguas de 4
a 8 días post ovulación, siendo los que mejores resultados que
proporcionan. Antes de la transferencia, la yegua debe de ser
examinada mediante ecografía transrectal y palpación. Tiene que tener
un buen tono uterino y el cuello del útero bien cerrado. Esto es
indicativo de un nivel de progesterona aceptable en la circulación
sanguínea. En la ecografía tiene que encontrarse desarrollo folicular,
una mucosa del útero uniforme, sin edema o fluido.
En el caso en que haya que sedar a la yegua, se esperará hasta que se
vaya a transferir el embrión. La cola tiene que estar atada o sujeta a un
lado. Se tiene que realizar una limpieza del periné, la vulva y el vestíbulo.
Debemos de añadir, que los aparatos no son tan importantes como la
técnica. Sin embargo, los que se utilizan son:
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Pajuelas
Existen dos medidas diferentes, de 0,25ml y de 0,5mL. El embrión debe
ocupar no más del 60% al 70% del diámetro interno de la pajuela,
preferiblemente menos.
Pistola de inseminación
Catéter de transferencia de embriones
Si el embrión es demasiado grande para una pajilla de 0,5mL, se realiza
una inseminación estándar con este catéter.
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Tanto la pistola como el catéter deben de estar protegidos por un
manguito de plástico estéril, para proteger la esterilidad del aparato de
transferencia de embriones.
Técnica:
Una vez que la yegua está preparada, se introduce la pistola o la pipeta
de transferencia de embriones se guía al cuello uterino. El orificio
externo puede ser rodeado por el pulgar, prácticamente, con los dedos
se puede proporcionar sujetar la pistola o la pipeta. Primero se introduce
el arma a través del guante y luego a través del cuello uterino.
El veterinario, mediante palpación rectal, sujeta el cuello del útero. La
punta de la pistola o pipeta se guía a través del cuerpo uterino. Una vez
dentro de la luz, en la base del cuerno uterino (cerca de la bifurcación),
un asistente, puede empujar el émbolo del aparato y expulsar el
embrión en el útero.
Entonces, la pistola o la pipeta se retiran. Este proceso debe de durar
entre 1 o 2 minutos y debe ser lo menos traumática posible para el
cérvix y el útero.
Hay que tener cuidado y ser lo más asépticos que podamos, ya que
cualquier paso de bacterias a la vagina o al útero puede dar lugar a
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una endometritis. No obstante, las yeguas que han recibido un embrión
no quirúrgicamente, se les administra antibiótico y Regumate
(progestágeno sintético) durante 5 días después de la transferencia. Las
receptoras serán examinadas con ecografía cinco días después de la
transferencia (9-12 días de la gestación) y luego a los 15, 25, 35, 45 y a
los 60 días de gestación.
La mayor tasa de muerte embrionaria se produce entre los días 15-60 de
gestación. Parece ser mayor en la transferencia de embriones en
yeguas inseminadas con semen fresco.
En los últimos años, se han logrado notables avances en la tecnología
de la transferencia de embriones y las técnicas asociadas
(superovulacion), micro manipulación y conservación de los embriones,
las cuales están rebasando la fase experimental, para convertirse en
herramientas útiles en las explotaciones equinas modernas.
5. Bibliografía
Libro:
-
P. Brinsko, S, L. Blanchard, T, D. Varner, D, Schumacher J, C, Love C,
Hinricks K, Hartman D. Manual of equine reproduction: Embryo
Transfer. Chapter 17. Maryland Heights, Missouri: Elsevier; 2011.
Monografías:
-
Katila T, Wade J.F. Equine embryo Transfer. Monograph Series No. 3.
Hvemeyer Foundation; 2000
Alvarenga M, Wade J.F. Equine embryo Transfer. Monograph Series
No. 14. Havemeyer Foundation; 2004
Artículos:
-
-
Vanderwall D. Tecnicas actuales de transferencia embrionaria
equina. Recent advances in equine reproduction. 2000; B. A. Ball
(Ed.)
Rodriguez I, Sanz J, Perez C, Felipe M; Fertilidad in vivo del esperma
equino congelado descongelado. I Jornadas de Investigacion
Veterinaria. Cordoba, España. Pp: 317-321
Tesis:
-
Alonso Castro Jimenez A. Tasa de ovulación y gestación en
yeguas sincronizadas con prostaglandinas y gonadotropina
coriónica humana. Julio de 2010
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Internet:
-
-
Rodriguez Artiles I, Profesora titular de la universidad,
departamento de medicina y cirugía animal, hospital clínico de la
universidad de córdoba. Inseminacion artificial o monta dirigida
en la yegua. www.argos.portaldeveterianaria.com
Broto Turmo M. Sincronización del celo. Aula Magna Equisan.
www.equisan.com
Autores: Inés Conejo Barruso/María García Gálvez
EQUISAN Veterinaria Equina Integral
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