“MONOGRAFÍA SOBRE LA INFLUENCIA DE CAMPOS
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“MONOGRAFÍA SOBRE LA INFLUENCIA DE CAMPOS MAGNÉTICOS EN EL CRECIMIENTO DE E. coli Y S. cerevisiae Y LA CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FÓSFORO EN Pseudomonas sp Y Bacillus sp, DE USO INDUSTRIAL” SANDRA JOHANA HERNÁNDEZ JIMÉNEZ Cód. 1.088.288.470 ESTEFANIA LUCERO DOMÍNGUEZ TORO Cód. 1.088.293.270 UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGIA TECNOLOGIA QUÍMICA PEREIRA, RISARALDA 2014 “MONOGRAFÍA SOBRE LA INFLUENCIA DE CAMPOS MAGNÉTICOS EN EL CRECIMIENTO DE E. coli Y S. cerevisiae Y LA CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FÓSFORO EN Pseudomonas sp Y Bacillus sp, DE USO INDUSTRIAL” SANDRA JOHANA HERNÁNDEZ JIMÉNEZ Cód. 1.088.288.470 ESTEFANIA LUCERO DOMÍNGUEZ TORO Cód. 1.088.293.270 Proyecto de Grado Modalidad Monografía presentado como requisito final para optar al título de Tecnóloga Química Director de Trabajo de Grado Luis Gonzaga Gutiérrez UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGIA TECNOLOGIA QUÍMICA PEREIRA, RISARALDA 2014 Nota de aceptación -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ____________________________ Presidente del Jurado AGRADECIMIENTOS. A nuestros padres y hermanos por su apoyo incondicional, al brindarnos comprensión, recursos, tiempo, paciencia y amor. Por estar en los momentos más difíciles de nuestra vida estudiantil y animarnos con sus palabras de aliento. A nuestro Director Luis Gonzaga Gutiérrez por tan valiosa ayuda en la búsqueda de alcanzar la meta. Por ofrecernos su tiempo y asesoría en el momento que necesitábamos con paciencia. Por darnos la oportunidad de trabajar con él y adquirir nuevos conocimientos. Al profesor Fernando Areiza por su contribución a la monografía. A todos nuestros amigos, por permitirnos pasar momentos felices a su lado, aprender y recordar con cariño nuestro paso por la Universidad Tecnológica de Pereira. GLOSARIO. - Absorvancia: Medida de la intensidad de luz que absorbe la muestra a una longitud de onda establecida. - Antígeno: Sustancias como proteínas y polisacárido que desencadenan la formación de anticuerpos. - ATP: El trifosfato de adenosina es una fuente energética necesaria para todas las formas de trabajo biológico. - Campo magnético: Cargas con movimiento, paralelo a una corriente producida por otras cargas y que experimenta una fuerza perpendicular a su propia velocidad. - Carga microbiana: Número de microorganismos viables presentes en un elemento determinado. - Célula fotoeléctrica: Ánodo y cátado que convierte la energía luminosa en energía eléctrica. - Colonia bacteriana: Agrupación de microorganismos originados de una única célula y que se incrementan durante un intervalo de tiempo determinado. - Diploide: Célula somática que posee dos copias de cada cromosoma. - Densidad de Flujo magnético: Medida de la concentración de líneas de flujo en una sección puntual del circuito electromagnético. También se define como el flujo magnético por unidad de área y su unidad es el tesla. - Espectrofotómetro: Instrumento utilizado para cuantificar microorganismos y sustancias químicas al medir la longitud de onda. - Espora Bacteriana: Estructura en la que el microbio forma una capsula que protege al material genético de las condiciones adversas, como alta temperatura y escases de nutrientes. - Fimbrias: Grupo de filamentos filiformes cortos que rodean algunas bacterias gram negativas. - Flagelos peritricos: Apéndices similares a pelos sobresalientes de la pared celular. Permiten al microbio moverse y rodean toda la superficie bacteriana. - Flujo magnético: Número total de líneas de fuerza que atraviesa una superficie. La unidad del flujo magnético es el voltio segundo (Vs) o weber (Wb). - Haploide: Célula cuya dotación genética consta de solo un par de cromosomas en su núcleo. - Manitol: Azúcar derivado de la manosa o fructuosa. - Medio EMB: Medio Eosina azul de metileno, selectivo para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias gram negativas. - Meiosis: Es un proceso en que se origina cuatro gametos con la mitad de los cromosomas de la célula inicial. - Metabolitos secundarios: Mezcla de compuestos químicos que tiene distribución taxonómica restringida y se forman al terminar el crecimiento. - Mitosis: Reproducción en original. - Paramagnetismo: Característica de algunos materiales para magnetizarse al ser sometidos a la acción de un campo magnético, por lo que se imanta en el mismo sentido del campo. - Pilis: Estructura con forma de pelos, anclados a la membrana de algunas bacterias. Involucradas en la conjugación bacteriana. - Plasmólisis: Fenómeno en el que la célula pierde agua, aumentando la viscosidad intracelular y disminuye el volumen, por lo que la membrana citoplasmática se retrae. - Presión osmótica: Tipo de presión celular en la que se evita que pase solvente a través de una membrana semipermeable, al ejercer una presión mayor que la del diluyente puro. - Radicales libres: Molécula o átomo que tiene uno o más electrones desapareados y pueden existir en dicha forma. Son moléculas reactivas que producen la oxidación de las células y cambios en el ADN. la que se forman dos células idénticas a la - Transmitancia: Cantidad de luz que atraviesa un cuerpo en una determinada longitud de onda. - Telsa: Unidad para expresar la densidad del flujo magnético (B). 1 Telsa (T) = 104 Gauss RESUMEN. La estimulación magnética de microorganismos ha sido de interés investigativo debido a sus aplicaciones industriales e impacto positivo en el medio ambiente. Por ello, se ha visto como una alternativa viable para cambiar el crecimiento microbiano y la capacidad de solubilizar fósforo. Además, el crecimiento celular es el parámetro más importante en el estudio microbiológico, ya que es utilizado como base para medir la eficiencia en otras propiedades de los microorganismos, tales como el metabolismo y la producción de sustancias de interés científico y tecnológico. Por tal motivo, se describe la respuesta al campo magnético de Escherichia coli, el microorganismo más estudiado por habitar en ambientes cotidianos para el ser humano, y Saccharomyces cerevisiae con aplicaciones en la industria alimenticia. Por otra parte, los microorganismos solubilizadores de fosfatos son de gran importancia para la industria agrícola. Gracias a ellos las plantas pueden asimilar el fósforo que no logran procesar por sí mismas, ayudando así a su crecimiento. En este trabajo se profundiza en Pseudomonas sp y Bacillus sp por ser buenos solubilizadores de fósforo y por su capacidad para degradar los sustratos De ahí, que sea importante recopilar la información científica disponible, donde se describen los mecanismos por los cuales las microbios se reproducen y/o solubilizan fósforo, y la respuesta de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas sp y Bacillus sp, a campos magnéticos con densidades variables y su aplicación industrial. CONTENIDO GLOSARIO. ............................................................................................................. 5 RESUMEN. .............................................................................................................. 8 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 14 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................... 15 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................... 16 OBJETIVOS ........................................................................................................... 18 METODOLOGÍA .................................................................................................... 19 CAPITULO 1.......................................................................................................... 20 MARCO CONCEPTUAL ........................................................................................ 20 1.1 CAMPOS MAGNÉTICOS. ........................................................................ 20 1.2 CRECIMIENTO MICROBIANO. ................................................................ 24 1.2.1 Nutrientes. .......................................................................................... 24 1.2.2 Actividad del Agua.............................................................................. 25 1.2.3 Temperatura. ...................................................................................... 25 1.2.4 pH....................................................................................................... 26 1.2.5 Oxígeno. ............................................................................................. 27 1.3 CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR. ................................................... 29 1.3.1 Fase de Latencia. ............................................................................... 30 1.3.2 Fase de Crecimiento Logarítmico o Exponencial. .............................. 30 1.3.3 Fase Estacionaria............................................................................... 30 1.3.4 Fase de Declinación o Muerte Celular. ............................................. 31 1.4 TIPOS DE REPRODUCCIÓN EN MICROORGANISMOS. ...................... 31 1.4.1 REPRODUCCIÓN ASEXUAL. ........................................................... 32 9 1.4.1.1 Bipartición (división binaria). .................................................................. 32 1.4.1.2 Gemación. ............................................................................................. 33 1.4.1.3 Mitosis. .................................................................................................. 33 1.5 ALGUNOS MÉTODOS PARA MEDIR CRECIMIENTO CELULAR EN MICROORGANISMOS. ...................................................................................... 35 1.5.1 Recuento en placa. ............................................................................ 35 1.5.2 Filtración. ............................................................................................ 37 1.5.3 Número más probable (NMP). ........................................................... 37 1.5.4 Espectrofotometría y escala de Mcfarlan. .......................................... 39 1.5.5 DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS EN EL LABORATORIO. ............................................................................................. 43 1.5.5.1 1.6 MEDIDA DE LA SOLUBILIZACIÓN DE FÓSFORO. ................................ 44 1.6.1 En medio sólido: ................................................................................. 44 1.6.2 En medio líquido................................................................................. 44 1.7 SOLUBILIZACIÓN DE FÓSFORO. .......................................................... 45 1.7.1 Ciclo del Fósforo. ............................................................................... 45 1.7.2 Capacidad de solubilizar fósforo de los microorganismos. ................. 46 1.8 2 Preparación del inóculo. ........................................................................ 43 Resistencia a los Antibióticos. .................................................................. 47 CAPITULO 2 ................................................................................................... 48 ESTIMULACIÓN MAGNÉTICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO. ....................... 48 3 2.1 Escherichia coli. ........................................................................................ 48 2.2 Saccharomyces cerevisiae. ...................................................................... 54 CAPÍTULO 3. .................................................................................................. 59 ESTIMULACIÓN MAGNÉTICA Y CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FÓSFORO. ... 59 10 3.1 Pseudomonas sp. ..................................................................................... 59 3.2 Bacillus sp................................................................................................. 64 3.2.1 GENERADOR DE CAMPO MAGNÉTICO UTILIZADO PARA ESTIMULAR Bacillus substitute. ..................................................................... 67 3.3 APLICACIONES INDUSTRIALES DE ESTIMULAR MAGNETICAMENTE MICROORGANISMOS. ...................................................................................... 69 DISCUSIÓN GENERAL ......................................................................................... 70 CONCLUSIONES: ................................................................................................. 74 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 75 11 ÍNDICE DE TABLAS. Pág. TABLA 1. Resumen de factores limitantes del crecimiento en microorganismos.. .............................. 28 TABLA 2. Propagación celular ..................................................................................................................... 34 TABLA 3. NMP para calcular carga microbiana. ....................................................................................... 38 TABLA 4. Modelo de ensayo para calcular NMP. ..................................................................................... 39 TABLA 5. Número equivalente de microorganismos en la serie de tubos. ........................................... 41 TABLA 6. Proporción de reactivos para preparar la escala de McFarland. .......................................... 41 TABLA 7. Procedimientos para medir crecimiento de microorganismos ............................................... 42 TABLA 8. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente E. coli ...................... 51 TABLA 9. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente S. cerevisiae........... 57 TABLA 10. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente Pseudomonas sp.62 TABLA 11. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente Bacillus sp. ........... 68 TABLA 12. E.coli sometida a 2 mT. ............................................................................................................. 71 TABLA 13. Crecimiento de S. cerevisiae y efecto de las variables. ....................................................... 72 12 ÍNDICE DE FIGURAS. Pág. FIGURA 1. Parámetros bobina de Helmholtz. ........................................................................................... 20 FIGURA 2. Estimulación magnética usando un Solenoide. ..................................................................... 21 FIGURA 3. Imán superconductor para estimular magnéticamente S. cerevisiae. .............................. 22 FIGURA 4. Bobina para la exposición de cultivos de células. ................................................................. 23 FIGURA 5. Bobina para la exposición de cultivos de células en erlenmeyers. .................................... 23 FIGURA 6. Forma de las células bacterianas. ........................................................................................... 29 FIGURA 7. Curva de crecimiento microbiano. ........................................................................................... 31 FIGURA 8. Reproducción asexual por bipartición. .................................................................................... 32 FIGURA 9. Levadura en proceso de gemación. ........................................................................................ 33 FIGURA 10. División celular por mitosis. .................................................................................................... 34 FIGURA 11. Diluciones sucesivas. .............................................................................................................. 36 FIGURA 12. Colonias rojas de coliformes en medio Tipo-Endo que contiene lactosa........................ 37 FIGURA 13. Fundamento de espectrofotometría en crecimiento celular. ............................................. 40 FIGURA 14. Turbidez de mcfarland comparado con una solución microbiana y un tubo inocuo. ..... 41 FIGURA 15. Vista de Escherichia coli en microscopio de fuerza atómica. ........................................... 48 FIGURA 16. Reproducción de células haploide y diploide de la levadura S. cerevisiae..................... 55 FIGURA 17. Pseudomona sp con flagelos. ................................................................................................ 60 FIGURA 18. Véase el halo de fósforo solubilizado alrededor de la colonia de Pseudomonas en agar pikovskaya. ............................................................................................................................................. 60 FIGURA 19. Bacillus sp. ................................................................................................................................ 64 FIGURA 20. Influencia del campo magnético alterno, en el fondo congelación y su acción combinada en el crecimiento de Bacillus cereus: A.Es el control; B. Alternando mf; C. Acción de Bacillus cereus en frío; D. Acción del campo magnético en frío. ............................................. 66 FIGURA 21. Generador de campo magnético. .......................................................................................... 67 13 INTRODUCCIÓN El campo magnético es una propiedad física que influye en los seres vivos, por lo que, es de interés científico y tecnológico estudiar cómo actúa en microorganismos y su aprovechamiento en la industria alimentaria, agro y tratamiento de aguas, entre otros. Investigaciones fijan su atención en un parámetro importante de microbiología, el crecimiento, ya que las bacterias después de ser expuestas a campos magnéticos controlados manifiestan cambios en la reproducción celular afectando el funcionamiento del organismo expuesto, como sucede con Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. Además, la capacidad de solubilizar fósforo de bacterias que ayudan a las plantas en la asimilación del elemento también se cambia, pues experimentos realizados revelan variaciones en Pseudomonas sp y Bacillus sp. después de la magneto -estimulación. El presente trabajo discute la información científica recopilada sobre el crecimiento de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, y la capacidad de solubilizar fosfatos de Pseudomonas sp y Bacillus sp después de ser sometidos a campos magnéticos. 14 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Debido al creciente interés de la sociedad por utilizar los recursos naturales de manera más responsable, se han buscado métodos amigables con el ambiente que permitan adquirir eficiencia en procesos industriales a menor costo con intervalos de tiempo cortos. Buscar una forma de acelerar los procesos de crecimiento celular bacteriano y aumentar la capacidad de solubilizar fósforo, es una opción viable a través de la estimulación magnética de los microorganismos ya que permite obtener resultados en tiempos menores a los esperados. Por otra parte, la magneto-estimulación en ciertas dosis también tiene efecto bactericida. Por lo que su utilización puede disminuir la contaminación microbiana en alimentos, y con esto reducir la transmisión de enfermedades producidas por bacterias patógenas (Al-Zeyara et al. 2010). De manera que esta técnica tiene aplicaciones en la industria en general. En un medio en el que se deben ofrecer más alimentos y productos con cada vez menos recursos y tierra adecuada para esta actividad, condicionada además a las severas limitaciones que le impone el cambio climático, es urgente y oportuna la búsqueda de prácticas tecnológicas alternativas, que se vislumbren como eficaces y sustentables, capaces de dar salidas a las típicas de la revolución verde, incluida la fertilización por síntesis química (Patiño, 2010). El fósforo después del nitrógeno, es el nutriente inorgánico más requerido por plantas y microorganismos y además, en el suelo es el factor limitante del desarrollo vegetal a pesar de ser abundante tanto en formas inorgánicas como orgánicas. En Colombia, estimular magnéticamente microorganismos es una tarea que poco se ha investigado. Debido a que la respuesta de las bacterias al campo electromagnético es muy variable y depende directamente del tiempo e intensidad del campo magnético suministrado, es importante recopilar la información disponible, que permita tener una idea general sobre lo que es la estimulación magnética de microorganismos, que produce en el individuo y como ha sido implementado en la industria. Por tal razón, se desea discutir cómo un campo magnético controlado afecta la capacidad de crecimiento de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, y solubilización de fósforo de Pseudomonas sp y Bacillus sp. Para tal efecto esta monografía se encaminará a estudiar la influencia de campos magnéticos sobre diferentes especies de bacterias para analizar su crecimiento y solubilización de fósforo. 15 JUSTIFICACIÓN Debido a que es difícil encontrar tratamientos industriales que resulten benéficos para los recursos naturales porque la mayoría contaminan los ecosistemas, ha crecido el interés por investigaciones que conduzcan al desarrollo de prácticas ambientalmente amigables, capaces de evitar el crecimiento de bacterias patógenas, incrementar la proliferación de microorganismos de interés científico y económico, y aumentar la solubilización de fósforo (Zhang et al. 2002). Por tal motivo, Zapata et al. (2002) plantean que se deben desarrollar mecanismos posibilitadores del incremento en la reproducción celular de organismos de uso industrial, mediante estimulación magnética, permitiendo disminuir el tiempo de fermentación, aumentar rendimiento y reducir costos en la producción de alimentos, enzimas y fármacos, entre otros. Con ese fin, Ayed et al. (2007) han venido trabajando en la magneto-estimulación para cultivar con eficiencia microorganismos utilizando grupos de imanes, obteniéndose como resultado que el campo magnético ha cambiado la tasa de crecimiento y ayuda a optimizar la elaboración de productos que son capaces de fabricar (Zapata et al. 2005). Entre los microbios cultivados con este tipo de estimulación se encuentra, E. coli ampliamente analizado por su resistencia a agentes antimicrobianos y fácil duplicación (Johnson, 2011; Romero, 2007). Por otro lado, S. cerevisiae también ha sido sometida a campos magnéticos, ya que, es conocida en la elaboración de alimentos; pero además es de interés investigativo por su fácil manipulación y reproducción rápida (Blackburn, 2006). Por otro lado, el fósforo es uno de los elementos (macronutrientes) que las plantas demandan en cantidades relativamente grandes. Su importancia radica en formar parte de los fosfatos portadores de energía (ATP-ADP), fosfolípidos, ácidos nucleicos y varias coenzimas esenciales. Las plantas absorben la mayoría del fósforo como ion dihidrogenofosfato H2PO4- y pequeñas cantidades como ion hidrogenofosfato HPO42-. No obstante, la mayor parte del elemento en el suelo, aproximadamente 95-99%, se encuentra en forma de fosfatos insolubles, los cuales no pueden ser utilizados por las plantas (Kang et al. 2002). Como medida para suplir la carencia de fósforo en el suelo se ha recurrido a la aplicación de fertilizantes fosfatados. Sin embargo, una considerable cantidad de estos fertilizantes es convertida rápidamente a compuestos insolubles, lo cual no resulta útil para las plantas por terminar almacenados en el suelo (Narloch et al. 2002). Con el fin de incrementar la presencia del elemento de forma asimilable 16 para las plantas se fija la atención en Pseudomonas sp como solubilizadoras de fósforo, ya que, crecen con rapidez y tiene la habilidad de metabolizar variedad de sustratos (Ruiz, 2007). Al igual que Bacillus sp, porque posibilita la disponibilidad de fósforo soluble en el suelo y es importante en el ciclo de carbono y nitrógeno (Zuñiga et al. 2011). Como se ha dicho, resulta útil estudiar el crecimiento de bacterias de interés científico y la solubilización de fósforo de diferentes microorganismos de uso agroindustrial, después de ser sometidos a diversos campos magnéticos y analizar los beneficios de esta práctica amigable con el medio ambiente. 17 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Analizar la influencia de densidades de flujo magnético en el crecimiento de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae y en la capacidad de solubilizar fósforo de Pseudomonas sp y Bacillus sp; comparando respuestas según la información encontrada. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Discutir cómo la estimulación magnética de E. coli y S. cerevisiae interviene en el crecimiento celular, según la información científica recopilada. Discutir el efecto sobre la solubilización de fósforo, según la información científica disponible, de estimular magnéticamente a Pseudomonas sp y Bacillus sp. Evaluar la aplicación industrial de la estimulación magnética para el crecimiento de E. coli, S. cerevisiae y solubilización de fosforo de Pseudomonas sp y Bacillus sp. 18 METODOLOGÍA 1. Recolección de información: Es realizada mediante las diferentes herramientas electrónicas proporcionadas por la biblioteca de la Universidad Tecnológica de Pereira. Institución que facilita el acceso a revistas, libros y bases de datos. Además, existen diferentes buscadores académicos y sitios especializados. 2. Clasificación de la búsqueda: Determinar la cantidad de citas bibliográficas relevantes y desechar la información que no contribuye al desarrollo del trabajo. 3. Redacción monografía: Escribir de manera lógica, argumentativa y organizada, todos los aspectos involucrados con la estimulación magnética y los microorganismos en cuestión. 19 CAPITULO 1 1 1.1 MARCO CONCEPTUAL CAMPOS MAGNÉTICOS. Los campos magnéticos son generados por cargas en movimiento y medidos por la intensidad, que se define como la concentración de líneas de fuerza por centímetro cuadrado creadas en un campo magnético, y que existe en proporción a la acción del campo. La unidad de dicha intensidad es tesla y adopta ese nombre en honor al científico Nikola Tesla (Ball, 2004). La estimulación magnética puede ser desarrollada mediante una bobina de Helmholtz que consiste de dos bobinas circulares de radio R separadas por una distancia igual a su radio (Figura 1). Cada bobina está formada por espiras hechas de un hilo conductor, aislado y enrollado que produce un campo uniforme en una región situada entre las dos bobinas. Lo anterior, es obtenido gracias a que el campo magnético de cada espira se añade al de la siguiente, por lo que, es agrupado en el centro y hay incremento de la intensidad en dicho punto (Ramsden, 2006; Alcalde, 2008). En consecuencia el radio de la bobina y su separación tiene campo magnético no homogéneo, es decir, todos los puntos poseen diferente intensidad magnética, lo que hace necesario colocar las muestras que se desean estimular en el centro de la bobina donde se concentra el campo magnético. Figura 1. Parámetros Bobina de Helmholtz. (Ramsden, 2006) 20 Por otra parte, Gaafar et al. (2006) utilizo estimulación magnética implementando un solenoide. Este dispositivo es un electromagneto que produce en el interior de la bobina un campo magnético intenso y homogéneo, lo que significa que en todo el circuito magnético se genera la misma cantidad de campo. Consiste en un alambre conductor largo enrollado en forma de espiras ubicadas una junto a la otra (Figura 2), una fuente de voltaje y a veces un núcleo de hierro. (Tipler y Mosca, 2005; Enríquez, 2000). Figura 2. Estimulación magnética usando un solenoide. (Gaafar et al. 2006) Otra forma de generar campos magnéticos es mediante imanes superconductores. Consta de electroimanes con la capacidad de soportar altas dosis de electricidad y fuertes campos magnéticos uniformes y estables, difíciles de obtener por otras técnicas. En comparación con los electroimanes convencionales, los superconductores poseen ventajas, entre ellas crear magnitudes de campo grandes en el orden de 10 T, mayor eficiencia y bobinas más compactas al no necesitar canales para la circulación de refrigerantes (Ford y Freedman, 2005; Lufkin, 2000). La Figura 3 muestra el proceso implementado por Iwasaka et al. (2004) para estimular magnéticamente S. cerevisiae utilizando imanes superconductores: 21 Figura 3. Imán Superconductor para estimular magnéticamente S. cerevisiae. (Iwasaka et al. 2004) Por otro lado, debido a su composición electrolítica, los seres vivos son por lo general buenos conductores de electricidad. Además, en los sistemas biológicos existen estructuras magnéticamente influenciables como los radicales libres que presentan propiedades paramagnéticas y aquellas en las que intervienen sustancias ferromagnéticas. La respuesta de un sistema biológico a un campo magnético externo depende tanto de las propiedades magnéticas intrínsecas del sistema como de las características del campo externo y de las propiedades del medio en el cual tiene lugar el fenómeno (Heredia et al. 2003). En las últimas décadas, se ha presentado mucho interés en estudiar los posibles efectos de los campos electromagnéticos en sistemas biológicos complejos y sus aplicaciones en tratamientos, diagnósticos, monitoreo y control. Los campos magnéticos de bajas intensidades muestran diferencias significativas entre las muestras tratadas y el testigo, cuando la energía inducida por los magnetos es mayor que la energía térmica producida en el sistema durante el tratamiento (Recalde, 2013). El campo magnético puede aplicarse en la estimulación de microorganismos de interés (Figura 4 y 5). A diferencia de otros métodos es posible utilizarlo sin grandes variaciones en las líneas tecnológicas, disminuyendo así notoriamente los costos en la producción de la industria alimentaria (Barbosa et al. 2000). En diferentes lugares del mundo se ha venido estudiando la estimulación magnética de microorganismos para aumentar la fuente de biomasa, al igual que la producción de metabolitos de interés químico, farmacéutico e industrial, 22 identificando factores que estimulen su producción a gran escala (Luna et al. 2011). Figura 4. Bobina para la exposición de cultivos de células. (Úbeda et al. 2011) Figura 5. Bobina para la exposición de cultivos de células en Erlenmeyers. (Villalpanda et al. 2011) Relacionado con la estimulación magnética de microorganismos, existen antecedentes. Fojt et al. (2004) estudiaron el campo magnético con Leclercia adecarboxylata y Staphylococcus aureus resultando bajo crecimiento bacteriano, por lo que según Strasák et al. (2002) la exposición magnética tiene efecto bactericida. Además, Streptococcus mutans fue expuesta al magnetismo, mostrando disminución del crecimiento celular (Masahiro et al. 2000). En contraste, Chacón et al. (2006) observaron que en Lactococcus lactis se produjo el doble del volumen celular en presencia del campo magnético, y con respecto a 23 Streptomyces avermitilis aumentó la producción de metabolitos secundarios pero se inhibió el desarrollo morfológico del microorganismo (Mei et al. 2011). Zapata et al. (2002) atribuyeron los resultados anteriormente descritos a varios factores: posibles alteraciones en la orientación o estructura de las proteínas del microorganismo, a cambios en el flujo de iones que atraviesan la membrana plasmática al modificarse la velocidad de reproducción celular, a variaciones en la membrana lipídica y en la síntesis de ADN, produciendo como consecuencia modificaciones del crecimiento bacteriano. 1.2 CRECIMIENTO MICROBIANO. Todos los microorganismos requieren condiciones específicas para su óptimo crecimiento. Además de las necesidades nutricionales, intervienen factores externos que permiten su reproducción y que difieren para cada unicelular. Tales factores incluyen: Actividad del agua, temperatura, pH y oxígeno. (Alarcón, 2001; Tucker y Featherstone, 2011). 1.2.1 Nutrientes. Según Tortora et al. (2007) los microorganismos exigen nutrientes como carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y otros elementos que varían de un organismo a otro. Dicha característica está definida por la composición química de la célula, su estructura genética y el entorno en el que se desarrollan. Por tal razón, se encuentran en la naturaleza bacterias que pueden solubilizar fósforo, biodegradadoras de compuestos orgánicos, fijadoras de nitrógeno o por el contrario desnitrificadoras, entre otras. En consecuencia, los unicelulares convierten diferentes sustancias químicas tomadas del medio y las utilizan dependiendo de su fisiología (Alarcón, 2001). Starr et al. (2004) afirman que los mecanismos por los cuales los microorganismos obtienen nutrientes, se pueden clasificar en: quimioheterótrofas, quimioautótrofas, fotoautótrofas, fotoheterótrofas: Las bacterias Quimioheterótrofas son parásitos que adquieren energía de su huésped vivo. 24 Las Quimioautótrofas se alimentan mediante sustancias orgánicas e inorgánicas que utilizan como fuente de carbono. Las Fotoautótrofas se valen, al igual que las plantas, de la fotosíntesis para absorber energía y obtienen carbono del CO2. Las Fotoheterótrofas adquieren energía del sol, pero recibe el carbono de compuestos orgánicos que provienen de otros seres vivos. Por otro lado, la investigación de cepas bacterianas en laboratorios, ha sido posible por la implementación de medios de cultivo artificiales ricos en nutrientes que permiten el crecimiento microbiano a temperatura y pH controlados. Estos medios poseen los compuestos específicos que necesita cada tipo de microorganismo existente, por tal razón, es esencial comprender los requerimientos nutricionales del organismo en cuestión y suministrar el medio adecuado. Muestra de ello, es que Escherichia coli puede tener multiplicación celular por las siguientes fuentes de alimento: Caldo bilis verde brillante, caldo de enriquecimiento para enterobacterias, entre otros, y sucede de la misma forma para todos los microorganismos (Corry et al. 2012). 1.2.2 Actividad del Agua. Bylund (2003), asegura que el agua representa el 80-90% de la célula microbiana. Es el compuesto esencial para la proliferación de microorganismos en todo tipo de medio de cultivo, ya que, en el se encuentran disueltos los nutrientes que aquellos organismos aprovecharan de manera independiente. En ausencia de humedad es imposible que las bacterias logren sobrevivir a menos que formen esporas. La escasez de agua se produce cuando la presión osmótica se eleva, aumentando la concentración de soluto en los medios, lo que causa un choque osmótico en la bacteria, provocando la plasmólisis e influyendo negativamente en la proliferación; además, afecta las reacciones metabólicas por no disponer de la cantidad de agua necesaria (Forbes, 2009; Tortora et al. 2007). 1.2.3 Temperatura. Existen microbios en todos los ecosistemas, incluyendo aquellos ambientes que poseen temperaturas extremas como volcanes y zonas polares. Cuando el microorganismo está expuesto a temperaturas mayores a la que es capaz de 25 crecer, se afecta las funciones metabólicas de la célula, además de las proteínas y ácidos nucleídos, llevándola a inactivarse (Romero, 2007). Por tal razón, según Tortora et al. (2007) los unicelulares tienen temperatura óptima de crecimiento, es decir, en la que se manifiesta mejor su proliferación. Dicha característica permite clasificarlos en tres grupos principales: sicrófilos, mesófilos y termófilos. Para los sicrófilos la temperatura óptima está cerca de 15 ºC. Los mesófilos se propagan entre 26 y 40 ºC, siendo la mayoría de seres microscópicos responsables de enfermedades en humanos, animales y deterioro de alimentos. Los termófilos entre 50 y 60 ºC, por lo que viven en climas cálidos como aguas termales. Sin embargo, es importante resaltar que el crecimiento es menor en las temperaturas máximas y mínimas del intervalo para cada organismo. 1.2.4 pH. Determina la concentración de iones hidrógeno que posee el entorno de un microorganismo. La mayoría de las bacterias crece en pH cercano al neutro, es decir, entre 6.5 y 7.5. Por otra parte, los hongos proliferan en valores alrededor de 5. Por tal razón, se ha agrupado a los microbios según su exigencia de pH en categorías: Acidófilos. Neutrófilos. Alcalófilos o basófilos. Dicha necesidad a llevado a producir medios de cultivo que contengan la cantidad de H+ requerido para el crecimiento del organismo en cuestión, valiéndose de soluciones buffers como son las peptonas, aminoácidos y sales de fosfato (Tortora et al. 2007). 26 1.2.5 Oxígeno. El oxigeno es el elemento determinante en la reproducción celular. Su presencia establece si crecerá o no un ser microscópico, ya que, varia su requerimiento de las necesidades de cada organismo. Muestra de ello, es que no todos exigen incluir O2 en el medio para su propagación (Romero, 2007). Esta característica permite dividir los microorganismos en seis grupos: Aerobias. Estrictas y facultativas: Aerobias estrictas son las que requieren obligatoriamente de oxígeno para reproducirse, logrando generar más energía a partir de nutrientes que los microorganismos anaerobios. Por el contrario, las aerobias facultativas pueden subsistir sin presencia del compuesto al valerse de la respiración anaeróbica o mediante fermentación (Tortora et al. 2007). Anaerobias. Estrictas y facultativas: Según Montoya (2008) y Tortora et al. (2007) las anaerobias estrictas crecen en ausencia de oxígeno únicamente, pues su existencia en el medio es letal, ya que, posiblemente acumulan en el citoplasma radicales libres superóxido (O 2-) que son una forma toxica del oxígeno. Sin embargo, las anaerobias facultativas tienen la capacidad de utilizar parte del elemento que se encuentra disponible en el entorno, aunque no sea imprescindible para su supervivencia. Microaerofílicas y Capnófilos: En contraste, los microaerofílicos necesitan O2 en concentraciones menores a las requeridas por las anaerobias, porque su multiplicación se inhibe. Por otro lado, existen bacterias que requieren concentraciones elevadas de CO2 y se conocen con el nombre de capnófilos (Montoya, 2008; Tortora et al. 2007). La tabla 1 muestra un resumen general de los factores que intervienen en el crecimiento de los microorganismos. 27 Tabla 1. Resumen de factores limitantes del crecimiento en microorganismos. Fuente (Autores). CRECIMIENTO Clasificación Característica. Factor Quimioheterótrofas Quimioautótrofas Nutrientes Fotoautótrofas Fotoheterótrofas. Actividad del agua. Todos los microorganismos. Sicrófilos. Temperatura. Mesófilos. Termófilos. Acidófilos. Neutrófilos. pH. Alcalófilos o basófilos. Aerobias estrictas. Aerobias facultativas. Oxígeno. Anaerobias estrictas. Anaerobias Facultativas. 28 Los sustraen de su huésped vivo. Utilizan sustancias orgánicas e inorgánicas. Mediante la fotosíntesis y el CO2. Por fotosíntesis y otros seres vivos. 80-90% de las células. Es imposible la proliferación bacteriana en ausencia del elemento. Crecimiento óptimo a 15ºC 26 – 40 ºC 50 – 60 ºC Aunque la mayoría de microorganismos crecen en pH entre 6.5 y 7.5 existen diferentes exigencias. Necesitan obligatoriamente del elemento para vivir. Pueden sobrevivir en ausencia o presencia de O2. Únicamente crecen sin oxígeno. Proliferan en ausencia o presencia de O2. Microaerofílicas. Oxígeno. Capnófilos. 1.3 Requieran del elemento en pequeñas concentraciones. Necesitan CO2 a elevada concentración. CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR. Las procariotas utilizan reproducción asexual. Esto es, una célula madre se divide produciendo dos hijas idénticas genéticamente. Lo que lleva a concentrar miles de células en grupos llamados colonias que tienen diferencias en su color, borde, forma y superficie, características dependientes del tipo de microorganismo (Tucker y Featherstone, 2011). Además, el crecimiento permite clasificar los seres microscópicos según su forma en (Figura 6): Bacilos (alargados). Cocos (redondos). Espirilos (hélice rígida). Vibrios (coma). Espiroqueta (hélice flexible). a) Bacilos. b) Cocos. c) Espirilos. d) Vibrios. Figura 6. Forma de las células bacterianas. (Tortora et al. 2007). 29 e) Espiroqueta. Por otra parte, el proceso de multiplicación se divide en cuatro fases: latencia, exponencial, estacionaria y muerte (Figura 7), y su duración depende del microorganismo (Tucker y Featherstone, 2011). 1.3.1 Fase de Latencia. Periodo de adaptación de los microorganismos al medio que lo rodea. Aunque las células no están inactivas el número de ellas aumenta muy poco o nada y la etapa puede durar de horas a días (Negroni, 2009). Según Silva et al. (2006) y Romero (2007), durante esta fase la bacteria produce enzimas esenciales y otras sustancias que ayudan a su acoplamiento en el medio. También, incrementan su actividad metabólica y se almacena ARN y otros productos que ayudan para el metabolismo. A medida que va trascurriendo el tiempo de adaptación comienza su duplicación de manera lenta. 1.3.2 Fase de Crecimiento Logarítmico o Exponencial. Terminado el periodo de adecuación, empieza a notarse incremento de células, ya que, existen condiciones optimas de pH, temperatura y nutrientes. El crecimiento es máximo en esta etapa llegando a ser constante; por lo tanto, se genera una relación lineal entre el tiempo y el número de unidades formadas, como ilustra la Figura 5 (Negroni, 2009). Además, existe mayor producción de metabolitos, lo que la hace la fase para uso industrial. Sin embargo, cuando los microorganismos atraviesan el crecimiento exponencial, son más susceptibles a perturbarse por entornos hostiles que perjudican su reproducción (Tortora et al. 2007). 1.3.3 Fase Estacionaria. Romero (2007) y Tortora et al. (2007), aclaran que en esta fase las condiciones declinan, los nutrientes se agotan, empieza a concentrarse desechos nocivos y el pH del medio de cultivo cambia a estado ácido. Los seres microscópicos terminan muriendo al generarse un ambiente tóxico en el que solo las bacterias más fuertes logran mantenerse vivas y multiplicarse. Con esto, inicia un periodo de equilibrio entre células vivas y muertas en que los organismos viables tienen actividad metabólica lenta. 30 1.3.4 Fase de Declinación o Muerte Celular. A medida que trascurre el tiempo las condiciones empeoran cada vez más al no existir nutrientes e incrementarse los desechos tóxico. Por lo que, las bacterias no se encuentran en el ambiente propicio para seguir existiendo. Debido a su entorno, desciende el número de organismos de forma exponencial culminando en muerte total de la población (Tortora et al. 2007). Figura 7. Curva de Crecimiento Microbiano. (Tucker y Featherstone, 2011). 1.4 TIPOS DE REPRODUCCIÓN EN MICROORGANISMOS. Los seres vivos, independientemente de la especie, necesitan propagarse, debido a que es la única manera de garantizar la prolongación biológica. Tal condición obliga a que las células utilicen su capacidad de transmitir material genético a sus descendientes, produciendo seres idénticos a su antecesor (Jaramillo, 2004). Existen diferentes mecanismos por los que es posible la duplicación, a continuación se exponen algunos de ellos: 31 1.4.1 REPRODUCCIÓN ASEXUAL. Se manifiesta principalmente en organismos unicelulares como bacterias y hongos, entre otros. Consiste en la división mitótica de la célula implicada, por lo que es generado uno o varios seres genéticamente idénticos al progenitor. Todo es posible debido a que el individuo tiene la capacidad de fragmentar o desprender parte de su cuerpo que contiene material genético y desarrollar un nuevo individuo. En este tipo de reproducción no es necesaria la presencia de órganos reproductivos, esa ventaja hace que los organismos logren propagarse de forma rápida (Jaramillo, 2004). La reproducción asexual se manifiesta de las siguientes maneras: 1.4.1.1 Bipartición (división binaria). En este proceso el cromosoma de la célula madre se replica, separándose hacia extremos opuestos del individuo (Figura 8). Después crea la nueva pared entre ambas porciones de material genético, produciendo dos células que poseen cromosomas idénticos a su antecesora (Pierce, 2009). Figura 8. Reproducción asexual por bipartición. (Pierce, 2009) 32 1.4.1.2 Gemación. Tipo de reproducción frecuente en levaduras, en el que la célula desarrolla protuberancias o yemas que pasan por un periodo de alargamiento hasta desprenderse, formando así un individuo nuevo semejante al progenitor (Figura 9) (Montoya, 2008; Jaramillo, 2004). Figura 9. Levadura en proceso de Gemación. (Tortora et al. 2007). 1.4.1.3 Mitosis. Según Flores (2004) y Passarge (2009), es la división propia de las eucariotas. También conocido como cariocinesis, que genera dos células hijas genéticamente idénticas al dividirse el núcleo de forma equitativa. Se desarrolla en varias fases (Figura 10). 1. Profase: Periodo en que los cromosomas son condensados volviéndose más cortos y gruesos. Además, empieza a formarse el huso mitótico, el cual se ocupa de orientar los cromosomas hacia polos opuestos de la célula mediante los centriolos. 1. Metafase: El huso mitótico se forma totalmente como filamentos finos. Los cromosomas se unen a las fibras del huso, para ser desplazadas al plano ecuatorial de la célula. 2. Anafase: Se separa el centrómero quedando dos cromátides de cada cromosoma, que serán extraídas hacia los polos de la célula. 33 3. Telofase: El huso es desintegrado al dispersarse las fibras. Se rompe la membrana nuclear para formar dos nuevas envolturas y es dividido el citoplasma, además las cromátides llegan a sus polos. 1. Profase. 2. Metafase. Huso. Plano ecuatorial. 3. Anafase. 4. Telofase. Figura 10. División celular por mitosis. (Flores, 2004) La Tabla 2 es un resumen de los tipos de reproducción celular: 34 Tabla 2. Propagación celular. Fuente (Autores). Tipos de reproducción Celular. Una célula madre se divide en partes iguales Bipartición. produciendo dos hijas con cromosomas idénticos a la progenitora. Las células crean protuberancias que se Gemación. desprenden formando otro individuo. Tipo de reproducción en eucariotas que se divide Mitosis. en: Profase, metafase, anafase y telofase. 1.5 ALGUNOS MÉTODOS PARA MEDIR CRECIMIENTO CELULAR EN MICROORGANISMOS. El crecimiento celular es un parámetro muy importante en el estudio microbiológico. Por tal motivo, han sido creadas técnicas adecuadas, desarrolladas hace aproximadamente cien años por científicos, que posibilitan el análisis confiable de resultados (Tortora et al. 2007) obtenidos al estimular magnéticamente microorganismos. A continuación se citan algunos de ellos: 1.5.1 Recuento en placa. Es el método más utilizado. Se basa en presumir que cada célula se divide hasta formar una colonia. Según Fojt et al. (2009), en la práctica esto no es verídico, ya que, en el laboratorio se suele utilizar muestras pequeñas de colonias que son compuestas por más de una sola célula. De ahí que la técnica se reporte en UFC (Unidades Formadoras de Colonias), que se conoce como el número de bacterias vivas capaces de formar una colonia. Para garantizar la lectura correcta del número de elementos presentes en cada caja de Petri, es necesario que las colonias no se encuentren aglomeradas, pues en esas condiciones es imposible identificarlas individualmente y no se desarrollan 35 de manera adecuada. Por tal motivo, se deben implementar diluciones en soluciones estériles (Figura 11) que permiten disminuir la carga microbiana y calcular las UFC de la muestra inicial (Tortora et al. 2007). Figura 11. Diluciones sucesivas. (Tortora et al. 2007) Cada dilución requiere 9 ml de caldo estéril, a los que será adicionado 1 ml de la muestra problema, la solución es homogenizada en un tubo tapa rosca marcado como Dilución 10-1 para sembrarlo en caja de Petri (según el método deseado), igual que lo muestra la Figura 11. Posteriormente, es tomado 1 ml de la solución 10-1 para agregarlo en 9 ml de caldo contenido en un tubo de ensayo marcado como 10-2 y sembrarlo. El proceso es repetido cuantas veces necesite el analista hasta llegar a la cantidad de microorganismos viables que desee, permitiendo así su recuento adecuado. Añadido a eso, es preciso escoger un método de siembra entre las diferentes técnicas existentes, es decir, por diseminación y profundidad, donde la última es también conocida con el nombre de vertido en placa. (Tortora et al. 2007). Conjuntamente, es importante sembrar por triplicado, pues este es un método sensible porque existe muchos factores que intervienen en los resultados como: Desarrollo de colonias muy pequeñas que son pasadas por alto al realizar el recuento, además no todas se forman a la misma velocidad en idénticas condiciones de incubación (Madigan et al, 2004). 36 1.5.2 Filtración. Según Leiva (2006) este método es frecuente para determinar la carga microbiana en agua. Se utiliza una membrana estéril con poros de 0,45 m que impiden el paso de las bacterias, por lo que son retenidas en aquel filtro que posteriormente es incubado sobre un medio selectivo. La técnica permite saber si la muestra de líquido posee coliformes totales o fecales, debido a que las colonias desarrollan cierta coloración, dependiendo al medio de cultivo. Mostrando dicha característica esta el agar Endo, que posee sulfito de sodio y fucsina básica permitiendo crecer solo bacterias gram negativas, en este medio las colonias de coliformes son rosadas (Figura 12) ya que el microorganismo tiene la capacidad de fermentar lactosa. Figura 12. Colonias rojas de coliformes en medio tipo-Endo que contiene lactosa. (Leiva, 2006) 1.5.3 Número más probable (NMP). Desarrollada por la técnica de fermentación en tubos múltiples, la cual permite establecer mediante cálculos de probabilidades la presencia y cantidad de coliformes o microorganismos que no crecen en medios sólidos en una muestra dada. El método se basa en que las bacterias del compuesto a analizar, pueden separarse agitando el medio de cultivo liquido y de esa manera quedar bien distribuidas, resultando una suspensión de bacterias homogénea. Mediante diluciones seriadas es inoculada la muestra problema en tubos de ensayo estériles que contienen el medio adecuado, permitiendo así que solo en algunas diluciones crezcan bacterias. De esta manera se produce una mezcla de resultados positivos 37 y negativos que permite estimar el NMP de microorganismos presentes (Roldán y Ramírez, 2008). La Tabla 3 expresa resultados de una muestra de agua con 95% de confiabilidad, arrogados por cálculos estadísticos al observar 3 series de 5 tubos que revelan ser positivos (poseen turbiedad y/o producción de gas) o negativos (ningún cambio, por lo tanto no existe crecimiento) con respecto a la proliferación microbiana: Límite de confianza de 95 % Inferior Superior 9 56 12 65 12 67 15 77 16 80 Combinación de positivos 4-2-0 4-2-1 4-3-0 4-3-1 4-4-0 Índice de NMP/100 ml 22 26 27 33 24 5-0-0 5-0-1 5-0-2 5-1-0 5-1-1 5-1-2 23 30 40 30 50 60 9 10 20 10 20 30 86 110 140 120 150 180 5-2-0 5-2-1 5-2-2 5-3-0 5-3-1 5-3-2 50 70 90 80 110 140 20 30 40 30 40 60 170 210 250 250 300 360 Tabla 3. NMP para calcular carga microbiana. (Tortora et al. 2007). 38 Ejemplo (Tabla 4.): Para las series 1,2 y 3 existen 4, 2 y 0 tubos respectivamente, positivos (presencia de turbidez) lo que significa crecimiento celular. Por lo tanto, según la Tabla 3, el número más probable de microorganismos es de 22NMP/100ml y el 95 % de las muestras con este resultado poseen entre 9 a 56 bacterias. Tubos 1 2 3 4 5 Serie 1 Sin cambio Turbidez Turbidez Turbidez Turbidez Serie 2 Turbidez Sin cambio Turbidez Sin cambio Sin cambio Serie 3 Sin cambio Sin cambio Sin cambio Sin cambio Sin cambio Tabla 4. Modelo de ensayo para calcular NMP. (Autores) 1.5.4 Espectrofotometría y escala de Mcfarlan. Cuando los seres microscópicos se reproducen en medios líquidos, estos cultivos se tornan turbios demostrando así la propagación. Ya que la turbidez es un parámetro practico para controlar la carga microbiana, es útil implementar métodos que permitan determinar la concentración de microorganismos en medios de cultivo acuosos, que por tiempo y recursos, no es posible su recuento en placa. Por ello, se recurre al espectrofotómetro, pues permite medir con exactitud la cantidad de organismos del medio al tener una solución lo bastante turbia, es decir, que existan entre 10 a 100 millones de bacterias por cada mililitro (Tortora et al. 2007). El fotómetro mide la intensidad de una fuente luminosa que incurre sobre alguna superficie. Con microbios, el haz de luz a una longitud de onda determinada, atraviesa la solución bacteriana, por lo tanto, entre más seres se encuentran en la suspensión, menos luminosidad llegara a la célula fotoeléctrica (Figura 13). De este modo, el detector del instrumento mostrará dicho fenómeno en unidades que el observador pueda analizar, es decir, % de transmitancia o absorbancia, donde 39 la absorbancia será útil para graficar la curva de crecimiento que permite estimar la concentración de microorganismos (Tortora et al. 2007; Delgadillo et al. 2010). Figura 13. Fundamento de Espectrofotometría en crecimiento celular. (Tortora et al. 2007). Por otro lado, la turbidez estándar de 0,5 o escala de Mcfarland, mediante once alícuotas de BaCl2•2H20 y H2SO4 almacenadas en tubos de ensayo bien sellados, permite comparar la solución bacteriana motivo de análisis con parámetros ya establecidos y presumir la cantidad de microorganismos presentes (Figura 14). Se trata de una serie de tubos con turbidez definida, donde cada solución corresponde a una concentración bacteriana, por lo tanto se toman como base para establecer la carga microbiana de la solución motivo de análisis (Tabla 5). La exactitud de la escala es verificada mediante fotometría, ya que, a 625 nm la absorbancia de la turbidez 0,5 debe ser entre 0,08 - 0,1 y de esta manera se garantiza que concuerde con los valores de concentración microbiana estipulados (Perilla et al. 2004). En la Figura 14 se comparan tres tubos. El a forma parte de la turbidez estándar de Mcfarland y se confronta con b, la solución bacteriana motivo de estudio que no es traslucida porque los microorganismos cuando crecen en medio acuoso 40 producen soluciones opacas o turbias; en contraste c es un tupo inocuo, por lo que no presenta turbidez. Número de la turbidez estándar 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Densidad de bacterias aproximada correspondiente. 1x108 3 x108 6 x108 9 x108 12 x108 15 x108 18 x108 21 x108 24 x108 27 x108 30 x108 Tabla 5. Número equivalente de microorganismos en la serie de tubos. Figura 14. Turbidez de (Perilla et al. 2004) Mcfarland comparado con una solución microbiana y un tubo inocuo. Aunque en el mercado se encuentra disponible la turbidez estándar, es posible prepararla a partir de cloruro de bario al 1,175% (p/v) y acido sulfúrico 1% (p/v). Las cantidades de cada reactivo son las descritas en la Tabla 6 y pueden ser conservadas durante seis meses, siempre que no se evapore parte de la solución. Tabla 6. Proporción de reactivos para preparar la escala de Mcfarland. (Perilla et al. 2004) 41 Tabla 7. Procedimientos para medir crecimiento de microorganismos. Fuente (Autores). Técnicas para valorar crecimiento celular. Característica. Método Recuento en placa. Los resultados son reportados en UFC y el método propone que se formada una colonia por célula. Filtración. Es utilizada generalmente para recuento de coliformes en agua. Número más probable. Mezcla de tubos que mediante probabilidades permiten estimar el número microorganismos presentes en una muestra dada. Espectrofotometría. Mediante la turbidez de la suspensión bacteriana a una longitud de onda determinada es medida la cantidad de microorganismos presentes. Turbidez estándar de 0,5 o escala de Mcfarland. Serie de tubos con turbidez definida, que se comparar con los microorganismos en medio acuosos para estimar cualitativamente la concentración. 42 1.5.5 DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS EN EL LABORATORIO. 1.5.5.1 Preparación del inóculo. En un matraz con 100 ml de caldo de nutrientes se inocula con el cultivo de agar inclinado de Pikovskaya y se incuba a 30 ± 0,2 ° C durante 48 h. Las células se separaran del caldo mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 20 min, se lavan dos veces con agua destilada estéril y se resuspenden en agua destilada estéril. Esta suspensión se utiliza como inóculo. Todos los pasos se llevan a cabo en condiciones asépticas. (Ramani, 2011). Los siguientes medios de cultivo se utilizan para el aislamiento, identificación y detección de bacterias solubilizantes de fosfato: Medio de agar / caldo de Pikovskaya (g / l) Glucosa 10 g; fosfato tricálcico (TCP) 5 g; sulfato de amonio 0,5 g; cloruro de sodio 0,2 g; cloruro de potasio 0,2 g; sulfato de magnesio 0,1 g; extracto de levadura 0,5 g; sulfato de manganeso, rastrear; ferroso sulfato, traza; agar, se añaden 15 g a 1 L de agua destilada, el pH se ajusta a 7,0 ± 0,2 antes de la esterilización. Después de la esterilización se añade 50 g/ml ciclohexamida asépticamente al medio de enfriado (60 ° C) para inhibir el crecimiento de hongos (Ramani, 2011). Agar modificado de Pikovskaya: (g / l) El medio anterior se modifica mediante la adición de 4,0 ml de 0,16% de solución de azul de bromofenol (en etanol) a 1 litro del medio antes de la esterilización. Se utiliza el medio para la detección de fosfato soluble basado en la zona clara de la solubilización de fosfato alrededor de las colonias. 0,02% de NaCl en el medio de agar original del Pikovskaya se sustituye por diferentes concentraciones (0,04 a 25%) de NaCl. El pH se ajusta a 7,0 ± 0,2 antes de la esterilización (Ramani, 2011). 43 Caldo modificado de Pikovskaya: (g / l) 0,02% de NaCl en caldo de la Pikovskaya fue sustituido por diferentes concentraciones (0,02%, 0,06, 0,1%, 0,2%, 0,6% y 1%) de NaCl que tiene la CE correspondiente 2 (2,10, 2,69, 3,35, 4,91, 9,74 y 15,51 mS cm -1 , respectivamente, a 25 ° C) (Ramani, 2011). Fosfato tricálcico (TCP) se sustituye de forma individual por el fosfato ferroso (FP), fosfato de aluminio (AP) y el fosfato dicálcico (DCP) en la cantidad equivalente a 229 mg% de P2O5. TCP fue reemplazado con los fosfatos de roca (RPS) y harina de hueso (BM) en cantidad equivalente a 100 mg% de P2O5. El pH se ajusta a 7,0 ± 0,2 antes de la esterilización (Ramani, 2011). 1.6 MEDIDA DE LA SOLUBILIZACIÓN DE FÓSFORO. 1.6.1 En medio sólido: En el medio que contiene agar modificado de azul de bromofenol de Pikovskaya mediante la observación de zona clara solubilizante TCP (Fosfato tricálcico) alrededor de las colonias. Todas las placas se incuban a 28 ° C ± 0,2 ° C durante 24 h. Se mide la zona de solubilización de fosfato que rodea la colonia (halo). Tamaño de la zona clara se calcula restando diámetro de la colonia menos el diámetro total del halo. 1.6.2 En medio líquido. La actividad en caldo de Pikovskaya contiene 0,5% de TCP (Fosfato tricálcico). En un matraz que contenga 100 ml de caldo de Pikovskaya se inocula asépticamente 1,0 ml de inóculo. Medio no inoculado sirve como control y se incuba a 28 ° ± 0,2 ° C durante 21 días bajo condiciones estáticas y se agita a 12 intervalos h. 10,0 ml de medio se retira en cada tercer día y se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se analiza para determinar su contenido de agua soluble en fósforo por el método de molibdofosfórico reducida chlorostannous azul ácido 44 descrito por Jackson (1973). El pH final del medio se mide utilizando medidor de pH contra la solución tampón estándar. El experimento se lleva a cabo por triplicado. Entre los géneros bacterianos más estudiados por su capacidad para solubilizar fosfatos se encuentran: Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus, Aerobacter, Flavobacterium, Azotobacter y Erwinia observando una cantidad considerablemente mayor en la rizosfera, en comparación con el suelo no rizosferico (Kumar, 2001). Igualmente, se ha documentado la actividad fosfato solubilizadora por diferentes hongos (Pérez, 2012). Fueron seleccionadas Pseudomonas sp. y Bacillus sp. sobre la base de la tolerancia a la sal y la actividad de solubilización de fósforo con diferentes formas de fosfatos (Ramani, 2011). 1.7 SOLUBILIZACIÓN DE FÓSFORO. 1.7.1 Ciclo del Fósforo. Es el proceso de circulación del elemento en la corteza terrestre. El P se encuentra principalmente en la litosfera, también existe en huesos fósiles, rocas fosfatadas y excremento de aves. Las lluvias y los ríos disuelven el fósforo retenido en las diversas fuentes para ser asimilado por las plantas a través de las raíces. El proceso hace que el fósforo sea integrado en los ácidos nucleicos para utilizarlo en el material genético de los microorganismos. Al morir las plantas, se reintegra el fósforo al suelo como fosfato soluble por la acción de las bacterias. Sin embargo, el fósforo puede drenarse por la erosión, llegando al mar donde lo toman animales y seres humanos para consumo, o como medio para producir fertilizantes, por lo que el fósforo regresa al suelo (De la llata, 2003; Manahan, 2007). 45 1.7.2 Capacidad de solubilizar fósforo de los microorganismos. El fósforo es uno de los nutrientes inorgánicos más requeridos por plantas, ya que hace parte de las moléculas de ADN, ARN y posibilita la transferencia de energía como ATP (Barroti et al. 2001). En el suelo, el elemento limita la producción y rendimiento vegetal aunque se encuentre presente en formas inorgánicas y orgánicas, debido a que se halla en concentraciones bajas que varían de 5 y 30 mg Kg-1, tales niveles son producidos al reaccionar el fosforo del suelo con iones de Calcio, Hierro o Aluminio que provocan precipitación o fijación, disminuyendo de esta forma la disponibilidad para las plantas (Fernández et al. 2004). Además, según Peña y Cardona (2010) su disponibilidad está ligada a la naturaleza del suelo, donde una variable importante es el pH que debe ser entre 5.5 y 7.9. Los fosfatos inorgánicos aplicados como fertilizantes químicos son retenidos en el suelo y como resultado no son aprovechados por los cultivos. Por ello, se estima que la solubilización de rocas fosfatadas y de otras fuentes de fósforo inorgánico por los microorganismos del suelo es una opción para elevar la cantidad del elemento disponible para las plantas (Fernández et al. 2004). La actividad microbiana en la rizosfera es de gran transcendencia, al solubilizar los fosfatos no disponibles para la planta, los cuales se encuentran bajo formas orgánicas e inorgánicas. La habilidad para solubilizar los fosfatos se encuentra presentes en abundantes microorganismos como bacterias, levaduras, actinomycetes y hongos de vida libre que han sido relacionados con el incremento en la disponibilidad de fósforo en el suelo. Se ha estimado que entre el 10 - 50 % de la flora bacteriana existente en el suelo posee la capacidad de solubilizar fósforo, algunos de ellos con mayor eficacia como Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus y Flavobacterium (Peña y Cardona, 2010). A través de las aplicaciones de los biofertilizantes a base de microorganismos solubilizadores de fosfatos, la disponibilidad de fósforo puede incrementarse y el producto de su acción (fosfato soluble) puede ser absorbido eficientemente por las plantas (Fernández et al. 2004). El fósforo es limitante para la producción de cultivos y se ha estimado que los recursos mundiales de fosfato de roca de bajo costo pueden ser agotados para el año 2050 (Vance et al. 2003). La falta de fósforo de bajo costo ha sido reconocida como una potencial crisis futura en la agricultura. La mejora de la absorción de fósforo en las plantas y su utilización tendrá algunos impactos significativos en la agricultura y en el medio ambiente (Singh y Satyanarayana, 2011). 46 En el laboratorio es evidente que los microorganismos tienen la capacidad de solubilizar fosfato cuando el medio de cultivo presenta zonas claras, conocidas con el nombre de halos, que rodean las colonias. Sin embargo, existen organismos que no forman halos por lo que es necesario realizar pruebas cuantitativas en medio líquido (Bonilla, 2005). 1.8 Resistencia a los Antibióticos. Los antibióticos son sustancias producidas por bacterias, hongos y actinomicetos, que inhiben el crecimiento de otro microorganismo o lo elimina; son de bajo peso molecular y también se pueden obtener por síntesis química. La resistencia a esos agentes se debe a que el organismo ha desarrollado mecanismos que restan actividad al antibiótico o lo hacen inútil, por lo que disminuye su sensibilidad (Díaz et al. 2001). Según, Restrepo et al. (2003) los aspectos que hacen posible esa resistencia son: mutaciones espontaneas que afectan a los genes codificadores de la molécula ligada al antibiótico, reorganización genética u obtención de plásmidos que otra bacteria transfiere permitiendo pasar dicha resistencia de una célula medre a sus hijas. Forbes (2009) explica que la resistencia a los fármacos por parte de un microorganismo se distingue en: Intrínseca o inherente: Se presenta de forma natural, siendo parte de la estructura genética, por lo que es una característica del microorganismo. Esta particularidad hace posible identificar ciertas bacterias o grupos por tener resistencia predecible a los antibióticos. Adquirida: Es impredecible. Puede obtenerse por mutaciones o genes de otra bacteria, provocando alteraciones en la composición genética de la célula y con ello cambio en su fisiología y estructura. La disminución de la sensibilidad de algunas bacterias a los antibióticos se produce gracias a que los microorganismos poseen la capacidad de eliminar el fármaco antes de que este ejerza su acción sobre la célula, también pueden inactivar enzimáticamente el medicamento o restringir la entrada del mismo al microorganismo (Restrepo et al. 2003). Además, cuando se someten a estimulación magnética también han demostrado resistencia a los antibióticos (Ibraheim et al. 2013) 47 2 CAPITULO 2 ESTIMULACIÓN MAGNÉTICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO. 2.1 Escherichia coli. E. coli es el microorganismo mas estudiado por el ser humano. Su descubrimiento se remonta a 1885, gracias al pediatra Theodor Escherich (1857-1911) quien aisló la bacteria de las heces de uno de sus pacientes, y por tal motivo se le atribuye dicho nombre (Johnson, 2011). Se reproduce con facilidad en ambientes cotidianos para el hombre y animales tales como tierra, agua y plantas, ya que, su temperatura óptima de crecimiento se encuentra en 37ºC (Allauca, 2005), lo que la hace pertenecer al grupo de los mesófilos. Dicha característica vuelve a este bacilo un ser habitual en el intestino grueso y delgado, por ello es el microorganismo más relacionado con enfermedades gastrointestinales usuales en personas y animales (Koneman y Allen, 2008). Se identifica por ser miembro de la familia enterobacteriaceae. Es un bacilo gram negativo, aerobio facultativo que mide 1 x 2 m (Figura 15); goza de una sola cadena en espiral de ADN, se mueve mediante flagelos perítricos, no produce esporas y forma fimbrias y pilis (Sánchez y Trejo, 2006). E. coli es fermentadora de lactosa y a partir de glucosa fermenta manitol; además es positiva para indol y descarboxilasa de lisina. También, es motivo de investigación su resistencia a antimicrobianos y la capacidad de producir toxinas, fortaleza originada en los plásmidos porque contienen información genética que lo hace posible (Romero, 2007). Figura 15. Vista de Escherichia coli en Microscopio de Fuerza Atómica. (Klinth et al. 2012) 48 Para cultivar en laboratorio, es necesario a 37 ºC utilizar como medio de cultivo agar EMB, que es específico y da una tonalidad característica de este microorganismo: verde metálico brillante. Este agar es el más utilizado, ya que, contiene azul de metileno actuando como agente inhibitorio del crecimiento de bacterias gram positivas (Alarcón, 2001). Sin embargo, es capaz de crecer en muchos otros medios sintéticos como agar cromogénico, base de agar endo, agar eosina azul de metileno, caldo lactosado, entre otros (PANREAC, 2009). En lo referente a la estimulación magnética E. coli ha sido objeto de varios estudios, entre ellos se ha observado la respuesta del crecimiento del bacilo, como se describe a continuación: Según Shin-ichiro et al. (2002) y Zhang et al. (2002), E. coli fue expuesta a campos magnéticos durante el periodo de crecimiento exponencial resultando en muerte bacterial al presentarse disminución de células, en comparación con el control, por lo que, los investigadores sugieren que la estimulación ocasiona cambios en el metabolismo de la célula y varia el pH del medio Luria Bertani a básico, porque E. coli toma los aminoácidos y los transforma en sustancias como el amoniaco. Además, al afectar la proliferación del microorganismo también existe interferencia en la actividad oxido-reductiva y esa variación se incrementa a medida que aumenta el tiempo de exposición (Strasák et al. 2002). Asimismo, mediante un ensayo Fojt et al. (2004) comparan los efectos de la estimulación magnética con la viabilidad del bacilo, mediante conteo de UFC. En esta ocasión E. coli fue expuesta al campo magnético en la fase logarítmica, encontrando que el número de unidades disminuye, en equivalencia con el control, de manera exponencial al aumentar dos variables: tiempo de exposición y densidad de flujo magnético. La causa de muerte bacterial no es clara, pero se presume, se debe a posibles cambios biológicos como es la alteración en el transporte de iones y formación de radicales libres producidos por la estimulación electromagnética, además concluyeron que dicho efecto empieza desde el momento en que se enciende el campo magnético. De la misma forma, Wenjin et al. (2009) encontraron como el número de UFC se ve afectado negativamente cuando incrementa el tiempo de estimulación electromagnética y aumenta la temperatura a la que es realizado este ensayo (25 a 40 °C), produciéndose daño en la superficie de las células implicadas. Sin embargo, una vez E. coli ha logrado adaptarse al ambiente hostil, empieza a disminuir la cantidad de bacterias inhibidas. Según Filipic et al. (2012) E. coli responde dependiendo la densidad de flujo magnético, por ejemplo, a 17 mT se 49 afectó el crecimiento de manera negativa, pero a 5 y 50 mT la influencia fue menos pronunciada. Aun así, la estimulación magnética aumentó los niveles de ATP y la actividad enzimática, que se presume es manifestada al luchar E. coli por adaptarse al entorno, por la presencia del campo magnético. En otro caso, Bajpai et al. (2014) demostraron como utilizar la estimulación magnética añadiendo un sustrato con propiedades de magnetización afecta el crecimiento de esta población bacteriana, pues los resultados revelaron inhibición en un 83 % al pasar 4 h de exposición. No obstante, confirmaron que sin implementar el sustrato también se influye negativamente en la propagación de E. coli porque causa daño en su membrana desintegrándola y produciendo liberación de material intracelular (Bajpai et al. 2012). Asimismo, según Kamel et al. (2013), a 40, 80, 120 y 160 mT produce disminución de células viables y variaciones en la sensibilidad a ciertos antibióticos. Debido a los resultados, Belyaeva (2011) afirmó que tales efectos dependen directamente de las variables físicas y biológicas que forman parte del entorno que envuelve al microorganismo al ser estimulado magnéticamente. Por tal razón, E. coli disminuye la tasa de crecimiento cuando es tratada a 2 mT y con tiempos de exposición de 4,6 y 8 horas, y pasadas 24 horas el número de células bacterianas aumenta, por lo que, los investigadores opinan que el microorganismo posee capacidad de adaptarse al campo magnético (Segatore et al. 2012). Por otro lado, según la densidad de flujo magnético y tiempo de exposición será el efecto en las células expuestas. Muestra de ello, es que en algunos casos E. coli sometida a este tipo de estimulación electromagnética no han sufrido ningún tipo de transformación en su capacidad de multiplicarse como lo afirman Del Re et al. (2003). Y Según Esmekaya et al. (2013), a 2 mT y 24 horas la exposición al campo no produce ningún cambio en la viabilidad de las células, pero sí afecta su morfología al formarse poros y desintegrar la membrana. Por el contrario, Nawrotek et al. (2014) y Fijałkowski et al. (2014) encontraron que la exposición al campo magnético incrementa la reproducción celular de E. coli. Del mismo modo, un estudio realizado por Nascimento et al. (2003) mostró que la magneto-estimulación puede influir positivamente la multiplicación en presencia de glucosa, al incrementar la entrada del azúcar por la membrana celular, disminuir la fase estacionaria y aumentar el tiempo que E. coli permanece en periodo de crecimiento logarítmico. Es evidente que los resultados cambian dependiendo del campo magnético aplicado, por tal razón Babushkina et al. (2005) aseguran que utilizar frecuencias 50 bajas produce incremento de la proliferación bacteriana. También, Gaafar et al. (2006) concluyeron que el tiempo de exposición hace variar drásticamente el crecimiento de este bacilo, por lo que, depende en mucho del tiempo como factor clave. Por ello, Rodríguez et al. (2006), hallaron modificación en el crecimiento bacterial a 0,1 Tesla y 6,5 horas, al manifestarse incremento de 100 % comparándolo con el control no estimulado. En la siguiente tabla se describe la respuesta de E. coli al ser sometida a diferentes campos magnéticos: Tabla 8. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente E. coli Fuente (Autores). Autor(es) Tiempo de exposición (minutos) Temperatura (ºC) Densidad de campo magnético (mT) Medio de cultivo. Efecto sobre el crecimiento. Belyaev (2011) 15 No aplica 0,021 Caldo Luria Inhibición Bajpai et al. (2012) 30,60,120, 240 100 Medio Luria Bertani Inhibición 100 Medio Luria Bertani con hidroxiapat ita y magnetita. Inhibición 5,17,50. Medio Luria Bertani. Inhibición 10 Caldo TY y Agar nutritivo. Inhibición Bajpai et al. (2014) Filipic et al. (2012). Fojt et al. (2004) 30, 120, 240 0 -25 30 37 37 28 + 0.5 20 - 25 51 Gaafar et al. (2006) Kamel et al. (2013). Shinichiro et al. (2002) Strasak et al. (2002) Wenjin et al. (2009) Zhang et al. (2002) Del Re et al. (2003) 360 -960 1440, 2880, 4320 720 0 -12 0 -60 0 -1500 3480 2 Agar nutritivo. Inhibición 40, 80, 120, 160 Agar MacConke y y caldo nutritivo. Inhibición 5200 -6100 Medio Luria Bertani. Inhibición 20 - 25 2.7 -10 Caldo TY y Agar nutritivo. Inhibición 25 - 40 45, 450 3.500 Medio Luria Bertani. Inhibición 50,100,200, 400,600 Preparado con: Extracto de carne, peptona, extracto de levadura, Cloruro de sodio y agua destilada. Inhibición 0,1 - 1 Medio Luria Bertani. Ningún cambio 2 Medio Luria Bertani con FeCl3. Ningún cambio 37 No aplica 43 No aplica 37 Esmekaya et al. (2013) 1440 No aplica 52 1080 No aplica 25 Medio Luria Bertani. 60 No aplica 25 -34 No aplica Incremento 480 No aplica 0.5 Caldo glucosa. Incremento 30 -150 No aplica 30 No aplica Incremento 100 -1000 Agar nutritivo, peptona y extracto de carne. Incremento 2 Caldo Mueller Hinton. Incremento Babushkina et al. (2005) Incremento Fijałkowski et al. (2014) Nascimento et al. (2003) Nawrotek et al. (2014) Rodríguez et al. (2006) Segatore et al. (2012) 60 - 720 0 -24 No aplica 37 + 0.3 53 2.2 Saccharomyces cerevisiae. El género Saccharomyces fue expuesto por primera vez en 1838 por Meyer. Con el paso de los años, se han realizado cambios del mismo hasta clasificarlo en dos principales grupos: Saccharomyces sensu stricto y Saccharomyces sensu lato. La categoría sensu stricto enlaza las levaduras relacionadas con S. cerevisiae en su origen o historia evolutiva, conocido como filogenia; además este tipo de microorganismos se caracteriza por ser utilizado en la industria alimentaria. Por otra parte, el grupo sensu lato encierra todos los demás miembros del género (Fleet, 2006). Saccharomyces cerevisiae es eucariota, anaerobia facultativa, la forma de su célula es elipsoidal de aproximadamente 5 m de diámetro, posee una temperatura optima de crecimiento entre 37-40 ºC y se reproduce por gemación multilateral, más o menos cada 90 minutos. Además, la levadura puede propagarse como haploide o diploide y sufrir mitosis (Dickinson y Schweizer, 2004: Páez, 2010). Las células haploides existen de dos tipos: a y α. Para la formación de diploides (a/α) se requiere elementos haploides de ambas tipologías a y α que se conjugan entre sí cuando cada una forma protuberancias que logran fusionarse al entrar en contacto. Al llegar el momento en que los nutrientes se agotan, las células diploides atraviesan la meiosis formando cuatro esporas capaces de germinar al poseer de nuevo condiciones favorables para su crecimiento. Sin embargo, se generan como haploides, dos del tipo a y dos α (Figura 16) (Dickinson y Schweizer, 2004). La figura siguiente describe el proceso de reproducción de los tipos de células mencionadas: 54 Seudohifas. Diploide. (a/α) Fase Estacionaria. Esporulación. Conjugación. α a Fase Estacionaria. Haploide. (α) y (a) Filamentos Invasivos. (Dickinson, 2004) Figura 16. Reproducción de Células Haploide y Diploide de la Levadura S. cerevisiae (Dickinson y Schweizer, 2004) 55 S. cerevisiae puede crecer en diferentes medios de cultivo dentro del laboratorio. Con este objetivo, ha sido implementado los siguientes agares: Glucosa y patata que es útil en la identificación y recuento de la levadura en productos alimenticios, BHI, nutritivo, Maltosa Sabouraud y agar diferencial. También algunos presentados en el mercado como agar o caldo: extracto de malta para aislamiento y otros fines, Glucosa Sabouraud, entre otros (PANREAC, 2009). Por otra parte, las levaduras han sido de interés investigativo porque son eucariotas unicelulares, fáciles de manipular y con capacidad de reproducirse de maneras rápidas. Además, S. cerevisiae es extensamente estudiada por su uso en alimentos, entre ellos vino y pan, por lo que se considerada muy útil en la elaboración de diferentes tipos de víveres que enriquecen las mesas de muchos hogares (Blackburn, 2006). Esto es posible, debido a que son utilizadas sustancias de desecho que provienen de la fermentación alcohólica, tales como etanol y dióxido de carbono, y contribuyen a producir los comestibles (Tortora et al. 2007). La estimulación magnética de S. cerevisiae ha mostrado resultados variables: Novák et al. (2007) y Otabe et al. (2009), encontraron que el campo magnético además de disminuir el número de UFC, retarda el crecimiento de esta levadura cuando elimina parte de ellas, mientras otras células, se adaptan al ambiente adverso en el que se encuentran. Por ello, Iwasaka et al. (2004), afirma que la exposición al campo magnético tiene efecto bactericida. También, Markkanen et al. (2001) hallan como la radiación UV, junto con este tipo de estimulación electromagnética, tiene mayor capacidad de disminuir la cantidad de células presentes de S. cerevisiae, comparándolo con la falta de electro-estimulación. Por otro lado, según Egami et al. (2010) el efecto depende del tiempo y la intensidad del campo magnético suministrado. En vista de ello, Anton-Leberre et al. (2010) afirman que la interacción con el campo magnético a 16 T y 8 horas, no produce cambios en la forma en que se propaga S. cerevisiae o su sistema biológico. Al igual, Ruiz et al. (2004) hallan que el crecimiento de S. cerevisiae puede ejecutarse sin ninguna variación. Además, El-Gaddar et al. (2013) y Ruiz et al. (2010) concordaron que las células expuestas siguen su ciclo natural. En contraste, observaron a S. cerevisiae antes, durante y después de la estimulación magnética, concluyendo que existe un ligero incremento en la proliferación de esta levadura resultando positivo para su propagación (Motta et al. 2001). También, han implementado densidades de campo diferentes, resultando que a 20 mG (mili-Gauss) y 30 segundos de exposición magnética la 56 concentración celular aumento 30% con respecto al control (Zapata et al. 2002). Según Zapata et al. (2005), en un estudio desarrollado en Medellín, Colombia, hallaron que el cultivo de S. cerevisiae puede superar el efecto inhibitorio del campo magnético y aprovechar mejor el sustrato (miel virgen de caña), por lo que, fue observado aumento en el volumen celular en un 14%, en comparación con el control, con menor consumo de miel virgen (medido por el método antrona). Asimismo, mostrando como este tipo de estimulación magnética intensifica el número de individuos, a 25 mT se obtuvo aumento en el crecimiento de S. cerevisiae entre 8.7 a 43.1 %, concluyendo que el volumen celular depende del tiempo de exposición al campo (Oliveira et al. 2010), y con este incremento de la población, mejorar la producción de etanol (Deutmeyer et al. 2011). En la siguiente tabla se describe la respuesta de S. cerevisiae al ser sometida a diferentes campos magnéticos: Tabla 9. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente S. cerevisiae. Fuente (Autores). Autor(es) Tiempo de exposición. (minutos) Temperatura (ºC) Densidad de campo magnético (mT) Medio de cultivo. Efecto sobre el crecimiento. Egami et al. (2010) 240 No aplica 2930 Agar YPD. Inhibición 430 No aplica 120 Caldo YPD Inhibición Inhibición Markkanen et al. (2001) Novák et al. (2007) 24 24 - 26 0 -10 Caldo extracto de malta. Otabe et al. (2009) 1800 No aplica 10 Agar YPD. Inhibición 9000 -14000 Agar YPD y medio peptonaglucosa. Inhibición Iwasaka et al. (2004) 960 No aplica 57 AntonLeberre et al. (2010). 480 No aplica. 16000 Agar YEPD. Ningún cambio El-Gaddar et al. (2013) 4320 No aplica 500 Agar YEPD. Ningún cambio Ruiz et al. (2004) 1440 y 4320 23 0.35 y 2.45 Caldo YPD Ningún cambio Ruiz et al. (2010) 60 y 4320 No aplica 0.35,1.4,2.45 Caldo YPD. Ningún cambio 100 y 200 Extracto de levadura y peptona. Incremento Incremento Deutmeyer et al. (2011) 1500 No aplica Motta et al. (2001) 1440 No aplica 110 y 220 Agar Sabouraud Glucosado Oliveira et al. (2010) 480 -960 No aplica 25 -34.3 Agar YM Incremento Zapata et al. (2002) 0.5 No aplica 0.002 Agar Sabouraud Incremento Zapata et al. (2005) 3 No aplica 0.025 Agar Sabouraud. Incremento 58 3 CAPÍTULO 3. ESTIMULACIÓN MAGNÉTICA Y CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FÓSFORO. Bacterias que tienen la capacidad de solubilizar compuestos ricos en fósforo, que no está disponible para las plantas, mediante su actividad fisiológica secretan ácidos orgánicos y enzimas denominadas fosfatasas, que propician la liberación del fósforo para que las plantas puedan aprovecharlo. Además, estas bacterias tienen la facultad de promover el crecimiento vegetal a través de la síntesis de hormonas reguladoras del crecimiento, como el ácido indolacético, así como de inhibir el crecimiento e incidencia de patógenos de hábito radical, mediante la secreción de sustancias de tipo antibióticas. El estudio sobre este fenómeno ha permitido entender cómo las bacterias pueden superar la estrategia terapéutica mediante intercambio genético, generando así un aumento en la capacidad de solubilizar fósforo (Sánchez et al. 2012). 3.1 Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. es un Bacilo Gram negativo, aerobio, no formador de esporas. Puede presentar de 1.5 a 5 µm de largo y, un diámetro de 0.5 a 1 µm. Las especies de este género son móviles, debido a las presencia de 1 o más flagelos polares (Figura 17). Es oxidasa y Catalasa positiva, no fermentadores de lactosa. La mayoría de especies del género, no crecen bajo condiciones ácidas (pH 4.5 o menor). El género Pseudomonas es bien conocido por su versatilidad metabólica y plasticidad genética. Las especies de Pseudomonas, en general, crecen rápidamente y presentan habilidad para metabolizar una gran variedad de sustratos. (Ruiz, 2007). 59 Figura 17. Pseudomona sp con flagelos. (Carrión et al. 2010) P. putida es conocido por su capacidad para degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos recalcitrantes, y es por lo tanto importante para el tratamiento de aguas residuales (Ogunseitan, 1996). Figura 18. Véase el halo de fósforo solubilizado alrededor de la colonia de Pseudomonas en agar pikovskaya. (Naik et al. 2008) 60 En lo referente a estimulación magnética, según Anaya et al. (2011), al someter Pseudomonas sp. a campos magnéticos de 0.015, 0.03 y 0.06 mT y diferentes tiempos de exposición se evidencia un aumento en el crecimiento bacteriano. Pseudomonas sp. se hizo pasar por imanes para estimulación magnética de microorganismos. Recibió una inducción magnética de 0.12 T. Se inoculó una muestra de bacterias tratada en el intervalo de 0.01-0.16 T junto a antígenos de Bacillus cereus y Pseudomonas aeruginosa. El incremento de la proliferación microbiana ha permitido proponer su uso como ayudante inmunológico para la obtención de sueros policlonales antibacterianos y sugerir su empleo en otros inmunobiológicos (Martínez, 2004). Según Ibraheim et al. (2013) al someter Pseudomonas aeruginosa a un campo magnético controlado de 4 mT y 50 Hz hubo una disminución en la sensibilidad de las células expuestas a los campos magnéticos. Estos resultados indican que la viabilidad de las células tratadas durante 14 horas disminuyó en comparación con las células no expuestas causando inhibición. Se evidenció un incremento en la sensibilidad de las células estudiadas a norfloxacina y la ciprofloxacina. También las células estimuladas a 14 h se hicieron más resistentes a estos antibióticos. Todo esto indica que hay efectos del campo electromagnético utilizado en la acción del medicamento sobre la célula bacteriana a través de la inhibición de la síntesis de proteínas, síntesis de la pared celular, la transcripción de ARN y la replicación de ADN, la síntesis de proteínas y con ello aumento en la solubilización de fósforo. Por otra parte, la fuerza magnética alta en Pseudomonas aeruginosa generó sensibilidad a los antibióticos durante un corto período de tiempo (4-6 horas) y aumentó su resistencia al mismo antibiótico a largo plazo de exposición (18-20 h) mostrando, por lo tanto, efecto positivo en la capacidad del microorganismo de degradar fósforo insoluble. Además, las enzimas bacterianas como TDA (Triptófano desaminasa), GLU (glutamato), ARA (angiotensina), se efectúan por el campo magnético (Kamel et al. 2013). Segatore et al. (2012) observaron que los efectos de la exposición a campos magnéticos de baja frecuencia (2 mT; 50 Hz) sobre la tasa de crecimiento y la sensibilidad a los antibióticos de P. aeruginosa influenció significativamente la tasa de la cepa cuando se incubó en presencia de concentraciones subinhibitorias de amikacina. En particular, a las 4, 6, y 8 h de incubación el número de células disminuyó significativamente en las bacterias expuestas a 61 campos electromagnéticos y de la misma manera la solubilización de fósforo. Además, a las 24 h de incubación, el porcentaje de células de Pseudomonas aureginosa aumentó en los grupos tratados con respecto al control. En la siguiente tabla se describe la respuesta de Pseudomonas sp. al ser sometida a diferentes campos magnéticos: Tabla 10. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente Pseudomonas sp. Fuente (Autores). Autor(es) Tiempo de exposición. Temperatura (ºC) Densidad de campo magnético y frecuencia (Hz) Anaya et al. (2011) No aplica No aplica 0.015 mT 0.03 mT 0.06 mT No aplica Aumento en el crecimiento Martínez (2004) 0.3m/s 37 0.01-0.16 RPMI Aumento en el crecimiento. Caldo nutritivo Disminución de la sensibilidad y degradación de fosfato. Ibraheim et al. (2013) Kamel et al. (2013) Kamel et al. (2013) 14 h 2-20 h 4-6 h Medio de cultivo. Efecto 37 4mT 50Hz 37 400, 800, 1200 y 1600 Gauss Caldo nutritivo Disminución en el crecimiento, aumento en la fase logarítmica 37 400, 800, 1200 y 1600 Gauss Caldo nutritivo Se genera sensibilidad antibiótica 62 Kamel et al. (2013) Segatore et al. (2012) Segatore et al. (2012) 18-h 4, 6, y 8 h 24 h Caldo nutritivo Aumenta la resistencia antibiótica y la capacidad de degradar fósforo. 37 2 mT 50 Hz Caldo Mueller Hinton Disminución del número de células. Sin cambio en la actividad antibiótica. 37 2 mT 50 Hz Caldo Mueller Hinton Sin cambio en la actividad antibiótica. 400, 800, 1200 y 1600 Gauss 37 63 3.2 Bacillus sp. El género Bacillus pertenece a la familia Bacilliaceae, e incluye más de 60 especies de bacilos. Este género está formado por microorganismos bacilares Gram positivos, formadores de endosporas, quimiheterotrofos que normalmente son móviles y rodeados de flagelos periticos. Son anaerobios o aerobios facultativos, catalasa positiva. Las células bacterianas de este género tienen un amplio tamaño que varía 0,5 a 2,5 µm x 1,2-10 µm. Se encuentra comúnmente en suelos y plantas donde tienen un papel importante en ciclo del carbono y el nitrógeno (Lozada, 2010). Conjuntamente, los Bacillus formadores de esporas aerobias son quimioheterótrofos versátil. En algunas ocasiones, fermentan los hidratos de carbono en una reacción mixta que produce típicamente glicerol y butanodiol. Algunas especies, como el Bacillus megaterium, no requieren factores de crecimiento orgánico, mientras que otros pueden requerir aminoácidos, vitaminas del grupo B, o ambos. La mayoría son mesófilos, con temperatura óptima entre 30 y 45 grados, pero algunos termófilos con óptima de hasta 65 grados. Otros son psicrófilas, capaces de crecer y esporular a 0 grados. Se encuentran más en un intervalo de pH de 2 a 11. En el laboratorio, en condiciones óptimas de crecimiento, las especies de Bacillus exhiben tiempos de generación de unos 25 minutos (Kenneth, 2012) En la Figura 19 se muestran Bacillus sp. Vistos desde un microscopio. Figura 19. Bacillus sp. (Quintero, 2009) 64 Estimular magnéticamente Bacillus sp. facilito la disponibilidad de los nutrientes, algunas especies del genero Bacillus son capaces de solubilizar el fósforo contenido en compuestos no asequibles, haciéndolo disponible, mejorando por tanto, el régimen fosfórico de los suelos. Para la aplicación de esta tecnología una muestra de Bacillus sp. son sometidos al campo electromagnético de 4,0 mT con frecuencia de 25 Hz durante 2 h (Zúñiga et al. 2011). Campos magnéticos de 5.2 a 6.1 T retrasan la muerte celular en cultivos estacionarios de Bacillus subtilis (Gu et al. 2012). Según Nakamura et al. (1997) se desarrolló un biosistema imán superconductor, que puede proporcionar un campo magnético de 0,5-7 T, donde las reacciones biológicas pueden llevarse a cabo bajo condiciones de temperatura controlada. El crecimiento aeróbico Bacillus subtilis, se investigó bajo (5.2 a 6.1 T) campos magnéticos homogéneos (7 T) y no homogéneos. En la fase estacionaria, el número de células en un campo magnético no homogéneo fue aproximadamente dos veces mayor que la de la referencia no estimulada, lo que indica que la magnitud de la disminución en el número de células se redujo por el campo magnético de alta densidad. La disminución más lenta en el número de células en un campo magnético se presentó debido a la tasa de muerte más lenta de las células vegetativas. La inhibición de la formación de esporas a partir de las células vegetativas también se observó en un campo magnético, que se refleja en la reducción de la actividad de la fosfatasa alcalina. Transformadas genéticamente B. subtilis produce una mayor concentración de un antibiótico lipopéptido, surfactina, y por lo tanto aumenta la capacidad de degradar fosfato en la fase estacionaria en un campo magnético no homogéneo debido al mayor número de células alteradas en el campo magnético. Por otra parte, Gu et al. (2012) demostraron que al someter Bacillus subtilis a densidades de campo magnética altas (5.2 - 6.1T) y frecuencia de 0 -0.03 Hz se inhibió completamente el crecimiento ocasionando la muerte y con ello afectando la acción de Bacillus subtilis sobre el fósforo. Los estudios experimentales de Ramón et al. (2005) mostraron un aumento en el crecimiento de Bacillus subtilis a 800 Hz a campos magnéticos de 1 kHz con un período de 2 segundos. La intensidad del campo magnético fue de entre 0,8 y 2. 5 mT. En contraste, el grupo de Bacillus expuestas al campo magnético mostraron poca o ninguna cohesión; las células parecían estar distribuidas homogéneamente por toda la muestra. Estos resultados sugieren que los patrones de crecimiento y de degradación de fosfato de Bacillus subtilis pueden ser alterados como resultado de los efectos inducidos por el campo magnético. 65 Estudios realizados por Raichenko et al. (2012) dieron como resultado en todos los casos estudiados un retardo en el crecimiento en Bacillus cereus durante el período de 1 - 2 días, seguido de la restauración del crecimiento de la población al someterlos a un campo magnético de 30 - 50mT durante 2 a 15 minutos (Figura 20). Figura 20. Influencia del campo magnético alterno, en el fondo congelación y su acción combinada en el crecimiento de Bacillus cereus: A.es el control; B. alternando MF; C. acción de Bacillus cereus en frío; D. acción del campo magnético en frío. ( Raichenko et al. 2012) Según Jin et al. (2009) Bacillus subtilis en medio de agar nutritivo fue expuesto a campos magnéticos de 0,085 a 0,092 T durante 12h, generando resultados diferentes en cada etapa. El cultivo se comparó con el grupo de control en el campo geomagnético normal. El valor experimental de densidad óptica de este aerobio fue significativamente más alto que el del grupo de control de 3h a 9h. Sin embargo, después de 11 h, no hubo diferencia notable con respecto a los valores de densidad óptica entre los dos grupos .El contenido de oxígeno disuelto en el medio agar nutritivo sometido a estimulación magnética durante 12 h produjo un aumento del 15% en promedio y no hubo diferencia significativa en comparación con el control. Los resultados mostraron que los campos ferromagnéticos aumentaron el contenido de oxígeno disuelto en agar nutritivo significativamente. Estos hallazgos sugieren que los efectos de los campos magnéticos estáticos sobre Bacillus subtilis se relaciona con el oxígeno disuelto. 66 En una investigación realizada por Wu et al. (2007) sobre la reacción bioquímicafisiológica de Bacillus subtilis. se incubó esta bacteria bajo las intensidades de campo magnético de 100mT y 500mT. Encontrándose fermentación de carbohidratos bajo la fuerza del campo magnético de 500 mT durante 24h. 3.2.1 GENERADOR DE CAMPO MAGNÉTICO UTILIZADO PARA ESTIMULAR Bacillus substitute. Figura 21. Generador de campo magnético. (Gu et al. 2012) Este equipo se compone de dos partes: la unidad generadora de ELF- EMF (Frecuencias extremadamente bajas – Campos electromagnéticos) que contiene unas bobinas. La otra es el amplificador de corriente. Con el fin de asegurarse de que las bobinas generan ELF- EMF uniforme, la corriente eléctrica entra primero al amplificador, de manera tal que la corriente que finalmente se transporta a las bobinas es estable. La temperatura se controla a 37ºC (Gu et al. 2012). 67 En la Tabla 11 se describe la respuesta de Bacillus sp. al ser sometida a diferentes campos magnéticos: Tabla 11. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente Bacillus sp. Fuente (Autores). Autor(es) Gu et al. (2012) Zúñiga et al.(2011) Wu et al. (2007) Nakamura et al. (1997) Ramón et al. (2005) Tiempo de exposición. (minutos) 1080-1440 240 1440 No aplica 2 seg Temperatura (ºC) 37 No aplica Densidad de campo magnético y frecuencia Medio de cultivo. Efecto 5,2 - 6,1T Extracto de levadura y peptona Retrasan la muerte celular No aplica Facilitan la disponibilida d de nutrientes 100T y 500T No aplica Aumentan la capacidad para degradar ácido rojo 7T Extracto de levadura y peptona Reducción de la actividad de la fosfatasa alcalina 0,8 y 2. 5 mT y 800 Hz No aplica Alteración de los patrones de crecimiento 30 - 50mT Medio nutritivo Aumento en el crecimiento 4mT y 25 Hz No aplica 37 No aplica Raichenko et al. (2012) 2-15 37 68 3.3 APLICACIONES INDUSTRIALES DE ESTIMULAR MAGNETICAMENTE MICROORGANISMOS. En lo relacionado con campo magnético y crecimiento microbiano en la industria se cuentan con algunos informes. Hofmann (1987) plantea que debido a los múltiples resultados de inhibición, es decir, disminución del número de individuos o desactivación de los mismos, es posible implementar esta técnica para beneficio de la industria alimenticia, ya que, permite esterilizar los víveres sin alterar su sabor u otras características que incluyen las organolépticas, importantes para los consumidores. Además, el método ayudaría a desinfectar artículos plásticos, que por su composición química, no pueden ser introducidos en autoclave. Cambiando de esta manera la técnica que por décadas ha sido implementada, como método de control de bacterias contaminantes en procesos alimenticios, es decir, los productos químicos (Baruj y Tufano, 2012). También, los microorganismos estimulados magnéticamente tienen uso en biorremediación al ser mezclados con elementos o sales de Na, K, Ca, Mg, P y Cl (Bitz y Jones, 1996). Incluso en tratamiento de agua disminuye costos, al tomar una masa del líquido que contiene microbios contaminantes y exponerlo al campo magnético. Esto es posible debido a que la técnica mata los seres microscópicos existentes, por lo que, químicos tóxicos usualmente utilizados en agua, serán manejados en menor cantidad y su impacto ambiental será consecuente a dicha disminución (Sanderson, 1997). Sin embargo, aumentar el número de algunos microorganismos ha sido útil para incrementar la producción de proteínas y otras sustancias por parte del ser microscópico (Chen et al. 2010) lo que hace posible utilizarlo en agricultura (Wan-kei, 2012). La estimulación magnética de microorganismos que descomponen moléculas complejas de material orgánico facilita la absorción de elementos hacia las plantas (Zúñiga et al. 2011). De igual modo la estimulación magnética de microorganismos contribuye significativamente a la aceleración del proceso de compostaje (Santillán et al. 2010). Los tratamientos magnéticos pueden ser utilizados en la preservación de los alimentos, mejorar su calidad sensorial, propiedades reológicas y estimular procesos fermentativos. Además, es necesario profundizar en la genotoxicidad manifestada en algunos sistemas biológicos tratados con campo magnético (Anaya et al. 2011). 69 DISCUSIÓN GENERAL El crecimiento microbiano es una medida importante en microbiología porque permite analizar otras propiedades de los organismos unicelulares. Para que un microorganismo se propague requiere óptimas condiciones, su entorno debe contar con los requerimientos nutricionales, pH, agua, oxígeno y temperatura que exige el individuo, la unión de todos los componentes posibilitan la reproducción de las distintas formas de vida celular, ya sea por bipartición, gemación o mitosis. En el laboratorio es posible determinar la carga microbiana de muestras mediante técnicas creadas por científicos expertos en el tema. Esos métodos son útiles para cuantificar microorganismos estimulados magnéticamente y así establecer el impacto del campo magnético en los individuos expuestos. Los organismos responden a campos magnéticos debido a que poseen en su sistema estructuras que se magnetizan al ser expuestas al electromagnetismo. La estimulación magnética se produce implementando una bobina de Helmholtz, un solenoide o utilizando imanes superconductores. La magneto-estimulación de E.coli y S. cerevisiae son ejemplos de la influencia que tiene el campo magnético en el crecimiento de las bacterias. Es notable que el tiempo que permanece el microorganismo bajo el magnetismo, la temperatura y la intensidad de este, son factores importantes, pues de ello dependerá en gran medida el efecto del campo magnético sobre el individuo. Cuando el campo magnético produce muerte bacterial, siempre va acompañado de cambios en el entorno o la estructura del microorganismo que producen tales efectos. Después de la estimulación magnética, E. coli presenta algunas diferencias como: alteración en el transporte de iones debido a que cambia la velocidad de reproducción celular, variación del metabolismo lo que ocasiona en el medio de cultivo aumento de pH a básico afectando el crecimiento con ello, desintegración de la pared celular produciendo liberación del material interno porque se forman poros que permiten la salida del mismo. Para E. coli el ambiente se torna hostil desde el momento que se enciende el campo magnético, sin embargo, la bacteria tiene la capacidad de adaptarse al entorno difícil, por lo que a medida que transcurre el tiempo disminuye el número de bacterias inhibidas, eleva los niveles de ATP y la actividad enzimática. Someter microorganismos a campos electromagnéticos en todos los casos no produce 70 inhibición celular. También, puede ser sometida la bacteria sin ningún tipo de cambio o incrementar el número de individuos presentes hasta en 100%, porque el periodo en que la bacteria permanece en la fase estacionaria es mas largo. Por otra parte, en el caso de S. cerevisae se destacan algunos aspectos con respecto a su respuesta a la estimulación electromagnética: La levadura sometida al campo magnético sufrió inhibición del crecimiento celular, aunque tiene la capacidad de adaptarse al ambiente con magnetismo. También es notable que utilizar radiación UV y electromagnetismo para inhibir la proliferación de microorganismos es una alternativa viable, pues presenta resultados más eficaces. Al igual que E.coli, la levadura S. cerevisiae puede incrementar el volumen celular tras ser sometida a campos magnéticos, notándose aumentos de 8.7 hasta 43.1% lo que es de gran utilidad en la industria alimentaria y de etanol, pues se conoce a este organismo unicelular como ayudante en la fabricación de diferentes productos. La Tabla 12 refleja la dependencia del crecimiento con otras variables. Aunque en los tres casos E.coli fue sometida a 2 mT, el tiempo de exposición electromagnética fue diferente para cada estimulación, afectado el crecimiento de forma distinta. Tabla 12. E.coli sometida a 2 mT. Autor(es) Gaafar et al. (2006) Esmekaya et al. (2013) Segatore et al. (2012) Tiempo de exposición (minutos) Densidad de campo magnético (mT) Efecto sobre el crecimiento. 360 -960 2 Inhibición 1440 2 Ningún cambio 0 -24 2 Incremento Otro caso que confirma este hecho es el de S.cerevisiae sometida a periodos de tiempo que se relacionan, pero a diferentes densidades de flujo magnético, 71 provoco resultados distintos con respecto al crecimiento de la levadura como se observa en la Tabla 13. Tabla 13. Crecimiento de S. cerevisiae y efecto de las variables. Autor(es) Tiempo de exposición. (minutos) Densidad de campo magnético (mT) Efecto sobre el crecimiento. Iwasaka et al. (2004) 960 9000 14000 Inhibición AntonLeberre et al. (2010). 480 16000 Ningún cambio Oliveira et al. (2010) 480 -960 25 -34.3 Incremento Por otro lado, el fósforo soluble es un elemento esencial para las plantas ya que restringe la producción de los cultivos, por ello, el suelo se vale del ciclo del P para recircular el nutriente. Existen bacterias solubilizadoras de fosfatos que tienen la capacidad de producir sustancias antibióticas, por lo tanto esas propiedades están relacionadas. Cuando Pseudomonas sp. es sometida a la estimulación magnética incrementa su resistencia a los antibióticos, concluyendo que su capacidad de solubilizar fósforo aumenta. También se presenta el caso contrario, disminución de la oposición al agente, notando que todos los resultados van ligados al tiempo y la intensidad de campo magnético suministrado. La exposición magnética de colonias del género Bacillus sp. a demostrado el doble de crecimiento de la bacteria comparándolo con el microorganismo no estimulado, produciendo mayor concentración de antibióticos, en consecuencia superior capacidad de solubilizar el fósforo para ser asimilado por las plantas, revelando que el campo magnético altera esta propiedad en Bacillus sp. Muestra de ello es que la magneto – estimulación produce que el bacilo tenga una fase de muerta más lenta, aunque inhibe la formación de endosporas En la industria es posible aprovechar la estimulación magnética de microorganismos. Implementarlo en el sector alimenticio es viable debido a que 72 produce inhibición celular, por lo que los microorganismos no contaminaran los alimentos. Además, utilizarlo para esterilizar artículos que no pueden ser sometidos a altas temperaturas ahorraría parte del dinero invertido en utensilios microbiológicos desechables u otros elementos que deben mantenerse inocuos. Otras ventajas de la técnica es que disminuye el impacto negativo de los productos químicos en el medio ambiente, pues los agentes tóxicos serán utilizados en menor medida al ser remplazados por la electroestimulación; también los microorganismos estimulados pueden ayudar a la absorción de nutrientes de las plantas para la industria agro. 73 CONCLUSIONES: Según la información científica encontrada es posible implementar una gama amplia de densidades de flujo magnético y tiempos de exposición al campo, que permiten producir resultados variables con respecto a la multiplicación celular de microorganismos. Sin embargo, identificar la mejor respuesta a la estimulación magnética depende de lo que pretendemos al utilizar la técnica, es decir, inhibición o incremento del volumen microbiano como se evidenció en E. coli y Saccharomyces cerevisiae. Evitar el crecimiento de agentes patógenos en la industria alimentaria, tratamiento de aguas y diversos sectores de producción, es de interés internacional, ya que, controlar este tipo de contaminación permite frenar la propagación de enfermedades por tener efecto bactericida. Por otro lado, incrementar el volumen celular permite aprovechar la actividad metabólica de diversos microorganismos de uso industrial, lo que sucede con Saccharomyces cerevisiae, pues implementar el método aumentará la producción de sustancias de interés semejantes a etanol. Además, en biorremediación es posible beneficiarse de microbios degradadores de compuestos contaminantes, permitiendo recuperar hectáreas de suelo para agricultura. Al someter microorganismos solubilizadores de fósforo como Pseudomonas sp. y Bacillus sp. a campos magnéticos controlados se puede mejorar su capacidad de degradación y metabolización, ayudando así a mejorar los procesos de compostaje y a la disponibilidad de fósforo para el metabolismo de las plantas. La solubilización de fósforo en casi todas las circunstancias, se encuentra ligado al metabolismo y el crecimiento. Una de las dificultades experimentales en estudios de crecimiento es discernir condiciones relacionadas con el metabolismo. El uso de campos magnéticos puede modificar la actividad antibiótica que poseen los microorganismos, siendo así una alternativa viable para ayudar a la producción de fármacos. 74 BIBLIOGRAFÍA Anaya, M; Guzmán, T y Acea, C. (2011). El campo magnético aplicado a la industria alimentaria. Argentina: Publitec. 10. Anton-Leberre, V; Haanappel, E; Marsaud, N; Trouilh, L; Benbadis, L; Boucherie, H; Massou, S y François, J. (2010). 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