Clase 4 2015 Transformación fondo blanco.pdf

AGROBIOTECNOLOGIA
CURSO 2015
Transformación Genética de Especies Vegetales
Dra. Marisa LOPEZ BILBAO
[email protected]
Instituto de Biotecnología, INTA
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
-
Para transformar una especie vegetal
Mercedes R
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia fértil
Método de selección
(Sin escapes)
-
Vector de Transformación (gen de
interés, gen de selección, promotor,
otras secuencias regulatorias)
Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos
menos usados)
Ensayos de transformación
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresión del transgén)
Sistemas de transferencia genética en plantas
-
• Sistemas de transferencia de ADN basados
en vectores biológicos
- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
y Agrobacterium rhizogenes
- Sistemas basados en virus vegetales
Entrega: Cepa de
Agrobacterium o
Gen Gun (otros
métodos menos
usados)
• Sistemas de transferencia directa de ADN
- Transferencia por biobalística
- Transferencia mediada por cationes divalentes
y/o electroporación
- Transferencia por microinyección
Biología de Agrobacterium tumefaciens
Procesos celulares involucrados
en las etapas de interacción entre
la bacteria y la planta
Etapas de infección
-
Procesos celulares
Agrobacterium se une a
la célula húesped
Reconocimiento célula
célula
Agrobacterium tumefaciens
BI
BD
Formación del complejo T
inmaduro, compuesto por
VirD2 y la hebra T
Procesamiento del ADN
Hebra T
Empaquetamiento del ADN
Tumor de tallo provocado
por Agrobacterium tumefaciens
Formación del complejo T
maduro, compuesto por
VirD2 y la hebra T cubierta
por VirE2
Transporte intercelular
Formación del pilus para el
transporte del complejo T
dentro de la célula húesped
Importación al núcleo
Importación de la hebra T al
núcleo de la célula húesped
Integración del ADN
y expresión de los genes
Integración de la hebra T y la
formación del tumor
Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.
Biología de Agrobacterium tumefaciens
-
Mapa genético del plásmido
Ti de octopina
-
Mapa genético del
plásmido Ti de
octopina
Estructura de la
región T de un
plásmido Ti de
octopina
Mecanismos moleculares implicados en la transformación por Agrobacterium tumefaciens
-
2
Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.
-
Agrobacterium
tumefaciens posee
un sistema
regulatorio de dos
componentes para
reconocer las
células vegetales
susceptibles
Procesamiento de la hebra T y formación
del complejo T maduro
Ensamblaje de las proteínas de Agrobacterium
involucradas en el transporte del complejo T
-
VirB2
Se requieren
600 moléculas
de VirE2 para
recubrir los 20
Kbp del ADN-T
Una única molécula
de proteína VirD2 se
halla unida
covalentemente al
extremo 5’ del DNA.
-
La integración
del ADN-T al genoma
de la célula vegetal
involucra
el apareamiento
no homólogo entre
éste y el ADN
cromosómico
(1) y (3): digestión de las cadenas desplazadas de ADN
de la planta por endonucleasas. (2): digestión del
extremo no apareado
del ADN-T por exo- o endonucleasas. (4) y (5): cortes
en la cadena desapareada del ADN de la planta
-
Protocolos de transformación mediante Agrobacterium tumefaciens
Se obtienen plantas y su descendencia
portadoras del transgén
Transformación transiente No se hereda y se usa para estudios en
el laboratorio de función, especificidad,
nivel de expresión, etc
Transformación estable
Transformación estable
Transformación
girasol
Transformación
tabaco
Explanto inicial plantas maduras
en macetas
Desinfección Explanto inicial semillas
Germinación
en germinación
Agroinfección
&
Co-cultivo
Re1
Re2
Regeneración
Re3
Kan
50 mg/L
Enraizamiento
Invernáculo
Re4
RA
-
-
Transformación lechuga
Explanto inicial cotiledones expandidos y verdes
Transformación estable
-
Transformación
estable por floral dip
en Arabidopsis
-
Bombardeo en hojas de cebolla
Agroinfiltración en Nicotiana benthamiana
Evaluación
sobre el
explanto
inicial a los ¾
días de la
agroinfección
«estable» de
girasol
Cultivo de raíces de tabaco transformadas
por Agrobacterium rhizogenes
Tumor de raíces producido por
Agrobacterium
rhizogenes en discos de remolacha
Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus
No se necesita marcador de selección porque se ve
directamente la raíz
Protocolos de transformación mediante Agrobacterium rhizogenes
-
Genetic transformation of
Calibrachoa excellens via
Agrobacterium rhizogenes:
Changing morphological
traits
Transformación estable
-
El uso de Agrobacterias implica el agregado de antibióticos para eliminar la
bacteria del medio de cultivo de plantas
Los más utilizados son cefotaxina, carbenicilina, timentina, augmentina.
La evaluación de estos antibióticos se realiza casi al mismo tiempo que la
puesta a punto del protocolo de cultivo de tejidos
Sistemas de transferencia directa de ADN
• Ventajas
-
- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos
vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal
- No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas
transgénicas
- Requieren construcciones más simples y pequeñas
- Son apropiados para estudios de expresión transitoria
• Desventajas
- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del
vector en varios sitios del genoma de las células transformadas
- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de re-arreglos en los transgenes
Bombardeo de
micropartículas
1984. Sandford et al.,
describen la técnica de
bombardeo de
micropartículas para la
transferencia directa de
ADN (Universidad de
Cornell, EEUU).
-
Acelerador de micropartículas PDS 1000/He
por descarga de helio a alta presión
Modelo comercial actual
Medidor de presión de helio
Tubo de aceleración de gas
Interruptores de control
Medidor de vacío
Portador del disco
de ruptura
Portador del
macroproyectil
Ensamblaje del propulsor
de microproyectiles
Cámara de
bombardeo
Células blanco
Soportedel
del tejido
blancoblanco
Soporte
Válvula de medición
de helio
Controles del flujo
de aire y de vacío
• Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia
del
ADN
- Método de aceleración de las micropartículas
- Naturaleza química y física, densidad y volumen de micropartículas
- Naturaleza, preparación, adherencia y concentración del ADN
La transformación
- Vacío y distancias de bombardeo
por biobalística
- Diámetro de apertura de la placa de retención
depende de
factores físicos,
- Número de bombardeos
químicos
• Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada
y biológicos
- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y genes marcadores
de selección
• Parámetros relacionados con el tejido o células blanco
-
- Transferencia de genes a células,
tejidos y órganos vegetales
- Transferencia de genes a
microorganismos y organelas
(cloroplastos)
- Estudio de expresión transitoria
- Análisis de promotores y de
delección de genes
- Estudio de mecanismos de
expresión. y regulación de genes
- Transferencia de ARN viral
-
Transformación
genética de plantas in
vivo usando una
pistola génica Helios
Plantas transgénicas obtenidas por bombardeo de micropartículas
Transformación de Festuca arundinacea
a partir de suspensiones celulares
Tipos de explantos
A
B
C
D
E
F
A
B
C
D
M
P
A y B: callos de maíz. C: brotes
primordiales de maíz. D y E: callos y
brotes de soja. F: ápice de una plántula
de algodón de 4 días (M: meristema
apical y P: primordio foliar).
A: suspensión de células de Festuca arundinacea sobre papel de filtro
antes del bombardeo. B: selección de células transformadas en medio
de selección conteniendo higromicina. C y D: plántulas transgénicas
de Festuca arundinacea regeneradas a partir de callos resistentes.
Transferencia de ADN mediada por electroporación y/o
métodos químicos
Electroporación de protoplastos
Pulsador de
electroporación
Cubetas de
electroporación
-
A
B
C
D
E
F
Cultivo y regeneración de
protoplastos de tabaco
-
Aislamiento y electroporación de protoplastos de Citrus sinensis
(naranjo dulce) con el gen gfp
Línea celular embriogénica
usada como fuente
de protoplastos
Protoplasto fluorescente
a las 24 h de la electroporación
Protoplastos luego de
la electroporación
Callos embriogénicos GFP positivos a los 6
meses de la transformación
Callos embriogénicos de 4
semanas derivados de protoplastos
Planta regenerada a partir de
callos en selección positiva
-
Expresión estable de genes transferidos a protoplastos de plantas por métodos
químicos y/o electroporación
Gen marcador de
selección / agente de
selección
Técnica de transformación
Tipo de
transgénico
Nicotiana tabacum
Métodos químicos
Plantas fértiles
npt II / kanamicina
Lolium multiflorum
Métodos químicos
Callos
npt II / kanamicina
Triticum monococcum
Métodos químicos
Callos
npt II / kanamicina
Brassica campestris
Métodos químicos
Callos
npt II / kanamicina
Petunia hybrida
Métodos químicos
Plantas
npt II / kanamicina
Brassica napus
Electroporación
Callos
npt II / kanamicina
Panicum maximum
Electroporación
Callos
dhfr / metotrexato
Oryza sativa (Japonica)
Electroporación
Plantas fértiles
hpt / higromicina
Dactylis glomerata
Métodos químicos / Electroporación
Plantas
hpt / higromicina
Solanum tuberosum
Electroporación
Plantas fértiles
npt II / kanamicina
hpt / higromicina
als / clorosulfuron
Arabidopsis thaliana
Métodos químicos
Plantas fértiles
hpt / higromicina
Oryza sativa (Indica)
Métodos químicos
Plantas fértiles
hpt / higromicina
Festuca arundinacea
Métodos químicos
Plantas fértiles
hpt / higromicina
pat / fosfinotricina
Zea mays
Métodos químicos
Plantas fértiles
npt II / kanamicina
pat / fosfinotricina
Especie
-
Para transformar una especie vegetal
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia fértil
Método de selección
(Sin escapes)
-
Vector de Transformación (gen de
interés, gen de selección, promotor,
otras secuencias regulatorias)
Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos
menos usados)
Ensayos de transformación
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresión del transgén)
-
La capacidad de Agrobacterium
tumefaciens de introducir ADN
en el genoma de la planta permitió
desarrollar vectores plasmídicos
basados en el plásmido Ti
Vectores basados en el plásmidos T
-
Mapa de restricción
de los plásmidos
pBIN19; pPZP111;
pMON10098;
pGreen0029.
Abreviaturas:
BI: borde izquierdo; ori:
origen de replicación;
BD: borde derecho
-
diseño de vectores binarios
Tamaño
(kb)
Sitios
únicos de
restricción
en ADN -T
Selección
bacteriana
Marcador
de
selección
en:
LacZ
pBIN19
11777
9
Si
Kanamicina
pC22
17500
2
No
pGA482
13200
7
pPCV001
9200
pCGN1547
Vector
Origen de replicación
Mobilización
Movilización
Agrobacterium
E. coli
BD
pRK2
pRK2
Si
Ampicilina ,
estreptomicina y
espectinomicina
BD
pRi
ColE1
Si
No
Tetraciclina
BD
pRK2
ColE1
Si
6
No
Ampicilina
BD
pRK2
ColE1
Si
14440
5
Si
Gentamicina
BI
pRi
ColE1
Si
pJJ1881
25700
4
No
Tetraciclina
BI
pRK2
pRK2
Si
pPZP111
8909
9
Si
Cloranfenicol
BI
pVS1
ColE1
Si
pGreen0029
4632
18
Si
Kanamicina
BI Tomado de: Hellens
pSaand Mullineaux,pUC
No
Trends in Plant Science, 2000.
GATEWAY vectors for
Agrobacterium-mediated plant
transformation
Mansour Karimi, Dirk Inzé and Ann
Depicker
TRENDS in Plant Science Vol.7 No.5 May
2002
Genes Reporteros
Permiten ver la expresión del transgen (reportero)
GUS
Gen de la β glucuronidasa
GFP (green fluorescent protein)
Otras proteínas fluorescentes
No es destructiva
-
Genes reporteros utilizados en transformación de plantas
-
Genes reporteros
Abreviatura
Origen
Detección
-glucuronidasa
gus/uidA
E. coli
Fluorométrico (cuantitativo)
o histoquímico (in situ),
no radiactivo
Proteína de fluorescencia
verde
GFP
Aequorea victoria
Fluorescencia,
no destructiva
Cloranfenicol
acetiltransferasa
Cat
E. Coli
Ensayo radiactivo
sensitivo, semi cuantitativo
Luciferasa
Luc
Photinus pyralis
Luminiscencia
Luciferasa
luxA, luxB
Vibrio harveyi
Luminiscencia
Ejemplo de utilización del gen reportero uid A
-
Promotores constitutivos vs tejido específico
Promotores
-
• Promotores constitutivos
• todos los tejidos
• independiente de factores ambientales
• activos entre especies y reinos
•
Promotores inducibles
– expresión dependiente de factores externos
– factores abióticos (luz, temperatura, heridas)
– factores bióticos (ataque patógenos)
•
Promotores tejido o desarrollo específico
– expresión restringida en tiempo y/o espacio
– desde órganos completos durante todo el desarrollo hasta pocas células en
corto tiempo
– órgano especifico (semillas)
-
Esqueleto del vector
Bordes Izquierdo y Derecho
Gene de selección en bacterias (en E coli y en Agrobacterium)
Genes Reporteros o Genes de Interés
Promotores
Terminadores
Secuencias Enhancer
Para transformar una especie vegetal
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia fértil
Método de selección
(Sin escapes)
-
Vector de Transformación (gen de
interés, gen de selección, promotor,
otras secuencias regulatorias)
Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos
menos usados)
Ensayos de transformación
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresión del transgén)
Genes de selección
Genes Marcadores ó
de Selección
Selección negativa
Kanamicina,
Higromicina,
Gentamicina,
Diferenciar células
transformadas de las
no transformadas
vs
Antibióticos
-
Selección Positiva
Manosa y
otros
azúcares
manosa-6P
manosa–6P
isomerasa
fructosa-6P
Glufosinato de
amonio
Glifosato
Herbicidas
Ejemplos de genes de selección
Gen de selección
Producto genético
Fuente
Selección
nptII
Neomicina fosfotransferasa
Tn5
Kanamicina, G418,
paromomicina, neomicina
Ble
Resistencia a bleomicina
Tn5 y Streptoalloteichus
hindustanus
Bleomicina, fleomicina
dhfr
Dihidrofolato reductasa
Plásmido R67
Metotrexato
cat
Cloranfenicol acetil
transferasa
Fago p1Cm
Cloranfenicol
Higromicina fosfotransferasa
E. coli
Higromicina B
SPT
Estreptomicina
fosfotransferasa
Tn5
Estreptomicina
aacC3, aacC4
Gentamicin-3-Nacetiltransferasa
Serratia marcescens;
Klebsiella pneumoniae
Gentamicina
Fosfinotricin acetil
transferasa
Streptomices
hygroscopicus
Fosfinotricina, bialofos
5-enolpiruvilshikimato-3fosfato sintasa
Petunia hybrida
Glifosato
aphIV
bar
EPSP
-
Ya tenemos todos los elementos necesarios, por lo
que podemos armar un vector de transformación
Para transformar una especie vegetal
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia fértil
Método de selección
(Sin escapes)
-
Vector de Transformación (gen de
interés, gen de selección, promotor,
otras secuencias regulatorias)
Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos
menos usados)
Ensayos de transformación
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresión del transgén)
Después de los ensayos de transformación, sigue Análisis T1, T2……
Diseño experimental para los ensayos en semillas de lechuga
-
-
14 líneas T1 PrHaAP10
Ensayos fluorométricos
Ensayos histoquímicos
-
Líneas T2
Tesis
Diego
Zavallo
-
¿Y este es el final del trabajo en un laboratorio
con plantas transgénicas??
Luego comienza el camino de los desafíos a
los estreses, analizar la equivalencia
sustantiva, observar si aparece el
silenciamiento génico, la estabilidad de los
transgenes, los niveles de expresión, etc.
Esto en invernáculos de bioseguridad
Y así comienza el camino de la desregulación
(Fase I).
Por último comenzar el camino de la desregulación en Fase II,
que son las pruebas a campo.
-
Hasta el momento no existen desarrollos argentinos liberados en el mercado