Aislamiento y caracterización bioquímica de

Aislamiento y caracterización bioquímica de heterótrofos
aeróbicos asociados a biopelículas de plantas nativas
chilenas
Roxana Sepúlveda Morales1, Paz Jopia Contreras y Homero Urrutia Briones
Laboratorio de Biopelículas y Microbiología Ambiental, Centro de Biotecnología, Universidad de
Concepción, Chile.
1
Contacto: [email protected]
Resumen
Las biopelículas, constituyen una estructura de desarrollo de vital importancia para un alto
número de bacterias fitopatógenas, las cuales dependen en gran parte de ellas para lograr
una efectiva colonización y grado de patogenicidad en sus respectivos hospedadores. Por
ello, la caracterización bioquímica yo molecular de las especies que constituyen estas
biopelículas patógenas, es de vital importancia considerando que con ello se puede llegar
identificar la bacteria con la que se trata en cada estudio, así como determinar un método de
inhibición del crecimiento y potencial formación de estas biopelículas fitopatógenas. Se
presenta el resultado del análisis de distintas pruebas aplicadas a cepas recuperadas desde
muestras de rizhoplan tomadas en la octava región a distintas plantas nativas con el fin de
caracterizar bioquímicamente y determinar la especie a la que probablemente pertenecen.
Palabras Clave: Fitopatógeno, Biopelícula, Pseudomonas, MATLAB, Taxonomía
Numérica, Caracterización Bioquímica
Introducción
Una biopelícula es un ensamblaje de
células microbianas irreversiblemente
asociadas con una superficie y encerradas
en una matriz de material polisacárido
primario. En el caso de un gran número
de bacterias fitopatógenas, la formación
de esta estructura es imprescindible para
el desarrollo de sus patologías en las
estructuras vegetales, debido a que en
estas estructuras, la viabilidad bacteriana
y su virulencia se ven aumentadas
significativamente. Estas biopelículas
fitopatógenas, constituidas principalmente
por representantes de Agrobacterium,
Clavibacter, Erwinia, Pseudomonas,
Xanthomonas y Streptomyces entre otros
constituyen un grave problema para la
industria agrónoma y forestal debido a las
pérdidas económicas provocadas por sus
patologías, destacando entre estas las
provocadas
por
bacterias
como
Pseudomonas sp., distribuidas ampliamente
a nivel mundial y teniendo además un
amplio rango de hospedadores. Debido a
esto, el aislamiento y caracterización de
este tipo de cepas desde muestras
ambientales con herramientas bioquímicas
o moleculares constituye una parte
importante del estudio de las biopelículas
que estas forman en los distintos
ecosistemas, ya sean nativos o manipulados
por el hombre, con el fin de determinar, por
ejemplo, el grado de impacto que tienen
sobre distintos tejidos de la planta, métodos
para combatir su formación, etc.
Materiales y métodos
Cepas utilizadas
Las cepas utilizadas fueron obtenidas
desde muestras de hojas, raíces y suelo de
distintas plantas nativas chilenas cuyo
hábitat se encuentra entre la séptima y la
octava región, las cuales fueron sonicadas
en solución buffer fosfato salino pH 7,4
por 15 minutos y luego recuperadas
inoculando parte de estas muestras en
diferentes medios de cultivo (Tripticasa,
Nutritivo, R2A, Tripticasa-1 y Nutritivo-1),
posteriormente se traspasaron a placas de
cultivo preparadas con los mismos
medios a 22ºC por 24h. Para verificar la
pureza de las cepas se eligieron colonias
(una o dos de cada placa) y se les realizó
tinciones de Gram. Al obtenerse tinciones
puras se repite el cultivo en placa de la
colonia seleccionada y se reitera la
tinción de Gram, traspasándose la cepa a
un tubo con glicerol al 20% en caso de
obtenerse nuevamente pura.
Para la reutilización de esas sepas en este
protocolo, se tomó una muestra del
criotubo, y se cultivó a 22ºC por 24 h en
tubos de Caldo Tripticasa. Luego, se
repitió el procedimiento para la
realización de la tinción de Gram,
utilizándose colonias que quedaron
marcadas en la placa para todas las
pruebas diferenciales, con el fin de no
tener diferencias en las cepas utilizadas a
lo largo del protocolo.
Medios
de
Cultivo
y
pruebas
diferenciales
Para la realización de las Pruebas
diferenciales fueron utilizados los medios
Agar Tripticasa (composición por litro:
Agar-agar 15.0g, Digerido Pancreático de
caseina 17.0g, digerido enzimático de
soja 3g, Dextrosa 2.5g, Cloruro de sodio
5.0g, fosfato dipotásico 2.5g), Agar NBY
(Agar nutritivo – extracto de levadura)(10)
(Composición por litro: Caldo nutritivo
8.0g, Extracto de Levadura 2.0g, K2HPO4
2.0g, KH2PO4 0.5g, Glucosa 2.5g, Agar
15.0g); Agar D1M(9) (composición por
litro: Celobiosa 5.0g, NH4Cl 1.0g,
NaH2PO4 1.0g, K2HPO4 1.0g, MgSO4 ·
7H2O 3.0g, Verde Malaquita 10.0mg,
Agar-agar 15.0g); Agar King B(1)
(composición por litro: Proteasa peptona
20.0g, Fosfato dipotasio hidrogenado 1.5g,
Sulfato de Magnesio 1.5g, Agar-agar 10.0g,
glicerol 10ml); Caldo producción ureasa(1)
(Composición por 800ml: NH4H2PO4 0.5g,
K2HPO4 0.5g, MgSO4 · 7H2O 0.2g, NaCl
5.0g, extracto de levadura 1.0g, rojo cresol
16.0mg); Agar-Urea (composición por
litro: Peptona de Carne 1.0g, D(+)-glucosa
1.0g,
Cloruro
de
sodio
5.0g,
Dihidrógenofosfato potásico 2.0g, Rojo
fenol 0.012, Agar-agar 12.0g, Urea 20.0g);
Medio Hugh & Leifson(11) (composición
por litro: Peptona 2.0g, NaCl 5.0g,
KH2PO4 0.3g, Agar-agar 3.0g, Azul de
Bromotimol 3.0ml solución 1% acuosa);
TSI (composición por litro: Peptona de
caseina 15.0g, peptona de carne 5.0g,
extracto de carne 3.0g, extracto de levadura
3.0g, cloruro de sodio 5.0g, lactosa 10.0g,
sacarosa 10.0g, D(+)-glucosa 1.0g, citrato
de amonio y hierro (III) 0.5g, tiosulfato de
sodio 0.5g, rojo fenol 0.024g, Agar-agar
12.0g); OF (comp. por litro: Peptona de
caseina 2.0g, extracto de levadura 1.0g,
cloruro de sodio 5.0g, hidrógenofosfato
dipotásico 0.2g, azul de bromotimol 0.08;
Agar-agar 2.5g); Además del Reactivo
oxidasa (Scharlau Chemie) y elementos
para la realización de las tinciones de Gram
(Cristal Violeta, Lugol, Etanol al 95% y
Safranina, Diprolab). Los tiempos y
temperaturas de incubación para las
diferentes pruebas fueron las establecidas
en bibliografía al diseñar estos medios.
Resultados
Los resultados obtenidos se detallan en la
tabla 1. Dentro de los resultados se
destaca el hecho de que cuatro de las
muestras
estudiadas
presentaron
resultados positivos para la fluorescencia
en medio King B al ser observados a luz
UV, lo que según protocolo nos permitiría
considerar a estas cepas como candidatas
a Pseudomonas. Por otra parte las
colonias y tapices presentadas en la gran
mayoría de las cepas estudiadas
presentaban
fenotipo
similar
caracterizado por un aspecto mucoso,
blanquecino y de bordes definidos,
además de un olor particular después de
cierto tiempo de incubación, presentando
un gran numero de placas respuestas muy
similares, lo que puede hacer presumir
que un gran número de las cepas
obtenidas pertenezcan a una misma
especie.
Dado que la Matriz que contiene los datos
referenciales (tabla 2) debe ser comparada
con vectores columna que contienen los
datos captados para cada cepa analizada,
se debe elegir algún mecanismo que
permita determinar la columna de la
matriz que se parezca más al vector
ingresado. Dentro de las técnicas de
minimización existentes, se elige la
conocida como Root Mean Square Error,
que determina - como su nombre lo dice
– la raíz del error medio cuadrático total
entre todos los elementos de los vectores
a comparar. El RMSE está dado por:
1 N
2
( xi − yi )
∑
N i =0
En donde xi e yi son los vectores a
comparar, y N es el número de
elementos que estos tienen.
Entonces, realizando las comparaciones
del vector ingresado con todas las
columnas de la matriz previamente
almacenada, se determinan los 3 mínimos
errores que existen, lo que significa que
RMSE =
en forma indirecta, se están encontrando las
3 columnas más “parecidas” al vector
ingresado, lo que permite obtener las
conclusiones detalladas en la tabla 3. Cabe
destacar que el programa fue desarrollado
en lenguaje de programación MATLAB v
7.1
Discusión
Las respuestas entregadas por el programa
son consecuentes con las respuestas
obtenidas fenotípicamente, coincidiendo
además con la consideración de algunas de
las cepas como Pseudomonas sp., debido a
su respuesta al agar King B. Destaca
además la gran cantidad de cepas
caracterizadas como integrantes de Erwinia
sp. Su alto número justificaría el porqué un
alto numero de cepas presentaron
características comunes luego de ser
cultivadas por algunos días. Respecto al
método utilizado, La utilización de
métodos
numéricos
y
aún
más
implementados sobre este tipo de interfaces,
como MATLAB u otros lenguajes de
programación se puede considerar una gran
herramienta en cuanto a clasificación de
especies desconocidas o “problema” se
refiere. Sin embargo, debido a la similitud
de respuestas existentes entre distintas
especies, el grado de meticulosidad con que
se lleve a cabo la realización de las
muestras y de objetividad con que se
registren los resultados puede afectar
considerablemente esta aproximación.
Por otra parte, la utilización de esta técnica
en conjunto con herramientas de
identificación mediante biología molecular
puede resultar un método bastante certero y
eficaz de identificación de cepas
bacterianas problema, dando validez al
tratamiento que recibieron las muestras
para recuperar las muestras, y además
permitiendo estandarizar estos métodos
bioquímicos para su posterior utilización en
casos de la misma índole.
Bibliografía y Referencias
1. Schaad N.W, Jones J.B, Chun W
2001. Pp 1-16, 84-120 en:
Laboratory Guide for Identification
of Plant Pathogenic Bacteria, 3º Ed.
APS Press, St. Paul, MN, USA.
2. Krieg N.R, Holt J.G 1984. Pp 140199 en: Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology, Volumen 1.
Williams & Wilkins, Baltimore, MD
USA.
3. Stoodley P., Sauer K., Davies D.G.,
and Costerton J.W. Biofilms as
Complex
Differentiated
Communities; Annu. Rev. Microbiol.
2002, 56:187-209.
4. Donnlan R.M. Biofilms: Microbial
Life on surfaces; Emerg. Infect. Dis.
2002 Sep;8(9):881-90.
5. Odutayo O. I., Oso R.T., Akinyemi
B.O. & Amusa N.A. Microbial
contaminants of cultured Hibiscus
cannabius and Telfaria occidentalis
tissues; Afr. J. Biothecnol. Vol 3 (9),
pp. 473-476. 2004.
6. Alvarez F., García de los Ríos J.E.,
Jimenez P., Rojas A., Reche P. &
Troya M.T. Phenotypic variability in
different strains of Pseudomonas
syringae subsp. savastanoi isolated
from different hosts; European
Journal of Plant Pathology 104: 603609.1998.
7. García Quintana H et al., Antibiotic
effect of wild Streptomyces strains
isolated from chilean soils; Rev.
Med. Chile, 1997 Oct, 125(10),
1157-1164.
8. Hernandez Y. & Trujillo G.E. La
bacteriosis del Ocumo (Xanthosoma
sagittifolium) en algunas localidades
de Venezuela; Fitopatol. Venez.
4(1): 9-10. 1992.
9. Perry K., Kado C., Characteristics of
Ti Plasmids from Broad-Host-Range
and Ecologically Specific Biotype 2
and 3 Strains of Agrobacterium
tumefaciens; J Bacteriol., 1982
Jul;151(1):343-50.
10. Vidaver, Anne K. Synthetic and
Complex Media for the rapid
detection of Fluorescence of
Phytopathogenic Pseudomonads:
Effect of the Carbon Source; Appl
Microbiol. 1967 Nov;15(6):1523-1524.
11. Hugh R., Leifson E., The
taxonomic
significance
of
fermentative
versus
oxidative
metabolism of carbohydrates by
various gram negative bacteria; J
Bacteriol. 1953 Jul;66(1):24-6.
Agradecimientos
Los Autores desean Agradecer a Grupo de
trabajo proyecto INNOVA Biobío del
Laboratorio
de
Biopelículas
y
Microbiología Ambiental, Centro de
Biotecnología Universidad de Concepción,
a la Sra. Cecilia Ramírez, a la Srta. Leslie
Abarzúa, de la Facultad de Ciencias
Naturales y Oceanográficas (ambas de la
misma universidad) por el apoyo brindado
durante todo el desarrollo del proyecto.
Además, se desea agradecer al Sr.
Sebastián Godoy, del Departamento de
Ingeniería Eléctrica, Facultad de Ingeniería
de la Universidad de Concepción, por su
importante apoyo en el desarrollo del
software de análisis de datos.
El Proyecto se desarrolló en el marco del
Proyecto INNOVA Biobío 04-B1-321
“Control de biopelículas microbianas de
importancia fitopatógena, por metabolitos
secundarios extraídos desde
plantas
nativas de VIII región y áreas aledañas”.
Anexo:
Característica
Erwinia
Pantoea
Acidovorax
Pseudomonas
Ralstonia
Bukholderia
Xanthomonas
Xylophilus
Agrobacterium
Clavibacter
Clostridium
Bacilus
Streptomyces
Tabla 1: Caracteres utilizados para diferenciar géneros de procariontes fitopatógenos que
crecen en medio estándar
Tinción Gram
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
Crecimiento Anaeróbico
+
+ -
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
Crecimiento Aeróbico
+
+ +
+
+
+
+ + +
+
-
+
+
-
-
-
a
Colonias amarillas o naranjas
en YDC, o NBY
Colonias mucosas en YDC a
30ºC
Pigmento Fluorescente en KB
-
+
-
-
-
-
+
-
- +
-
+
-
-
-
-
+
-
Pigmentos difusos no
fluorescentes en KB
Ureasa
-
-
-
-
-e
+ +
Oxidasa
-
+ +
b
c
d
+ -
+
-
-
+
+
N
D
N
D
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
v
-
+
N
D
-
N
D
N
D
ND
+
+
+f -
-
+
-
-
v
+
-
-
-
-
+
+
-
g
Crecimiento a 40ºC
-
+ +
+
-
+
Más de cuatro flagelos
+
+ -
-
-
-
-
-
-
-
v
v
-
Crecimiento en agar DIM
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
Formación de esporas
-
-
-
-
-
-
- -
-
-
+
+
-
Micelio aereo
-
-
-
-
-
-
-
- -
_
-
-
+
Tabla 2: Resultados Obtenidos por la aplicación de las distintas pruebas bioquímicas.
Test
Ureasa
II
I
II
* = Resultado poco concluyente o no claro.
I
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
1
0,5 1
1
*
1
1
0,5 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
* 0,25 0,25
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
*
*
*
1
1
0
1
1
1
0
1
Test
Oxidasa
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
*
1
1
1
1
1
*
0
1
1
1
1
1
1
0
1
*
1
1
II
Ox
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
*
1
1
1
1
1
*
0
1
1
0
1
1
1
0
1
*
1
1
I
Ferm
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
Agar NBY
II
0
0
0
0
0
0
*
0
*
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
*
0
0
II
I
1
1
1
1
0
1
*
1
*
1
1
1
0
1
1
1
1
*
0
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
I
OF
G-
1
1
1
1
0
1
*
1
*
1
1
1
0
1
1
1
1
*
0
1
1
0
1
1
1
0
1
0
1
1
Agar DIM
TSI
G+
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Ferm
Hugh &
Leifson
Gram
Agar King
B
Tinción
placa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
*
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
*
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
1
0
0
1
*
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
1
0
0
1
*
1
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
*
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
*
0
0
0
Tabla 3: Resultados post análisis en MATLAB.
cepa
1º sp
> Prob.
2º sp
> Prob.
3ºsp
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Xanthomonas sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Xanthomonas sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Agrobacterium sp.
Pseudomonas sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
Pseudomonas sp.
Erwinia sp.
Xanthomonas sp.
Erwinia sp.
Pseudomonas sp.
Erwinia sp.
Pseudomonas sp.
Erwinia sp.
Erwinia sp.
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Xylophilus sp.
Xanthomonas sp.
Agrobacterium sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Agrobacterium sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Streptomyces sp.*
Xylophilus sp.
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
Streptomyces sp.*
Xanthomonas sp.
Agrobacterium sp.
Xanthomonas sp.
Streptomyces sp.*
Xanthomonas sp.
Streptomyces sp.*
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp.
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Ralstonia sp.
Agrobacterium sp.
Erwinia sp.
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Xylophilus sp.
Erwinia sp.
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Ralstonia sp.
Ralstonia sp.
Agrobacterium sp.
Agrobacterium sp.
Ralstonia sp.
Xylophilus sp.
Erwinia sp.
Agrobacterium sp.
Ralstonia sp.
Xylophilus sp.
Ralstonia sp.
Agrobacterium sp.
Xylophilus sp.
* Resultado discutible (Por diferencia en reacción a la tinción de Gram)