Diapositiva 1

Elementos genéticos
móviles
Genética I - 2015
Flávio Silva Junqueira de Souza
photo credit: Robert Martienssen, Cold Spring Harbor Laboratory
Elementos genéticos móviles
- hay elementos genéticos que pueden moverse
(transponerse) de un lugar a otro en el genoma
- ocurren en los genomas de todos los seres vivos en que han sido
buscados
- no tienen función definida (pueden ser considerados parásitos
moleculares) pero influyen en la evolución de los genomas
- en organismos multicelulares (animales, plantas) gran parte del genoma
está compuesto por restos inactivos de elementos transponibles
- son usados como herramientas moleculares para modificar genomas
- denominaciones: elementos genéticos transponibles, transposones,
"genes saltarines" (jumping genes) etc
Locus Dotted (Dt) en maíz
- Marcus Rhoades (1938): descubrió herencia no-mendeliana de algunos
loci de maíz;
- analisó mazorcas de una autofecundación de un maíz negro mexicano y
encontró que la marzorca tenía granos que segregaban de la siguiente
manera:
12 granos pigmentados
3 granos moteados (dotted)
1 grano incoloro
Locus Dotted (Dt) en maíz
- hipótesis de Rhoades: dos loci involucrados; A(a) y Dt(dt)
A grano pigmentado
a grano incoloro
Dt produce efecto variegado
dt no produce efecto variegado
- el alelo Dt causa la reversión a
A
Locus Dotted (Dt) en maíz
- la cantidad y tamaño de las manchas en el grano de maíz dependen del
momento en el desarrollo en que ocurre la reversión a
A
Locus Dotted (Dt) en maíz
- Rhoades razonó que las reversiones en linea germinal deberían ser
heredables. Para probarlo encontró anteras pigmentadas en plantas
a/a; Dt/- y las cruzó con plantas a/a; dt/dt
plantas
a/a; Dt/-
X
plantas
a/a
- el polen de las anteras pigmentadas dió origen a granos totalmente
pigmentados, lo que muestra que el fenotipo pigmentado es causado por
un evento de reversión que ocurrió en la linea germinal
- primer caso de un alelo mutante inestable (alelo que revierte a muy alta tasa)
Barbara McClintock
- en la década de 1930 estudió la citogenética
del maíz, caracterizando sus 10 cromosomas;
- visualizó el proceso de crossing-over en
cromátidas hermanas durante la meiosis en
el maíz (1931);
- estudió el ciclo de breakage-fusion-bridge en
cromosomas inestables de maíz, causado por la
pérdida de un telómero antes de la división
celular;
- descubrió que algunos elementos genéticos
podían moverse (transponerse) en el genoma,
causando la activación o inactivación de genes;
- llamó a los genes móviles "elementos
controladores" (controlling elements)
- ganó el Premio Nobel en 1983
Sistema Ds/Ac en maíz
- McClintock observó que el locus Dissociator (Ds) en el cromosoma 9 de maíz causaba
inestabilidad (rotura) en el cromosoma durante el desarrollo, llevando a la pérdida de los
loci C (Colored), Sh (Shrunken) y Wx (Waxy);
pérdida de C
(grano pigmentado)
lleva al
fenotipo c
(no pigmentado)
- la rotura en el locus Ds solo ocurre en presencia del locus Activator (Ac), localizado en
otra zona del genoma
- el locus Ac no tiene una localización definida; en distintas cepas de maíz Ac se localiza
en distintas ubicaciones en el genoma
Sistema Ds/Ac en maíz
C Ds / C Ds; Ac/Ac+
x
c Ds+ / c Ds+; Ac+/Ac+
Ac: presente
Ac+: ausente
Ds: presente
Ds+: ausente
C: grano pigmentado
c: grano incoloro
Cu: alelo C inactivado por
inserción del Ds
- la presencia de algunos granos incoloros con manchas oscuras indicaba que Ds podía
insertarse en C sin causar rotura y después salir de C restaurando su funcionalidad
(siempre que Ac esté presente)
Sistema Ds/Ac en maíz
- la presencia de algunos granos incoloros con manchas oscuras indicaba que Ds podía
insertarse en C sin causar rotura y después salir de C restaurando su funcionalidad
(siempre que Ac esté presente)
Sistema Ds/Ac en maíz
- otros experimentos de McClintock
mostraron que el elemento Ac
también podía insertarse en C y
inactivarlo. La inactivación era
revertida cuando Ac volvía a
moverse;
- estos resultados indicaban tanto
Ds como Ac eran elementos
móviles relacionados
funcionalmente;
- McClintock los llamó elementos
controladores y dedujo que
participaban de la regulación
génica
- los genes eran imaginados como
unidades estáticas; la idea de que
se podían mover de esa manera
regulando la actividad génica era
revolucionaria;
Sistema Ds/Ac en maíz
- desde la década de 1980 se conocen las bases moleculares del sistema Ds/Ac
Ac
elementos
Ds
- el elemento Ac es un transposón de DNA que codifica una transposasa; como tal puede
transponerse de manera autónoma (elemento autónomo);
- los elementos Ds tienen deleciones y son defectivos en el gen de la transposasa; debido
a eso dependen de la transposasa de un elemento Ac para moverse (elemento noautónomo)
transposición en el
sistema Ac/Ds
excisión
al producirce la excisión
se restablece (o no) la
unión cromosómica
Transposones en maíz
- hay varios transposones autónomos y no-autónomos en maíz
Elementos móviles en bacterias
- las investigaciones en elementos genéticos móviles en maíz se estancaron
por falta de herramientas moleculares;
- en la década de 1960 los conocimientos de genética bacteriana eran ya
muy avanzados (conjugación, fagos, operón lac, etc);
- se descubrieron mutaciones en el operón lac que revertian a una tasa muy
alta (como las causadas por Ac/Ds en maíz);
- las mutaciones eran polares: a veces inactivaban todos los genes del
operón, a veces inactivaban sólo los más lejanos del promotor.
Y, A inactivos
lac operon
Z, Y, A inactivos
Elementos móviles en bacterias
- los primeiros elementos móviles de bacterias encontrados fueron las
insertion sequences (IS) que inactivaban el operón lac;
transducción especializada
del fago lambda puede llevar
parte del operón lac y
incorporarlo a la partícula viral
Insertion sequences (IS) de E. coli
- los primeiros elementos móviles de bacterias encontrados fueron las
insertion sequences (IS) que inactivaban el operón lac;
CsCl
gradient
- fagos con operones lac con mutaciones polares cargaban mas material
genético (DNA) que los con el operón lac salvaje (tenían una inserción).
Insertion sequences (IS) de E. coli
- el DNA de los fagos con mutaciones del operón, cuando eran hibridados
con DNA de fagos con el operón salvaje, formaban loops
Insertion sequences (IS) de E. coli
- las mutaciones polares del operón lac son debidas a la inserción de los
elementos IS adentro del operón, interrumpiendo los genes;
- existen naturalmente en el cromosoma y en plásmidos de bacterias;
- son elementos autónomos (pueden transponerse solos);
- tienen una estructura muy simple: codifican una transposasa; los extremos
tienen secuencias repetidas invertidas
Insertion sequences (IS) de E. coli
- durante la inserción de los elementos IS mediada por la transposasa, la
secuencia-blanco del genoma sufre una duplicación:
complejo
transposasa + IS
elementos
IS
Insertion sequences (IS)
- mecanismo de inserción
Insertion sequences (IS)
- mecanismo de inserción
Transposones compuestos en bacterias
- algunos transposones bacterianos poseen dos elementos IS en sus extremos y se
transponen como una unidad; pueden moverse de un plásmido al cromosoma o a
otro plásmido;
- los segmentos invertidos pueden estar en la misma
orientación o no; las dos transposasas pueden ser
activas o solo una;
- frecuentemente llevan genes de resistencia a
antibioticos en la parte central; plásmidos conjugativos
con ese tipo de transposón pueden transmitir la
resistencia entre bacterias
Transposones compuestos en bacterias
- ejemplos de transposones compuestos de bacterias:
Tn5
Tn9
Tn10
Kan: kanamycin; Ble: phleomycin; Str: streptomycin; Cam: chloramphenicol; Tet: tetracyclin
Transposones compuestos en bacterias
- plásmidos R conjugativos confieren resistencia múltiple a antibioticos
- contienen varios elementos Tn/IS y genes de resistencia
ejemplo: plásmido R100
- contiene los transposones Tn10 y
Tn9 y con múltiples genes de
resistencia a antibioticos
- se transfiere entre bacterias entéricas
Transposones no-compuestos en bacterias
- los transposones de DNA que vimos hasta ahora (Ac, IS, Tn10 etc) se mueven por
un mecanismo de cortar-y-pegar (cut-and-paste; transposición no replicativa o
conservativa);
- hay transposones de DNA que se mueven por un mecanismo replicativo; en ese
caso generan una copia extra en el sitio de inserción;
- no tienen elementos IS en los extremos, sí tienen secuencias invertidas;
- codifican una transposasa y una resolvasa (enzima que actua en la recombinación);
poseen un sitio de resolución y pueden tener también genes de resistencia a
antibioticos
Transposones no-compuestos en bacterias
- la transposasa corta una unión
fosfodiester en una hebra (nick)
de un inverted repeat (IR) y otra
unión en la hebra complementaria
del otro IR; transposasa también
corta las hebras de DNA-blanco;
- los extremos 3' del IR se unen a
los extremos 5' del DNA blanco;
- el DNA es replicado desde los
extremos 3' del DNA-blanco;
res
res
- ligación del DNA forma un
cointegrado (forma fusionada de
los dos fragmentos de DNA);
- recombinación sitio-específica
entre los dos sitios res mediada
por la resolvasa (resolución);
- cada fragmento de DNA ahora
tiene una copia del transposón
Regulación de la transposición
- la inserción de transposones puede interrumpir genes y causar aberraciones
cromosómicas; el exceso de transposición puede ser letal;
- mecanismos de regulación aseguran que la tasa de transposición de elementos
genéticos móviles sea bajo;
- mecanismos observados:
inhibición de la transcripción de la transposasa por una proteina represora
codificada en el transposón (p. ej. Tn3);
inhibición de la transcripción de la transposasa por metilación del DNA del promotor;
inhibición de la unión de la transposasa a las secuencias IS por metilación del DNA;
inhibición de la traducción del mRNA de la transposasa por un RNA antisentido
expresado de manera abundante;
degradación rápida de la transposasa (no se acumula proteina);
acción en cis de la transposasa (la enzima se une fuertemente al DNA inmediatamente
después de ser traducida; no difunde a otras zonas del genoma)
Regulación de la transposición
- transposón Tn10 (compuesto): promotor bidireccional produce el mRNA de la
transposasa y un RNA antisentido que se solapan en 36 bp
- RNA antisentido es 30 veces más abundante que el mRNA; híbridos RNA:RNA
inhiben la traducción de la transposasa
Regulación de la transposición
- transposón Tn10 (compuesto): metilación Dam completa (ambas hebras) de sitios
GATC presentes en el promotor impide la transcripción de la transposasa; la misma
metilación de la secuencia IS impide la unión de la transposasa;
sitios
metilados
- además, la transposasa es muy inestable, difunde poco y actua solamente en la
inserción desde donde fue traducida (acción en cis)
Transposones en Drosophila
- en Drosophila, 10% del genoma está compuesto por restos de transposones, la
vasta mayoría inactivos;
- los elementos P son los más estudiados transposones de DNA de moscas;
- codifican una transposasa y están flanqueados por secuencias invertidas repetidas;
- se mobilizan por el sistema de cut-and-paste (como el Ac de maíz o el IS de
bacterias) ;
- son usados como herramientas moleculares
elemento-P
Disgénesis del híbrido
- en Drosophila, la cruza entre hembras
de laboratorio con machos salvajes
genera híbridos infértiles;
- estos híbridos tienen varias mutaciones
y aberraciones cromosómicas;
- si la cruza es entre un macho de
laboratorio y una hembra salvaje, los
híbridos son fértiles;
- la causa de la disgénesis del híbrido es
la mobilización excesiva de elementos-P
en los embriones de hembras de
laboratorios, que normalmente no tienen el
elemento-P;
- las hembras salvajes producen un
represor de la mobilización de
elementos-P (pequeños RNAs llamados
piRNA que reprimen la expresión de la
transposasa por RNAi)
Disgénesis del híbrido
- el elemento-P solo es activo en células
germinales, pero no en células somáticas;
- el gen de la transposasa tiene 3 intrones;
la regulación es a nivel del splicing;
- en células somáticas, sólo se splicean los
intrones 1 y 2; la proteina resultante trunca
es un represor de la actividad del
transposon;
- en células germinales los tres intrones
sufren splicing; la proteina (87 kD) es la
transposasa
Disgénesis del híbrido
- en la disgénesis del híbrido,
falta un represor citoplasmático
que reprima la transposición
del elemento P en los
embriones;
- ese represor en embriones
está compuesto por RNAs
pequeños (piRNAs) que
llevan a la degradación del
mRNA de la transposasa por
RNA de interferencia (RNAi)
Transgénesis con elemento P
- un plásmido tiene las secuencias IR del
elemento P con el trasgén y un factor de
selección (rosy) pero sin transposasa;
- el segundo plásmido expresa la
transposasa pero tiene mutaciones en
las secuencias IR y no se puede insertar;
- los plásmidos son inyectados en el polo
posterior de un embrión rosy- (blastodermo) ;
el plásmido se inserta en algunos nucleos;
- moscas de la F1 con ojos rojos (rosy) tienen
el transgén en todas sus células
Retrovirus y retrotransposones
- los retrovirus tienen genoma de RNA; al entrar en una célula, el RNA es convertido
en DNA por la transcriptasa reversa y se integra al genoma del huésped (provirus);
- el genoma del retrovirus produce las proteinas necesarias para formar la cápside y
otras proteinas del virus
Retrovirus y retrotransposones
- el típico genoma de retrovirus está flanqueado por dos regiones repetidas (LTR, long
terminal repeats) y los genes gag (forma la cápside), pol (transcriptasa reversa [RT],
proteasa, integrasa) y env (glicoproteinas de la membrana del virus);
genoma de
retrovirus
- los genoma animales contienen miles de copias de genomas de retrovirus inactivos;
- 5-8% del genoma humano está compuesto por restos de antiguos retrovirus (ERV;
endogenous retroviruses); las copias tienen múltiples mutaciones y ninguna puede
formar un retrovirus infectivo; muchas consisten solamente de la región LTR
Retrovirus y retrotransposones
- retrotransposones de LTR son una clase especial de transposones derivados de
retrovirus; son flanqueados por dos LTR pero no contienen todos los genes
necesarios para formar una partícula viral; sí contienen la pol
genoma de
retrovirus
elemento
Ty de levadura
elemento copia
de Drosophila
Retrovirus y retrotransposones
- retrotransposones de LTR son una clase especial de transposones derivados de
retrovirus; son flanqueados por dos LTR pero no contienen todos los genes
necesarios para formar una partícula viral; sí contienen la región pol;
ciclo simplificado de
movimiento de un
retrotransposón
- la región LTR sirve como promotor; el transcripto codifica la RT y otras proteinas, que
convierten la secuencia de RNA en una secuencia de DNA y lo integran al genoma;
- la copia de DNA se integra en otro sitio del genoma (transposición replicativa) de la
misma célula, no puede entrar a células vecinas como los genomas de retrovirus;
Retrovirus y retrotransposones
mecanismo de retrotranscripción
(parte I)
mediada por la transcriptasa reversa
Retrovirus y retrotransposones
mecanismo de retrotranscripción
(parte II)
mediada por la transcriptasa reversa
Retrovirus y retrotransposones
mecanismo de integración del DNA
doble cadena del retrotransposón en un
sitio del genoma
la integrasa es la única enzima
necesaria para ese proceso
Elementos Ty en levaduras
- levaduras tienen una familia de retrotransposones denominados Ty;
- tienen ~6.3 kb y dos secuencias LTR (delta) de 330 bp;
- hay varios tipos de Ty; el genoma típico de S. cerevisiae contiene ~30 copias de Ty1
y ~6 copias de Ty917;
- se transcriben dos RNAs (5.7 y 5.0 kb) que codifican
dos ORFs: TyA (similar a la proteina gag) y TyB
(similar a la RT, proteasa y integrasa);
Elementos Ty en levaduras
- levaduras tienen una familia de retrotransposones denominados Ty;
- tienen ~6.3 kb y dos secuencias LTR (delta) de 330 bp;
- hay varios tipos de Ty; el genoma típico de S. cerevisiae contiene ~30 copias de Ty1
y ~6 copias de Ty917;
Ty VLPs
- mobilización de Ty genera virus-like particles
(VLPs) en el citoplasma de las levaduras;
- las VLPs no son infectivas; contienen RNA,
DNA, retrotranscriptasa, integrasa y la proteina
TyA procesada;
Retrotransposones sin LTR
- retrotransposones sin LTR también se movilizan por un RNA intermediario pero no
contienen regiones LTR a los extremos;
- los elementos LINE (long interspersed nucleotide elements) son comunes en
mamíferos; corresponden a ~17% del genoma humano;
- poseen dos ORFs; la ORF2 codifican una endonucleasa (en) y la transcriptasa
reversa (rvt); son elementos autónomos;
- el promotor se sobrepone con la región transcripta como la 5' UTR del RNA;a los
extremos tiene pequeñas duplicaciones del DNA blanco (TSD, target site duplications)
LINE-1
(6 kb)
Retrotransposones sin LTR
- la retrotranscripción y la inserción del elemento LINE-1 están acopladas:
- ORF2 corta una hebra de la secuencia
blanco (TTTT), que hibrida con la cola del
RNA del LINE-1 y es usada como primer
para la síntesis de las cadenas de DNA
Retrotransposones sin LTR
- hay retrotransposones sin LTR que no se pueden mobilizar solos; no codifican ninguna
proteina y necesitan la transcriptasa reversa (ORF2) de un elemento LINE para
transponerse (elementos no-autónomos);
- estos elementos se denominan SINE (short interspersed nucleotide elements) y son
muy comunes en mamíferos;
- en humanos, hay 1 millón de copias de elementos Alu, que corresponden a ~15% del
genoma;
- SINEs comunes en ratones son los elementos B1 y B2;
promotor
(pol III)
TSD: target site
duplication
monómeros derivados
del RNA 7SL
Elementos Alu
- en humanos, hay 1 millón de copias de elementos Alu, que corresponden a ~15% del
genoma;
- tienen un promotor con cajas A y B, transcripto por la RNA polimerasa III;
- poseen dos regiones duplicadas derivadas del gen del RNA 7SL (signal recognition
particle):
Elementos Alu
- los RNAs de Alu interaccionan con los ribosomas;
- cuando una molécula de RNA de ORF2 de un LINE es traducida, la cola poly A del Alu
puede tomar el lugar de la cola poly A del RNA del LINE;
- como resultado, la proteina ORF2 transpone el RNA del elemento Alu en lugar del RNA
del LINE (los Alus son parásitos de parásitos)
ORF2
Classificación de los elementos genéticos móviles
clase II
clase I
(DNA)
(intermediario de RNA)
Abundancia de elementos genéticos móviles
- ~43% de la secuencia del genoma humano corresponde a transposones;
- solamente están activas algunas copias de LINE-1 (pueden causar enfermedades)
Consecuencias de la actividad de transposones
- en bacterias, los transposones participan del intercambio de genes entre individuos y
especies (poco comun en eucariotas);
- en general la actividad de los transposones es deleteria; causa mutaciones,
hemofilia en humanos
causada por inserciones de
elementos LINE-1 en el gen
del factor VIII
- procesos de recombinación aberrante entre copias de transposones pueden dar origen
a inversiones, deleciones y duplicaciones;
- ocasionalmente puede contribuir para generar variación génica ventajosa (por ejemplo
por exon shuffling o generando nuevas regiones regulatorias)
Consecuencias de la actividad de transposones
- exon shuffling causado por un error en la transposición puede, ocasionalmente, generar
algun gen nuevo ventajoso para el organismo:
Uso de transposones como herramientas
- mutagénesis por inserción;
- clonado posicional de genes (gene tagging);
- estudio de secuencias regulatorias;
- transgénesis en insectos, peces y otros organismos
- terapia génica
Peces transgénicos
- utiliza el transposón de DNA Tol2,
encontrado en el pez medaka
- microinyección en embrión de 1-célula:
plásmido con gen de interés
flanqueado con sitios Tol2
mRNA de transposasa Tol2
- la transposasa integra gen de interés
al genoma de las células del embrión
(se genera un pez mosaico);
- peces transgénicos pueden ser usados
para generar una linea estable si el
transgén se encuentra insertado en la
linea germinal.
Kawakami Genome Biology 2007 8(Suppl 1):S7
Sundaresan et al Gen Dev 1995
Enhancer trap
- técnica para encontrar nuevos genes y enhancers expresados en regiones de
interés de un organismo;
- ejemplo: enhancer trap en Arabidopsis usando el sistema Ac/Ds
- generación de plantas con el elemento Ac no transponible (sin las repeticiones
flanqueantes) y un elemento Ds transponible con un promotor mínimo ríoarriba de un
reportero (GUS)
- si el elemento Ds se ubica cerca de un enhancer (E), el reportero se activará en una
región específica
Nakayama et al Plant Cell 2005
Enhancer trap
- ejemplo: enhancer trap en Arabidopsis usando el sistema Ac/Ds
flores de Arabidopsis expresando
GUS en diferentes regiones (pétalos,
anteras, sépalos) de acuerdo al sitio
de inserción del elemento Ds
modificado