CLASE 12. Tema III. Genetica bacteriana
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Genética bacteriana II Genética de bacteriófagos Generalidades de Virus • Tamaño 24 – 300 nm • DNA o RNA, de cadena simple o doble • Cubierta de proteínas con o sin lípidos • Forma icosaédrica, de varilla, o cabeza y cola Virus de la influenza (200 nm) Clasificación de fagos por su estructura. Icosahédricos sin cola (φX174) Icosahédricos con cola (λ) Filamentosos (M13) Están formados por un ácido nucleico (DNA/RNA) y una cápside de proteína El genoma de los fagos RNA simple cadena (MS2, Qß) RNA doble cadena (phi 6) DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4) Estos ácidos nucleicos pueden contener bases inusuales que son sintetizadas por proteínas del fago. En los fagos T-pares, el genoma no contiene citosina sino 5'- hidroximetilcitosina, mientras que en otros tipos de fago alguna de las bases está parcialmente sustituida. Fago libre Componentes del Fago Bacteriofago T4 virulento Cabeza Cuello y collar Fago infectando Centro Vaina Placa Basal Fibras Ciclo Lítico Ciclo de Replicación del Bacteriofago T4 1. Adsorción del fago a receptores en la superficie de la bacteria (proteínas transportadoras de maltosa o de Fe2+) 2. Inyección del material genético viral 3. Transcripción del DNA del bacteriófago y producción de proteínas virales 4. Replicación del material genético viral 5. Empaquetamiento del DNA dentro de la envoltura proteica y ensamblaje de la envoltura 6. Lisis y liberación de las partículas virales Halos ó placas de lisis de los fagos Ciclo Lisogénico (Fagos temperados) 1. Una molécula de DNA del fago es inyectada a la bacteria. 2. Transcripción de genes necesarios para la integración. 3. El DNA del fago se inserta en el cromosoma bacteriano. (Integración) 4. La bacteria replica su DNA (y el del fago) y se divide normalmente. 5. El fago insertado se denomina profago y a la bacteria lisógeno. 6. La bacteria es ahora inmune a la infección de otros fagos. Integración del DNA del fago al cromosoma bacteriano El cromosoma del bacteriófago lambda (λ) en estado libre es circular. El sitio de integración λ es una región del cromosoma que se alinea en un sitio del cromosoma bacteriano (entre los genes gal y bio). Ocurre un entrecruzamiento recíproco entre el fago circular y el cromosoma bacteriano resultando en la integración. Esta integración es mediada por los genes del bacteriofago y no por el sistema de recombinación de la bacteria. Al DNA del fago integrado al cromosoma se le llama profago. Bacteria lisogénica portadora de Profago Molécula lineal de DNA del bacteriofago λ Integración de λ al cromosoma bacteriano Bacteriófago lambda (λ λ) (fago temperado) Ciclo lisogénico Ciclo lítico TRANSDUCCIÓN Transferencia de material genético entre bacterias a través de un bacteriófago Transducción Transferencia de material genético bacteriano por los virus de bacteria (fagos) phe– trp– tyr– met– his– WT TRANSDUCCIÓN Profago Cromosoma bacteriano Inducción del ciclo lítico La escición del DNA del fago acarrea DNA cromosomal Replicación del fago Lisis celular y liberación del fago La célula receptora adquiere nuevos genes El fago infecta a la Integración del DNA del fago al cromosoma célula receptora Transducción Transducción generalizada Transducción especializada Transducción generalizada Transducción especializada Durante la transducción se pueden mapear genes Células donadoras: arg+; met+, strs Infección con el fago P1. Ciclo lisogénico. Integración Ciclo lítico y cosecha de fagos. Mezclar los fagos con la bacteria receptora: arg-; met-; strr Ciclo lisogénico del bacteriofago Selección fenotípica de las bacterias receptoras. Transposones (Elementos genéticos móviles) • La transposición es otro tipo de recombinación de DNA en el cual un elemento transponible o transposón se mueve de una molécula de DNA a otra (recombinación ilegítima). Fueron descubiertos originalmente en maíz por Barbara Mc Clintock y su presencia se ha documentado también en otras especies, desde bacterias hasta humanos. Descubrimiento de los transposones eucariontes Elementos de Control Barbara Mc Clintock, 1951 Tipos de transposones Secuencia de Inserción o Elemento de Inserción (IS): contiene una secuencia central con el gen de la transposasa y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso no nesariamente idéntica, aunque muy parecida. Cuando un transposón simple se integra en un determinado punto del DNA aparece una repetición directa de la secuencia diana (512 pb). Transposón Compuesto (Tn): contiene un elemento de inserción (IS) en cada extremo, en orden directo o inverso y una región central que además suele contener información de otro tipo. Por ejemplo, los Factores de transferencia de resistencia (RTF) poseen información para resistencia a antibióticos (cloranfenicol, kanamicina, tetraciclina, etc.). http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm Características de algunos elementos IS Elemento Longitud IS1 IS2 IS4 IS5 786 pb 1327 pb 1428 pb 1195 pb Repetición terminal invertida 23 pb 41 pb 18 pb 16 pb Repetición directa de la diana Selección de la diana 9 pb 5 pb 11-12 pb 4 pb Regional Zona caliente AAAX20 .........XTTT Zona caliente Características de algunos Transposones compuestos (Tn) MÓDULOS TERMINALES Elemento Longitud Marcador genético (resistencia) Tn 10 Tn 5 Tn 903 Tn 9 9300 pb 5700 pb 3100 pb 2500 pb Tetraciclina Kanamicina Kanamicina Cloranfenicol IS Orientación Relación entre ambos IS 10 IS 5 IS 903 IS 9 Invertida Invertida Invertida Directa Divergencia 2.5% Difieren en 1 pb Idénticos Idénticos (?) http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm Tanto los elementos IS como los transposones (Tn) tienen que estar integrados en una molécula de DNA, que contenga un origen de replicación, ya sea en el cromosoma principal bacteriano o en un plásmido, nunca se encuentran libres. Cromosoma de E. coli Algunos elementos pueden estar en varias copias http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm Transposones en procariontes Secuencias de inserción (IS) Frecuencia global de transposición: 10-3 – 10-4 Frecuencia individual de transposición: 10-5 – 10-7 Reversión de la transposición: 10-6 – 10-10 Transposones El tamaño de los transposones varía entre 103 a 104 pb dependiendo del tipo de transposón. La secuencia íntegra del transposón se puede insertar en un sitio particular del cromosoma. La transposición involucra recombinación entre secuencias no relacionadas (recombinación ilegítima) que son los extremos flanqueantes del transposón y el sitio del cromosoma donde se insertó. Dos formas de transposición Replicativa Conservativa Transposasa. Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y une los extremos del transposón. Secuencias repetidas invertidas. Funcionan como el sitio de reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son invertidas, son idénticas. Marcador de selección. La inserción del transposón confiere una ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún antibiótico. KanS KanR Tn5: 5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb. Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp. Tn7: 14,000 pb y regiones flanqueantes (secuencias repetidas invertidas de 30 pb). Resistencia a Strp, Spec. Tn10: 9,300 pb y regiones flanqueantes de 1,300 pb. Genes de resistencia a Tet. Mecanismo de transposición (recombinación ilegítima) Repetidos directos (5-9 pb) Transposición conservativa Unión de la transposasa a la región flanqueante Formación del asa (complejo sináptico). Los extremos del transposón se acercan. Corte del DNA y escición del transposón Unión del transposón al DNA blanco La transposasa cataliza la inserción del transposón al DNA blanco. Transposición replicativa Transposasa Resolvasa Transposones de eucariontes Retrotransposones Transposones de DNA Los retrovirus se integran al DNA provirus Los transposones pueden causar reordenamientos y cambios en los genomas Transposones Transferencia de DNA Duplicación de DNA Los Virus Evolución de genomas Uso de los transposones para generar una colección de mutantes 1.Para introducir inserciones de Tn5 al azar en el cromosoma de E. coli, se usa un vector de fago lambda: λ Pam int-::Tn5 2.Cuando este fago infecta células KanS, el DNA del fago no se puede replicar ni integrar, así que la única manera de que E. coli se vuelva KanR es que el transposón Tn5 se inserte en algún sitio del cromosoma. Esto va a ocurrir en aprox. 1 de cada 100,000 células infectadas. 3. Si se infectan 2 x 109 células, se obtendrán aprox. 2 x 104 colonias KanR. Cada una tendrá una inserción de Tn5 en un sitio distinto del cromosoma. Si en el genoma de E. coli hay unos 5,000 genes, es probable que se tenga una colección con inserción de Tn5 en casi todos los genes. La transferencia horizontal de genes entre distintas especies, e incluso géneros de bacterias Mecanismos de resistencia a antibióticos y su transmisión 1. Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram(capa de LPS). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en plásmido o en cromosoma. 2. Modificación e inactivación del antibiótico. β-lactamasa, enzimas modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa. 3. Modificación del blanco. Dominios de transpeptidasa con menor afinidad por las β-lactamas. 4. Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato insensible a sulfonamidas. 1. Cuatro cepas Hfr de E. coli procedentes de la misma cepa F+ transfieren los siguientes marcadores en el orden: Cepa 1: M Z X W C Cepa 2: L A N C W Cepa 3: A L B R U Cepa 4: Z M U R B ¿Cuál es el orden de estos marcadores en la cepa F+ original? 2. Se realiza un cruzamiento entre una cepa Hfr arg+ bio+ leu+ y una cepa F– arg– bio– leu–. Experimentos de conjugación interrumpida demuestran que arg+ entra en el receptor en último lugar, de modo que se seleccionan recombinantes arg+ para determinar la presencia de bio+ y leu+ encontrando los siguientes números: arg+ bio+ leu+ 320 8 arg+ bio+ leu– arg+ bio– leu+ 0 arg+ bio– leu– 48 ¿Cuál es el orden de estos marcadores? ¿Cuáles son las distancias en unidades de mapa?
