3. Técnicas de microscopía con luz visible y sus aplicaciones

3. Técnicas de microscopía
con luz visible
y sus aplicaciones
Técnicas de microscopía con luz visible
●
Microscopías de campo claro y campo oscuro
●
Microscopía de polarización
●
Microscopía de contraste de fases
●
Microscopía de contraste interferencial
(Nomarski)
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo claro
Se contrasta el objeto que se observa del medio que
le rodea o las diferentes partes del mismo objeto
gracias a que la luz que lo atraviesa con respecto a
la que no lo atraviesa presenta diferencias
en su longitud de onda (diferencias de color)
y/o de amplitud (diferencias de intensidad)
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo claro
Int. del fondo – Int. de la muestra
% contraste =
x 100
Int. del fondo
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro
La imagen se forma sólo con los rayos difractados por
el objeto.
(Es el mismo principio que nos permite ver las
estrellas de noche o las partículas de polvo en un
rayo de luz cuando entramos en una sala oscura.)
Especialmente indicada para muestras con poco
contraste.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro
objetivo
muestra
condensadora
diafragma
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro
La luz se hace incidir muy oblicuamente sobre la
preparación.
Los rayos que la atraviesan o no, pero que siguen
más o menos la trayectoria inicial no son recogidos
por el objetivo.
Sólo la luz que es difractada por el objeto, o que el
objeto refleja casualmente, llega al objetivo.
De esta manera la imagen del objeto aparece clara
sobre un fondo oscuro.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro
Esta iluminación está especialmente indicada para
preparaciones delgadas y sin teñir.
Glóbulos rojos
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro
Montaje de organismos vivos del agua
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro
Es especialmente útil para observar células en
suspensión.
Permite encontrar fácilmente el plano focal correcto
a bajos aumentos en muestras pequeñas y con
poco contraste.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro
Es necesario emplear un objetivo con una A.N. algo
inferior a la A.N. que ilumina la condensadora de
campo oscuro para evitar que luz directa entre en
la imagen.
La eficacia de este sistema también depende de
que el haz luminoso sea intenso y no dispersado,
ya que sólo se va a utilizar parte de la luz.
Para ello se usa una fuente luminosa homogénea y
brillante como un filamento incandescente.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
LUZ POLARIZADA:
Las ondas electromagnéticas son de naturaleza
transversal, es decir, el vector de vibración es
perpendicular a la dirección del desplazamiento.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
LUZ POLARIZADA:
Si se restringe la vibración de los vectores
eléctricos a un solo plano mediante un filtro se
obtiene luz linealmente polarizada respecto a un
solo plano de vibración.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
LUZ POLARIZADA:
Los polarizadores son filtros que contienen
moléculas poliméricas de cadena larga orientadas
en una única dirección.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
LUZ POLARIZADA:
Si ahora un rayo polarizado incide sobre una
segunda lámina polarizadora, la intensidad y la
amplitud de la onda que atraviese la segunda
lámina dependerán del ángulo de incidencia
respecto a la dirección de polarización.
●
●
Si las dos láminas son paralelas en sus direcciones
de polarización, se transmite toda la luz.
Si las dos láminas son perpendiculares, el rayo no
consigue atravesar la segunda.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
Polarización cruzada
La base de la microscopía de polarización.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
Birrefringencia:
Existen materiales que poseen doble refringencia.
Esta propiedad es indicativa de anisotropía óptica,
es decir, que el comportamiento de la luz al
atravesarlos no es el mismo independientemente
de la dirección en la que incide.
La calcita, CaCO3, es un material birrefringente.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
Birrefringencia:
La luz que entra en un material birrefringente se
descompone en dos rayos.
Cada uno está determinado por un índice de
refracción y cada uno vibra sólo en una dirección
(polarizados) pero a ángulos rectos uno del otro.
Originalmente los polarizadores se hacían de
calcita y se conocen como “Prismas de Nicol”.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
La técnica explota las propiedades ópticas de la
anisotropía para revelar información detallada
acerca de la estructura y composición de los
materiales.
La finalidad es conseguir contrastar las diferentes
estructuras observadas aprovechando que entre
ellas pueda haber alguna que sea capaz de
cambiar el plano de polarización de la luz, es decir,
que haya alguna sustancia birrefringente ella
misma.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
Los microscopios de polarización incorporan dos
láminas polarizadoras.
La primera llamada polarizador se sitúa después de
la fuente luminosa, generalmente en el soporte de
filtros de la subplatina.
La segunda, denominada analizador, se dispone
entre el objetivo y el ocular.
Ambas tienen que girar fácilmente y ser capaces de
fijación. También conviene que estén graduadas
para que se pueda apreciar el ángulo que se giran.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
●
●
Cuando el polarizador se dispone de forma que su
dirección de polarización es perpendicular a la del
analizador el campo aparece totalmente oscuro en
ausencia de la preparación.
Al colocar la muestra aquellas zonas de la
preparación que no sean capaces de variar el plano
de polarización de la luz que las atraviesa
aparecerán completamente oscuras.
Mientras que las que sí sean capaces aparecerán
más o menos claras según la magnitud de la
variación en el plano de polarización que sufra la
luz al atravesarlas.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
Dominios de nucleación
de cristal líquido ferroeléctrico
Coke de petróleo
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización
Almidón de maíz
Diatomeas
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
●
La mayoría de los detalles de las células vivas son
indetectables mediante la microscopía de campo
claro porque hay muy poco contraste entre las
estructuras ya que tienen similar transparencia y
son incoloras.
●
A
no
ser
que
el
medio
de
montaje
sea
extremadamente fino, el modo de campo oscuro
puede distorsionar los detalles.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
●
Es
una
técnica
de
aumento
de
contraste
especialmente indicada para la observación de
muestras transparentes o sin teñir.
Permite
observar
muestras
vivas
sin
que
previamente haya que matarlas, fijarlas y teñirlas.
●
Así, la dinámica de los procesos biológicos se
puede observar y grabar con elevado contraste y
los pequeños detalles de la muestra se ven con
gran claridad.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
●
Se basa en el hecho de que cuando interfieren
ondas que tienen un determinado desfase se
produce una interferencia constructiva (con mayor
amplitud) o destructiva (con menor amplitud).
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
Interferencia
constructiva
+
=
Interferencia
destructiva
+
=
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
●
El objetivo es manipular el desfase de dos haces
de luz para trasladar esas pequeñas variaciones de
fase a los correspondientes cambios de amplitud
que se visualizan como diferencias de contraste.
●
Pequeñas diferencias de fase se convierten en
cambios de intensidad.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
Luz incidente
Desfase
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
●
El contraste de fases básicamente es un método de
iluminación que trata una determinada porción de la
luz (la que ha sufrido difracción al atravesar el
objeto) de forma diferente al resto (la que no ha
sufrido ninguna alteración) para, a continuación,
provocar que la primera porción de la luz interfiera
con el resto, de manera que resulte una imagen
visible de una muestra transparente.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
La formación de la imagen es un resultado de la
interferencia de la luz directa y la luz difractada.
La luz directa (sin desviar) se proyecta por el
objetivo y se extiende de forma homogénea en el
plano imagen en el diafragma del ocular. Allí la luz
difractada
causa
interferencia
y
reduce
la
intensidad dando lugar a áreas más o menos
oscuras.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
Luz de la fuente
Anillo anular
Lente condensadora
Muestra
Lente objetivo
Placa de fase
Plano focal posterior
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
●
El primer paso es separar la luz directa de la luz
difractada. Para ello se coloca, en el plano focal de
la condensadora, un diafragma anular que proyecta
en el infinito la imagen de un haz anular.
Este cono de luz hueco pasa a través de la muestra
sin desviarse y la débil luz difractada por la muestra
se extiende en todo el plano focal posterior del
objetivo.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
Luz de la fuente
Anillo anular
Lente condensadora
Muestra
Lente objetivo
Placa de fase
Plano focal posterior
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
●
Después se acelera la luz que no se ha desviado
mediante una lámina colocada en el plano focal
posterior del objetivo, que contiene un anillo,
llamado anillo de fase.
Este anillo es más fino que el resto de la lámina de
forma que la luz que pase a través de él (la luz no
difractada) viaja una distancia más corta al
atravesar el objetivo que la luz difractada.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
Luz de la fuente
Anillo anular
Lente condensadora
Muestra
Lente objetivo
Placa de fase
Plano focal posterior
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
●
Así, cuando la luz directa y la luz difractada llegan
al plano imagen están desfasadas en ½ λ y cuando
interfieren lo hacen destructivamente y los detalles
de la muestra aparecen oscuros sobre un fondo
más claro.
●
El efecto final es la imagen de una muestra que
tuviera variaciones de densidad en lugar de
variaciones de índice de refracción.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
AJUSTE DEL MICROSCOPIO:
●
La correspondencia entre las placas de fase de los
objetivos
y
los
diafragmas
anulares
de
la
condensadora ha de ser exacta. A cada placa le
corresponde un diafragma anular y el centrado de
ambos ha de ser exacto.
●
El centrado se realiza con una lente de Bertrand
que permite enfocar el diafragma anular del
condensador.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
AJUSTE DEL MICROSCOPIO:
●
La iluminación de Köhler debe estar ajustada y el
diafragma de apertura completamente abierto para
trabajar en modo contraste de fases.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
AJUSTE DEL MICROSCOPIO:
●
Para centrar las placas con el diafragma anular se
inserta la lente de Bertrand y se enfoca.
Se gira el disco de la condensadora para insertar el
diafragma anular que corresponda y se hacen
coincidir con unos tornillos de ajuste
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
Limitaciones:
●
Las imágenes presentan “halos” alrededor de los
detalles.
●
Puede empeorar la resolución.
●
No funciona bien con muestras gruesas porque los
desplazamientos de fase ocurren en áreas ligeramente
por debajo o por encima del plano de foco.
Estos desplazamientos pueden confundir y distorsionar
los detalles de la imagen.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
Pescado cteonide
(teleosteo)
Células ováricas
de hamster
Glóbulos rojos
humanos
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
Nomarski
DIC
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
El principio es el mismo que en el caso de una placa de
fases:
La interacción de los rayos difractados por el objeto con
rayos que no lo hayan atravesado de manera que se
puedan apreciar diferencias de amplitud derivadas de
esta interacción.
●
Pequeñas diferencias de fase se convierten en
cambios de intensidad entre las zonas adyacentes.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
●
El dispositivo consiste en la separación de los rayos
provenientes del condensador en dos haces que viajan
en direcciones ligeramente diferentes.
●
Después de atravesar el objeto los dos haces son
recombinados.
●
El diferente desfase causado por el objeto en los haces
se transforma en un contraste de amplitud al sumarse o
restarse las fases de éstos.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
●
Si
la
iluminación
es
monocromática
la
imagen
presentará un contraste de intensidad con el fondo.
●
Si la iluminación es policromática, como la variación de
fase introducida por el objeto depende de la longitud de
onda, el resultado será una imagen de colores sobre un
fondo elegible (mediante el ajuste de la diferencia de
camino entre los haces).
●
Esta técnica elimina los efectos de halo de la
microscopía de contraste de fases.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
●
●
●
Los sistemas de contraste diferencial interferencial
desarrollados por Nomarski emplean un filtro de
polarización para producir luz vibrando sólo en un
plano perpendicular a la dirección del haz de luz.
Este haz pasa a través de un prisma de Wollaston
modificado que separa el haz de luz en dos rayos
perpendiculares el uno al otro (de modo que no
pueden causar interferencia).
Los dos rayos pasan a través de la lente
condensadora y emergen como dos haces
paralelos que están extremadamente juntos, pero
que tienen una ligera diferencia de caminos.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
●
●
●
El haz separado entra en la muestra y ambos
haces son desviados de acuerdo con su interacción
con las características de la muestra (grosor, forma
e índice de refracción).
Los dos haces de luz alterados individualmente por
sus interacciones con la muestra pasan a través del
objetivo y se recombinan por el prisma combinador
de haces de Wollaston modificado, después de
atravesar el objetivo.
Esto elimina el corte o distancia y la diferencia de
caminos original entre el par de haces.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
●
●
●
Como resultado de haber atravesado la muestra,
los caminos de los dos haces paralelos no son de
la misma longitud (hay una diferencia de camino
óptico) para las diferentes áreas de la muestra.
Para que ambos haces puedan interferir, las
vibraciones de los haces de diferente longitud de
caminos se deben llevar al mismo plano y eje.
Para ello se coloca un segundo polarizador (el
analizador) a continuación del prisma de Wollaston
recombinador.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
●
●
●
El haz de luz pasa a través del analizador cruzado
con el primer polarizador que los lleva al mismo
plano y eje.
Así ocurre una diferencia interferencial entre los
dos haces originalmente independientes que se
observan como diferencias en intensidad y color.
Las diferencias en la intensidad de la luz o el color
observado dependen de variaciones en los índices
de refracción y/o grosor de las muestras.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
●
Cuando el segundo prisma se coloca de forma que
produzca la imagen más gris se produce la visión
tridimensional más evidente de la muestra.
Rotando la muestra 180º se consigue que las
zonas que aparecían elevadas aparezcan hundidas
y viceversa.
●
Con una fuente de luz blanca, la luz de diferentes
colores tiene diferentes longitudes de camino
después de atravesar la muestra.
Algunas áreas generan interferencia constructiva
para un color y destructiva para otros.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
Alga spirulina
Contraste de fases
Contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
Cianobacteria
Contraste de fases
Contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial
Glóbulos rojos
Contraste de fases
Contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Aplicaciones
Según la configuración del microscopio:
●
Microscopios derechos:
●
●
Preparaciones de cortes histológicos y cortes semifinos,
frotis, células vivas, muestras microbiológicas, láminas
geológicas delgadas, probetas de ciencia de materiales
de tamaño reducido, …
Microscopios invertidos:
●
Preparaciones de cortes histológicos y cortes semifinos,
frotis, células cultivadas dentro de cámara de cultivo,
plancton
y
microorganismos
en
suspensión,
microorganismos cultivados en placa de Petri,
micromanipulación de células y embriones, probetas de
ciencia de materiales, trabajo con subplatinas especiales,
...
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Aplicaciones
Según el tipo de iluminación:
●
Microscopía de campo oscuro:
●
Está especialmente indicada para muestras con
poco contraste:
espiroquetas, flagelatos, suspensiones celulares,
técnicas de flujo celular, parásitos, conteo de
granos de autorradiografía, ...
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Aplicaciones
Según el tipo de iluminación:
●
Microscopía de luz polarizada:
●
●
Estudio de todas aquellas estructuras en las que se
prevé una cierta ordenación que las hará,
probablemente, anisótropas, tales como las paredes
de celulosa de las células vegetales, las fibras
musculares, etc.
Casos de interés clínico como la detección de
diferentes sustancias minerales en los tejidos: sílice
y asbestos en los tejidos pulmonares, mica y
almidón en granulomas postoperatorios, etc.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Aplicaciones
Según el tipo de iluminación:
●
Microscopía de luz polarizada:
●
●
Estudio de moléculas biológicas altamente
ordenadas como DNA, almidón, madera y urea.
Numerosos cristales, estructuras fibrosas (naturales
y artificiales), pigmentos, lípidos, proteínas, huesos y
depósitos de amiloide exhiben birrefringencia y por
tanto ofrecen información bajo luz polarizada.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Aplicaciones
Según el tipo de iluminación:
●
Microscopía de luz polarizada:
●
●
●
Aplicaciones geológicas, principalmente para el
estudio de minerales en secciones rocosas
delgadas.
Minerales naturales e industriales, materiales
compuestos tales como cementos, cerámicas, fibras
minerales y polímeros.
Identificación de fibras de asbestos, estudio de la
formación rocosa, polímeros naturales y sintéticos,
fibras de nylon, etc.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Aplicaciones
Según el tipo de iluminación:
●
Microscopía de contraste de fases:
●
Obtención de imágenes de elevado contraste de
muestras transparentes:
Células
vivas
(generalmente
en
cultivo)
microorganismos, secciones finas de tejido,
patrones de litografía, fibras, dispersiones de látex,
fragmentos de vidrio y partículas subcelulares
(incluyendo el núcleo y otros orgánulos).
●
Secciones en parafina o resina sin teñir y muestras
congeladas.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Aplicaciones
Según el tipo de iluminación:
●
Microscopía de contraste de fases:
●
●
●
●
En investigación médica y biológica especialmente
en los campos de citología e histología:
Visualización de componentes celulares internos
como las membranas, núcleo, mitocondrias,
cromosomas, aparato de Golgi y gránulos del
citoplasma en células animales y vegetales.
Diagnóstico de células tumorales y para ver el
crecimiento, dinámica y comportamiento de una
gran variedad de células vivas en cultivo.
Hematología, virología, bacteriología, parasitología,
paleontología y biología marina.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Aplicaciones
Según el tipo de iluminación:
●
Microscopía de contraste de fases:
●
●
●
Aplicaciones químicas e industriales: mineralogía,
cristalografía
y
morfología
de
polímeros.
Microcristales sin color, polvo, partículas sólidas y
polímeros cristalinos que tienen un índice de
refracción que difiere sólo ligeramente del medio de
inmersión.
Productos comerciales como arcillas, grasas,
aceites, jabones, pinturas, pigmentos, alimentos,
drogas, tejidos y otras fibras.
Examen de superficies: circuitos integrados,
dislocaciones cristalinas, defectos y litografía.