Tema 9 - BioScripts

Genética Microbiana
Tema 9
DNA móvil
Barbara McClintock (1902-1992)
Variegación del color de los granos de maíz
El color oscuro se pierde en algunos grupos de células de aquellos
heterocigotos C/c que portan al menos una copia del alelo Ac (dominante)
En algunos granos el alelo C ha mutado (alelo Cu) dando color claro, pero
revierte con mucha facilidad (manchas oscuras)
La inestabilidad de C se debe a la presencia en el mismo
cromosoma de un elemento Ds+, que provoca la pérdida del
extremo del cromosoma, donde se localiza C
La inestabilidad de C se debe a la presencia en el mismo
cromosoma de un elemento Ds+, que provoca la pérdida del
extremo del cromosoma, donde se localiza C
Ds es un transposón defectivo,
que necesita de la transposasa de Ac para saltar.
Su salto puede provocar la rotura del cromosoma
Muchos fenotipos variegados se deben a la
acción de elementos móviles en el genoma
Detección de un elemento móvil bacteriano por su
inserción en un fago lambda (aumento de su densidad)
Hibridación de DNA de fagos lamda silvestres con mutantes
que llevan una secuencia IS: estructuras en “chupachup”
debido a las secuencias repetidas invertidas de las IS
Las secuencias IS controlan su propia transposición
hisG
707
hisD
595
hisC
142
IS200 ORF
translational
repressor
(bp 66-139)
1
p
transcriptional
terminator
(bp 9-32)
Algunos transposones procarióticos
Un transposón surge por combinación de dos IS
Un transposón surge por combinación de dos IS
Estructura en
“chupachup” producida
por la hibridación de
secuencias repetidas
invertidas
La evolución de los transposones puede eliminar
las secuencias IS autónomas en los extremos
Plásmido
Plásmido R
que lleva un
transposón
Integrón
El cointegrado es un intermediario en la transposición replicativa
El cointegrado es un intermediario en la transposición replicativa
Transposición no replicativa: Tn10
La transposición produce pequeñas repeticiones directas de la secuencia diana
La transposición puede conllevar la formación
de deleciones en las secuencias adyacentes
Taylor, 1963
Fago Mu (“Mutador”)
~1% de los lisógenos son auxótrofos
El profago Mu se inserta aleatoriamente en el
genoma del hospedador
Tras la inducción, Mu se replica transponiéndose
Fago Mu
El fago Mu se transpone de forma masiva antes de lisar
El fago Mu transduce los genes adyacentes:
al empaquetarse se lleva 2 kb adicionales
-35
-10
GATCCCTAGTAATGG
CTAGGGATCATTACC
Promotor metilado = inactivo
Promotor hemimetilado
o desmetilado = activo
DNA
DNA
Elementos de inserción (IS)
Transposones compuestos
Transposones con resolvasa (familia Tn3)
Integrones
Transposones conjugativos
DNA
RNA
DNA
Retrones
Retrotransposones
Intrones móviles
etc.
Retrovirus y retrotransposones
Retrovirus y retrotransposones
Retrotransposón con repeticiones terminales largas (LTR)
Retrotransposones de levaduras: elementos Ty
Retrotransposones de levaduras: elementos Ty
Retrotransposones de levaduras: elementos Ty
Retrotransposones de levaduras: elementos Ty
Ty-1
Ventajas de los transposones como mutágenos
1. Pueden insertarse en muchos sitios
2. El gen interrumpido sufre pérdida total de función
3. El transposón confiere a la mutación un fenotipo
seleccionable
4. La reversión de la mutación está asociada a la
pérdida del marcador del transposón
5. Las inserciones en operones son polares sobre los
genes distales
F’ 114 ts lac+ zzf::Tn10
Selección:
Resistencia a tetraciclina
Control de ausencia del vector:
Fenotipo Lac- en medio indicador
Procedimientos de contraselección:
1. Incubación a temperatura restrictiva
2. Transducción no homóloga
Ejemplo de escrutino: búsqueda de auxótrofos
E. coli portadora del
F’ ts lac+ zzf::Tn10
Incubación a 42oC
étodos de Gen
é
Medio MacConkey
Estirpe donadora: lleva un plásmido que no es
empaquetable en la cápsida del fago transductor.
El plásmido lleva un transposón.
Lisis
Estirpe receptora: no lleva plásmido. Seleccionar
transductantes que hayan incorporado el marcador
dominante del transposón.
Derivados sofisticados de transposones bacterianos:
transposones defectivos
IS10L
tcR
IS10R
Tn10
tcR
mini-Tn10
Fusión de genes
AUG
AUG
Fusión de proteínas
MudJ
Km-r
lacZY
promotor
Lac+
promotor
Lacpromotor
Lac-
Tn5 Kmr
recA1
50% ligamiento
por cotransducción
Transducir
seleccionando
Kmr
Lisado
1 de cada 2 transductantes
llevará el alelo recA1
Tn10 Tcr
pyrB
90% ligamiento
por cotransducción
1. Mutagenizar un lisado con
hidroxilamina
2. Transducir la estirpe silvestre
seleccionando Tcr
3. Buscar auxótrofos Pyr- entre los
transductantes