Página 1 de 3 Info 11/2014 Diagnóstico laboratorial de procesos inflamatorios: Proteínas de fase aguda y electroforesis capilar PROTEÍNAS DE FASE AGUDA Ante una inflamación, el organismo reacciona con una respuesta inmune no específica conocida como respuesta de fase aguda. Durante esta respuesta se liberan citoquinas, tales como interleucina-1, interleucina-6 o interferón que desarrollan una importante función mediadora. Tras su liberación por células endoteliales, fibroblastos, macrófagos y granulocitos, las citoquinas se dirigen por el torrente sanguíneo hacia el hígado. Ante una infección, daño tisular, crecimiento neoplásico o desorden inmunológico, estas células inmunocompetentes estimulan, junto a cortisol, la síntesis de aproximadamente 20 proteínas de fase aguda (APPs) diferentes. Estas APPs a nivel local son las responsables de limitar la infección así como de eliminar toxinas o sustancias nocivas por fagocitosis. A nivel sistémico, protegen el organismo frente endotoxinas y son responsables del desencadenamiento de la respuesta inmune, resultando en el incremento de la temperatura corporal y en el aumento del recuento leucocitario. Según la variación que se produce en su concentración estas proteínas pueden ser clasificadas en proteínas de fase aguda positivas o negativas. Las proteínas de fase aguda positivas son aquellas cuya concentración se ve aumentada al menos un 25% durante la reacción de fase aguda. En contraste, la concentración de las proteínas de fase aguda negativas disminuye durante la reacción de fase aguda. Proteína C reactiva La proteína C reactiva (CRP) es considerada un marcador importante para el diagnóstico de inflamación durante la reacción de fase aguda. Debido a su estructura molecular, esta glicoproteína es capaz de unirse a multitud de bacterias patógenas y antígenos intracelulares, así como de reconocer moléculas extrañas, y realizar un cambio estructural durante la opsonización de bacterias. Adicionalmente conduce a la activación del complemento, estimula la fagocitosis y la producción de citoquinas antiinflamatorias. El análisis de la concentración de CRP es útil para el diagnóstico en el caso de infecciones microbianas, lesiones tisulares necróticas agudas secundarias a trauma o a cirugía, y en caso de que exista sospecha de enfermedad autoinmune acompañada de inflamación (por ejemplo artritis reumatoide, vasculitis inmune), siendo las infecciones bacterianas las que provocan un mayor estímulo. En infecciones agudas o traumas, la síntesis de CRP se inicia a las 6 horas, alcanzando su máximo a las 48 horas para descender posteriormente, con una vida media de 48 horas. La concentración de CRP es directamente proporcional al daño tisular o severidad de la inflamación, volviendo a descender rápidamente tras el tratamiento. Por lo tanto, CRP es un excelente marcador del éxito de la terapia antibiótica en perros. Adicionalmente, la concentración de CRP aumenta antes que el nivel de leucocitos, los cuales requieren de 3 días. En el gato, la CRP parece no reaccionar ante una inflamación, por lo tanto no se debería de tener en cuenta para el diagnóstico de inflamación. Amiloide A sérico El amiloide A sérico (SAA) es una proteína de fase aguda y bajo peso molecular, unida a lipoproteínas de alta densidad (HDL) en el plasma. SSA es el precursor de la proteína A amiloidea, principal componente del amiloide A y decisivo durante el desarrollo de amiloidosis e inflamaciones crónicas. Durante la respuesta de fase aguda SAA es sintetizado en hígado tras la estimulación de interleucina-6. Desde un punto de vista diagnóstico su determinación permite identificar infecciones bacterianas o virales, así como inflamaciones leves. LABOKLIN • LABOR FÜR KLINISCHE DIAGNOSTIK GMBH & CO.KG Steubenstraße 4 • 97688 Bad Kissingen • Tel.: +34 644 030 557 • Fax: 0971-68548 • E-Mail: [email protected] • www.laboklin.com Página 2 de 3 Info 11/2014 El nivel de SAA aumenta aproximadamente 8h tras el inicio de la respuesta de fase aguda, sobrepasando el intervalo de referencia antes que la CRP. A diferencia de la CRP, la SAA suele estar aumentada en infecciones leves, tales como las infecciones virales. Adicionalmente, SAA es más sensible a inflamaciones leves, y por lo tanto sirve para distinguir infecciones virales de bacterianas. El análisis de SAA está disponible en caballo, perro, gato y ganado vacuno. Haptoglobina La haptoglobina (Hp) es una glicoproteína que se sintetiza en hígado, pero también en pulmones, tejido adiposo, bazo y riñón. La HP se une a la hemoglobina libre (fHb) en plasma, la cual es tóxica y actúa como mediador pro-inflamatorio. FHb contiene hierro que en su forma libre puede unirse a radicales de oxígeno desarrollando efectos dañinos. En caso de hemólisis intravascular, Hp se une a fHb evitando la pérdida renal de hierro. Adicionalmente Hp protege las células del daño oxidativo, inhibe la quimiotaxis de los granulocitos, la fagocitosis y el efecto bactericida. Además, parece inhibir la proliferación de los mastocitos. La identificación de una disminución o aumento en su concentración tiene importante valor diagnóstico. Por un lado, la disminución en los niveles de Hp es indicativa de hemólisis, y por el otro el aumento de su concentración es indicativo de una reacción de fase aguda secundaria a inflamación, infección o enfermedades autoinmunes. El análisis de haptoglobina es usado en el ganado vacuno. Electroforesis de proteínas séricas El proteinograma es una técnica útil para orientar un diagnóstico y evaluar infecciones o inflamaciones agudas y crónicas. Adicionalmente permite la identificación de gammapatías monoclonales y síndromes que cursan con pérdida de proteínas. La separación de las proteínas se lleva a cabo a pH alcalino, debido a la carga neta, punto isoeléctrico y al peso molecular de las proteínas. Electroforesis capilar La electroforesis capilar permite la separación de las proteínas presentes en una disolución de pH básico (9-10). La separación se lleva a cabo en un capilar estrecho (diámetro interno de 50200 μm). Tras aplicar un voltaje de aproximadamente 7.000 voltios los componentes migran hacia el cátodo separándose en diferentes zonas según su movilidad y carga. Las moléculas neutrales también migran hacia el cátodo, pero no se separan. Las fracciones de proteínas se cuantifican en el cátodo mediante el detector ultravioleta, obteniendo una curva con 8 fracciones que incluye: Albúmina, alfa 1 y alfa 2 globulinas, ß1 y ß2 globulinas (o ß globulinas), y gamma globulinas. La electroforesis capilar es una técnica altamente eficiente ya que los volúmenes requeridos son muy pequeños, reduce los tiempos de análisis, y permite la automatización del análisis. Así mismo, permite identificar enfermedades o grupos de enfermedades utilizando el electroferograma (curva de electroforesis), aporta información sobre la actividad inflamatoria de una enfermedad, y finalmente es una ilustración esquemática muy útil para la evaluación del curso de una enfermedad. Electroforesis capilar: fracciones Fracción albúmina: prealbúmina albúmina a-lipoproteína (HDL) Alfa globulina: alfa 1: - glicoproteína a ácida - a antitripsina alfa 2: - a macroglobulina - haptoglobina Beta globulina: beta 1: - hemopexina - transferrina beta 2: - C4 complemento - CRP - C3 complemento Gamma globulina: inmunoglobulina Página 3 de 3 Info 11/2014 Figura 1: perro con la inflamación aguda (alfa globulina) y producción de inmunoglobulinas (beta, gamma-globulinas) Kapillarelektrophorese Fracción Albúmina: Alfa: Beta Gamma % g/dlPerro: 28,7 41,33 Alb.: 47 - 59 % 27,5 39,60 Alfa-glob.: 9 - 15 % 10,7 15,41 Beta-glob.: 14 - 24 % 33,1 47,66 Gamma-glob.: 8 - 18 % Alb/Glo: 0,40 Proteínas totales: 144 g/dl Figura 2: gato con gammapatía monoclonal (gammaglobulina) Kapillarelektrophorese Fracción % g/dl Albúmina: 27,3 44,09 Alfa: 11,8 19,06 Beta 5,5 8,88 Gamma 55,1 89,47 Gatto: Alb.: 45 - 60 % Alfa-glob.: 8 - 15 % Beta-glob.: 10 - 20 % Gamma-glob.: 10 - 28 % Alb/Glo: 0,38 Proteínas totales: 161,5 g/dl LABOKLIN • LABOR FÜR KLINISCHE DIAGNOSTIK GMBH & CO.KG Steubenstraße 4 • 97688 Bad Kissingen • Tel.: +34 644 030 557 • Fax: 0971-68548 • E-Mail: [email protected] • www.laboklin.com