Agua ultrapura libre de impurezas biológicamente activas apta para

••• Técnicas: PCR-Secuenciación
Agua ultrapura libre de impurezas
biológicamente activas apta para
técnicas PCR
••• Las técnicas PCR se utilizan ampliamente en el sector biotecnológico
para la amplificación de material genético, desde la investigación genómica fundamental hasta aplicaciones forenses y biomédicas avanzadas. La necesidad de reactivos y soluciones libres de nucleasas
(DNasa, RNasa) que puedan provocar la fragmentación de los oligonucleótidos está ampliamente reconocida; sin embargo, la influencia
de otros contaminantes transmisores de enfermedades a través del
agua raramente se considera. Estos pueden provocar problemas con
los resultados de las pruebas, por lo que es vital que el agua a utilizar
esté libre de contaminantes transmisores de enfermedades.
Dr. Paul Whitehead,
PhD, CChem, FRSC, ELGA
Labwater R&D Facility (England)
Introducción
La llegada de las técnicas de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) revolucionó
la genómica a principios de la
década de 1980, y los métodos
basados en PCR, como la PCR
de transcripción inversa (RTPCR) y la PCR cuantitativa (qPCR), ahora son esenciales en
una amplia gama de aplicaciones en la investigación médica
y biológica. La amplificación
del ADN por PCR se basa en
el uso de enzimas de polimerasa de ADN para sintetizar
moléculas de ADN de cadena
doble a partir de “plantillas” de
cadena única, usando cortas
secuencias de iniciación de oligonucleótidos para identificar
el gen de interés. Aunque este
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proceso emplea generalmente
polimerasas de ADN termoestables, tanto la especificidad del
gen diana como la eficiencia
de la reacción catalizada de la
enzima son altamente dependientes de las condiciones físicas (pH, temperatura, etc.) y
de la composición de la mezcla
de la reacción1. La presencia de
nucleasas –enzimas que rompen los enlaces de fosfodiéster
entre las subunidades de los
ácidos nucleicos– dentro del
recipiente de reacción llevará a
la interrupción severa del proceso de PCR, ya que el material
genético se fragmentará rápidamente bajo las condiciones
de reacción. Por lo tanto, es
fundamental garantizar que
todos los reactivos y soluciones
utilizados en las aplicaciones de
PCR estén libres de nucleasas.
La necesidad de un agua “libre
de nucleasas” en las aplicaciones de PCR está ampliamente
reconocida; sin embargo, hay
otros contaminantes que se
encuentran comúnmente en
el agua que pueden impedir
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Es fundamental
garantizar que
los reactivos
y soluciones
utilizados en PCR
estén libres de
nucleasas
la amplificación del ADN por
PCR, incluyendo:
Bacterias
La presencia de ADN de bacterias puede llevar a resultados
erróneos, especialmente en las
técnicas qPCR, así como en la
amplificación de secuencias no
diana. Además, muchas bacterias liberan nucleasas extracelulares y otras pequeñas moléculas e iones que interfieren con la
polimerización del ADN.
Iones
Las polimerasas de ADN termoestables requieren un cofactor de magnesio (Mg2+) para
la unión efectiva al sustrato.
La concentración de Mg2+ por
tanto es crucial para la optimización de la actividad de la polimerasa3.
Las enzimas de polimerasas
también son muy sensibles a
otros cationes divalentes comunes (Cu2+, Fe2+, Ni2+, etc.),
que interfieren con la coordinación del cofactor y entorpecen
la unión del sustrato dentro del
punto activo. Además, la presencia incluso de cantidades de
trazas de iones de metales pesados (como el cadmio) inhibirá
la actividad enzimática.
Compuestos orgánicos
Las partículas pueden causar
daños en la bomba de la HPLC
y también provocar que las
columnas se bloqueen. Este
efecto es aún más significativo
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en los usuarios de UHPLC, ya
que los tamaños de partículas
mucho más pequeños y con
diámetros más reducidos de
estas columnas hacen que sean
más susceptibles al bloqueo
prematuro que sus homólogas
HPLC. Los coloides pueden
ser adsorbidos irreversiblemente en la fase inmóvil, resultando en un cambio en la
eficiencia de la separación de
la columna.
Radiación ultravioleta (UV)
Debido a que las moléculas
de ADN llevan carga negativa, otras biomoléculas cargadas negativamente dentro del
entorno de reacción pueden
interferir con la unión del
sustrato introduciéndose en
el entorno activo cargado positivamente y causando una
interferencia estérica, lo que
provoca una menor producción de sustrato.
Purificación del agua para
PCR
La optimización de los procesos de PCR requiere el uso de
agua libre de nucleasas, microorganismos, compuestos
orgánicos y trazas de elementos para la elaboración de todos los reactivos y tampones.
Para garantizar que todos estos contaminantes no estén
presentes, el agua de grado
ultrapuro (Tipo I) –con una
resistividad de 18,2 MΩ cm,
un valor de carbono orgánico
total (TOC) inferior a 10 ppb,
niveles de bacterias por debajo de 1 CFU/ml y endotoxinas
por debajo de 0,01 EU/ml– es
altamente recomendable para
aplicaciones4 PCR. El Ultra
Genetic PURELAB de ELGA
utiliza un proceso de purificación multi-etapa para producir
agua de grado ultra-puro adecuada para PCR, incluyendo:
Radiación ultravioleta (UV)
El paso del agua a través de
un haz de luz ultravioleta descompone de forma efectiva los
compuestos orgánicos incluyendo bacterias y moléculas
bioactivas tales como las nucleasas y endotoxinas. La longitud de onda de 185 nm oxida
las macromoléculas con contenido de carbono, produciendo
fragmentos ionizados para la
posterior eliminación por intercambio de iones, mientras
que la radiación UV de longitud de onda más larga (254
nm) interrumpe la actividad
de las enzimas bacterianas,
evitando la reproducción. Para
maximizar la fragmentación
de las moléculas orgánicas, el
PURELAB Ultra Genetic emplea una lámpara UV de espectro total con un manguito
de cuarzo sintético de pureza
ultra alta.
Ultrafiltración
Los ultrafiltros (UF) son filtros de membrana con poros
típicamente de 1 a 50 nm,
frecuentemente en forma de
fibras huecas, que ofrecen altas velocidades de flujo por
unidad de volumen. Normalmente están hechos de fibras
asimétricas con la capa activa,
con los poros más finos, en un
lado. Los UF se caracterizan
por la eficiencia con la que
eliminan contaminantes específicos a niveles aceptables. La
ultrafiltración es útil junto con
los UV para maximizar la eliminación de macromoléculas
y bacterias.
El PURELAB Ultra Genetic de ELGA utiliza la fotooxidación UV y cartuchos de
purificación de alta capacidad
combinados con un ultrafiltro,
para proporcionar de forma
fiable agua ultrapura libre de
endotoxinas (ver tabla). La resistividad en tiempo real y el
control de los valores TOC garantizan la eliminación comprobable de los contaminantes
orgánicos e inorgánicos, y el
sistema ofrece trazabilidad validada y calidad garantizada.
Conclusión
El agua ultrapura con alta resistividad (>18,2 MΩ cm) y
libre de nucleasas, compuestos
orgánicos y endotoxinas debe
ser utilizada para todas las
aplicaciones PCR para garantizar la amplificación optimizada de las secuencias diana. 9
Referencias:
1 Bogetto, P et al. (2000). Helpful tips for PCR.
Focus, 22 (1), 12
2 Sambrook, J and Russel, DW (2001). Chapter 8:
In vitro Amplification of DNA by the Polymerase
Chain Reaction, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (3rd ed)
3 Yang, L et al. (2004). Critical role of magnesium
ions in DNA polymerase beta’s closing and active site assembly, J Am Chem Soc, 126 (27),
8441-8453
4 ASTM “Standard Guide for Bio-applications Grade Water”, D 5196-06.
Para saber más sobre las tecnologías y soluciones para el tratamiento del
agua de ELGA LabWater para aplicaciones biotecnológicas, visite www.
elgalabwater.com
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