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7.012 Serie de ejercicios 4
Pregunta 1
Usted está estudiando la síntesis del aminoácido triptófano en las bacterias. Las enzimas
TrpA, TrpB, TrpC, TrpD, TrpE and AroH son necesarias para la síntesis del triptófano. En
presencia de triptófano, la bacteria de tipo salvaje no sintetiza ninguna de estas enzimas, sin
embargo, en ausencia de triptófano, todas estas enzimas lo hacen en grandes cantidades.
a) En términos teóricos, si la síntesis de las anteriores enzimas se regula
negativamente:
I) ¿Qué cambio en la proteína represora haría que las enzimas se sintetizaran incluso
en presencia de triptófano?
II) ¿Qué cambio en la secuencia operadora haría que las enzimas se sintetizasen incluso
en presencia de triptófano?
III) ¿Qué cambio en la proteína represora causaría la inhibición de la síntesis de las
enzimas incluso en ausencia de triptófano?
b) Si la síntesis de las anteriores enzimas se regula positivamente,
I) ¿Qué cambio en la proteína activadora haría que las enzimas se sintetizaran
incluso en presencia de triptófano?
II) ¿Qué cambio en la proteína activadora impediría la síntesis de las enzimas, incluso
en ausencia de triptófano?
III) ¿Qué cambio en la secuencia operadora impediría la síntesis de enzimas, incluso en
ausencia de triptófano?
c) Mediante un análisis mutacional se identifican dos regiones de ADN muy
importantes en la regulación de la síntesis del triptófano. La primera de estas
regiones, llamada trpR, es un gen que codifica una proteína enlazada con el ADN.
La segunda región es una secuencia de ADN, llamada trpO, a la que se une el
producto del gen trpR. El análisis de las 3 cepas bacterianas con diferentes
genotipos en los loci trpR y trpO arroja los siguientes resultados:
Cepa
Medios de crecimiento
trpR + trpO +
con triptófano
sin triptófano
0,1%
100%
trpR – trpO +
con triptófano
sin triptófano
100%
100%
trpR + trpO –
con triptófano
sin triptófano
100%
100%
I)
II)
Niveles ARNm de trpA,trpB
trpC, trpD y trpE
¿El control de la síntesis de triptófano es un ejemplo de regulación positiva o
negativa?
La proteína producida a partir de un gen trpR, ¿es activadora o represora?
d) Los experimentos para controlar la presencia o ausencia de enzimas producidas por
los genes trpC, trpD, trpE y aroH en algunos mutantes aislados muestran los
siguientes resultados:
tipo salvaje
mutante
1
2
3
4
5
Nivel TrpC
con triptófano
Sin triptófano
+
-
+
+
-
+
+
Nivel TrpD
con triptófano
Sin triptófano
+
+
-
+
-
+
+
Nivel TrpE
con triptófano
Sin triptófano
+
+
+
+
-
+
+
Nivel AroH
con triptófano
Sin triptófano
+
+
+
-
+
+
+
I) Enumere todos los mutantes cuyas mutaciones afectan a la producción de cualquier
TrpC funcional.
II) Enumere todos los mutantes cuyas mutaciones afectan a la producción de cualquier
TrpD funcional.
III) Enumere todos los mutantes cuyas mutaciones afectan a la producción de cualquier
AroH funcional.
Pregunta 1 (continuación)
e) ¿Coinciden los datos anteriores con la teoría de que cualquiera de estos genes se
encuentra en el mismo operón (y por lo tanto bajo el control de un solo promotor)?
¿Por qué? ¿Qué genes estarían contenidos en dicho operón?
f) ¿Cómo explicaría el mutante 5 en términos de mutaciones reguladoras?
Pregunta 2
Trabajando con ratones dentro del programa de oportunidades de investigación para
universitarios descubre una enzima catabólica muy importante. Usted realiza
mutaciones en el gen codificador de esa enzima de forma que la enzima mutante esté
siempre activa. Los ratones portadores de dicho gen pierden peso de forma rápida y
permanente sin otros efectos secundarios. ¡HA DESCUBIERTO POR FIN LO QUE
MILLONES DE PERSONAS EN TODO EL MUNDO HAN BUSCADO DURANTE
AÑOS Y AÑOS! Pero... necesita la versión humana de este gen.
Para empezar, decide organizar una biblioteca de ADN genómico humano.
a) A continuación, explique resumidamente cómo haría usted una biblioteca de
ADN genómico humano en bacterias. Incluya los términos: ADN genómico,
enzima de restricción, plásmido, ligación, transformación, placas de Petri,
sonda e hibridar.
Consigue encontrar el homólogo humano. Ha localizado la colonia que contiene
plásmido, llamada plib1, en el homólogo humano. Aísla el plásmido, clona el gen y lo
denomina gen esbelto. Ahora, desea expresar muchas enzimas humanas para poder
completar un estudio bioquímico de la proteína. Para ello, debe convertir el gen esbelto
del plásmido plib1 en una expresión vectorial. Tiene una gran expresión vectorial,
p7.01MIT para usar en E. Coli. A continuación se muestra un diagrama de la expresión
vectorial p7.01MIT y el plib1 con sus únicos sitios de enzimas de restricción.
b) Quiere insertar un fragmento de ADN, que contiene el gen esbelto y el gen resistente a la
kanamicina (kan R ), en la expresión vectorial p701MIT.
I)
¿Qué enzima o enzimas utilizaría para cortar plib1 y así obtener un solo
fragmento que contenga el gen esbelto y el gen resistente a la kanamicina
(kan R )? ¿Qué tamaño tendrían los fragmentos obtenidos?
II)
¿Qué enzima o enzimas utilizaría para cortar plib1? ¿Qué tamaño tendrían
los fragmentos obtenidos?
c) Después de la ligación, transforma su nuevo vector p701MIT, que contiene el gen esbelto
y el gen resistente a la kanamicina (kan R ), en una cepa E.Coli.
I) Antes de llevar a cabo la transformación, esta cepa de E.Coli debería ser... (rodee
con un círculo la opción adecuada)
Resistente a la ampicilina
Resistente a la kanamicina
Sensible a la ampicilina
Sensible a la kanamicina
II) ¿Cómo detectaría las células que poseen un vector que contiene a su vez el gen
esbelto?
III) ¿Qué ventaja hay al incluir el gen kan
p701MIT?
R
en el fragmento que clonó en un
Pregunta 3
a) Aísla las células que se comportan según lo previsto. Del mismo modo, aísla el
vector contenido en dichas células. Para confirmar que ese vector es el p701MIT que
contiene el gen esbelto, usted lleva a cabo una serie de restricciones de digestión. En
la siguiente tabla, marque los lugares donde cree que puede encontrar bandas.
Escriba en cada banda el número de bases que puede contener el fragmento.
Ahora que ha conseguido clonar la versión humana del gen esbelto y puede expresar
la proteína, la revista Science y varias empresas de biotecnología están llamando a
su puerta insistentemente. ¡Podría hacerse de oro antes de licenciarse en la MIT! Sin
embargo, un licenciado escéptico y resentido le explica que siempre es una buena
idea secuenciar genes recién clonados para asegurarse de que tiene lo que cree que
tiene. Así que usted decide secuenciar el gen esbelto.
b) En el siguiente fragmento de ADN de una sola hebra, obtenga la secuencia en
base 10 cebador que se podría usar para secuenciar el fragmento. Marque los
extremos 5’ y 3’ del cebador. Este cebador debe hibridar las primeras 10 bases por
un extremo y alargarse en la reacción de secuenciación.
5’
ATGCTGGGCGTAAAGGCCCGCTACTGATACTC
cebador:
3’
c) ¿Cuál es la secuencia del ADN recién sintetizado? Incluya y marque el cebador y
marque los extremos 5’ y 3’.
Pregunta 4
Imagine que es usted un consejero genético del hospital de Boston. Una pareja
(cuyo árbol genealógico se muestra debajo) acude a usted para conocer la
probabilidad de que el hijo que esperan nazca con las orejas grandes.
Hace muy poco que se clonó y secuenció el gen que causa las orejas grandes. A
continuación se muestra la región que rodea el gen regulador del tamaño de las
orejas.
a) Quiere amplificar este gen de cada uno de los progenitores utilizando PCR
(reacción en cadena de la polimerasa). Obtenga la secuencia de dos cebadores para
dicha reacción de PCR. Marque los extremos 5’ y 3’.
cebador A:
cebador B:
b) A continuación encontrará un esquema de la misma región. Dibuje en el
diagrama de debajo dónde debería unirse cada cebador.
c) En un esquema como el anterior (b), dibuje las hebras de ADN que estarían
presentes después de 2 series de reacción en cadena de la polimerasa. Incluya los
cebadores en cada hebra donde sea necesario.
Pregunta 4
A continuación se muestra un mapa de restricción de esta región:
El ADN, amplificado con PCR, de cada miembro de la familia se ha asimilado con
Hind III, Nde I y Bgl II. El ADN asimilado ha sido separado mediante electrofóresis
en gel. Los resultados son los siguientes:
d) El fenotipo de las orejas grandes, ¿es dominante o recesivo? ¿Cómo se determina
esto?
e) Después de observar el árbol genealógico y la tabla, ¿qué posibilidad hay de que
los individuos 1 y 2 tengan hijos con las orejas grandes? Explíquelo.