Transposones - genoma . unsam . edu . ar
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Transposones • Segmentos de DNA que pueden moverse de un sitio a otro del genoma – Transposones: movilización directa de segmentos de DNA. Codifican para las proteínas necesarias para manipular el DNA y propagarse en el genoma. – Retrotransposones: movilización a través de molécula de RNA La Movilidad depende de su capacidad de hacer copias de DNA a partir de su RNA transcripto 1 Movilización en el genoma No replicativa Replicativa 2 Transposones: Causa importante de variación en genomas •Mutagénesis por el evento de transposición mismo: inserción, deleción, o movimiento de una secuencia del DNA genómico a otra localización •Recombinación desigual entre elementos dispersos. Inserciones, deleciones, inversiones o translocaciones de secuencias genómicas. 3 Transposones bacterianos 4 5 Secuencias de Inserción (IS) IR Target repeat IR (repet.inv) Largo IS1 9pb 23pb 768pb IS2 5pb 41pb 1327pb IS4 11-13pb 18pb 1428pb IS5 4pb 16pb 1195pb IS10R 9pb 22pb 1329pb IS50R 9pb 9pb 1531pb IS903 9pb 18pb 1057pb IR transposasa Genoma de E.coli varias copias (<10) Frec Transposición 10-3 -10-4/elemento x genoma 6 • Transposones compuestos IS IS Tn9 IS1 CamR módulos IS funcionales Tn903 IS903 KanR IS903 Tn10 IS10L(nf) TetR IS10R Tn5 IS50L(nf) KanR IS50R 7 Transposición no replicativa 8 Intermediario en la transposición 9 Transposición replicativa Tn 3 (familia TnA) Requiere Resolvasa y sitio res 10 REFERENCE: Shapiro, J. 1979. Molecular model for the transposition and replication of bacteriophage Mu and other transposable elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1933-1937. 11 Tn5 • IS50: secuencia de inserción • OE ,IE: repeticiones invertidas Tnp: Transposasa (476aa) -Proteína muy inactiva (inhibición por cercanía de extremo N y Cterminal). Requiere cambio de conformación. -Dímero -Transcripción regulada por metilación Dam -Actividad regulada por proteína Inh 12 13 Uso de Transposones en Técnicas de DNA recombinante Inserción al azar de secuencias en el DNA de plásmidos o genómico Transposición “in vitro” •Transposón Tn 5 artificial •Transposasa específica 14 Transposición “in vivo” 15 Mutagénesis al azar clonado y secuenciación de la región de DNA genómico donde se insertó el transposón •Electroporación del transposoma •Activación intracelular por Mg2+ 16 Generación de mutantes por inserción 17 18 Transposones eucariotas • Maiz – Elementos Ac y Ds (no autónomos) • • • • • • Transposición no replicativa Produce deleciones, inserciones y/o rupturas cromosómicas Gen único con 5 exones que codifica para la transposasa Terminaciones con repeticiones invertidas de 11pb Transposición regulada (inhibida por metilación del DNA) Transposición genera duplicaciones directas de 8nt en secuencia blanco IR IR Ac 4.5kb transposasa IR IR Ds: elementos Ac con deleciones internas 19 20 Transposón Tagging Permite el clonado de genes que contienen el transposón. 1º paso: identificación de una planta mutante para una característica específica por inserción de un transposon e inactivación del gen. 2º construcción de una biblioteca genómica 3º selección de clones que contienen el transposón 21 •Drosophila –Elementos P (2907pb) •Regulación de transposición tejido específica (proteína represora de splicing en células somáticas) •Represor de la transposasa (citotipo) •4 ORF IR: 31pb 31pb 1 ORF 0 2 ORF 1 3 ORF 2 ORF 3 •Transcripción en todos los tejidos. •Patrón de “splicing” distinto en células somáticas y en células germinales. Represor (66kDa) Células somáticas RNA ORF 0 ORF 1 ORF 2 Transposasa (87 kDa) Células germinales RNA ORF 0 ORF 1 ORF 2 ORF 3 22 Líneas P: 30 a 50 copias de elemento P distribuidas en el genoma (1/3 completas) 23 Otros Transposones D.melanogaster M. domestica Lepidópteros D.hydei D.mauritana 24 Transformación de Insectos con transposones no autónomos 25 26 Ciclo de vida de un retrovirus 27 28 29 30 Transposición de un retrotransposón o retrovirus 31 Retrovirus y retrotransposones tipo LTR • Genoma retrovirus U3 R U5 LTR U3 R U5 gag pol env LTR • Retrotransposones TyA TyB 6,3 kb Elemento Ty (levadura) Copia (Drosophila) LTR LTR 5 kb 32 Retrotransposones • LTR – Promotor en LTR – RNA poliadenilado – RT citoplasmática a partir de PBS (en extremo 5´) – Transporte del DNAdc al Nu para integración – Reg codificantes con homología a RT, endonucleasa y gag virales Elementos Ty y copia 33 Retrotransposones no LTR •No LTR –Promotor en la región codificante (extremo 5´) Promotor RNA Pol II –RNA transcripto poliadenilado (Señal de poly A débil) –RNA bicistrónico2 ORF : Prot de unión a RNA + Prot con dominio Endonucleasa y dominio RT –RT a partir de cola de poly A (priming DNA genómico) •Señales poly A débiles Duplicación de genes GENOMA HUMANO • LINES (autónomos) (6-8kb) • SINES (no autónomos) – – – – – – Promotor RNA pol III RNA transcripto con corrida de U PolyA codificado en DNA 90-300pb Derivados de tRNA y 7SL RNA No codificantes 34 35 Integración de retrotransposones no retrovirales 36 LTR LTR LTR PBS PolyA AAAA RNA LINES PolyA AAAA SINES RNA AAAA AAAA UUUU RNA 37 GENOMA HUMANO % GENOMA NºCOPIAS L1 (LINE) 16,9 0,5 x 106 Alu (SINE) 10,6 1,1 x 106 L2 (LINE) 3,2 0,3 x 106 MIR (SINE) 2,5 0,46 x 106 LTR 8,3 0,3 x 106 Transposones DNA 2,8 0,3 x 106 Pseudogenes Procesados <1 1-2 x 104 TOTAL 45 3 x 106 38
