Biotecnología Vegetal 2010 Transformación
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Biotecnología Vegetal 2010 Transformación Introducción de ADN foráneo en células vegetales Sistemas basados en vectores biológicos • Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes • Sistemas basados en virus vegetales Sistemas de transferencia física • Transformación por bombardeo con micropartículas • Transformación de protoplastos por fusógenos y/o cationes divalentes • Transformación de protoplastos por electroporación •“Whiskers” de siliconas • Microinyección • Electroporación de tejidos enteros TRANSFORMACION CON AGROBACTERIUM Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium ataca a un amplio rango de huéspedes, a la mayoría de las dicotiledóneas, y con baja eficiencia a varias monocotiledóneas Tumor provocado por A.tumefaciens Los tumores aparecen asociados a heridas Células aisladas de los tumores siguen creciendo en ausencia de la bacteria Células aisladas de los tumores siguen creciendo en ausencia de hormonas Células aisladas de los tumores producen grandes cantidades de opinas La formación del tumor está asociada con la presencia de un megaplásmido Ciclo de la enfermedad de la agalla de corona causada por Agrobacterium tumefaciens Mapa genético del plásmido Ti de octopina Ti 200-800 kpb Región T entre 20 y 80 kpb La región T La región T está definida por dos repeticiones directas de 25 pares de bases altamente homólogas El borde derecho es imprescindible, el izquierdo no Sistema de dos componentes para reconocer células vegetales susceptibles Procesamiento de la hebra T y formación del complejo T maduro El complejo T esta compuesto de una cadena simple de ADN-T cubierta por proteína VirE2. Una única molécula de proteína VirD2 se halla unida covalentemente al extremo 5’ del DNA. Se estima que se requieren 600 moléculas de VirE2 para recubrir los 20 kb del ADN-T. Transporte del complejo T Procesos celulares y factores en la planta La integración del ADN-T al genoma de la célula vegetal involucra el apareamiento no homólogo entre éste y el ADN cromosómico Agrobacterium tumefaciens aprovecha los mecanismos de defensa de la planta Resumen de los mecanismos implicados en la transformación por Agrobacterium tumefaciens Vectores basados en el plásmido Ti Síntesis de hormonas y opinas prescindible cointegrados binarios Ejemplos de vectores binarios Optimización en el diseño de los vectores binarios Vector Tamaño (kb) Sitios únicos de restricción en ADN-T LacZ Selección bacteriana Marcador de selección en: pBIN19 11777 9 Si Kanamicina pC22 17500 2 No pGA482 13200 7 pPCV001 9200 pCGN1547 Origen de replicación Mobilización Agrobacterium E. coli BD pRK2 pRK2 Si Ampicilina, estreptomicina y espectinomicina BD pRi ColE1 Si No Tetraciclina BD pRK2 ColE1 Si 6 No Ampicilina BD pRK2 ColE1 Si 14440 5 Si Gentamicina BI pRi ColE1 Si pJJ1881 25700 4 No Tetraciclina BI pRK2 pRK2 Si pPZP111 8909 9 Si Cloranfenicol BI pVS1 ColE1 Si pGreen0029 4632 18 Si Kanamicina BI pSa pUC No Tomado de: Hellens y Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000. Genes para la selección de transformantes Gen de selección Producto genético Fuente Selección nptII Neomicina fosfotransferasa Tn5 Kanamicina, G418, paromomicina, neomicina Ble Resistencia a bleomicina Tn5 y Streptoalloteichus hindustanus Bleomicina, fleomicina dhfr Dihidrofolato reductasa Plásmido R67 Metotrexato cat Cloranfenicol acetil transferasa Fago p1Cm Cloranfenicol Higromicina fosfotransferasa E. coli Higromicina B SPT Estreptomicina fosfotransferasa Tn5 Estreptomicina aacC3, aacC4 Gentamicin-3-Nacetiltransferasa Serratia marcescens; Klebsiella pneumoniae Gentamicina Fosfinotricin acetil transferasa Streptomices hygroscopicus Fosfinotricina, bialofos 5-enolpiruvilshikimato-3fosfato sintasa Petunia hybrida Glifosato aphIV bar EPSP Genes para la selección de transformantes Gen selector Producto genético Fuente Selección bxn Bromoxinil nitrilasa Klebsiella ozaenae Bromoxinil psbA Proteína Qn Amaranthus hybridus Atrazina tfdA 2,4-D monooxigenasa Alcaligenes eutrophus Ácido 2,4 diclorofenoxiacético Dihidroxipicolinato sintasa E. coli S-aminoetil L-cisteína AK Aspartato kinasa E. coli Alta concentración de lisina y treonina sul Dihidropteroato sintasa Plásmido R46 Sulfonamida Acetolactato sintasa Arabidopsis thaliana Herbicida sulfonilurea Triptofano decarboxilasa Catharanthus roseus 4-metil triptofano Manosa 6P-isomerasa E. coli Manosa 6P DHPS Csrl-l tdc manA PROTOCOLOS DE TRANSFORMACION Totipotencialidad Desdiferenciación Rediferenciación Transformación mediante cocultivo de Agrobacterium tumefaciens y discos de hojas de tabaco A B C D Transformación mediante co-cultivo de Agrobacterium tumefaciens y cotiledones de soja A cotiledón con heridas E inducción de tallos + higromicina B inducción de tallos - higromicina F C inducción de tallos + higromicina G enraizamiento + higromicina transplante Transformación de Arabidopsis thaliana mediante Agrobacterium tumefaciens usando la técnica de inmersión floral plantas de Arabidopsis florecidas recolección de semillas inmersión de las flores en la solución de infiltración con Agrobacterium selección de semillas en placa Transformación transitoria de Nicotiana benthamiana por agroinfiltración GENES REPORTEROS Genes reporteros Genes reporteros Abreviatura Origen Detección β-glucuronidasa gus/uidA E. coli Fluorométrico (cuantitativo) o histoquímico (in situ), no radiactivo Proteína de fluorescencia verde GFP Aequorea victoria Fluorescencia, no destructiva Cloranfenicol acetiltransferasa Cat E. Coli Ensayo radiactivo sensitivo, semi cuantitativo Luciferasa Luc Photinus pyralis Luminiscencia Luciferasa luxA, luxB Vibrio harveyi Luminiscencia Uso de GFP para estudiar el desarrollo de la raíz Uso de GFP para seguir la transformación de Brachypodium distachyon semillas esterilizadas embriones inmaduros cultivo en medio de proliferación con auxina 2+2+1 semanas proUbq1/intron GFP tNOS pro35S HPT tNOS RB LB incubación con Agrobacterium+acetosiringona 2 días paso a medio con auxina, higromicina y antibiótico 2+2 semanas Ventaja: no invasivo, se puede seguir in vivo Uso de GFP para seguir la transformación de Brachypodium distachyon 3 semanas en medio de regeneración (-aux+citoquinina) + higromicina + antibiótico medio de germinación (-aux-citoq) - higromicina + antibiótico análisis de la progenie Uso del gen uidA (β-glucuronidasa) de E.coli embriones de arroz • La proteína Gus es estable y conserva su actividad cuando es fusionada a otras proteínas. • La detección de la actividad Gus es muy sensible. • La reacción históquímica es destructiva por lo tanto el ensayo no puede realizarse en tejido vivo. vasculatura de Arabidopsis SISTEMAS DE TRANSFERENCIA DIRECTA El rango natural de hospedantes de Agrobacterium es un factor limitante en la transformación de monocotiledóneas y algunas dicotiledóneas que no presentaban susceptibilidad a la bacteria. En consecuencia, se desarrollaron métodos alternativos de transferencia de ADN basados en procedimientos de naturaleza química, fisicoquímica, o mecánica. Estos nuevos métodos son conocidos como de transferencia directa por transferir ADN desnudo sin la mediación de vectores biológicos. Sistemas de transferencia directa de ADN Transferencia por bombardeo de micropartículas o biobalística Transferencia mediada por policationes (PEG, PVP) y/o fusógenos lipídicos Transferencia mediada por electroporación Transferencia con whiskers de carburo de silicio Transferencia por microinyección Sistemas de transferencia directa de ADN Ventajas • Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal • No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas transgénicas • Requieren construcciones más simples y pequeñas • Son apropiados para estudios de expresión transitoria Desventajas • Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del vector en varios sitios del genoma de las células transformadas • Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de rearreglos en los transgenes La biobalística puede utilizarse con diversos fines experimentales - Transferencia de genes a células, tejidos y órganos vegetales - Transferencia de genes a microorganismos y organelas - Estudio de expresión transitoria - Análisis de promotores y de delección de genes - Estudio de mecanismos de expresión y regulación de genes - Estudio de infecciones virales - Transferencia de ARN viral - Estudio de vías metabólicas - Estudio del desarrollo de plantas Aceleración de micropartículas Acelerador de micropartículas PDS 1000/He® por descarga de helio a alta presión Modelo comercial actual Medidor de presión de helio Tubo de aceleración de gas Interruptores de control Medidor de vacío Portador del disco de ruptura Portador del macroproyectil Ensamblaje del propulsor de microproyectiles Cámara de bombardeo Células blanco Soporte del blanco Válvula de medición de helio Controles del flujo de aire y de vacío 1. Adsorción de ADN a micropartículas Au W 2. Disparo Adaptado de: Hagio, JARQ,1994. Promotores constitutivos usados en transformación de cereales por biobalística Promotor Actividad relativa en células de cereales Uso en cereales transgénicos 35S Baja Arroz Maíz Pasturas 35S-Adh1 intrón 1 Baja Maíz Avena Trigo Emu Moderada Caña de azúcar Arroz Act1-Act1 intrón 1 Moderada Arroz Ubi1-Ubi1 intrón 1 Alta Trigo Cebada Arroz Adapatado de: Christou. Plant Molecular Biology Manual, 1995. • La transformación por biobalística no requiere construcciones genéticas especiales. En algunos casos, se ha obtenido mayor eficiencia de tansformación cuando los plásmidos son linealizados. • El promotor constitutivo más ampliamente utilizado para inducir la expresión de genes en dicotiledóneas es el promotor 35S del Cauliflower Mosaic Virus (CaMV). En monocotiledóneas se utilizan promotores como el del gen ubi1 (ubiquitina) de maíz y el del gen act1 (actina) de arroz. Expresión transitoria del gen reportero uidA en explantos bombardeados con micropartículas piel de cebolla hojas Tipos de explantos utilizados para experimentos de transformación A B C D E F M P Adaptado de: Hansen and Wright, Trends in Plant Science, 1999 A y B: callos de maíz. C: brotes de maíz. D y E: callos y brotes de soja. F: ápice de una plántula de algodón de 4 días (M: meristema apical y P: primordio foliar) QTLs Variación cuantitativa Un carácter cuantitativo es aquel para el que la diferencia fenotípica media entre genotipos es pequeña comparada con la variación entre individuos dentro decada genotipo. VP=VG+VE
