INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO DE HMG

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO DE HMG-CoA REDUCTASA
EN LA RESPUESTA HIPOCOLESTEROLEMICA DIFERENCIAL A
ESTATINAS EN PACIENTES CON CARDIOPATÍA CORONARIA
Tesis entregada a la Universidad de Chile
para optar al grado de
DOCTOR EN FARMACOLOGIA
Por
VIVIANA CAROLINA NORIEGA SEPULVEDA
Directores de Tesis
Prof. Dr. Juan Carlos Prieto D.
Prof. Dr. Sergio Lavandero G.
Santiago Chile
2008
FINANCIAMIENTO
Esta tesis se realizó a través de una alianza estratégica entre el Programa de
Farmacología Molecular & Clínica, ICBM de la Facultad de Medicina y la Unidad de
Farmacogenómica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la
Universidad de Chile.
El desarrollo de esta tesis se financió por los siguientes proyectos:
ƒ
Beca
Sociedad
Medica
de
Chile
“Diferencias
en
la
repuesta
hipocolesterolémica por estatinas dependiente del polimorfismo de HMG-CoA
reductasa en pacientes chilenos con Cardiopatía Coronaria” otorgada a Viviana
Noriega y patrocinada por el Dr. Juan Carlos Prieto y financiada por
Laboratorios Saval S.A
ƒ
FONDAP 15010006 al Dr. Sergio Lavandero
Publicaciones
Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Diferencias
genéticas en la disminución del colesterol por estatinas en pacientes chilenos
con cardiopatía coronaria. Rev. Chil Cardiol 2007; 26: 135-143
Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Influence of
the HMG-Coa Reductase (TTA)n repeat gene polymorphism on the effects of
atorvastatin in coronary artery disease patients (enviada a publicación).
II
Presentaciones a congresos
Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Ausencia de
asociación entre el polimorfismo (TTA)n en el gen de la enzima HMG-CoA
reductasa y la reducción de los lípidos plasmáticos con atorvastatina en
pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. XLIV Congreso Chileno de
Cardiología y Cirugía Cardiovascular de Chile, Viña del Mar, 2007, Chile.
Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Ausencia de
asociación entre el polimorfismo (TTA)n en el gen de la enzima HMG-CoA
reductasa y la reducción de los lípidos plasmáticos con atorvastatina en
pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. XXIX Congreso Sociedad de
Farmacología de Chile; Iquique, 2007, Chile.
Noriega V, Pennanen C, Jimenez G, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC.
Diferencias genéticas en la disminución del colesterol por estatinas en
pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. XLIII Congreso Chileno de
Cardiología y Cirugía Cardiovascular de Chile, Viña del Mar, 2006, Chile.
Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Diferencias
genéticas en la respuesta hipocolesterolémica por estatinas en pacientes
chilenos
con
cardiopatía
coronaria.
XXVIII
Congreso
Sociedad
de
Farmacología de Chile; Olmue, 2006, Chile.
III
INDICE
TEMA
PÁGINA
INDICE DE FIGURAS ................................................................................................ VII
INDICE DE TABLAS .................................................................................................. VIII
INDICE DE ANEXOS ................................................................................................... IX
ABREVIATURAS .......................................................................................................... X
RESUMEN .................................................................................................................. XII
ABSTRACT ................................................................................................................ XIV
1.
INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1
1.1
Cardiopatia coronaria ...................................................................................... 1
1.2.
Aterosclerosis .................................................................................................. 1
1.2.1.
Colesterol en la aterosclerosis......................................................................... 4
1.2.2.
Inflamación en la aterosclerosis ...................................................................... 5
1.2.3.
Proteína C reactiva .......................................................................................... 5
1.3.
Tratamiento farmacológico de la cardiopatia coronaria ................................... 7
1.3.1.
Estatinas .......................................................................................................... 7
1.3.2.
Mecanismos moleculares de acción de las estatinas ..................................... 7
1.3.2.1
Estatinas e isoprenilación de proteinas .......................................................... 8
1.3.2.2
Estatinas y factores nucleares ......................................................................... 9
1.3.3.
Eficacia de la terapia farmacológica con estatinas en prevención
secundaria de la cardiopatia coronaria .......................................................... 10
1.3.4.
Estatinas en la reducción del cLDL, inflamación y estrés oxidativo .............. 11
1.4.
Farmacogenómica del tratamiento con estatinas .......................................... 13
1.4.1.
Polimorfismo en el gen de la HMG-CoA reductasa (HMGCR) ...................... 14
2.
HIPÓTESIS.................................................................................................... 17
3.
OBJETIVOS .................................................................................................. 17
3.1.
Objetivo general............................................................................................. 17
3.2.
Objetivos específicos ..................................................................................... 17
4.
METODOLOGÍA............................................................................................ 18
4.1.
Diseño del Estudio ......................................................................................... 18
4.2.
Presentación y aprobación por Comité de Etica ............................................ 18
IV
4.3.
Incorporación de los pacientes con cardiopatía coronaria al estudio ............ 19
4.4.
Determinación del tamaño de muestra ......................................................... 19
4.5.
Pacientes ....................................................................................................... 19
4.6.
Enrolamiento de pacientes ............................................................................ 20
4.7.
Recolección de muestras ............................................................................. 20
4.8.
Exámenes de laboratorio ............................................................................... 21
4.9.
Aislamiento y cuantificación del DNA genómico ............................................ 22
4.10.
Estandarización de la concentración de Magnesio en la reacción de PCR
para la amplificación del gen de la HMGCR ................................................. 23
4.11.
Genotipificación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n en el gen
de la HMG-CoA reductasa Análisis de resultados ......................................... 23
4.12.
Secuenciación ............................................................................................... 24
4.13.
Análisis de resultados y estadística ............................................................... 24
4.14.
Materiales y equipos ...................................................................................... 25
5.
RESULTADOS .............................................................................................. 26
5.1.
Genotipificación del polimorfismo de tipo tandem (TTA)n en el gen
de la HMGCoA reductasa .............................................................................. 26
5.2.
Pacientes del estudio..................................................................................... 26
5.2.1
Características basales de los pacientes enrrolados .................................... 27
5.2.2
Frecuencia alélica de los pacientes participantes del estudio ....................... 29
5.2.3
Condiciones de los pacientes después de un año de finalizado el estudio ... 29
5.3.
Lípidos plasmáticos ....................................................................................... 30
5.3.1
Niveles de lípidos plasmáticos basales y después de 8 semanas
de tratamiento con atorvastatina, para diferentes polimorfismos
(TTA)n en pacientes con cardiopatía coronaria ............................................. 30
5.3.2
Frecuencia y porcentaje de cambio desde el basal de lipidos
plasmaticos, después de 8 semanas de tratamiento, para diferentes
polimorfismos (TTA)n en pacientes con cardiopatía coronaria .................... 31
5.4.
Proteina C reactiva ultrasensible y F-2 isoprostanos .................................... 33
5.4.1
Reduccion y porcentaje de cambio, de los niveles de proteina C
reactiva ultrasensible desde el basal del colesterol total en mujeres
después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina, para diferentes
polimorfismos (TTA)n en pacientes con cardiopatía coronaria .................... 33
5.4.2
Distribución de PCRu .................................................................................... 34
5.5.
Índice de masa corporal y peso de los pacientes del estudio ....................... 35
V
5.6.
Tolerabilidad y evaluación de la seguridad en la utilización de
atorvastatina, como medicamento del estudio ............................................. 35
6.
DISCUSIÓN ................................................................................................... 37
7.
CONCLUSIONES .......................................................................................... 41
8.
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 42
9.
ANEXOS........................................................................................................ 57
VI
INDICE DE FIGURAS
FIGURA
PÁGINA
Figura 1:
Desarrollo de una placa aterosclerótica.................................................. 3
Figura 2:
Estructura química de atorvastatina.................................... ................ ...7
Figura 3:
Efectos celulares de las estatinas.................................................... .....10
Figura 4:
Polimorfismo del tipo tandem (TTA)n, en el gen de la
HMG-CoA reductasa. ....................................................................... ....14
Figura 5:
Diseño del estudio clínico......................... ........................................ ....18
Figura 6:
Estandarización de concentración de Mg2+ en la amplificación
por PCR del gen de la HMGCR................................................. .... ……23
Figura 7:
Organización estructural del gen HMGCR............. ............................ ...24
Figura 8:
Secuenciación de un templado amplicado de DNA que contiene
repetición TTA...................................................................................... .24
Figura 9:
Electroforesis en gel de poliacrilamida que muestra la
separación de los productos de PCR del polimorfismo (TTA)n
del gen HMGCR de distintos pacientes....... ................................... ......26
Figura 10:
Diagrama de flujo……………… ......................................................... ...27
Figura 11:
Niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total según polimorfismo
(TTA)n en el gen de la HMGCG……………… ...................................... 31
Figura 12:
Porcentaje de cambio de niveles plasmáticos de cLDL y colesterol
total de acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de la
HMGCG.................................................... ......................................... ...33
Figura 13:
Valores de índice de masa corporal y peso de acuerdo al
polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCG ……...................... ... .....35
Figura 14:
Valores de GOT, GPT y CK…... ………………………….............. ... .....36
Figura 15:
Valores de GOT y GPT de acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de
la HMGCR. …... ………………………….............. ............................ .....36
VII
INDICE
DE
TABLAS
TABLA
Tabla 1:
PÁGINA
Exámenes de laboratorio realizados por protocolo a todos
los pacientes del estudio ........................................................................... 22
Tabla 2: Características basales de los pacientes en estudio .................................. 28
Tabla 3: Frecuencia alélica de los pacientes ............................................................ 28
Tabla 4: Condiciones de los pacientes después de un año de finalizado el estudio 29
Tabla 5: Valores basales de lípidos plasmáticos y después de 8
semanas de tratamiento ............................................................................. 30
Tabla 6: Reducción y porcentaje de cambio desde el basal de los
lípidos plasmáticos ..................................................................................... 32
Tabla 7: Reducción y porcentaje de cambio de los niveles de
proteína C reactiva ultrasensible y F2-isoprostanos .................................. 34
Tabla 9: Distribución de PCRu.................................................................................. 34
VIII
INDICE
INDICE DE ANEXOS
DE
ANEXOS
PÁGINA
Anexo 1:
Extracción de DNA a partir de sangre periférica ................................... 58
Anexo 2:
Consentimento Informado..................................................................... 60
Anexo 3:
CRF. Recolección de datos .................................................................. 62
IX
ABREVIATURAS
A to Z
: Aggrastat to Zocor trial
AFCAPS/Tex CAPS
: Air Forces/Texas Coronary Atherosclerosis Prevention Study
Apo-E
: Apolipoproteína–E
CAD
: Enfermedad de las arterias coronarias
CARE
: Colesterol And Recurent Event
CC
: Cardiopatía coronaria
CCR2
: Receptor de proteína-1 quimioatractante de monocitos
cHDL
: Colesterol de lipoproteína de alta densidad
cLDL
: Colesterol de lipoproteína de baja densidad
CML
: Células musculares lisas
CMLVs
: Células musculares lisas vasculares
CRP
: Proteína C-reactiva
CV
: Cardiovascular
eNOS
: NO sintasa endotelial
EIA
: Enzimoimmunoensayo
FPP
: Farnesil-pirofosfato
GGPP
: Genarilgenaril pirofosfato
hsCRP
: Proteína C reactiva ultrasensible
HMG-CoA reductasa
: 3-hidroxi 3-metilglutaril-coenzima A reductasa
HMGCR
: Gen de la HMG-CoA reductasa
HPS
: Heart Protection Study
IAM
: Infarto agudo del miocardio
IECA
: Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina-I
ICAM-1
: Molécula-1 de adhesión intercelular
IDEAL
: Incremental Decrease in End points through Aggressive Lipid
Lowering
IL-1
: Interleuquina 1
IL-8
: Interleuquina 8
JÚPITER
: Justification for the USE of Statins in Primary Prevention: an
Intervention Trial Evaluating Rosuvastatin
LDLox
: LDL oxidadas
LIPID
: Long term Intervention with Pravastatin in Isquemic Disease
MCP-1
: Proteína-1 quimioatractante de monocitos
MIRACL
: Myocardial Ischemia Reduction with Agressive Colesterol
Lowering
MMPs
: Metaloproteasas
X
NF-κB
: Factor transcripcional nuclear kappa B
NO
: Oxido nítrico
PCR
: Proteina C reactiva
PCR
: Reacción de la polimerasa en cadena
PCRu
: Proteína C reactiva ultrasensible
PPARα
: Peroxisome proliferators-activated receptor-α
PPARγ
: Peroxisome proliferator-activated receptor-γ
PROSPER
: PROspective Study of Pravastatin in the Elderly at Risk
PROVE-IT-TIMI 22
: Pravastatin or Atorvastatin Evaluation and Infecction TherapyThrombolysis in Myocardial Infarction 22
RAM
: Reacciones adversas a medicamentos
REVERSAL
: Reversal of Atherosclerosis with Aggressive Lipid Lowering
RNS
: Radicales libres derivados nitrógeno
ROS
: Radicales libres derivados del oxígeno
SNP
: Single nucleotide polymorphisms
TIMPs
: Inhibidores endógenos de las MMPs
TNF-α
: Factor de necrosis tumoral α
TNT
: Treating to New Targets
(TTA)n
: Polimorfismo de repetición (TTA)n
VCAM-1
: Molécula-1 de adhesión vascular
VNTR
: Número variable de repeticiones en tandem
4S
: Scandinavian Simvastatin Survival Study
XI
RESUMEN
La cardiopatía coronaria (CC), es la principal causa de muerte en Chile y en
países desarrollados. La etiología más frecuente es la ateroesclerosis, reconociéndose
ésta como una enfermedad dinámica y progresiva en la que se combina la disfunción
endotelial, inflamación y la acumulación de lípidos y elementos fibrosos en las arterias
en forma de placas. Los inhibidores de la 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A
reductasa (HMG-CoA), estatinas son uno de los medicamentos más efectivos en el
tratamiento de la hipercolesterolemia. Estos han sido ampliamente utilizados en la
clínica, para reducción el colesterol total y LDL (cLDL). Además el tratamiento con
estatinas también ha mostrado reducir los niveles plasmáticos de la proteína C
reactiva (PCR) de una manera independiente de la reducción del colesterol, de igual
manera estos fármacos han mostrado poseen propiedades antioxidantes.
Aunque los beneficios del tratamiento con estatinas han sido establecidos tanto
en la prevención primaria como secundaria de la CC, diferencias farmacológicas
interindividuales se observan con este tratamiento, las que se atribuyen a diferencias
genéticas. Estudios relacionados con la variaciones genéticas en el gen de la HMGCoA reductasa (HMGCR), el blanco directo del tratamiento con estatinas y su
influencia con los cambios en los niveles de los lípidos plasmáticos han sido limitados.
Estudios previos han indicado que el polimorfismo (TTA)n de número variable de
repeticiones en tandem (VNTR) en el gen HMGCR se asocia a patologías como la CC
y la hipercolesterolemia. Se ha descrito el polimorfismo de repetición (TTA)n en el gen
de la HMGCR y la absorción de colesterol en respuesta al consumo de esteres de
estanol.
El objetivo del presente estudio consistió en evaluar la influencia del
polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa en la magnitud de la
reducción del cLDL por atorvastatina en pacientes chilenos con CC. El objetivo
secundario fue determinar los cambios en los niveles plasmáticos de colesterol total,
PCR ultrasensible (PCRu) y F2-isoprostanos después del tratamiento con atorvastatina
y su relación con la presencia del polimorfismo (TTA)n en pacientes con CC. Este
estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Clínico de la Universidad de
Chile y todos los pacientes dieron su consentimiento para la participación en el
estudio. Sesenta y cuatro pacientes con CC documentada, completaron este estudio,
ellos recibieron 40 mg/día de atorvastatina por 8 semanas. Los niveles lípidos
plasmáticos; colesterol total, colesterol HDL (cHDL) y triglicéridos se determinaron
XII
utilizando métodos enzimáticos, el cLDL se calculó utilizando la formula de Friedewald.
Los niveles de PCRu se determinaron con una reacción antígeno-anticuerpo utilizando
la técnica de látex y los niveles de F2-isoprostanos se midieron utilizando
inmunoensayo. La genotipificación de los pacientes participantes del estudio se realizó
mediante la técnica de reacción de la polimerasa en cadena (PCR).
Los principales resultados de este estudio fueron:
•
La distribución del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa en
64 pacientes fue: genotipo >10/>10 en 22 pacientes (34%), genotipo >10/10
en 14 pacientes (22%) y genotipo 10/10 en 28 pacientes (44%)
•
Atorvastatina redujo significativamente los niveles plasmáticos de cLDL en
todos los pacientes (p< 0,0001), después de 8 semanas de tratamiento. Esta
reducción fue independiente del tipo de alelo (TTA)n en el gen de la HMGCR.
•
Los niveles de la PCRu disminuyeron en los pacientes tratados con
atorvastatina, sólo los alelos (TTA)n >10/>10 y 10/10 en el gen HMGCR
(p<0,05).
•
Los niveles plasmáticos de F2-isoprostanos y colesterol total disminuyeron
significativamente después del tratamiento con atorvastatina, para todos los
alelos (p< 0,001).
A partir de estos resultados se concluye que no hubo asociación entre el
polimorfismo (TTA)n presente en el gen de la enzima HMG-CoA reductasa y la
magnitud de la reducción de los niveles plasmáticos de cLDL, colesterol total, PCRu y
F2-isoprostanos en una muestra de pacientes chilenos con CC crónica estable
tratados por 8 semanas con atorvastatina.
XIII
ABSTRACT
Coronary Artery Disease (CAD) is the main cause of death in Chile and in
developed
countries.
The
most
frequent
ethiology
is
the
atherosclerosis.
Atherosclerosis is recognized as a dynamic and progressive disease, in which
ethiology participate a combination of endothelial dysfunction and inflammation and is
characterized by the accumulation of lipid and fibrous elements in the large arteries, as
plaques fibrous. One of the drugs that has shown to be more effective on the treatment
of hipercholesterolaemia, are the inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A
(HMG-CoA) reductase, statins have been clinically used for lowering total and lowdensity lipoprotein cholesterol (LDL-C). Statins therapy also lowers C-reactive protein
(CRP) levels in a LDL cholesterol-independent manner. Statins also have antioxidant
properties.
Although the beneficial effects of statins treatment in the primary and secondary
prevention of CAD have been established, interindividual pharmacological differences
observed with this treatment have been attributed to genetic differences. Studies about
genetic variations in HMG-CoA reductase gene (HMGCR), the direct target of statin
therapy, and the relation with the changes in lipid levels with statin therapy are limited.
Previous studies have indicated that variable number of tandem repeats (VNTR)
polymorphism (TTA)n of the HMGCR gene was associated with pathologies such as
CAD and hypercholesterolemia. Moreover, it has been reported an almost significant
difference between the (TTA)n repeat polymorphism in the HMGCR gene and
cholesterol absorption in response to plant stanol consumption.
The aim of the present study was to evaluate the role of HMG-CoA reductase
gene (HMGCR) (TTA)n repeat polymorphism in relation to the LDL-C lowering efficacy
of atorvastatin in Chilean patients with CAD. A secondary objective was to determine
the change in levels of total cholesterol, high-sensitivity CRP (hsCRP) and free F2isoprostanes after atorvastatin treatment and its relation with the presence of HMGCR
(TTA)n polymorphism in patients with CAD.
This study was approved by the Ethics Committee of the Clinical Hospital of the
University of Chile, and all patients gave their informed consent.
Sixty-four patients with documented CAD completed the trial receiving 40 mg of
atorvastatin daily for 8 weeks. Lipid levels as, total cholesterol, high-density lipoprotein
XIV
cholesterol (HDL-C) and serum triglyceride levels were determined using enzymatic
methods. LDL-C was calculated using the Friedewald´s formula. The hsCRP levels
were determined by latex method assay and free F2-isoprostanes were performed
using enzyme immunoassay (EIA). Genotyping was done by the polymerase chain
reaction.
The results of this study were:
•
The genotype distribution of the HMGCR (TTA)n polymorphism was:
Allele >10/>10 in 22 of 64 patients (34%)
Allele >10/10 in 14 of 64 patients (22%)
Allele 10/10 in 28 of 64 patients (44%).
•
Atorvastatin significantly reduced LDL-C levels in all patients (p<0.0001),
regardless the type of HMGCR (TTA)n polymorphism.
•
Reduction on hsCRP were observed in atorvastatin-treated patients with
HMGCR (TTA)n alleles >10/>10 and 10/10 (p<0.05).
•
Free F2-isoprostanes and total cholesterol were also reduced significantly after
treatment for all alleles (p<0.001).
In summary we found in a sample of patients with chronic stable CAD, no
associations were found in the atorvastatin-induced reduction of LDL-C, total
cholesterol, hsCRP and free F2- isoprostanes with the HMGCR (TTA)n polymorphism.
XV
1.
INTRODUCCIÓN
1.1.
Cardiopatía coronaria
La cardiopatía coronaria (CC), es la principal causa de muerte en Chile y en países
desarrollados (1), incrementándose rápidamente su prevalencia en los países en vías de
desarrollo. Producto de la cardiopatía coronaria desde 1990 ha muerto mas gente en todo
el mundo que de cualquier otra enfermedad (2). Se denomina cardiopatía coronaria a las
alteraciones cardíacas secundarias a trastornos de la circulación coronaria. La etiología mas
frecuente es la aterosclerosis (3) y sus manifestaciones clínicas mas importantes son: la
angina y el infarto agudo del miocardio (IAM). Las intervenciones clínicas de mayor beneficio
en la cardiopatía coronaria son las farmacológicas y las de revascularización (cirugía de
bypass coronario y angioplastía).
Varios de los factores de riesgo para el desarrollo de la cardiopatía coronaria están
determinados genéticamente, por ejemplo colesterol total y la lipoproteína de baja densidad
(LDL). Otros rasgos que también son influenciados genéticamente y que aumentan el riesgo
de desarrollar cardiopatía coronaria son la hipertensión arterial, diabetes tipo II y el síndrome
metabólico.
1.2.
Aterosclerosis
La aterosclerosis se reconoce como una enfermedad dinámica y progresiva en cuya
etiología participan una combinación de disfunción endotelial e inflamación (4). Esta se
caracteriza por la acumulación de lípidos y elementos fibrosos en grandes arterias en forma
de placas (ateromas). La asociación entre los lípidos y la ateroesclerosis dominó los
pensamientos hasta los años 1970, basada en importantes asociaciones clínicas y
experimentales entre la hipercolesterolemia y el ateroma (5,6). Luego, el desalentador
problema clínico de la reestenosis, posterior a una angioplastía coronaria, consideró el
problema de la proliferación, reforzando el interés en el control del crecimiento celular. Una
fusión de estos conceptos llevo al pensamiento de que el ateroma tenía un centro de lípidos
envuelto por una cápsula de células musculares lisas proliferativas. En la actualidad la
noción de que la inflamación y la respuesta inmune contribuyen a la aterogénesis y juegan
un papel importante, ha generado un interés creciente (7).
La aterosclerosis comprende varios procesos: disfunción endotelial, inflamación,
proliferación celular vascular y alteraciones de la matriz extracelular. La disfunción endotelial
1
es la primera alteración de la pared vascular, caracterizada por la disminución en la
producción del óxido nítrico (NO) o de su disponibilidad. El NO es un importante
vasodilatador que también disminuye la oxidación del colesterol LDL (cLDL) y la proliferación
de células musculares lisas (8). Entre los factores responsables de esta disfunción, se
encuentra los elevados niveles de cLDL y LDL oxidadas (LDLox), radicales libres derivados
del oxígeno (ROS) y/o del nitrógeno (RNS). Cabe mencionar que la concentración de LDLox
en la placa aterosclerótica es proporcional a la concentración plasmática de la LDL nativa
(9).
Cuando existe hipercolesterolemia, la LDL se retiene en la pared arterial, por una
fuerte adhesión a los proteoglicanos presentes en la íntima (10). La LDL unida a estos
proteoglicanos se oxida más fácilmente (11), modulando la aterogenicidad de las LDLs. Las
alteraciones de la permeabilidad del endotelio y el aumento de la expresión de MCP-1.
VCAM-1, ICAM-1 y selectinas inician una respuesta inflamatoria en la pared arterial. Las
acciones específicas de cada una de estas proteínas se describen a continuación:
• MCP-1 (proteína-1 quimioatractante de monocitos) (12) y de su receptor CCR2 en
monocitos (13), La MCP-1 estimula la migración de monocitos dentro de la pared
arterial y promueve la respuesta inflamatoria mediada por el factor de necrosis tumoral
α (TNF-α) e IL-1 (14),
• VCAM-1 (molécula-1 de adhesión vascular) molécula altamente expresada en la
superficie endotelial, clave para la adhesión de monocitos y linfocitos T a la pared
arterial (15),
• ICAM-1 (molécula-1 de adhesión intercelular) y
• P y E selectinas, que reclutan monocitos a la superficie vascular.
La importancia funcional de cada una estas moléculas se demostró en ratones
knockout (16-18). Todos estos procesos llevan progresivamente a la atracción y migración
de leucocitos al subendotelio, en particular monocitos, que después de adherirse e infiltrar al
endotelio se transforman en macrófagos, que fagocitan a las LDLox, por las que tienen
mayor afinidad que las LDL nativas (19). La LDLox es captada por los receptores SR-A
(scavenger-A) y CD36 (20) presentes en la superficie de los monocitos, cuando estos se
encuentran circulantes, expresan escasamente estos dos receptores, pero cuando cruzan la
pared arterial, ocurren cambios fenotípicos y su expresión aumenta significativamente.
Finalmente los macrófagos después de captar a las LDLox, se transforman en células
espumosas que forman parte de la placa de ateroma en la pared vascular. En esta etapa, la
lesión se caracteriza por contener células espumosas en el subendotelio, algunos
2
linfocitos T, depósitos en la matriz extracelular, migración de células musculares lisas (CML)
desde la capa media a la íntima e activación y adhesión de plaquetas y leucocitos a la
superficie endotelial (21). Cuando la inflamación prevalece, las células musculares lisas
vasculares (CMLVs) sintetizan nuevo colágeno para la reparación y mantención de la capa
fibrosa, pero la degradación de la matriz de colágeno aumenta por sobrexpresión y actividad
de las MMPs (metaloproteasas), enzimas especializadas en la degradación de componentes
de la matriz extracelular del subendotelio (22). Estudios in vitro muestran que mediadores
inflamatorios como IL-1β y TNF-α aumentan la expresión de las MMPs en fagocitos
mononucleares y células endoteliales (3). Es entonces como la capa fibrosa se debilita y se
hace susceptible a la ruptura cuando es expuesta a continuas tensiones, conduciendo a
hemorragia intraplaca, formación de trombos y finalmente oclusión de la arteria. Así es
importante la participación de las MMPs y los TIMPs (inhibidores endógenos de las MMPs)
en las enfermedades cardiovasculares ya que son responsables de los procesos de
remodelado ventricular y vascular e inestabilidad de la placa aterosclerótica (23). La figura 1
muestra los procesos y mediadores involucrados en la generación de una placa
aterosclerótica (24).
Proceso
Disfunción
Activación
endotelial
endotelial
Células apoptoticas
Plaquetas
Inflamación
Proteólisis
Apoptosis
Trombosis
de la matriz
Colágeno
Células musculares lisas
Célula endotelial
Células y moléculas de adhesión
Fibrina
LDL-C
Macrófagos
Cristales colesterol
Figura 1. Desarrollo de una placa aterosclerótica. Las LDLs penetran en el endotelio
disfuncional y la oxidación de las LDLs a LDLs oxidadas, las cuales son fagocitadas por los
macrófagos, transformándose en células espumosas. La acumulación y proliferación de las
células musculares lisas llevan al crecimiento de la placa. La infiltración de células
inflamatorias, la apoptosis de las células musculares lisas y la degradación de la matriz,
genera una placa vulnerable, con una capa fibrosa y una base necrótica rica en lípidos. La
ruptura de la placa puede causar trombosis, lo cual puede ser suficiente para causar la
oclusión del vaso (24).
3
1.2.1. Colesterol en la aterosclerosis
El siglo XX fue la etapa del colesterol y de las lipoproteínas que culminó en una serie
de estudios clínicos con gran número de pacientes que mostraron de manera definitiva que
la reducción de la hipercolesterolemia reduce la mortalidad y morbilidad asociado a
patologías cardiovasculares (25). Investigaciones han mostrado que la hipercolesterolemia
juega un rol clave en el desarrollo de la CC y otras manifestaciones de aterosclerosis. La
cardiopatía coronaria prematura -tan temprano como a los 5 años de edad- en pacientes con
hipercolesterolemia familiar, que tienen una mutación del gen que codifica para el receptor
de la LDL (LDLR)(26), indica que los altos niveles plasmáticos de colesterol, especialmente
cLDL, se retiene e infiltran el endotelio cuando se asocian a un fenómeno inflamatorio, se
reconoce entonces a la aterosclerosis como una enfermedad inflamatoria (25).
Una de las respuestas más tempranas inducidas por la hipercolesterolemia es un
incremento en la expresión VCAM-1, (15), MCP-1 (12) y su receptor en los monocitos (13) e
IL-8 (27). Pero las LDLs y más específicamente las LDLox, tiene efectos pro-inflamatorios
que son mediados por el factor transcripcional NF-κB (28), aumentando la expresión de IL-1
y IL-8 (29). Se ha demostrado que las LDLox inhiben a la eNOS (30,31) y producen una
down-regulation de esta enzima en células endoteliales de arterias coronarias (32),
induciendo también la unión de monocitos a estas células (33), mediado por un aumento en
la expresión de MPC-1 (34) y de VCAM-1 (35). Las LDLox aumentan la síntesis de colágeno
en CMLVs (36) y el calcio intracelular (37), además de inducir la expresión de MMP-1 (38).
Los niveles circulantes de LDLox se pueden sumar al riesgo global, basado en la
edad, el sexo, el colesterol total y bajos niveles de cHDL (lipoproteína de alta densidad),
diabetes mellitus, hipertensión arterial y el hábito de fumar y se ha utilizado como marcador
de riesgo cardiovascular (39,40). En el estudio AIR (41), los niveles circulantes de LDLox se
asociaron con aterosclerosis subclínica (determinada con ultrasonido) y marcadores de
inflamación (proteína C-reactiva, IL-6 y TNF-α). De la teoría de la oxidación nacieron varios
estudios clínicos con vitaminas, los que definitivamente no han mostrado su beneficio en la
prevención cardiovascular (42). También dentro de las lipoproteínas destaca la HDL, cuyos
niveles plasmáticos se han correlacionado inversamente con el riesgo a desarrollar
cardiopatía coronaria (43,44).
4
1.2.2. Inflamación en la aterosclerosis
La cascada inflamatoria se inicia por el reclutamiento y diferenciación de macrófagos
en la pared arterial. Citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β o TNF-α, mediados por NFκB
inducen la activación de VCAM-1 (45). La activación del NFκB promueve el reclutamiento y
activación de más células inflamatorias para el desarrollo de la lesión ya que varios genes
que codifican para citoquinas pro-inflamatorias y otros mediadores de inflamación son
regulados simultáneamente por este factor (46-48).
Los macrófagos después de fagocitar a las LDLox liberan a la circulación citoquinas,
ROS, MMPs y factor tisular, una potente proteína pro-coagulante (3). Citoquinas, incluyendo
a IL-1, TNF-α y IL-6 son altamente expresadas en las lesiones ateroscleróticas avanzadas
(49). La IL-6 se considera, entre varias citoquinas pro-inflamatorias, como el principal
mediador de la producción hepática de la proteína C reactiva (PCR) (8), siendo este último
un importante marcador de inflamación. Los niveles elevados en la sangre tanto de
citoquinas pro-inflamatorias como de PCR se consideran actualmente factores de riesgo
cardiovascular (7).
1.2.3. Proteína C reactiva
La proteína C reactiva es un pentámero, compuesto de cinco sub-unidades de 23
kDa. Los niveles plasmáticos de la PCR se incrementan rápidamente en respuesta a un
estimulo no específico, por ejemplo: trauma, inflamación, tumores e infecciones y disminuye
rápidamente después de la estabilización del paciente. En contraste con otros marcadores,
la PCR tiene una vida media larga (> 96h), una alta estabilidad (50), carece de variaciones
diurnas o estaciónales y no depende del genero (51,52). Ha sido rigurosamente
estandarizada y se puede medir en sangre, con una alta sensibilidad. Más de veinte
estudios prospectivos han mostrado que la PCR ultrasensible (PCRu) a pesar de su
respuesta inespecífica, es biomarcador de inflamación y un predictor independiente de
futuros eventos cardiovasculares (53).
Concentraciones elevadas de PCRu predicen riesgo cardiovascular en varios
subgrupos de pacientes: hombres y mujeres sin enfermedad cardiovascular (54), con angina
estable o síndrome agudo coronario (55), pacientes con angina inestable (56), después de
un IAM (57) e incidencia de reestenosis post- angioplastía (58). La evaluación de diferentes
5
marcadores de inflamación revela que la PCRu posee el mayor valor predictivo de eventos
cardiovasculares respecto a otros biomarcadores como moléculas de adhesión, citoquinas
(TNF-α e IL-6) y homocisteína. (54,59). Recientes observaciones del estudio de
Framingham (60) indican que los niveles de PCRu actúan como potenciales predictores del
riesgo cardiovascular global (61). La American Heart Association recomienda la aplicación
de la PCRu para la determinación del riesgo cardiovascular (CV) (62). Basados en datos
epidemiológicos se ha propuesto categorizar a los pacientes de acuerdo a los niveles
basales de la PCRu; niveles que indican un bajo riesgo PCRu < 1 mg/L, riesgo intermedio
PCRu entre 1 y 3 mg/L y el grupo de alto riesgo PCRu >3 mg/L (59).
En la biología endotelial, la PCR también tiene un papel crítico en la patogenia de la
aterosclerosis, favoreciendo un fenotipo pro-inflamatorio y pro-aterosclerótico. La PCR
produce una potente “down-regulation” de la trascripción de la NOsintasa endotelial (eNOS),
desestabilizando su mRNA in vitro, (63), estimula la apoptosis de células endoteliales,
bloquea la angiogénesis por inhibición de la producción del NO (63) e inhibe la sobrevida y
diferenciación de células progenitoras endoteliales desde la médula ósea (64). Se ha
descrito también que la PCR estimula la liberación de endotelina-1 e IL-6 desde células
endoteliales (65) y disminuye la producción del vasodilatador prostaciclina (66). La PCR
sobrerregula a NF-kβ (67) y estimula la expresión de VCAM-1, ICAM-1, E-selectina e IL-8
(14), promoviendo la adhesión de monocitos a las células endoteliales (14). La PCR también
induce a MCP-1 y juega un rol en la desestabilización de la placa de ateroma, estimulando a
la MMP-1 (68). Además bloquea la fibrinolisis y
promueve la síntesis y expresión del
inhibidor del plasminógeno (69).
Tradicionalmente se conocía que la PCR sólo se producía en el hígado. Sin
embargo, recientes estudios han identificado que varios tipos celulares pueden sintetizarla,
entre los que se incluyen a macrófagos del pulmón y cerebro (70,71), el epitelio renal (72) y
adipocitos (73). Además su mRNA (74) y proteína se ha detectado en placas
ateroscleróticas pero no en la íntima normal (75), localizándose predominantemente en CML
y macrófagos. Todo esta argumentan a favor de que existe síntesis de novo en la pared
arterial y lleva a la idea de que la PCR presente en la circulación sistémica no sólo proviene
del hígado (76,77).
6
1.3. Tratamiento farmacológico de la cardiopatía coronaria
Ensayos randomizados han confirmado los beneficios de 4 grupos de fármacos,
administrados de manera profiláctica, en la prevención secundaria (78): a) antiagregantes
plaquetarios, (79-81); b) β-Bloqueadores (82,83); c) inhibidores de la enzima convertidora
de angiotensina- I (IECA) (84-88) y d) estatinas (89-92).
1.3.1. Estatinas
Las estatinas son inhibidores competitivos y reversibles de la hidroximetilglutaril
coenzima-A reductasa (HMG-CoA, Figura 2), enzima limitante en la biosíntesis endógena
de colesterol. Las estatinas inhiben a esta enzima, compitiendo con el sustrato endógeno
por el sitio activo de la enzima (93). En la actualidad son fármacos de elección en el
tratamiento de la dislipidemia, logrando reducir considerablemente los niveles de los lípidos
plasmáticos, con especial importancia
el LDL. Además de la disminución de lípidos
sanguíneos, a las estatinas se les atribuyen efectos extralipídicos, de importancia en la
patología coronaria (94, 95).
Figura 2. Estructura química de atorvastatina.
1.3.2. Mecanismos moleculares de acción de las estatinas
Dado el efecto positivo de las estatinas en las células vasculares, la dilucidación de
los mecanismos básicos moleculares ha despertado gran interés en la comunidad científica.
7
Variados estudios han llevado al establecimiento de múltiples mecanismos que se han
extendido desde interacciones con moléculas en células de superficie a alteraciones en la
señalización de proteínas y modulación de la expresión/función de factores nucleares.
1.3.2.1.
Estatinas e isoprenilación de proteínas
La síntesis de colesterol se lleva a cabo en múltiples pasos (Figura 3). Los
isoprenoides (fernesil-pirofosfato y geranilgenaril-pirofosfato) son importantes intermediarios
de la biosíntesis endógena de colesterol, pero además son esenciales para la unión a las
membranas y la actividad biológica de distintas proteínas G pequeñas como Rho, Rac, Rab,
Rap y Ral (96). La translocación de Ras a la membrana es necesaria para su actividad
biológica y es dependiente de la fernesilación. Similarmente la translocación de Rho y Rac a
la membrana se requiere para su actividad, pero a diferencia de Ras esta experimenta
geranilgeranilación (Figura 3). Aunque sus funciones pueden en algún grado estar
superpuestas, Ras se asociada a proliferación celular, Rac con la generación de especies
reactivas de oxigeno (ROS) y Rho con la activación de vías pro-inflamatorias (96, 97).
Las estatinas, como inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa, bloquean la
biosíntesis de isoprenoides como fernesil- pirofosfato (FPP) y genarilgenaril pirofosfato
(GGPP) (Figura 3) y como consecuencia, a las proteínas G pequeñas. La depleción de
GGPP y/o FPP puede explicar muchos de los efectos anti-inflamatorios de las estatinas en
la células vasculares (95). Por ejemplo la inhibición de la geranilgeranilación de Rho por
estatinas, puede reducir la adhesión de leucocitos y la actividad fibrinolítica (98-100).
También las estatinas pueden incrementar la expresión de eNOS en células endoteliales, un
efecto dependiente de la inhibición de la geranilgeranilación de Rho (101,102). El efecto de
las estatinas en la “up-regulation” de la expresión de la eNOS se debe a la prolongación de
la vida media de su mRNA (101). Las estatinas por inhibición de la isoprenilación de Rac
pueden llevar a una reducción del ensamble de la NADPH oxidasa y consecuentemente de
la generación de ROS (103-105). Por otra parte, el metiléster de la L-nitro-arginina (LNAME), inhibidor selectivo de la eNOS, inhibe el aumento de las concentraciones de NO
inducido por las estatinas, tanto in vivo como in vitro, confirmando que ellas actúan por
acción en la síntesis de NO dependiente de eNOS. Importantemente aunque las ROS
puedan inactivar al NO, las propiedades antioxidantes de las estatinas pueden a través del
incremento de la eNOS contribuir a mejorar la función endotelial (95).
8
Se ha demostrado que las estatinas activan la vía de la PI3K/PKB que regula
distintas funciones del endotelio (96). PKB también fosforila a caspasa-9 y eNOS (106,107),
por lo que la activación de PKB por estatinas ha demostrado inhibir la apoptosis e
incrementa la producción del NO en cultivos de células endoteliales (108). La exposición a
estatinas disminuye la expresión del inhibidor del plasminógeno en células endoteliales,
favoreciendo la lisis de coágulos, un efecto pleiotrópico de las estatinas (109,110). Estudios
clínicos y pre-clínicos han mostrado que el tratamiento con estatinas restaura las funciones
normales de las células vasculares (111-113). Otros estudios pre-clínicos han mostrado que
las estatinas pueden disminuir la inflamación vascular independientemente de la disminución
de los niveles de colesterol (114). Pero cabe destacar que la mejoría de la función endotelial
es a menudo observada antes de cambios en los lípidos plasmáticos.
1.3.2.2.
Estatinas y factores nucleares
La activación de receptores localizados en la superficie celular y la posterior
activación de diversas vías transduccionales culminan en una serie de eventos nucleares
que terminan en la regulación de la expresión de genes y cambios en la función celular.
Diversos estímulos pro-inflamatorios convergen en el factor trascripción NFκB y el activador
de la proteína 1 (AP-1), que inducen la expresión de genes pro-adhesivos y protromboticos
en las células vasculares (115). Las proteínas G pequeñas Rho y Rac pueden inducir la
actividad del NFκB por mecanismos que involucran la fosforilación de IκB (inhibidor del
NFκB) y llevan a la acumulación del factor nuclear NF-κB (116,117). La proteína Rho
también ha mostrado activar a AP-1 en células T (118). Se postula que las propiedades antiinflamatorias de las estatinas son mediadas a través de la inhibición de NFκB y AP-1. Las
estatinas limitan la acumulación nuclear de NFκB y su unión al DNA, tal vez vía un
incremento de la expresión de IκB (119-123). Con respecto al AP-1, las estatinas han
mostrado reducir la expresión de c-Jun, una de las dos proteínas que forman el complejo
AP-1(122). Otro mecanismo por el cual las estatinas confieren favorables propiedades en el
endotelio es a través de la activación del receptor proliferador activado por peroxisoma
(PPARs) (124), Los PPARα y γ se han identificado en células endoteliales y poseen una
potente actividad anti-inflamatoria mediada en parte por la inhibición de factores
transcripcionales como NFκB y AP-1 (125,126). Agonistas específicos de PPARγ y α inhiben
la aterosclerosis experimental y la formación de células espumosas en macrófagos (127).
Las estatinas pueden aumentar la expresión y/o incrementar la actividad de PPARα y γ
(128,129). Más aún las estatinas y los ligandos de PPARγ pueden actuar de manera
9
cooperativa en atenuar la respuesta inflamatoria en monocitos humanos (128, 130).
Además, las estatinas a través de la inhibición de Rho, aumentan la actividad de PPARα y
como consecuencia de ello, la expresión de moléculas anti-aterogénicas como es la apoA-1
(131).
Factores de crecimiento y citoquinas pro-inflamatorias
Estatinas
HMG-CoA
reductasa
Mevalonato
Fernesil PP
Genarilgenaril PP
Esqualeno
Estrés Oxidativo
Proliferación
Colesterol
Factores de crecimiento y citoquinas pro-inflamatorias
Figura 3. Efectos celulares de las estatinas. La inhibición de la HMG-CoA reductasa por
estatinas, bloquea la síntesis de colesterol y la producción de isoprenoides, resultando en
una reducción de la isoprenilación de proteínas G pequeñas, como Rho lo que lleva a la
disminución de la actividad del NFκB. FPP, farnesilpirofosfato; GGPP genarilgenaril
pirofosfato.
1.3.3. Eficacia de la terapia farmacológica con estatinas en la prevención secundaria
de la cardiopatía coronaria.
Un tratamiento farmacológico adecuado en prevención secundaria para pacientes
portadores de cardiopatía coronaria, puede tener un gran impacto en la recurrencia de
nuevos eventos coronarios (132). Las estatinas son uno de los medicamentos que ha
mostrado mayores beneficios en estos pacientes, reduciendo significativamente los eventos
cardiovasculares. En un meta-análisis prospectivo con datos de 90.056 pacientes, de 14
estudios clínicos que utilizaron estatinas, mostró menor recurrencia de IAM y accidentes
cerebrovasculares (133). Estudios clínicos con gran número de pacientes muestran la
eficacia de las estatinas en la cardiopatía coronaria aguda y crónica. Así lo muestran los
10
estudios en prevención secundaria 4S (Scandinavian Simvastatin Survival Study) (89),
CARE (Colesterol And Recurent Event) (90), LIPID ( Long-Term Intervention with Pravastatin
in Ischaemic Disease trial) (91) y HPS (Heart Protection Study) (92), PROSPER
(PROspective Study of Pravastatin in the Elderly at Risk) (134), PROVE-IT-TIMI 22 (135), A
to Z (Aggrastat to Zocor trial)(136), TNT(Treating to New Targets) (137) e IDEAL
(Incremental Decrease in End points through Aggressive Lipid lowering(138).
1.3.4. Estatinas en la reducción del cLDL, inflamación y estrés oxidativo
Las estatinas son los fármacos más efectivos en la disminución de los niveles
plasmáticos de colesterol, logrando reducir los niveles de colesterol total y cLDL en
aproximadamente 20 a 50%. A las estatinas también se les atribuyen efectos antiinflamatorios que pueden ser evaluados mediante la determinación de la PCRu. Además a
las estatinas se les atribuye propiedades antioxidantes (139) que pueden ser medidas a
través de la determinación de F2-isoprostanos. F2-isoprostanos son un producto de la
lipoperoxidación de membranas y marcador de estrés oxidativo y puede ser determinado en
plasma y orina.
El marcador de inflamación PCRu se ha evaluado en innumerables ensayos clínicos.
En el estudio CARE, que incluyó pacientes post-IAM, se describió que niveles elevados de
PCRu incrementaban el riesgo de sufrir nuevos eventos cardiovasculares (58). Después de
5 años de análisis del CARE se demostró que pravastatina reduce significativamente los
niveles plasmáticos de PCRu de manera independiente a los niveles de cLDL (140- 142).
En el estudio clínico AFCAPS/TexCAPS, en prevención primaria, se demostró que
individuos con elevados niveles de PCRu se beneficiaban con el tratamiento con estatinas,
aún cuando los niveles de cLDL no estaban elevados (143). En el PRINCE (Pravastatin
Inflammation/PCR Evaluation) que incluyó hombres y mujeres sin historia cardiovascular
(prevención
primaria)
y
con
enfermedad
cardiovascular
(prevención
secundaria),
pravastatina 40 mg/día versus placebo redujo los niveles de PCRu independientemente de
los niveles de cLDL, después de 12 y 24 semanas de tratamiento (144). También en los
estudios MIRACL (Myocardial Ischemia Reduction with Agressive Colesterol Lowering) (145)
y REVERSAL (Reversal of Atherosclerosis with Aggressive Lipid Lowering) (146)
demostraron que la estatinas reducen los niveles de PCR y cLDL. En un subgrupo del
estudio clínico PROVE IT-TIMI 22 (Pravastatin or Atorvastatin Evaluation and Infecction
Therapy- Thrombolysis in Myocardial Infarction 22) (147) con 3.745 pacientes con angina
inestable y post-IAM, se comparó el uso de una terapia intensiva (80 mg/día de
11
atorvastatina) y una moderada (40 mg/día de pravastatina) midiendo los niveles de cLDL y
PCRu antes y después de la terapia. Ambos marcadores se redujeron después de 30 días
de tratamiento, pero los pacientes que redujeron los niveles de PCR a menos de 2 mg/L
mejoraron su sobrevida independientemente de los niveles del cLDL. La terapia agresiva
con atorvastatina (80 mg/día) logró niveles óptimos de cLDL < 70mg/dL y PCR <2 mg/L,
disminuyendo el riesgo de un muevo IAM y muerte por causa coronaria. Así el PROVE ITTIMI 22 mostró la importancia de mantener los niveles de cLDL < 70mg/dL y los de
PCRu < 2 mg/L. Este concepto también se apoya en las observaciones de Nissen y cols
(148), en el estudio clínico REVERSAL. Este estudio incluyo a 502 pacientes con
diagnóstico de cardiopatía coronaria, se evaluó a los pacientes con ultrasonografía
intravascular, demostrando que los pacientes que lograron mayores reducciones de los
niveles de cLDL y PCRu también registraron la mayor regresión del ateroma. Recientemente
en el estudio clínico A to Z, los investigadores también describieron que alcanzar la meta de
cLDL < 70 mg/dL y PCRu < 2 mg/dL, se asociaba a una mejor respuesta clínica. Este
estudio se realizo en 3.813 pacientes con síndrome coronario agudo en tratamiento con
estatinas (149). En el estudio Women’s Health Study (60) que incluyo a 22.939 mujeres sin
historia de enfermedad cardiovascular seguidas por 8.3 años, determinó el riesgo según
Framingham y comparó la concentración basal de cLDL y PCRu. Los niveles bajos de
ambos marcadores fueron importantes predictores de una mayor sobrevida. En el estudio,
JÚPITER (150) (Justification for the USE of Statins in Primary Prevention: an Intervention
Trial Evaluating Rosuvastatin), que incluyo pacientes en prevención primaria y evaluó el
efecto de rosuvastatina 20 mg versus placebo en pacientes sanos y con PCR ≥ 2mg/L, su
hipótesis proponía que individuos con elevados niveles de PCR y bajos niveles de lípidos se
benefician de la terapia con estatinas, disminuyendo el riesgo cardiovascular. Así el 29 de
Marzo de 2008, el laboratorio AstraZeneca, suspendió el estudio a nivel mundial, por
haberse demostrado una reducción significativa de los end-point clínicos con rosuvastatina.
Adicionalmente el marcador de estrés oxidativo F2 isoprostanos, ha sido determinado
en tratamiento con estatinas. El tratamiento con simvastatina 40 mg/día en pacientes con
cardiopatía coronaria mostró una reducción significativamente de los niveles de F2
isoprostanos (151). En otro estudio realizado en pacientes chinos con diabetes mellitus
tipo 2 e hiperlipidemia, el tratamiento con fluvastatina por
12 semanas redujo
significativamente los niveles plasmáticos de F2-isoprostanos (152). Igual efecto se encontró
con atorvastatina en la reducción los niveles urinarios de F2-isoprostanos (153).
12
1.4.
Farmacogenómica del tratamiento con estatinas
La farmacogenómica es una nueva ciencia que estudia las variaciones genéticas que
influyen en la respuesta del individuo a los medicamentos (154-157). Estas variaciones
cuando se generan en un porcentaje menor al 1% de la población se denominan mutaciones
y cuando este porcentaje es superior al 1% se llaman polimorfismos (154-157).
Estas variaciones se pueden encontrar en los genes que codifican para enzimas,
transportadores y receptores (154-157). Estas diferencias genéticas explican la distinta
eficacia y toxicidad interindividuales de algunos medicamentos (157, 158).
Un polimorfismo se define como una secuencia de DNA que se transmite de
generación en generación de forma simple. Los polimorfismos pueden ser de varios tipos,
tales como: 1) polimorfismo de un sólo nucleótido (SNP) que se produce por el cambio de
una base nitrogenada; 2) de inserción o deleción de una base; 3) por inserción o deleción de
un conjunto de bases que pueden ser de cientos a miles; 4)
polimorfismo de número
variable de repeticiones tandem (VNTR) y 5) por inserción o deleción, repetidas veces, de
una o más bases, constituyendo los denominados microsatélites (157,158).
Aproximadamente, el 90% de los polimorfismos corresponden a SNP, identificándose
alrededor de cuatro millones de ellos (157). Sin embargo, la mayor parte de los SNP no
tiene relevancia clínica, puesto que son los denominados polimorfismos silentes, es decir,
que no tienen efecto en la expresión proteica, debido a que distintos tripletes pueden
codificar para un mismo aminoácido (157,158).
Recientes avances en la determinación de SNP se pueden aplicar para caracterizar a
los pacientes que experimentan un evento adverso o aquellos para los cuales un fármaco
muestra eficacia (159-161). Además la determinación de polimorfismos de genes
involucrados en farmacocinética y farmacodinamia de las estatinas, previo al inicio de la
terapia con el fármaco, podría ayudar a identificar pacientes con riesgo de desarrollar
reacciones adversas a medicamentos (RAM) (162). En la farmacocinética de las estatinas,
el CYP3A4 es la principal vía de metabolización para lovastatina, simvastatina y
atorvastatina. Un estudio observó una asociación entre el polimorfismo A290G del CYP3A4
y los niveles de cLDL en plasma después del tratamiento con atorvastatina (163). Así
polimorfismos de genes que codifican para proteínas que juegan un importante rol en el
13
metabolismo de colesterol, tienen un importante papel en la respuesta diferencial a la terapia
con estatinas. El gen de la apolipoproteína–E (Apo-E), que es sin duda el más estudiado y
probablemente uno de los genotipos más importante que afecta la respuesta hipolipemiante
a las estatinas (164). Otros genes importantes son el LDLR (receptor LDL) y el HMGCR (3hydroxy-3-metilglutaryl coenzyme A reductasa), reportándose polimorfismos en este último
gen.
El conocimiento de estos polimorfismos puede ayudar a una adecuada selección de
medicamentos, de su dosis y a la optimización de la eficacia y seguridad del tratamiento
(159-158, 165).
1.4.1
Polimorfismos en el gen de la HMG-CoA reductasa (HMGCR)
El gen de la HMG-Co A reductasa está compuesto de 20 exones y se ubica en el
cromosoma 5q 13.3 –q 14 (166). Existe un polimorfismo, en el intrón 2, que es del tipo de
número variable de repeticiones en tandem (VNTR) y consiste en la repetición (TTA)n; se
han descrito 7 alelos A1 a A7 que van desde 10 a 16 repeticiones (167). En la Figura 4 se
muestra la ubicación del polimorfismo de la HMG-CoA reductasa.
EXONES 1
2
EXONES 3
20
3´
5´
TTATTATTATTATTATTATTATTATTAT
Figura 4. Polimorfismo del tipo tandem (TTA)n, en el gen de la HMG-CoA reductasa.
Esquema del gen HMGCR. Las líneas negras indican secuencias intrónicas. El polimorfismo
tipo tandem se encuentra ubicado en el intron 2 de este gen, el fragmento puede tener de
175 a 193 pares de bases.
Previos estudios han asociado a este polimorfismo del tipo VNTR, (TTA)n en el gen
HMGCR, a patologías como la cardiopatía coronaria y la hipercolesterolemia (168,169).
Un estudio que analizó este polimorfismo, encontró que la frecuencia de repeticiones (TTA)n
varió desde 10 (55,2%) a 16 (3,0%), esta frecuencia de distribución sugiere que 10
repeticiones pueden ser consideradas como el alelo silvestre o “wild-type”. En este estudio
14
participaron 112 individuos no hipercolesterolémicos, de los países bajos, que consumieron
en la dieta esteres de estanol, compuestos que disminuyen la absorción de colesterol a
nivel intestinal (170).
Como ya hemos mencionado, la terapia con estatinas es ampliamente prescrita para
el tratamiento de la hipercolesterolemia, sin embargo existe una considerable variación
interindividual en la respuesta clínica y en la reducción de los niveles plasmáticos de
colesterol (171, 172).
En el estudio clínico PRINCE (Pravastatin Inflammation/CRP Evaluation) se
describieron dos variantes no codificantes en el HMGCR que se heredan juntas (SNPs 12 y
29) y se asociaron con la magnitud de la respuesta de la reducción de colesterol total y
cLDL. Los portadores del haplotipo constituidos por estos SNPs mostraron un 22 y 19% de
una menor reducción en el colesterol total y cLDL respectivamente, después del tratamiento
con estatinas (173). En este estudio participaron 1.536 pacientes, 88,7% blancos, 6,7%
negros, 2,9% hispanos, 1,2% asiáticos y 0,7% otras etnias (173) y la prevalencia del
polimorfismo A/T fue 6,7%. Sin embargo, la asociación entre los SNPs en el gen HMGCR y
la respuesta al tratamiento con estatinas no pudo ser reproducida en el estudio ACCESS
(174). Aparte de los estudios clínicos PRINCE y ACCESS no hay más estudios
farmacogenómicos que hayan estudiado polimorfismos en el gen de la HMG-CoA reductasa
y respuestas al tratamiento con estatinas.
En resumen lo que se conoce hasta ahora es:
•
Estudios clínicos multinacionales, con gran número de pacientes han demostrado
que la hipercolesterolemia, especialmente los altos niveles plasmáticos de cLDL,
se asocia a la cardiopatía coronaria.
•
Las estatinas son actualmente los fármacos de elección en el tratamiento de la
hipercolesterolemia, especialmente en la reducción de los niveles plasmáticos del
cLDL y por consiguiente la reducción de la mortalidad cardiovascular. Además en
los últimos años,
se les ha atribuido a las estatinas efectos extralipídicos o
pleiotrópicos relacionados con la reducción de inflamación y estrés oxidativo.
•
Un polimorfismo del tipo SNP en el gen de la HMG-CoA reductasa se ha
asociado a una respuesta diferencial frente al tratamiento con estatinas. Sin
embargo estos datos no pudieron ser reproducidos.
•
Se desconoce si el polimorfismo de tipo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA
reductasa se asocia a respuestas diferenciales en el tratamiento con estatinas.
15
En base a estos antecedentes, hemos elegido al polimorfismo (TTA)n en el gen de la
HMGCR para este estudio farmacogenético
en el que se evaluará de la respuesta
hipolipemiante a estatinas.
16
2. HIPÓTESIS
La magnitud de la respuesta hipolipemiante por estatinas en pacientes con cardiopatía
coronaria se asocia al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Objetivo primario: Evaluar los efectos del polimorfismo de número variable de repeticiones
tandem (VNTR) (TTA)n de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa sobre la magnitud de la
reducción de colesterol cLDL, en pacientes portadores de cardiopatía coronaria tratados con
atorvastatina.
Objetivo secundario: Estudiar el nivel de inflamación y estrés oxidativo en pacientes con
cardiopatía coronaria estable por medio de la determinación de la proteína C-reactiva
(PCRu) y F-2 isoprostanos y su modificación por estatinas.
3.2. Objetivos específicos
ƒ
Caracterizar una muestra de pacientes que presentan diagnóstico cardiopatía
coronaria estable y no reciben tratamiento con estatinas.
ƒ
Determinar la prevalencia del polimorfismo de número variable de repeticiones
tandem (VNTR) (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa en una muestra de
pacientes con cardiopatía coronaria.
ƒ
Evaluar el efecto de atorvastatina (40 mg/día) sobre la magnitud de la reducción de
los niveles plasmáticos cLDL, colesterol total, PCRu y F-2 isoprostanos en pacientes
con cardiopatía coronaria.
ƒ
Establecer correlaciones entre los distintos genotipos del polimorfismo (TTA)n en el
gen de la HMG-CoA reductasa y los cambios en las concentraciones plasmáticas del
cLDL y PCRu en pacientes con cardiopatía coronaria tratados con atorvastatina 40
mg.
17
4.
METODOLOGÍA
4.1.
Diseño del Estudio
El estudio clínico fue prospectivo y abierto, que siguió las pautas ICH-GCP. Los
pacientes recibieron una dosis de 40 mg/día de atorvastatina (Saval S.A. Chile) por 8
semanas, siendo cada paciente su propio control. En la primera visita, se obtuvo la historia
médica completa y la medicación concomitante del paciente. A todos los pacientes se les
realizó un examen físico y se les entregó un consejo dietético. Los potenciales efectos
adversos se registraron en cada una de las visitas de seguimiento. El esquema de diseño
del estudio se muestra en Figura 5.
Sceening
Atorvastatina
40 mg
V1
V2
-1
0
Visitas
V3
Semanas
8
Figura 5. Diseño del estudio clínico. Esquema de las visitas del estudio. Visita 1, semana
-1; Visita 2, semana 0; Visita 3, semana 8 y final del estudio.
4.2.
Presentación y aprobación por Comité de Ética
El estudio clínico se realizó bajo las normas internacionales y la declaración de
Helsinki para la protección del paciente, siendo aprobado por el Comité de Ética del
Hospital Clínico de la Universidad de Chile donde se realizó el enrolamiento de pacientes.
Además se diseñó un consentimiento informado en el que se especificaron las finalidades
del estudio. Todos los pacientes que aceptaron participar en él, firmaron este
consentimiento informado (anexo 2).
18
4.3.
Incorporación de los pacientes con cardiopatía coronaria al estudio
Se elaboró una ficha de recolección de datos, la que permitió el registro de los datos
personales y demográficos del paciente, como también información que permitiera
determinar la presencia de cardiopatía coronaria o equivalente (pacientes en prevención
secundaria), factores de riesgo y tratamiento farmacológico concomitante (Anexo 3).
4.4
Determinación del tamaño de muestra
La determinación del tamaño de la muestra, consideró un número de individuos que
permitiera asociar alelos con respuesta a terapias farmacológicas. Los pacientes se
separaron en grupos de acuerdo a la presencia o no del polimorfismo (TTA)n, en el gen de
la HMG-CoA reductasa. Para el cálculo de la muestra se asumió: a) la atorvastatina reduce
a esas dosis los niveles de colesterol LDL en un 30%, b) la intensidad de la respuesta
hipolipemiante (reducción de los niveles de cLDL) difiere en un 20% entre grupos. Se estimó
que se necesitaban 12 pacientes por grupo, es decir i) con dos alelos de 10 repeticiones
(10/10), ii) con dos alelos de más de 10 repeticiones (>10/>10) y iii) con cada uno de los
tipos de alelos antes descritos (10/>10). Para encontrar diferencias significativas y como se
desconocía la frecuencia alélica de este polimorfismo (TTA)n en la población chilena,
usamos como referencia el de una población europea, 20% en el caso de dos alelos con
más de 10 repeticiones. El tamaño de la muestra total incluyó a 60 pacientes. Se utilizó un
análisis de varianza, con un error α 0.05 y una potencia del 80 %.
4.5
Pacientes
Se aplicaron los siguientes criterios de inclusión y exclusión:
a) Criterios de inclusión:
• Hombres y mujeres mayores de 18 años.
• Pacientes con evidencia de ser portadores de cardiopatía coronaria estable, definido por
uno o más de los siguientes criterios clínicos: pacientes que han sufrido previamente un
IAM, paciente con antecedentes de angina estable o inestable documentada con
coronariografía, pacientes con Diabetes Mellitus no insulino dependiente y los pacientes a
los cuales se les ha practicado una angioplastía ó una cirugía de revascularización
coronaria.
• Colesterol LDL en ayunas en un rango de ≥100 y ≤ 220mg /dL.
19
• Trigliceridemia < 400 mg/dL.
• Pacientes que no hayan recibido tratamiento farmacológico con estatinas a lo menos dos
meses previos al ingreso de este estudio.
b) Criterios de exclusión:
• Mujeres embarazadas, en período de lactancia o en edad fértil sin método anticonceptivo.
• Pacientes que hayan sido hospitalizados dentro de los 90 días previos al ingreso del
estudio con: síndrome coronario agudo o hayan sido sometidos a procesos de
revascularización coronaria.
• Pacientes con disfunción hepática, indicada por transaminasas GOT, GPT ≥ 2 veces limite
normal superior. Pacientes con niveles plasmáticos de CK > 3 veces el límite normal
superior y creatinina plasmática > 2.0 mg/dL.
• Pacientes con antecedentes de hipotiroidismo, TSH ≥1.5 veces el limite normal superior.
• Pacientes con antecedentes de intolerancia o hipersensibilidad a las estatinas.
• En tratamiento con fármacos de conocida interacción con estatinas.
• Con cuadro inflamatorios o infecciosos intercurrentes.
• Con enfermedades gastrointestinales que limiten la absorción de medicamentos
• Y pacientes con limitaciones para comprender la naturaleza del estudio o que sean
portadores de enfermedades que limiten su sobrevida.
4.6.
Enrolamiento de pacientes
Entre Octubre del 2005 y Septiembre del 2006 se enrolaron pacientes del Centro
Cardiovascular del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. Esto pacientes se
contactaron telefónicamente y provenían de la base de datos de Rehabilitación Cardiaca,
Cirugía Cardiovascular y Hemodinamia. Las fichas clínicas se revisaron y aquellos pacientes
que cumplían con los requisitos de selección, se les invitó a participar en el estudio.
4.7.
Recolección de muestras
Después de haber firmado el consentimiento informado y como parte del protocolo se
extrajo una muestra de sangre de 10 mL, al indicio del estudio y después de 8 semanas de
tratamiento.
20
Las muestras de sangre venosa fueron extraídas por una enfermera universitaria y
recolectada en tubos vacutainer con EDTA y gel activador respectivamente. Las muestras
se enviaron al laboratorio Central del Hospital Clínico de la Universidad de Chile y/o a la
Unidad de Farmacogenómica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas,
almacenándose a 4ºC para la posterior extracción del DNA genómico.
4.8.
Exámenes de laboratorio
Los exámenes, Tabla 1 se realizaron en el Laboratorio Central del Hospital Clínico
de la Universidad de Chile.
• Perfil lipídico. Las determinaciones de los lípidos plasmáticos (colesterol total, cLDL y
cHDL) se realizaron con la técnica de test enzimático in vitro. La determinación cuantitativa
de colesterol en plasma se efectuó utilizando el kit Roche/Hitachi ref.03030024 y 11491458
para colesterol total y cHDL, respectivamente. El valor de cLDL se obtuvo utilizando la
formula de Friedewald
• Glicemia. La determinación de glicemia sanguínea se realizó mediante
un test
enzimático in vitro de Roche/Hitachi ref.11876899.
• PCRu. La determinación los niveles plasmáticos de la proteína C reactiva ultrasensible
(PCRu), se realizó mediante el test inmuno-turbidimétrico Tina–quant CRP usando
anticuerpo anti-PCR (Roche/Hitachi 902).
• Hormona estimulante de la tiroides (TSH). La determinación plasmática de TSH se
realizó con una técnica inmunométrica, que implica la reacción de la TSH con un anticuerpo
biotinilado (anticuerpo monoclonal de ratón anti-TSH total) y un anticuerpo conjugado
(monoclonal de ratón subunidad alfa-TSH). Test TSH Vitros Immunodiagnostic Products.
Johnson & Johnson.
• Creatina kinasa (CK). La determinación plasmática de CK se realizó mediante test
enzimático y detección fotométrica. Roche/Hitachi ACN 057.
• Enzimas hepáticas. Transaminasa oxalacética y pirúvica (GOT) y transaminasa
pirúvica (GPT). Las determinaciones plasmáticas de GOT y GPT se realizaron mediante
test enzimático y detección fotométrica de Roche/Hitachi 917:ACN 457 y 917:ACN 075,
respectivamente.
21
Tabla 1: Exámenes de laboratorio realizados por protocolo a todos los pacientes del estudio.
Exámenes
Basal, visita 1
Fin
del
estudio,
visita 3
4.9
Glicemia (mg/dL)
X
X
Colesterol total (mg/dL)
X
X
Colesterol LDL (mg/dL)
X
X
Colesterol HDL (mg/dL)
X
X
Triglicéridos (mg/dL)
X
X
PCRu (mg/L)
X
X
CK (U/L)
X
X
TSH ( mlU/L)
X
GOT (U/L)
X
X
GPT (U/L)
X
X
Aislamiento y cuantificación del DNA genómico
El DNA se aisló usando el método de precipitación por NaCl, estandarizado por
nuestro grupo de trabajo. Este consistió en la hemólisis y posterior centrifugación de la
muestra de sangre para separar los glóbulos rojos del plasma y poder extraer el DNA
presente en los núcleos de las células de la serie blanca. En el anexo 1 se describe el
protocolo completo de la extracción del DNA genómico.
La concentración de DNA resultante se determinó espectrofotométricamente en
cubetas de cuarzo a partir de la absorbancia a 260 nm. La pureza del DNA se evaluó a
través de la formula: (A260/A280) > 1,6, tomándose un valor óptimo entre 1,8 y 2,0 para esta
relación.
22
4.10
Estandarización de la concentración de Magnesio en la reacción de PCR para la
amplificación del gen de la HMGCR
En la Figura 6 se observa el efecto de la concentración de Mg2+ en la mezcla del
PCR, quedando para el protocolo una concentración final de 1,5 nM.
0,5
1
1,5
2
nM
Figura 6. Estandarización de concentración de Mg2+ en la amplificación por PCR del
gen de la HMGCR. Utilización de diferentes concentraciones de Mg, en la reacción de PCR
para la amplificación del gen de la HMGCR.
4.11
Genotipificación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n en el gen de la HMG-
CoA reductasa
Para la genotipificación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n presente en el intrón
2 del gen que codifica para la enzima HMG-CoA reductasa (ver Fig. 7), se utilizó la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de acuerdo al protocolo de Lalovic y col
(167). La estandarización comenzó con la verificación de la concentración de los partidores
y de magnesio. La mezcla final de reacción consistió en mezclar 1 μL de solución de DNA
con 2 μL de cada uno de los partidores; primer R: 5´CAGAGTGACACTCTGTCTCC-3´ y
primer F: 5´CATGTTCCATCCATGTCTGC-3´, en concentraciones de 5 μM, 0.75 μL de
MgCl2 50 mM, 4 μL tampón10x PCR, 0.5 μL de solución que contiene cada uno de los
deoxinucléotidos 10 mM, 0,4 μL de Taq polimerasa y 16,35 μL de agua nanopura en un
volumen final de 25 μL. Luego se utilizó la técnica de PCR, cuyas condiciones fueron: 35
ciclos de denaturación del DNA a 94ºC por 30 seg., alineamiento a 57°C por 30 seg. y
elongación a 72ºC por 30 seg., seguido por un ciclo de extensión final de 7 min a 72ºC.
Los productos amplificados se mezclaron con azul de bromofenol, se transfirieron 30
μL a un gel de poliacrilamida al 8% (p/v) en TBE 0,5x y se separaron por electroforesis. El
gel se tiñó con bromuro de etidio y los fragmentos se visualizaron bajo luz UV en un
transluminador como bandas de 175-193 pb. Siete alelos de 10 a 16 repeticiones están
presentes en este fragmento.
23
5´
3´
(TTA)n
Figura 7. Organización estructural del gen HMGCR. Representación estructural del gen
humano de la HMGCR. Los 20 exones están representados por barras verticales. En la
parte central de la figura se muestra una ampliación del intrón 2, donde se encuentra
localizado el polimorfismo (TTA)n. Las puntas de flecha indican la posición aproximada del
par de primers para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
4.12
Secuenciación
Como control en la determinación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n en el gen
de la HMGCG se realizó la secuenciación de un templado, en este caso el templado 5 con el
partidor F, el cual correspondía a un paciente homocigoto 10/10, encontrándose que la
secuenciación contenía la repetición (TTA)n 10 veces (ver Figura 8).
CCCNATTTTCTTCTTTAAATACATGTTNATACGTTTATTGGTAAAATGCAATTTTTTTGC
CAGCTTTATTGAGGTATACTTGCACAAAATTTCTATTTTA/TTA/TTA/TTA/TTA/TTA/TTA/
TTA/TTA/TTATTGTTTTGGAGACAGAGTGNTCACTCTGCNGN
Figura 8. Secuenciación de un templado amplicado de DNA que contiene repetición
TTA. En color rojo se muestra la secuencia de repetición (TTA)10, la cual se utilizó como
control.
4.13
Análisis de resultados y estadística
Los datos se analizaron mediante los test de Chi- cuadrado o Prueba exacta de
Fisher, según lo apropiado en cada caso. Las diferencias en variables continuas se
analizaron mediante el test de Student, análisis de varianza o Kruskal Wallis. El test no
paramétrico de Kruskal Wallis se usó para determinar las diferencias de cambios desde el
basal de variables con distribución no normal. Los resultados se expresan como
promedios ± DS, para la PCRu se muestran las medianas. Se consideraron significativos
aquellos resultados con valores p < 0,05.
24
4.14
Materiales y equipos
Los equipos usados fueron: termociclador Gene Cycler Bio-Rad, Transluminador
Vilber Lourmat, cámara vertical para geles de poliacrilamida, centrífuga Heraeus Suprafuge
220, Speedvac, Centrifuga Heraeus 220, termociclador Gene Cycler Bio-Rad, Speed Vac,
transluminador Vilber Lourmat, cámara para geles de poliacrilamida Mini Protean® II Cell
Bio-Rad.
Los compuestos orgánicos e inorgánicos, sales, ácidos y solventes de calidad
analítica se adquirieron en Merck. La enzima Taq pol, Taq I, Aci I, dNTPs, MgCl2 y tampón
10x se obtuvieron de Invitrogen. Marcador de DNA escala de 100 bp, de Winkler T.
25
5.
RESULTADOS
5.1.
Genotipificación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n en el gen de la HMGCoA reductasa
Los productos de PCR correspondieron a fragmentos de 175-193 pares de bases
que contenían la repetición (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa. Este fragmento
contiene 7 alelos, de 10 a 16 repeticiones. Los pacientes se dividieron en tres categorías. El
primer grupo tenía dos alelos con más de 10 repeticiones >10/>10 (homocigoto o
heterocigoto), el segundo grupo con un alelo de más de 10 repeticiones >10/10
(heterocigoto) y el tercer grupo con los dos alelos con 10 repeticiones 10/10 (homocigoto).
La Figura 9 muestra un gel de poliacrilamida, con el polimorfismo (TTA)n del gen HMGCG,
de 8 pacientes (carriles 2 a 9).
200 pb
1
2
3
4
10/10
10/10
>10/>10
5
10/10
6
10/10
7
8
>10/>10
10/10
9
10/>10
Figura 9. Electroforesis en gel de poliacrilamida que muestra la separación de los
productos de PCR del polimorfismo (TTA)n del gen HMGCR de distintos pacientes.
Carril 1: estándar de 200pb. Carrilles 2,3,5,6 y 8 pacientes: homocigotos para ambos alelos
10/10; carriles 4 y 7: pacientes homocigotos >10/>10 y carril 9 heterocigoto >10/10.
5.2.
Pacientes del estudio
Un total de 94 pacientes se seleccionaron para ingresar a la etapa de screening en el
Centro Cardiovascular del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. De ellos, 69
cumplieron con los criterios de inclusión y 25 fueron excluidos. Las principales causas de
exclusión de pacientes fueron: niveles de LDL colesterol < 100 ó > 220mg/dL,
TG > 400mg/dL e hipotiroidismo. Sesenta y cuatro pacientes completaron el protocolo y 5 se
retiraron durante el estudio por: eventos adversos 1 paciente (1,5%), perdidos en el followup 3 pacientes (4,5%) y un 1 paciente (1,5%) por aparición de
cáncer pancreático. El
diagrama de flujo del estudio se muestra en la Figura 10. De los 64 pacientes que
completaron el tratamiento con atorvastina, 51 fueron hombres (80%) y 13 mujeres (20%).
26
Screening
n= 94
Reclutados
n= 69
Completaron estudio
n= 64
Excluidos
n= 25
cLDL<100>200mg/dL(n=19)
TG > 400 mg/dL (n=3)
Mialgias previas (n=1)
Hipotiroidismo (n=2)
Retirados
n= 5
Evento adverso (n=1)
Perdidos al follow-up (n= 5)
Patología grave (n=1)
Figura 10. Diagrama de flujo
5.2.1
Características basales de los pacientes enrolados
Las características basales de los 64 pacientes que completaron el protocolo se
resumen en la Tabla 2. Los resultados se expresan como promedio ± desviación estándar,
número de pacientes (porcentajes), o medianas (rangos). Los pacientes se dividieron en 3
categorías. El primer grupo tenía: dos alelos con más de 10 repeticiones >10/>10
(homocigoto o heterocigoto); el segundo grupo: un alelo con más de 10 repeticiones >10/10
(heterocigoto) y el tercer grupo: dos alelos con 10 repeticiones 10/10 (homocigoto).
27
Tabla 2. Características basales de los pacientes en estudio
(TTA)n >10/>10
(TTA)n >10/10
(TTA)n 10/10
(n=22)
(n=14)
(n=28)
P
66 ± 8
0,796¥
12 (86%)
23 (82%)
0,668§
76 ± 16
70 ± 13
75 ±12
0,526¥
Índice de masa corporal (Kg/m2)
Presión arterial sistólica (mm Hg)
29 ± 5
155 ± 24
26 ± 4
154 ± 28
28 ±3
149 ±22
0,227¥
0,595¥
Presión arterial diastólica (mm Hg)
88 ± 12
89 ± 18
88 ±9
0,795¥
21 (95)
13 (93)
27 (96)
0,875§
5 (23)
3 (21)
9 (32)
0,762§
Dislipidemia
22(100)
14(100)
28(100)
Fumadores
3 (14)
4 (29)
1 (4)
0,070§
Historia familiar de CC
8 (36)
4 (29)
17 (61)
0,114§
IAM previo
11 (50)
9 (64)
14 (50)
0,691§
Cirugía de bypass previa
17 (77)
8 (57)
23 (82)
0,242§
9 (41)
9 (64)
10 (36)
0,228§
2 (9)
2 (14)
3 (11)
0,886§
Enfermedad Vascular
3 (14)
6 (43)
2 (7)
0,102§
Angina estable
6 (27)
4 (29)
9 (32)
0,939§
Angina inestable
7 (32)
7 (50)
12 (43)
0,529#
13 (59)
9 (64)
14 (50)
0,649§
1 (5)
1 (7)
5 (18)
0,353§
15 (68)
7 (50)
17 (61)
0,552#
Diuréticos
5 (23)
2 (14)
11 (39)
0,216§
Antagonistas de calcio
5 (23)
2 (14)
2 (7)
0,335§
11 (50)
13 (93)
26 (93)
0,235
§
Colesterol Total (mg/dL)
206,6 ±29
229,1 ±39
213,3 ±37
0,173
¥
Colesterol LDL (mg/dL)
134,2 ±23
141,4 ±30
137,1 ±34
0,793*
Colesterol HDL (mg/dL)
40,8 ± 9
48,7 ± 17
41,1 ±10
0,342*
158,3 ±63
183,3 ±69
175,2 ±86
0,645*
2.6 (0.4 – 20.3)
1.2 (0.1 - 6.8)
2.1 (0.1 - 14.1)
0,267*
44,2 ± 20
53,1 ± 19
48,9 ±23
0,317*
64 ± 8
65 ± 9
Hombres
16 (73%)
Peso (Kg)
Edad (años)
Factores de riesgo CV:
Hipertensión
Diabetes mellitus
Etiología :
Angioplastía previa
AVE previo
Terapia crónica:
Inhibidores de la ECA
Bloqueadores de receptores de
Angiotensina (ARA II)
β-bloqueadores
Ácido acetil salicílico
Laboratorio:
Triglicéridos (mg/dL)
PCRu (mg/L)
F2-isoprostanos (pg/mL)
Valores son promedio ± DS, número de pacientes (porcentajes), o medianas (rangos). AVE: Accidente vascular encefálico, IAM. Infarto
agudo del miocardio, CC: Cardiopatía Coronaría, ECA: Enzima convertidora de angiotensina, PCRu: Proteína C reactiva ultrasensible,
¥ANOVA, *Kruskal-Wallis rank test. §Prueba exacta de Fisher, #Test Chi-cuadrado
28
Los tres grupos presentaron características basales similares, no observándose
diferencias significativas.
5.2.2. Frecuencia alélica de los pacientes participantes en el estudio
Como se mencionó anteriormente, los pacientes se dividieron en 3 categorías,
>10/>10, >10/10 y 10/10. En la Tabla 3 se muestra la distribución genotípica de los
pacientes, observándose que el 44% del total de pacientes pertenecen al genotipo 10/10.
Tabla 3. Frecuencia alélica de los pacientes
Pacientes con CC (n= 64)
(TTA)n
(TTA)n
(TTA)n
>10/>10
>10/10
10/10
N
%
N
%
N
%
22
34
14
22
28
44
CC: Cardiopatía Coronaria
5.2.3
Condiciones de los pacientes después de un año de finalizado el estudio
La Tabla 4 muestra las condiciones de los pacientes después de transcurrido un año
de la fecha en que el ultimo participante finalizo el protocolo de tratamiento. En el grupo de
pacientes que permanecen el tratamiento con atorvastatina se incluyó a aquellos que
consumían la misma atorvastatina utilizada en el estudio, LowDen® (Laboratorios Saval S.A)
o atorvastatina genérica.
Tabla 4. Condiciones de los pacientes después de un año de finalizado el estudio
(TTA)n
(TTA)n
(TTA)n
>10/>10
>10/10
10/10
(n=22)
(n=14)
(n=28)
N
Pacientes permanecen en tratamiento con
%
N
%
N
%
15
68
10
71
13
46
20
91
13
93
24
86
atorvastatina
Pacientes vivos
Pacientes con nuevos eventos CV
Pacientes en control médico
1
5*
1
8*
3
13*
16
80*
9
69*
18
75*
* cálculo realizado en base a pacientes vivos, CV: Cardiovascular
29
5.3
Lípidos plasmáticos
5.3.1
Niveles de lípidos plasmáticos basales y después de 8 semanas de tratamiento
con atorvastatina, para diferentes polimorfismos (TTA)n, en pacientes con
cardiopatía coronaria
La Tabla 5 muestra los valores plasmáticos de colesterol total, cLDL, triglicéridos y
cHDL, al inicio y después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina 40 mg/día. Los
valores plasmáticos de cLDL y colesterol total se redujeron significativamente (p < 0,0001);
de igual modo que los niveles plasmáticos de triglicéridos (p < 0,05). Estas reducciones se
observaron en todos los grupos de pacientes al aplicar la prueba t de Student para datos
pareados.
La Tabla 5 también muestra que los valores plasmáticos de cHDL no cambiaron
significativamente después del tratamiento.
Tabla 5. Valores
basales de lípidos plasmáticos y después de 8 semanas de
tratamiento
(TTA)n
(TTA)n
>10/>10
>10/10
10/10
(n=22)
(n=14)
(n=28)
(TTA)n
P
Basales
Colesterol total (mg/dL)
207±29
229±39
213±37
Colesterol LDL(mg/dL)
134±23
141±30
137±34
Colesterol HDL(mg/dL)
41 ±9
49 ±17
41 ±10
Triglicéridos (mg/dL)
158±64
183±69
175±86
8 semanas
Colesterol total (mg/dL)
133±23
155±35
141±30
<0,0001
¥
Colesterol LDL(mg/dL)
72±17
76±22
76±24
<0,0001
¥
Colesterol HDL(mg/dL)
40 ±10
46 ±15
42 ±11
NS
Triglicéridos (mg/dL)
105±36
146±91
115±62
<0,05¥
Valores son promedio ± DS.
¥ANOVA
30
La Figura 11 muestra los niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total al inicio y
después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina 40 mg/día. Los pacientes se
agruparon de acuerdo al polimorfismo (TTA)n. Los valores plasmáticos de cLDL y colesterol
total disminuyeron significativamente (p<0,0001).
Al separar los grupos por sexo se observó la misma significancia antes/después del
tratamiento.
A
*
*
B
250
C o le s te r o l to ta l (m g /d L )
*
150
*
*
*
c L D L (m g /d L )
200
100
150
100
50
0
>10/>10
>10/10
10/10
50
0
>10/>10
>10/10
10/10
Figura 11. Niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total según polimorfismo (TTA)n
en el gen de la HMGCR. Los pacientes se dividieron en tres categorías >10/>10, >10/10 y
10/10. Panel A: valores plasmáticos cLDL. Panel B: valores para colesterol total. Las barras
|negras y blancas indican los valores basales y post tratamiento, respectivamente.
Reducciones significativas después del tratamiento para todos los grupos de pacientes en
tratamiento, p< 0,0001.
5.3.2 Reducción y porcentaje de cambio desde el basal de lípidos plasmáticos,
después de 8 semanas de tratamiento,
para diferentes polimorfismos (TTA)n, en
pacientes con cardiopatía coronaria.
La Tabla 6 muestra la reducción y porcentaje de cambio de los lípidos plasmáticos
después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina 40 mg/día.
No se observaron diferencias significativas en los lípidos plasmáticos al comparar las
reducciones alcanzadas al final del tratamiento entre los tres grupos de pacientes con
diferentes polimorfismos (TTA)n, con valores de p iguales a 0,890 y 0,979 para cLDL y
colesterol total, respectivamente.
31
En relación al porcentaje de cambio en el colesterol total y cLDL, los test estadísticos
mostraron que esta respuesta no fue diferente al comparar los cambios alcanzados al final
del tratamiento entre los tres grupos de pacientes con diferentes polimorfismos (TTA)n, con
un valor de p = 0,743 para cLDL y p = 0,117 para colesterol total.
Al separar los grupos por sexo, no se observaron diferencias significativas en el
porcentaje de cambio entre los tres grupos de pacientes, para cLDL y colesterol total.
Tabla 6. Reducción y porcentaje de cambio desde el basal de los lípidos plasmáticos
Colesterol total
Promedio ± SD (mg/dL)
Porcentaje
Colesterol LDL
Promedio ± SD (mg/dL)
Porcentaje
Colesterol HDL
Promedio ± SD (mg/dL)
Porcentaje
Triglicéridos
Promedio ± SD (mg/dL)
Porcentaje
(TTA)n
(TTA)n
>10/>10
>10/10
10/10
(n=22)
(n=14)
(n=28)
-74 ± 29
-74 ± 28
-73 ± 28
0,979¥
-35,1
-32,3
-33,7
0,117*
-63 ± 22
-65 ± 25
-61 ± 24
0,890*
-46,1
-45,6
-44,5
0,743*
-0.7 ± 7
-3 ± 8
0.7 ± 6
0,216*
-1,4
-5,0
2,0
0,292*
-53 ± 55
-37 ± 60
-60 ± 71
0,759*
-27,0
-20,3
-28,7
0,667*
(TTA)n
P
*Kruskal-Wallis rank test
32
>10/>10
>10/10
10/10
0
-10
-20
-30
-40
-50
>10/>10
B
p o rc e n t a je d e c a m b io d e C T d e s d e b a s a l
p o rc e n t a je d e c a m b io d e c L D L d e s d e b a s a l
A
>10/10
10/10
0
-10
-20
-30
-40
Figura 12. Porcentaje de cambio de niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total de
acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR. En A cLDL, p = 0,743, entre los
grupos de pacientes con diferentes polimorfismos (TTA)n. En B, colesterol total (CT), p =
0,117, entre los grupos de pacientes con diferentes polimorfismos (TTA)n.
5.4
5.4.1
Proteína C reactiva ultrasensible y F-2 isoprostanos
Reducción y porcentaje de cambio de los niveles de proteína C reactiva
ultrasensible y F-2 isoprostanos después de 8 semanas de tratamiento con
atorvastatina para diferentes polimorfismos (TTA)n en pacientes con cardiopatía
coronaria.
Los cambios de PCRu y F-2 isoprostanos por atorvastatina se muestran en la Tabla
7. Al final de las 8 semanas de tratamiento, los niveles de PCRu se redujeron
significativamente para los pacientes de los grupos >10/>10 y 10/10, respectivamente (p <
0,05). El grupo de pacientes >10/10 no mostró reducción significativa.
Los niveles de F-2 isoprostanos disminuyeron significativamente en relación a los
valores basales (p <0,001).
Los test estadísticos mostraron que esta respuesta no fue diferente al comparar los
promedios y porcentajes de cambio alcanzados al final del tratamiento entre los tres grupos
de pacientes con diferentes polimorfismos (TTA)n, con un valor de p = 0,406 para PCRu y p
= 0,542 para F-2 isoprostanos.
33
Al separar los grupos por sexo se observó la misma significancia antes/después del
tratamiento para los grupos >10/>10 y 10/10, para PCRu. Para F-2 isoprostanos se muestra
la misma significancia antes/después del tratamiento para los pacientes de todos los grupos,
al separarlos por sexo.
No hubo correlación de Pearson para F-2 isoprostanos con pacientes fumadores y ex
fumadores.
Tabla 7. Reducción y porcentaje de cambio de los niveles de proteína C reactiva
ultrasensible y F2-isoprostanos
PCRu (mg/L),
mediana (rango)
F2-isoprostanos (pg/mL)
Porcentaje
(TTA) >10/>10
(n=22)
-1,2 ± 6,4
(TTA) >10/10
(n=14)
-0,3 ± 2,4
(TTA) 10/10
(n=28)
-0,9 ± 3,9
p value
0,8 (-18,2 a 19,0)
0,2 (-2,3 a 6,6)
0,5 (-11,5 a 12,5)
-21 ± 18
-23 ± 21
-25 ± 25
-41,9
-38,2
-44,9
0,406*
0,542*
Valores son promedios de cambio ± SD. Para PCRu mediana (rango. PCRu: Proteina C reactiva ultrasensible
* test Kruskal-Wallis
5.4.2
Distribución de PCRu
La Tabla 8 muestra la distribución de la PCRu antes y después del tratamiento. Los
pacientes se agruparon por polimorfismo y sub-dividieron por valores de PCRu ≥ 2 y <2
mg/L. De acuerdo al estudio PROVE IT- TIMI 22, el valor límite en el cual la PCR, aumenta
el riesgo de re-infarto o muerte por causa cardiovascular, es 2mg/L, ello justifica nuestra
clasificación. Los resultados se expresan en porcentaje de pacientes.
Tabla 8. Distribución de PCRu
(TTA)n
(TTA)n
(TTA)n
>10/>10
>10/10
10/10
(n=22)
(n=14)
(n=28)
%
%
%
≥2
<2
≥2
<2
≥2
<2
Pre- tratamiento
33
67
62
38
48
52
Post- tratamiento
57
43
15
85
70
30
Pacientes con CC (n= 64)
PCRu: Proteína C reactiva ultrasensible.
34
5.5
Índice de masa corporal y peso de los pacientes del estudio
La Figura 13 muestra los valores de índice de masa corporal (IMC) y peso de los
pacientes participantes del estudio. No se observaron cambios significativos en los tres
grupos de pacientes después del tratamiento.
B
A
30
80
70
60
20
Kg
K g /m 2
50
40
30
10
20
10
0
0
>10/>10
>10/10
10/10
>10/>10
>10/10
10/10
Figura 13. Valores de índice de masa corporal y peso de acuerdo al polimorfismo
(TTA)n en el gen de la HMGCR. Los pacientes se dividieron en tres categorías >10/>10,
>10/10 y 10/10, En A, valores de índice de masa corporal. En B, valores para peso corporal.
Barras negras y blancas indican los valores basales y post tratamiento, respectivamente
5.6
Tolerabilidad e evaluación de la seguridad en la utilización de atorvastatina,
como medicamento del estudio
No se observaron efectos adversos relacionados con el fármaco del estudio, tales
como molestias gastrointestinales, dolores musculares o efectos hepáticos. La evaluación
de la seguridad se realizó midiendo de manera basal y al final de las 8 semanas de
tratamiento los niveles plasmáticos de las enzimas hepáticas GOT y GPT y creatinina
quinasa (CK) para evaluar posibles efectos adversos a nivel muscular. Se observaron leves
aumentos de CK, GOT y GPT, que se mantuvieron dentro de los rangos normales de
laboratorio y no tuvieron significación clínica. Figura 14.
La Figura 15 muestra los niveles plasmáticos de GOT y GPT. Los pacientes se
separaron según el polimorfismo (TTA)n en el gen HMGCR.
35
A
*
B
*
150
40
C K U /L
U/L
30
20
100
50
10
0
Pre
Post
Pre
GOT
0
Post
Pre
Post
GPT
CK
Figura 14. Valores de GOT, GPT y CK. En Panel A se muestran los valores de GOT y
GPT. En Panel B se muestran los valores para CK. Las barras blancas y negras indican los
valores basales y de post tratamiento, respectivamente Hubo aumentos significativos, pero
sin significancia clínica, después del tratamiento para GOT y GPT. p< 0,05.
A
B
GOT
40
*
35
*
*
*
>10/10
10/10
30
30
25
20
U/L
U/L
GPT
*
20
15
10
10
5
0
>10/10
>10/10
10/10
0
>10/10
Figura 15. Valores de GOT y GPT de acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de la
HMGCR. En Panel A se muestran los valores de GOT. En Panel B se muestran los valores
de GPT. Las barras blancas y negras indican los valores basales y de post tratamiento,
respectivamente Hubo aumentos significativos, pero sin significancia clínica, después del
tratamiento para GOT y GPT. p< 0,05.
36
DISCUSION
En esta tesis se estudió la asociación entre la reducción del cLDL por atorvastatina y
el polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR en pacientes chilenos con cardiopatía
coronaria. También se determinaron los cambios producidos por atorvastatina sobre los
niveles de colesterol total, PCRu, F2-isoprostanos y su asociación con el polimorfismo
(TTA)n.
Los principales resultados fueron:
•
Se establecieron las frecuencias genotípicas del polimorfismos (TTA)n en el gen de
la HMG-CoA reductasa en una muestra de pacientes chilenos portadores de
cardiopatía coronaria.
•
La frecuencia genotípica del polimorfismos (TTA)n en el gen de la HMG-CoA
reductasa fue 34% para el alelo >10/>10, 22% para el alelo >10/10 y 44% para el
alelo 10/10.
•
La magnitud de la reducción de los niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total al
final de las 8 semanas de tratamiento con atorvastatina 40 mg/día, no difirieron entre
las variantes genotípicas estudiadas.
•
El tratamiento con atorvastatina 40 mg/día por 8 semanas produjo reducciones
plasmáticas de PCRu y F2-isoprostanos de una manera paralela a la disminución de
cLDL.
Las estatinas y dentro de ellas la atorvastatina, son uno de los medicamentos más
prescritos para el tratamiento de la hipercolesterolemia. Sin embargo se ha observado que
existe una marcada diferencia interindividual en su eficacia (171,172). Las variaciones
genéticas en el gen de la HMGCR, el blanco directo de las estatinas, han sido poco
estudiadas.
En la presente tesis se determinó la asociación entre la magnitud de la reducción de
los niveles plasmáticos de cLDL por atorvastatina y la presencia del polimorfismo (TTA)n en
el gen de la HMGCR, en pacientes con CC. También fueron evaluados los cambios
37
inducidos por atorvastatina sobre los niveles de colesterol total, PCRu y F2-isoprostanos y su
relación con el polimorfismo (TTA)n.
La frecuencia genotípica del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR, obtenida
en esta tesis fue diferente a la observada en otra población. El estudio de Plat y col (170)
reportaron en sujetos normales una distribución genotípica de 21% para el alelo >10/>10,
47% para el alelo >10/10 y 31% para el alelo 10/10. Sin embargo en nuestra población la
distribución genotípica fue 34%, 22% y 44% para los pacientes de los grupos >10/>10,
>10/10 y 10/10 respectivamente. Estos resultados pueden ser explicados por las diferencias
étnicas de la población.
Estudios previos han indicado que el polimorfismo (TTA)n del tipo número variable de
repeticiones en tandem (VNTR) en el gen de la HMGCR se asocia a patologías como la
cardiopatía coronaria y la hipercolesterolemia (168, 169). Además se ha reportado que este
polimorfismo ha sido estudiado en individuos que consumían ésteres de estanol,
compuestos que disminuyen la absorción de colesterol a nivel intestinal. Los resultados de
este estudio mostraron una diferencia significativa entre el polimorfismo de repeticiones
(TTA)n en el gen de la HMGCR y la absorción de colesterol en respuesta al consumo de los
esteres de estanol. (170)
En relación al efecto de atorvastatina en la disminución de los lípidos plasmáticos se
observó que todos nuestros pacientes disminuyeron significativamente los niveles
plasmáticos de cLDL y colesterol total después de 8 semanas de tratamiento con
atorvastatina 40 mg/día. Sin embargo no se encontró una relación entre la magnitud de
reducción de los niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total y la presencia de distintos
genotipos del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa.
En relación a otro polimorfismo en el gen de la HMGCR, resultados controversiales
han sido reportados. El estudio clínico PRINCE (Pravastatin Inflammation/CRP Evaluation)
describió dos variantes no codificantes que estaban en estrecho linkage disequilibrium
(SNPs 12 y 29) y que se asociaban con la magnitud de la respuesta de colesterol total y
cLDL frente al tratamiento con pravastatina. Los pacientes portadores del haplotipo
constituido por estos SNPs mostraban una menor disminución de los niveles plasmáticos de
cLDL que aquellos no portadores (173). Sin embargo la asociación entre estos SNPs en el
gen de la HMGCR y la respuesta en la reducción de cLDL no pudo ser reproducida en el
estudio de cohorte ACCESS (174). Aparte de los estudios clínicos PRINCE y el ACCESS
no hay más estudios farmacogenéticos que hayan investigado los polimorfismos en el gen
38
de la HMGCR y la respuesta a estatinas. En esta tesis se encontraron pequeñas diferencias
entre los tres grupos de pacientes de acuerdo al polimorfismo (TTA)n y la magnitud de la
reducción de los niveles plasmáticos de cLDL.
Cabe destacar que ninguno de los polimorfismos, SNPs o (TTA)n altera la función o
expresión del gen HMGCR. Las variantes SNP 12 y 29 están presentes en el intrón 5 del
gen y la repetición (TTA)n en el intrón 2 del gen de la HMGCG.
Los efectos extralipídicos de las estatinas, incluyen la mejora de la disfunción
endotelial, aumento de la biodisponibilidad del oxido nítrico, propiedades antioxidantes,
inhibición de la respuesta inflamatoria y estabilización de las placas ateroscleróticas (175).
El efecto anti-inflamatorio ha sido relacionado con la PCR, no sólo como un marcador de
inflamación, sino también como un participante activo en este proceso patológico
inflamatorio. Por otro lado, las estatinas juegan un importante rol en el estrés oxidativo, a
través de la inhibición de la producción de F-2 isoprostanos (176).
La reducción de los niveles de PCRu y F-2 isoprostanos por estatinas, en el presente
trabajo, refuerza los efectos extralipídicos de las estatinas, independientemente del
haplotipo de los pacientes. Cabe destacar además que no se encontró correlación entre los
niveles plasmáticos de cLDL y PCRu.
En conclusión no se encontró una asociación entre la magnitud de la reducción del
cLDL y colesterol total por atorvastatina y la presencia de los distintos genotipos del
polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR en estos pacientes chilenos con cardiopatía
coronaria.
Esta tesis tuvo algunas limitaciones experimentales que requieren ser consideradas.
Primero, se utilizó como tratamiento sólo una estatina, siendo ella atorvastatina, por lo que
se debe tener cuidado antes de generalizar estos datos a otras estatinas. Segundo, el
diseño del estudio no permitió la evaluación de un efecto dosis-respuesta. Se utilizó una
dosis de 40mg, que es una dosis alta, comparada con la dosis rutinariamente utilizada de
este medicamento. Por lo que se esperaba una alta respuesta en la reducción de los lípidos
plasmáticos, cabe la posibilidad de haber testeado una dosis mas baja, 10 mg que también
corresponde a un dosis utilizada en la practica clínica, habríamos obtenido una respuesta
mas pobre en la reducción de los lípidos, lo que quizás nos habría permitido observar una
respuesta diferencial en la reducción de los niveles de colesterol, dependiendo del genotipo
de cada paciente. Es por ello que futuros estudios deberían determinar si esta pequeña
39
diferencia en la reducción de colesterol entre los distintos polimorfismos, podría ser
explicada por un ajuste de dosis. Tercero, este estudio tiene un tamaño de muestra
relativamente pequeño, que si bien es cierto fue determinado estadísticamente, requiere
como cualquier estudio genético ser reproducido en un estudio prospectivo con una cohorte
de pacientes más numerosa. También cabe destacar que este estudio se realizó en
Santiago de Chile, lo que nos lleva a pensar que todos estos pacientes corresponden a una
sola étnia, ya que los apellidos de los pacientes participantes fueron todos de origen
español. Y por ultimo mencionar que este estudio farmacogenético se realizó e un sólo
centro clínico, por lo que sería de gran importancia entonces, realizar este estudio a nivel
multicéntrico, aumentando así el numero de pacientes.
Se espera que la información generada en estudios farmacogenéticos, tenga un
gran impacto en el área clínica, permitiendo en el futuro la identificación de pacientes
susceptibles de obtener el mayor beneficio y el menor riesgo durante un tratamiento
farmacológico.
40
CONCLUSIONES
1. Las frecuencias genotípicas del polimorfismos (TTA)n en el gen de la HMG-CoA
reductasa fueron:
•
34% para el grupo de pacientes con el polimorfismo (TTA)n, >10/>10
•
22% para el grupo de pacientes con el polimorfismo (TTA)n, >10/10
•
44% para el grupo de pacientes con el polimorfismo (TTA)n, 10/10
2. El tratamiento con atorvastatina 40 mg/día disminuyó significativamente los niveles
plasmáticos de cLDL y colesterol total. No se encontró asociación entre la magnitud
de la reducción del cLDL y colesterol total por atorvastatina y la presencia de los
distintos genotipos del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa.
3. El tratamiento con atorvastatina 40 mg/día redujo significativamente los niveles
plasmáticos de PCRu. No se encontró asociación entre la magnitud del cambio de la
PCRu por atorvastatina y la presencia de los distintos genotipos del polimorfismo
(TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa.
4. El tratamiento con atorvastatina 40 mg/día también disminuyó los niveles plasmáticos
de F2-isoprostanos, no encontrándose asociación entre la magnitud de la reducción
de sus niveles por atorvastatina y la presencia de los distintos genotipos del
polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa.
41
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152. Miwa S, Watcda H, Omura C, Takayanogi N, Nishiyama K, Takano Y, Omuna T,
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insulin resistance and reduction in oxidative stress in vivo by atorvastatin
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54
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some plasma lipid metabolic phenotypes in patients with coronary heart disease.
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55
171. Pazzucconi F, Dorigotti F, Gianfranceschi G, Campagnoli G, Sirtori M, Franceschini
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long term permanence of hypocholesterolemic activity. Atherosclerosis 1995; 117:
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172. Kajinami K, Takekoshi N, Brousseau M, Schaefer E. Pharmacogenetics of HMGCoA
reductase
inhibitors:
exploring
the
potential
for
genotype-based
individualization of coronary heart disease management. Atherosclerosis. 2004;
177:219-234.
173. Chasman D, Posada D, Subrahmanyan L, CookN, Stanton V, Ridker P.
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63: 672-679.
56
ANEXOS
57
ANEXO 1
EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA.
Partir de sangre total con EDTA como anticoagulante.
1.
Transferir 5 ml de sangre total (o 1 ml de concentrado leucocitario) a un tubo cónico de 15 ml
y agregar la mezcla de 5 ml de buffer TKM1 con 125
l de Triton X-100 para lisar las células.
Esta solución de lisis celular se debe calentar (55°C) previamente por 5 min para disolver
el detergente y de esta forma facilitar la interacción del tritón, TKM1 y sangre.
2.
Centrifugar a 2200 rpm. por 10 min. a temperatura ambiente.
3.
Eliminar el sobrenadante por inversión y conservar el pellet nuclear (pellet pequeño).
4.
Lavar el pellet con 5 ml de buffer TKM1. Resuspenderlo suavemente, usar una pipeta pasteur
de ser necesario.
5.
Centrifugar a 2200 rpm. por 10 min. a temperatura ambiente.
6.
Resuspender suavemente el pellet en 800
l de buffer TKM2, usar una pipeta pasteur de ser
necesario.
7.
Agregar 50 µl de SDS al 10%, mezclar bien.
8.
Incubar 10 min. a 55º C.
9.
Agregar 300 µl de NaCl 6N (saturado) y mezclar bien, hasta observar la formación de un
precipitado de proteínas.
10. Centrifugar a 3500 rpm. por 15 min. a temperatura ambiente.
11. Recolectar el sobrenadante en un tubo de 15 ml por inversión. Descartar el pellet de
proteína.
12. Agregar al sobrenadante 2 volúmenes de etanol 100% a temperatura ambiente. Invertir para
mezclar.
13. Remover el DNA precipitado con la ayuda de una punta de pipeta y transferirlo a un tubo de
1,5 ml que contiene 1 ml de etanol 70% frio (mantener en hielo).
14. Centrifugar a 12000 rpm. por 5 min. a 4º C (puede ser a temperatura ambiente).
15. Eliminar el sobrenadante, dejar secar el precipitado a temperatura ambiente por 15 a 30
minutos.
16. Resuspender el DNA en 100 a 500 µl de buffer TE PCR (Tampón Tris-EDTA pH 7.4 (TrisCl
10 mM pH 7,4, baja concentración de EDTA 0,1 mM pH 8) o en NaOH 8mM.
17. Determinar la concentración y pureza del DNA midiendo la absorbancia 260 y 280 nm
58
REACTIVOS:
TKM1
TKM2
Tris-HCl 10 mM, pH 7,6
KCl 10 mM
MgCl2 10 mM
EDTA 2 mM
Tris-HCl 10 mM, pH 7,6
KCl 10 mM
MgCl2 10 mM
EDTA 2 mM
NaCl 0,4 M
Triton X-100
SDS al 10%
NaCl 6 M. (saturado)
Etanol 100%
Etanol 70%
Para preparar los buffers TKM1 y TKM2 a partir de las soluciones concentradas:
200 ml de TKM1
2 ml
2 ml
2 ml
0.8 ml
193 ml
Tris-HCl 1 M, pH 7,6
KCl 1 M
MgCl2 1 M
EDTA 0.5 M
H2O nanopure autoclavada
50 ml de TKM2
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.2 ml
5 ml
43 ml
Tris-HCl 1 M, pH 7,6
KCl 1 M
MgCl2 1 M
EDTA 0.5 M
NaCl 4 M
H2O destilada
59
ANEXO 2
CONSENTIMIENTO INFORMADO
Centro Cardiovascular
Hospital Clínico Dr. José Joaquín Aguirre
Universidad de Chile
ESTUDIO CLÍNICO
INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO DE HMG-CoA REDUCTASA EN LA
RESPUESTA HIPOCOLESTEROLEMICA DIFERENCIAL A ESTATINAS EN
PACIENTES CON CARDIOPATÍA CORONARIA
Antecedentes: el medicamento atorvastatina está indicado en el tratamiento de los niveles elevados
de colesterol en la sangre. Actualmente se indica de rutina en pacientes con antecedentes de
enfermedad coronaria y diabéticos, incluso si ellos tienen colesterol en rangos normales. Esto se
explica por que la atorvastatina tiene otros efectos, además de reducir el colesterol, que benefician a
los pacientes con las características mencionadas.
Propósito del presente estudio: Se evaluará si hay diferencias en la magnitud de la reducción de
colesterol en la sangre, según las características genéticas de los pacientes. Se postula que esta
diferencia genética puede determinar una diferente respuesta en la reducción de colesterol. Esto es
importante por que en el futuro podríamos ajustar las dosis de los pacientes según la necesidad
individual.
Que pacientes participarán? Se invitará a participar a pacientes con antecedentes de infarto agudo
del miocardio, con antecedentes de angina estable o inestable documentada con coronariografía y
pacientes a los cuales se les ha practicado una Angioplastía ó Cirugía de revascularización coronaria
y/o pacientes con Diabetes Mellitus que no estén en tratamiento con insulina. Además los pacientes
que participen no deben haber recibido tratamiento previo con atorvastatina (u otro fármaco de este
grupo denominado estatinas) por lo menos en los dos meses previo al ingreso en este estudio.
Procedimiento y seguimiento: Si usted acepta participar, se tomarán muestra de sangre para medir
los niveles plasmáticos de colesterol LDL y proteína C reactiva que es un marcador inespecífico de
inflamación, además de exámenes generales. Estos exámenes se repetirán después de completar 8
semanas de tratamiento con 40 mg de atorvastina al día.
Necesitamos además extraer 10 ml de sangre por una vez para analizar una parte de su DNA o
material genético. Para su conocimiento el DNA es una molécula que está en todas nuestras células y
que contiene la información de las características genéticas de cada persona. La única molestia que
podría causarle la toma de muestra, es la que ocasiona el pinchazo para tomar muestra de sangre.
Este estudio no significará gastos para usted.
Seguridad del medicamento: Atorvastatina es un medicamento comercializado desde hace años en
Chile y el mundo para el tratamiento del colesterol elevado. Entre los efectos adversos se describe
que puede producir dolores musculares con una frecuencia cercana al 1%. Se han descrito también
en 0,7% de los pacientes una alteración bioquímica hepática, caracterizada por aumento de las
transaminasas. Durante el estudio se realizarán exámenes de sangre y evaluaciones médicas, para
60
detectar estas eventuales alteraciones y tomar las medidas que correspondan según la alteración
encontrada, teniendo como objetivo siempre la seguridad para el paciente.
Confidencialidad: Todos los datos que se obtengan del estudio serán absolutamente confidenciales y
su nombre no aparecerá en ningún tipo de publicación
Relevancia del estudio. Sus resultados podrían ayudar a identificar en cuales pacientes de nuestra
población es necesario utilizar dosis mayores o menores de atorvastatina para lograr el objetivo
terapéutico.
Los encargados del estudio podrán contestar sus inquietudes. Si persisten dudas adicionales durante
el curso del estudio, diríjase a los Dres. Juan Carlos Prieto (6788355) o Marcelo Llancaqueo
(6788355).
Su participación en el presente estudio es voluntaria. Usted es libre de negarse a participar sin que
se modifique en nada la calidad de su atención médica. Este estudio ha sido revisado y aprobado por
el Comité de Ética del Hospital Clínico de la Universidad de Chile.
HE LEÍDO Y ENTENDIDO ESTE CONSENTIMIENTO. MIS PREGUNTAS HAN SIDO
RESPONDIDAS Y ACEPTO PARTICIPAR EN FORMA VOLUNTARIA
Nombre del paciente: ................................................................................................
Cédula de identidad: ...................................
Firma: ........................................
Nombre del médico:
Dr.:..............................…..........................................................
Cédula de identidad: ...................................
Firma: ........................................
61
ANEXO 3
CRF. RECOLECCION DE DATOS.
INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO DE HMG-CoA REDUCTASA EN LA
RESPUESTA HIPOCOLESTEROLEMICA DIFERENCIAL A ESTATINAS EN
PACIENTES CON CARDIOPATÍA CORONARIA
CRF RECOLECCIÓN DE DATOS
NUMERO PACIENTE
INICIALES
|___|___|
|___|___||___|___|
nombre
FECHA NACIMIENTO
‰M
SEXO
‰F
apellido
|___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
62
VISITA 1 Semana -1
NUMERO PACIENTE|___|___|
FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
INICIALES PACIENTE |___|___||___|___|
Nombre
apellido
CONSENTIMIENTO INFORMADO
He informado al paciente acerca de la naturaleza, objetivo y riesgos del estudio.
El paciente ha aceptado participar en el estudio y ha firmado el consentimiento informado.
Fecha de la firma del consentimiento informado |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
CRITERIO DE INCLUSION
1.
2.
3.
4.
5.
6.
NO
SI
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
Diagnostico de cardiopatía coronaria estable, definida por:
•
Pacientes con IAM previo
•
Paciente con antecedentes de angina estable o inestable documentada con
coronariografía
•
Pacientes con Diabetes Mellitus no insulino dependiente
•
Pacientes con angioplastía previa
•
Pacientes con cirugía de revascularización coronaria previo
Hombres y Mujeres mayores de 18 años.
Colesterol LDL en ayunas en un rango de ≥100 y ≤ 220mg /dL
Triglicéridos < 400 mg/dL
Pacientes que no hayan recibido tratamiento farmacológico con estatinas a lo menos dos
meses previo al ingreso al estudio
Firma del Consentimiento informado para la participación del estudio
) Si una de las respuestas es NO, el paciente no puede participar en el estudio.
CRITERIO DE EXCLUSION
1.
2.
3.
Mujeres embarazadas, en periodo de lactancia o en edad fértil sin método
contraceptivo
Pacientes que hayan sido hospitalizados dentro de los 90 días previos al
ingreso del estudio con: síndrome coronario agudo o hayan sido sometidos a
procesos de revascularización coronaria
Pacientes con CK > 3 LNS
4.
Pacientes con hipotiroidismo TSH ≥ 1,5 LNS
5.
Diabetes Mellitus insulino dependiente
6.
Con cuadros inflamatorios o infecciosos interecurrentes
7.
Disfunción hepática y/o renal, definido por los siguientes parámetros de
laboratorio, GOT o GPT≥ 2 veces el LNS y creatinina sérica > 2.0 mg/dL.
Tratamiento con fármacos de conocida interacción con atorvastatina
8.
9.
10.
12.
Antecedentes de intolerancia o hipersensibilidad a atorvastatina
Evidencia de enfermedades gastrointestinales que limiten la absorción de los
medicamentos
Enfermedades terminales o que determinen una reducida sobrevida a corto
plazo
Pacientes con limitaciones para comprender la naturaleza del estudio
13.
Antecedentes de dependencia a alcohol o drogas
11.
) Si una de las respuestas es SI, el paciente no puede participar en el estudio.
NO
SI
NA
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
VISITA 1 Semana -1
NUMERO PACIENTE|___|___|
FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
INICIALES PACIENTE |___|___||___|___|
Nombre
apellido
DATO DEL PACIENTE
Talla
|___|,|___|___| mt
Peso
|___|___|___|,|___| Kg
FACTORES DE RIESGO CARDIOVASCULAR
‰ NO
Fuma cigarros (actualmente)
‰ SI
Si es SI, numero de cigarros/día
|___|___|___|
‰ EX fumador
Si es EX, hace cuantos años
|___|___|
Antecedentes familiares
Padre o familiar de primer grado de sexo masculino con
IAM o muerte subita antes de los 55 años
‰ NO
‰ SI
Madre o familiar de primer grado de sexo femenino con
IAM o muerte subita antes de los 65 años
‰ NO
‰ SI
Hipertensión Arterial
diagnostico
‰ NO
‰ SI
Fecha de
|___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
2
IMC( Peso/ Talla )
Sobrepeso (IMC 25-30)
Obesidad (IMC > 30)
‰ NO
‰ NO
‰ SI
‰ SI
Diabetes Mellitus tipo II
‰ NO
‰ SI
Dislipidemia
‰ NO
‰ SI
SIGNOS VITALES
Efectuar la evaluación con el paciente en posición sentado
PAS
|___|___|___| mmHg
permanezca
PAD
|___|___|___| mmHg
Se tomara una vez que el paciente
sentado por 5 minutos
Frecuencia Cardiaca
|___|___|___| latidos/min
VISITA 1 Semana -1
NUMERO PACIENTE|___|___|
FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
INICIALES PACIENTE |___|___||___|___|
Nombre
apellido
TRATAMIENTO FARMACOLOGICO EN PREVENCION SECUNDARIA
El paciente esta en tratamiento con medicamentos de prevención secundaria ?
‰ NO
calcio
‰ SI
Si es SI, especifique
‰ Aspirina
‰ IECA
‰ Antagonistas
‰β bloqueadores
‰ ARA II
PATOLOGIA / COMORBILIDAD RELEVANTE
El paciente tiene alguna patología concomitante?
Si es SI, especifique
‰ NO
‰ SI
Fecha diagnostico
Patología
1. ___________________________________________
En terapia?*
|___|___|/|___|___|
‰NO
|___|___|/|___|___|
‰NO
|___|___|/|___|___|
‰NO
|___|___|/|___|___|
‰NO
|___|___|/|___|___|
‰NO
‰SI
2. ___________________________________________
‰SI
3. ___________________________________________
‰SI
4. ___________________________________________
‰SI
5. ___________________________________________
‰SI
mm
aa
TRATAMIENTO CRONICO CONCOMITANTE
Anotar todos los medicamentos que el paciente esta actualmente consumiendo o ha consumido en los últimos 30 días
Nombre comercial
del medicamento
Número
administraciones/día
Dosis total
diaria
Indicación*
1. __________________________
_____________
______________
____________________________________________________
2. __________________________
_____________
______________
____________________________________________________
3. __________________________
_____________
______________
____________________________________________________
4. __________________________
_____________
______________
____________________________________________________
5. __________________________
_____________
______________
____________________________________________________
*
La indicación debe corresponder a una de las patologías concomitantes descritas en “PATOLOGIA
/COMORBILIDAD/RELEVANTE”
VISITA 1 Semana -1
NUMERO PACIENTE|___|___|
FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
INICIALES PACIENTE |___|___||___|___|
Nombre
apellido
EXAMEN FISICO
Normal
Anormal
Observación
1. Apariencia general
‰
‰
____________________________________________________
2. Piel
‰
‰
____________________________________________________
3. Cabeza
‰
‰
____________________________________________________
4. Ojos
‰
‰
____________________________________________________
5. Cuello
‰
‰
___________________________________________________
6. Tórax
‰
‰
___________________________________________
7. Abdomen
‰
‰
___________________________________________________
8. Extremidades
‰
‰
___________________________________________
9. Músculo esquelético
‰
‰
____________________________________________________
10. Neurológico
‰
‰
Firma Dr.
_______
Fecha
__________________________________________
|___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
VISITA 2 – Semana 0
NUMERO PACIENTE|___|___|
FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
INICIALES PACIENTE |___|___||___|___|
Nombre
apellido
EXAMENES DE LABORATORIO
Antes de la iniciación del estudio, para confirmar los criterios de exclusión.
cLDL
Fecha examen
|___|___|___| mg/dL
|___|___|/|___|___|/|___|___|
) Si ≤ 100 o ≥ 220 mg/dL el paciente no puede ser incluido
Glicemia en ayunas |___|___|___| mg/dL
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Creatinina
)
CK
Fecha examen
|___|,|___|___| mg/dL
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Si > 2 mg/dl el paciente no puede ser incluido
Fecha examen
|___|___| U/L
)
GPT
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Si > 3 respecto al limite normal superior el paciente no puede ser incluido
Fecha examen
|___|___| U/L
|___|___|/|___|___|/|___|___|
) Si ≥ 2 respecto al limite normal superior el paciente no puede ser incluido
GOT
Fecha examen
|___|___| U/L
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Dd
mm
aa
) Si ≥ 2 respecto al limite normal superior el paciente no puede ser incluido
Test de embarazo
Fecha examen
) Si es positivo el paciente no puede ser incluido
|___|___|/|___|___|/|___|___|
EXAMENES DE LABORATORIO
Efectuados en Visita 1
Colesterol total
Fecha examen
|___|___|___| mg/dL
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Colesterol HDL
Fecha examen
|___|___|___| mg/dL
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Triglicéridos
Fecha examen
|___|___|___| mg/dL
|___|___|/|___|___|/|___|___|
TSH
Fecha examen
|___|___|___| mlU/L
|___|___|/|___|___|/|___|___|
SIGNOS VITALES
Efectuar la evaluación con el paciente en posición sentado
PAS
|___|___|___| mmHg
latidos/min
Firma Dr.
PAD |___|___|___| mmHg
_______
Frecuencia Cardiaca
Fecha
|___|___|___|
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Dd
mm
aa
VISITA 3 – Semana 8
NUMERO PACIENTE|___|___|
FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
INICIALES PACIENTE |___|___||___|___|
Nombre apellido
CUMPLIMIENTO DEL TRATAMIENTO
N° comprimidos entregados
|___|___|
N° comprimidos retornados
|___|___|
Días de tratamiento
|___|___|
Cumplimiento del tratamiento
|___|___|___| %
DATOS DEL PACIENTE
Peso
Circunferencia Cintura
|___|___|___|,|___| Kg
|___|___|___| cm
SIGNOS VITALES
Efectuar la evaluación con el paciente en posición sentado
PAS
|___|___|___| mmHg
permanezca
PAD
|___|___|___| mmHg
Se tomara una vez que el paciente
sentado por 5 minutos
Frecuencia Cardiaca
|___|___|___| latidos/min
EXAMENES DE LABORATORIO
Glicemia en ayunas |___|___|___| mg/dL
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Colesterol total
|___|___|___| mg/dL
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Colesterol LDL
|___|___|___| mg/dL
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Colesterol HDL
|___|___|___| mg/dL
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Triglicéridos
|___|___|___| mg/dL
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Creatinina
|___|,|___|___| mg/dL
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___|
CK
|___|,|___|___| U/L
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___|
GOT
|___|___|___| U/L
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___|
GPT
|___|___|___| U/L
Fecha examen
|___|___|/|___|___|/|___|___
Dd
mm
aa
aa
VISITA 3 – Semana 8
NUMERO PACIENTE|___|___|
FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
INICIALES PACIENTE |___|___||___|___|
Nombre apellido
EVENTO ADVERSO
Presento algun evento adverso durante este periodo
‰ NO
‰ SI
Si es SI, especifique_________________________________________________________________________
Firma Dr.
_______
Fecha
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Dd
mm
aa
EVENTO ADVERSO
VISITA _____
NUMERO PACIENTE|___|___|
FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
INICIALES PACIENTE |___|___||___|___|
Nombre
apellido
Diagnostico (si no esta disponible describir los síntomas) _____________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________
Duración del evento
Inicio
dd
mm
‰ Leve
Intensidad
Término
|___|___|/|___|___|/|___|___|
Relación con el fármaco en estudio
|___|___|/|___|___|/|___|___|
aa
dd
‰ Moderado
mm
aa
‰ Severo
‰ Probable
‰ No- pobable
‰ Ninguna
Acción
‰ Interrupción temporal del tratamiento con el fármaco
‰ Retiro definitivo de la terapia
‰
Tratamiento
del
evento
con
medicamentos
‰ Otro, especificar ___________________________________________________
‰ Mejoría
Resultado
‰ Empeoramiento
‰ Ningun cambio
‰ Muerte
) Evento Adverso Serio*
‰ Desconocido / perdido del follow-up
Muerte
‰ NO
‰ SI
Hospitalización
‰ NO
‰ SI
Aumento del tiempo de hospitalización
‰ NO
‰ SI
Causa invalidez/incapacidad grave o prolongada
‰ NO
‰ SI
Evento adverso serio*
* Si en uno de los siguientes criterios es “SI ” enviar la información dento de las siguientes 24 horas a los Comité de
Ética correspondientes.
Firma Dr.
_______
Fecha
|___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
mm
aa
EVENTO ADVERSO
VISITA _____
NUMERO PACIENTE|___|___|
FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___|
dd
INICIALES PACIENTE |___|___||___|___|
Nombre
apellido
mm
aa