Agua ultrapura sin impurezas biológicamente activas apta para

agua ultrapura
Agua ultrapura sin impurezas biológicamente
activas apta para técnicas PCR
Resumen
L
as técnicas PCR se utilizan ampliamente en el sector
biotecnológico para la amplificación de material genético, desde la investigación genómica fundamental
hasta aplicaciones forenses y biomédicas avanzadas. La necesidad de reactivos y soluciones sin nucleasas (DNasa, RNasa) que
puedan provocar la fragmentación de los oligonucleótidos está
ampliamente reconocida; sin embargo, la influencia de otros contaminantes transmisores de enfermedades a través del agua raramente se considera. Estos pueden provocar problemas con los
resultados de las pruebas, por lo que es vital que el agua utilizada
esté libre de contaminantes transmisores de enfermedades.
garantizar que todos los reactivos y soluciones utilizados en las
aplicaciones de PCR carezcan de nucleasas. La necesidad de
un agua “libre de nucleasas” en las aplicaciones de PCR está
ampliamente reconocida; sin embargo, hay otros contaminantes que se encuentran comúnmente en el agua que pueden
impedir la amplificación del ADN por PCR, incluyendo:
Bacterias
La presencia de ADN de bacterias puede llevar a resultados
erróneos, especialmente en las técnicas qPCR, así como en la
amplificación de secuencias no diana. Además, muchas bacterias liberan nucleasas extracelulares y otras pequeñas moléculas e iones que interfieren con la polimerización del ADN.
Introducción
La llegada de las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) revolucionó la genómica a principios de la década de 1980, y los métodos basados en PCR, como la PCR
de transcripción inversa (RT-PCR) y la PCR cuantitativa (q-PCR),
ahora son esenciales en una amplia gama de aplicaciones en la
investigación médica y biológica. La amplificación del ADN por
PCR se basa en el uso de enzimas de polimerasa de ADN para
sintetizar moléculas de ADN de cadena doble a partir de “plantillas” de cadena única, usando cortas secuencias de iniciación
de oligonucleótidos para identificar el gen de interés. Aunque
este proceso emplea generalmente polimerasas de ADN termoestables, tanto la especificidad del gen diana como la eficiencia de la reacción catalizada de la enzima dependen en
gran medida de las condiciones físicas (pH, temperatura, etc.) y
de la composición de la mezcla de la reacción1. La presencia de
nucleasas (enzimas que rompen los enlaces de fosfodiéster entre las subunidades de los ácidos nucleicos) dentro del recipiente de reacción llevará a la interrupción severa del proceso de
PCR, ya que el material genético se fragmentará rápidamente
bajo las condiciones de reacción. Por lo tanto, es fundamental
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Iones
Las polimerasas de ADN termoestables requieren un cofactor
de magnesio (Mg2+) para la unión efectiva al sustrato. La concentración de Mg2+ es por tanto crucial para la optimización de
la actividad de la polimerasa3.
Las enzimas de polimerasas también son muy sensibles a otros
cationes divalentes comunes (Cu2+, Fe2+, Ni2+, etc.), que interfieren con la coordinación del cofactor y entorpecen la unión
del sustrato dentro del punto activo. Además, la presencia
incluso de cantidades de trazas de iones de metales pesados
(como el cadmio) inhibirá la actividad enzimática.
Compuestos orgánicos
Las partículas pueden causar daños en la bomba de la HPLC y
también provocar que las columnas se bloqueen. Este efecto es
aún más significativo en los usuarios de UHPLC, ya que los tamaños de partículas mucho más pequeños y con diámetros más
reducidos de estas columnas hacen que sean más susceptibles al
bloqueo prematuro que sus homólogas HPLC. Los coloides pueden ser adsorbidos irreversiblemente en la fase inmóvil, resultando en un cambio en la eficiencia de la separación de la columna.
Radiación ultravioleta (UV)
Dado que las moléculas de ADN llevan carga negativa, otras biomoléculas cargadas negativamente dentro del entorno de reacción
pueden interferir con la unión del sustrato introduciéndose en el
entorno activo cargado positivamente y causando una interferencia
estérica, lo que provoca una menor producción de sustrato.
Purificación del agua para PCR
La optimización de los procesos de PCR requiere el uso de agua
sin nucleasas, microorganismos, compuestos orgánicos ni tra-
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zas de elementos para la elaboración de todos los reactivos y
tampones. Para garantizar que todos estos contaminantes no
estén presentes, el agua de grado ultrapuro (Tipo I) (con una
resistividad de 18,2 MW cm, un valor de carbono orgánico
total, TOC, inferior a 10 ppb, niveles de bacterias por debajo de 1 CFU/ml y endotoxinas por debajo de 0,01 EU/ml) es
muy recomendable para aplicaciones4 PCR. El PureLab Ultra
Genetic de Elga utiliza un proceso de purificación multietapa
para producir agua de grado ultrapuro adecuada para PCR,
incluyendo:
Radiación ultravioleta (UV)
El paso del agua a través de un haz de luz ultravioleta descompone de forma efectiva los compuestos orgánicos incluyendo bacterias y moléculas bioactivas como
las nucleasas y endotoxinas. La longitud de onda de
185 nm oxida las macromoléculas con contenido de carbono, produciendo fragmentos ionizados para la posterior eliminación por intercambio de iones, mientras
que la radiación UV de longitud de onda más larga
(254 nm) interrumpe la actividad de las enzimas bacterianas, evitando la reproducción. Para maximizar la fragmentación de las moléculas orgánicas, el PureLab Ultra Genetic
emplea una lámpara UV de espectro total con un manguito
de cuarzo sintético de pureza ultra alta.
Ultrafiltración
Los ultrafiltros (UF) son filtros de membrana con poros típicamente de 1 a 50 nm, frecuentemente en forma de fibras
huecas, que ofrecen altas velocidades de flujo por unidad de
volumen. Normalmente están hechos de fibras asimétricas con
la capa activa, con los poros más finos, en un lado. Los UF
se caracterizan por la eficiencia con la que eliminan contaminantes específicos a niveles aceptables. La ultrafiltración es útil
junto con los UV para maximizar la eliminación de macromoléculas y bacterias.
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Conclusión
El agua ultrapura con alta resistividad (>18,2 MW cm) y sin
nucleasas, compuestos orgánicos ni endotoxinas debe ser utilizada para todas las aplicaciones PCR para garantizar la amplificación optimizada de las secuencias diana. Para saber más
sobre las tecnologías y soluciones para el tratamiento del agua
de Elga LabWater para aplicaciones biotecnológicas, véase
www.elgalabwater.com.
Referencias
El PureLab Ultra Genetic de Elga utiliza la foto-oxidación UV y
cartuchos de purificación de alta capacidad combinados con
un ultrafiltro, para proporcionar de forma fiable agua ultrapura sin endotoxinas. La resistividad en tiempo real y el control
de los valores TOC garantizan la eliminación comprobable de
los contaminantes orgánicos e inorgánicos, y el sistema ofrece
trazabilidad validada y calidad garantizada.
1.Bogetto, P et al. (2000). Helpful tips for PCR. Focus, 22 (1), 12.
2.Sambrook, J and Russell, DW (2001). Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed).
3.Yang, L et al. (2004). Critical role of magnesium ions in DNA
polymerase beta’s closing and active site assembly, J Am
Chem Soc, 126 (27), 8441-8453.
4.ASTM “Standard Guide for Bio-applications Grade Water”,
D 5196-06.
www.elgalabwater.com