Producción de la Vacuna Cubana Antitifoídica de Polisacárido Vi de

Escalado de Producción de la vacuna cubana antitifoídica de
polisacárido Vi de Salmonella typhi
1
1
1
2
1
1
1
Luis Riverón , Alina Miranda , Julio Oramas , Ana Fernández , Enrique Muñoz , Pedro Gil , Luis Izquierdo , Gustavo
1
1
1
1
1
1
1
1
Sierra , Ramón Barberá , Mario Vieyto , Liliam Nápoles , Johana Díaz , Alina Puig , Xenia Muñoz , Clara Parra ,
1
1
1
1
Marixa Hernández , Ana Puig , Ileana Martínez , Marta Noroña .
1
2
Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción Vacunas y Sueros. Ciudad de La Habana, Cuba.
Facultad de Biología de la Universidad de La Habana, Cuba.
En el Instituto Finlay se viene desarrollando desde el año 1995 un proyecto para producir en Cuba la vacuna antitifoídica
de polisacárido Vi. Durante la fase investigativa se obtuvieron todos los parámetros de operación y control en las distintas
etapas del proceso, de forma tal que facilitara una caracterización del mismo y nos brindaran las ecuaciones de escala
necesarias para obtener los parámetros de operación y control a gran escala. Se garantizó así sistemas geométrica y
dinámicamente similares, lográndose resultados semejantes tanto en la fase de investigación como en la fase de
producción. Por último, se produjeron tres lotes consecutivos de vacuna final (8001, 8002 y 8003) que cumplieron con las
especificaciones de calidad establecidas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para este producto.
Palabras claves: Vacuna, antitifoídica, escalado, polisacárido Vi.
Introducción
La fiebre tifoidea es una enfermedad septicémica que causa
significativos niveles de morbilidad y mortalidad, principalmente
en países en vías de desarrollo. Se ha estimado que
anualmente ocurren alrededor de 33 millones de casos, de los
cuales 0,5 millones tienen un desenlace fatal (7). La incidencia
de la infección varía desde uno o menos casos por 100 000
habitantes en países como en Estados Unidos, hasta 100 o
más casos por 100 000 habitantes en países como Chile,
Indonesia y el subcontinente indio, donde se considera una
enfermedad severa, y donde de un 12% a un 32% de los casos
mueren.
El agente etiológico de la fiebre tifoidea es Salmonella typhi;
una bacteria encapsulada que fue descubierta en 1880 por C.
Eberth y aislada como cultivo puro en 1884 por G. Gaffky.
Los buenos resultados logrados mediante la inmunización con
polisacáridos capsulares contra otras enfermedades invasivas
causadas también por bacterias encapsuladas, tales como los
grupos A y C de Neisseria meningitidis, los neumococos y el
tipo b de Haemophilus influenzae, sentaron las bases para el
desarrollo de la vacuna de polisacárido capsular Vi (1), la que
ha logrado una eficacia en distintos ensayos de campo entre
70%-75% (8), además de haber presentado una baja
reactogenicidad.
En el mundo existen en estos momentos varias tendencias en
este sentido que son: i) la vacuna antitifoídica de células
enteras inactivadas (con acetona o con calor y fenol) que es
altamente reactogénica y en las diferentes pruebas de campo
ha alcanzado una eficacia entre 51% y 67% (9), ii) la vacuna
oral viva atenuada (7) y iii) la vacuna químicamente definida de
polisacárido Vi.
2
El polisacárido Vi es un homopolímero lineal del ácido 1-4 Nacetil-α
α-D galactosa minurónico, O-acetilado parcialmente en
el carbono 3 (6) que ha encontrado también aplicaciones
destacadas al conjugarse covalentemente con una proteína
como portadora (4). En estos momentos su empleo se ha
extendido también al campo de las vacunas combinadas (10).
El objetivo de este trabajo es mostrar los resultados obtenidos
en el escalado realizado a partir de las investigaciones de
procesos para la obtención de polisacárido Vi.
Materiales y Métodos
En la escala investigativa y en la productiva se trabajó con una
cepa de S. typhi Ty2, donada por la Empresa de Producción de
Biológicos "Carlos J. Finlay", de la cual se prepararon los lotes
de trabajo.
Durante la investigación se obtuvo un medio de cultivo óptimo
que maximiza la expresión de polisacárido Vi y luego se utilizó
un fermentador CHEMAP de 35 L de capacidad nominal,
donde se ajustaron los parámetros fundamentales (pH,
aireación, agitación y temperatura) que garantizaran los
mejores rendimientos de polisacárido Vi en cultivo sumergido.
Además se caracterizó el proceso fermentativo de forma tal
que permitiera adoptar el modelo de fermentación deseado y
así poder reproducir el mismo a mayor escala.
A escala productiva se utilizaron fermentadores CHEMAP de
300 L de capacidad nominal y se introdujo la utilización de
centrífugas continuas para la obtención del complejo
policetavlón.
El modelo de fermentación, así como los demás parámetros
que caracterizan el proceso fermentativo fueron calculados
VacciMonitor, mayo de 1999
utilizando el programa de computación "Cinética de
Fermentaciones" desarrollado en la Facultad de Biología de la
Universidad de La Habana.
11) y con el modelo que mejor se correlaciona es con el
logístico. Estas tres evidencias avalan el buen criterio de
escalado utilizado.
A partir del sobrenadante se realizó la purificación del
polisacárido Vi por el método de fenol en frío (1, 4, 5) y fue
ajustado este procedimiento para obtener un mayor
rendimiento del mismo.
Los rendimientos en mg de polisacárido purificado/L de cultivo
promedio (Tabla 2) reflejan una ligera disminución en la fase
productiva, porque fue necesario utilizar centrífugas de flujo
continuo y se probaron diferentes variantes de centrifugación
hasta obtener la que aportó mejores rendimientos. Si se
comparan los rendimientos obtenidos en los procesos a escala
productiva donde se utilizó la mejor variante de centrifugación
(4º y 5º proceso) que fueron de 176,90 mg/L de cultivo y
172,27 mg/L de cultivo respectivamente, siendo el promedio de
174 mg/L de cultivo, con los procesos llevados a cabo en la
fase investigativa, queda demostrada la semejanza en cuanto
a los rendimientos de polisacárido Vi purificado.
Se tomaron los últimos cinco procesos tanto de la etapa
investigativa como de la etapa de producción para realizar las
comparaciones.
Resultados y Discusión
En las Figuras 1 y 2 se observan los perfiles de fermentación
obtenidos en cada etapa, donde se evidencia la repetibilidad
alcanzada en ambos casos.
En la Tabla 1 se muestra que la velocidad específica de
crecimiento máxima promedio (µmáx) alcanzada tanto en la fase
investigativa como en la de producción fue similar, así como
los tiempos de duplicación promedio y el modelo de
fermentación. Si se tiene en cuenta que los polisacáridos
requieren energía para su síntesis, la cinética de formación de
este producto es de la llamada no asociada al crecimiento (10,
Figura 1.
D .O .
Además, se formularon tres lotes consecutivos de vacuna final
(8001, 8002 y 8003) a partir de los lotes de polisacárido Vi
7003, 7004 y 7005, respectivamente, que dieron lugar
aproximadamente a 20 000 dosis de vacunas, llenadas en
condiciones asépticas en bulbos de 10 dosis y que cumplieron
con las regulaciones establecidas para este producto por la
OMS (1).
Perfilde ferm entaciones obtenidas a escala investigativa
( 20 L de cultivo )
10
1
ferm 1
ferm 2
ferm 3
ferm 4
ferm 5
0.1
0.01
0
VacciMonitor, Año 8 No. 5
2
4
Tiem po (h)
6
8
3
Figura 2. Perfilde ferm entaciones obtenidas a gran escala
( 230 L de cultivo )
D .O .
10
1
ferm 1
ferm 2
ferm 3
ferm 4
ferm 5
0.1
0.01
0
2
4
6
8
Tiem po (h)
Tabla 1. Principales Características obtenidas en los procesos fermentativos en las diferentes escalas
Fermentación
Velocidad Específica de
crecimiento Máxima
Promedio
(Desviación Promedio)
Tiempo de
Duplicación Promedio
(Desviación
Promedio)
1,3868
(0,20584)
1,3118
(0,18936)
0,5184
(0,08088)
0,5418
(0,07144)
Etapa Investigativa
En La Planta
de Producción
Coeficiente de
Determinación
Promedio
(Desviación
Promedio)
0,9858
(0,01472)
0,9800
(0,0216)
Modelo de
Fermentación
Logístico
Logístico
Tabla 2. Principales características de los procesos de purificación obtenidas en las diferentes escalas
Proceso de purificación
En etapa
investigativa
En la Planta de
Producción
4
Masa en g. de Polisacárido
Semipurificado
(Desviación Promedio)
7,135
(2,1450)
152,01
(67,94)
Masa en g. de
Polisacárido Purificado
(Desviación Promedio)
3,684
(0,52288)
29,044
(7,4928)
Rendimiento en mg de
Polisacárido Purificado/L de
Cultivo
(Desviación Promedio)
184,19
(26,144)
132,014
(34,0568)
VacciMonitor, mayo de 1999
Referencias
1.
OMS. Normas para la vacuna antitifoídica de polisacáridos
o
Vi (Normas para Sustancias Biológicas N 48). Serie de
Informes Técnicos. 1994; (840).
2.
Levine M. Modern Vaccines Enteric infection. The Lancet.
1990; 335: 958-961.
3.
OMS. Normas para la vacuna de polisacáridos
o
meningocócicos (Normas para Sustancias Biológicas N
23). Serie de Informes Técnicos . 1981; (658).
4.
Cryz, et al. Construction and Characterization of a ViPositive Variant of the Salmonella typhi Live Oral vaccine
Strain Ty21a. Infection and Immunity. 1989; 57:3863-3868.
5.
Virlogeux-Payant I. The Vi Antigen of Salmonella typhi.
Bull. Inst. Pasteur. 1996; 94:237-250.
6.
Lee Fanning W. Typhim Vi Vaccine. Journal of Travel
Medicine. 1997; 4(1):32-37.
7.
Acharya IL, Lowe ChU, Thapa R, Gurubacharya VL,
Shrestha MB, Cadoz M, Schulz D, et al. Prevention of
Typhoid Fever in Nepal with the Vi Capsular.
Polysaccharide of Salmonella typhi. New England Journal
of Medicine. 1987;.317 (October 29):1101-1104.
8.
Ivanoff B. et al. Vaccination against typhoid fever: present
status. Bulletin of the World Healt Organization. 1994;
72(6):957-971.
9.
Ambrosch F., et al. Combined vaccination against yellow
fever and typhoid fever: a comparative trial. Vaccine. 1994;
12 (7):625-628.
10. Gaden, E.L. Fermentation process kinetics. Journal of
Biochemical Microbiol.ogy Technical & Engineering. 1959;
1:413.
11. Sinclair CG, Cantero D. Fermentation modelling. En:
McNeil B y Harvey LM Fermentation a practical approach.
Oxford, England: Press Ltd; 1990: 65-112.
Production Scaling-up of the Cuban Typhoid Vi Polysaccharide Vaccine from Salmonella typhi
Abstract
Since 1995, in our Institute we have been working on a project to produce the typhoid Vi polysaccharide vaccine in Cuba. During the
research stage we obtained all the operation and control parameters in the different steps of the process, in this way enabling its
characterization and obtaining the necessary equations to define the operation and control parameters for industrial scaling-up.
Similar geometrically and dynamically systems were guaranteed, thus achieving similar results for the research stage, as well as for
the production one. Also, three consecutive batches of final vaccine (8001, 8002, 8003 ) were produced and they fulfilled the quality
specifications established by the World Health Organization ( WHO ) for this product.
Keywords: Vaccine, typhoid, scaling-up, Vi polysaccharide.
VacciMonitor, Año 8 No. 5
5
Caracterización físico–química del polisacárido Vi de
Salmonella typhi
1
1
1
2
3
3
Ileana Martínez , Yanín Muñoz , Luis Riverón , Milagros Duarte , Christopher Jones , Xavier Lemercinier ,
1
1
Nápoles , Xenia Muñoz .
Lilian
1
Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción de Vacunas y Sueros. Ciudad de La Habana, Cuba.
Instituto Cubano de Investigaciones Nacionales del Azúcar (ICINAZ). Ciudad de La Habana, Cuba
3
National Institute for Biological Standards and Control (UK).
2
En este trabajo de caracterización del polisacárido Vi de Salmonella typhi se proporcionan algunas herramientas para la
determinación de propiedades estructurales que permitan reforzar los estudios de estabilidad (viscosidad, rotación óptica,
espectros de resonancia magnético nuclear), de identidad y pureza. Los resultados sugieren que es un producto apirogénico
viscoso, con alto contenido de humedad, con alto grado de sustitución de los grupos O-acetilo, con actividad óptica y
estructura similar a la de los polisacáridos de referencia internacionales, determinada por resonancia magnético nuclear.
Palabras claves: Polisacárido Vi, Salmonella typhi, caracterización.
Introducción
La incidencia mundial anual de la fiebre tifoidea excede los
12,5 millones de casos, muchas veces con una alta
mortalidad. El agente causal de esta enfermedad es
Salmonella typhy, bacteria gramnegativa encapsulada. La
infección produce fiebre, hemorragia gastrointestinal, toxemia
sistémica y otras implicaciones (1).
Uno de los factores de virulencia más conocidos es el antígeno
de superficie Vi (polisacárido capsular Vi), el cual es de gran
interés por su empleo potencial en vacunas (1). Está
constituido por la unidad repetitiva del ácido (1→4) N-acetil αD galactosaminurónico, de manera que se presenta como un
homopolímero lineal O-acetilado en la posición del carbono 3
(2).
Se conoce que los grupos O-acetilo de este polisacárido
suelen ser dominantes en la respuesta inmune (3); su peso
molecular es también importante en la inmunogenicidad y la
actividad protectora contra la infección por Salmonella typhi
(4).
Resultan pocos los métodos recomendados por la
Organización Mundial de la Salud (OMS) para el control del
polisacárido Vi vacunal, por lo que continúa la búsqueda
incesante y la incorporación de nuevas técnicas que
enriquezcan el conocimiento en la caracterización de esta
biomolécula. Estos métodos deben ser reproducibles,
específicos y sensibles ante cambios estructurales y en
muchos casos, deben servir como complemento de los que ya
existen para el estudio de la estabilidad del producto.
El objetivo de este trabajo es caracterizar el polisacárido Vi de
Salmonella typhi, producido en el Instituto Finlay, desde el
punto de vista físico-químico, mediante el uso de técnicas
como la cromatografía en gel, viscosidad, rotación óptica
específica, resonancia magnético nuclear (RMN) y
6
electroforesis en geles de poliacrilamida (esta última para la
determinación cualitativa de lipopolisacárido).
Materiales y Métodos
Muestras. Se emplearon 4 lotes de polisacárido Vi purificado,
obtenidos a partir de una cepa de Salmonella typhi, cuya
0
fórmula antigénica es 9,12[Vi]:d y conservados a –20 C
(Instituto Finlay, Cuba). Previo a la caracteriza-ción, los lotes
7003, 7004, 7005 fueron evaluados por el Laboratorio de
Control de Proceso, según los requisitos recomendados por la
OMS (2). Las muestras fueron secadas a vacío sobre CaCl2, a
0
4 C, durante 24 h y resuspendidas en agua destilada o en el
solvente específico para la evaluación.
Métodos
Contenido de humedad. La evaluación se realizó a través del
0
análisis termogravimétrico a 100 C y por secado a vacío con
0
la modificación del empleo de CaCl2, a 4 C (2).
Determinación del contenido de grupos O-acetilo. Se
utilizaron soluciones de referencia de cloruro de acetilcolina
con un rango de concentraciones de 1,66 a 8,3 µmol de Oacetilo/mL. Se evaluó 1 mL de cada una de las muestras con
cantidades de 1,28 a 1,74 mg de peso seco/mL de agua
destilada y se procedió según lo recomendado por Hestrin (5).
Cromatografía en gel. Se realizó según lo recomendado por
la OMS (2) y por Tiesjema y col. en 1977 (6). Se empleó una
columna de 1,6 x 100 cm de Sepharosa 4B equilibrada con
Tris–HCl 0,01 mol/L, NaCL 0,2 mol/L pH 7,4 y un sistema
cromatográfico de baja presión (Pharmacia– Biotech, Suecia).
Se aplicaron muestras de 1,28 a 1,74 mg de peso seco/mL,
disueltas en agua destilada y se determinaron los parámetros
de volumen muerto (Vo, azul dextrana), volumen total (Vt,
acetona), volumen de elución de las muestras (Ve) y la
constante de distribución cromatográfica (Kd). Se determinó
VacciMonitor, mayo de 1999
también la cantidad de polisacárido que eluía con un Kd menor
o igual que 0,25 (2).
Determinación de la viscosidad. Se evaluó el tiempo que
demora una solución de polisacárido en agua destilada, en
recorrer una distancia en el capilar de un viscosímetro
UBBELOHDE (Alemania). Las muestras se disolvieron en
agua destilada hasta concentraciones de 0,1 a 0,14 mg de
peso seco/ mL, en un volumen de 25 mL. Se determinó la
-1
0
viscosidad reducida (Nred) expresada en mL.mg , a 25 C (7).
Rotación óptica específica. Se determinó el parámetro
0
rotación óptica (α ) a 589 nm, con lámpara de halógeno y filtro
para sodio (8) en un polarímetro Sucromat (Alemania). Las
muestras de polisacárido se resuspendieron en agua destilada
(1 a 3 mg por peso seco/mL) y se utilizó una cubeta de 0,5 dm
0
con 5 mL de estas soluciones a 22 C.
Resonancia magnético nuclear. Los espectros fueron
obtenidos en un espectrómetro Varian Unity 500 NMR
equipado con una sonda de triple resonancia y un gradiente de
pulso de campo accesorio, a una temperatura de prueba de 50
0
C. Se disolvieron 1 a 3 mg de las muestras húmedas y
secadas a vacío sobre CaCl2, en 0,7 mL de agua deuterada
(Apollo Scientific, Ltd., UK, >99,92% de deuterio). Estas
muestras también se liofilizaron dos veces en agua deuterada
para eliminar residuos de etanol y fenol. Ambos tipos de
muestras fueron sometidas a experimentos TOCSY con
tiempos de mezcla de 25 y 45 mseg. El material fue tratado
además con NaOH 0,5 M durante
5 min, para la
determinación del contenido de grupos O-acetilo (9).
Electroforesis en geles de poliacrilamida para la detección
de lipopolisacáridos (LPS). El procedimiento se realizó
según lo recomendado por Tsai y Frasch (10). Se utilizó un gel
separador de 15% de acrilamida y un gel concentrador de 5%
de acrilamida. Se empleó un sistema de tinción por reducción
con 0,7% de peryodato de sodio en etanol 40%- ácido acético
5%, reacción con 20% de nitrato de plata en NaOH 0,018 N y
NH4OH y el posterior revelado con formaldehído 37%, diluido
1/2000 y ácido cítrico
0,05 mg/mL. Se incluyó en las
muestras un lote de polisacárido purificado (lote 7002)
obtenido en etapas iniciales de investigación que no cumplió
con los requisitos de la prueba en conejos para la
determinación de la pirogenicidad. Los geles se evaluaron en
un densitómetro (LKB, Suecia) para la determinación
aproximada del peso molecular de las bandas, referido a un
patrón de proteínas (BioRad).
Resultados y Discusión
La selección de un método colorimétrico para la evaluación del
contenido de polisacárido Vi de Salmonella typhi resulta un
tanto difícil, por cuanto la presencia de residuos de ácidos
urónicos en su estructura limita el empleo de agentes
hidrolíticos que garanticen la formación y estabilidad de
derivados de fácil cuantificación. De ahí que se requiera la
determinación del contenido de humedad y del peso seco de
la materia prima como referencia para el resto de las
evaluaciones. El polisacárido Vi purificado presenta un alto
contenido de humedad, como se puede observar en la Tabla
1 (92% a 94%) que se elimina a través del secado a vacío
0
sobre CaCl2, durante 24 h a 4 C, para su posterior
resuspensión en agua destilada o en el solvente en cuestión
La Tabla 1 muestra también los resultados obtenidos de la
evaluación del contenido de grupos O-acetilo por el método
colorimétrico, que sugieren un alto grado de sustitución (3,12 a
3,39 mmol/g de peso seco) (Tabla 1), lo cual se corrobora
posteriormente con la determinación de este parámetro por
RMN.
Por otra parte, la determinación de la integridad molecular
cromatográfica permite sugerir la presencia de dos
distribuciones de diferentes tamaños moleculares: una
mayoritaria de mayor peso molecular y otra minoritaria de
menor peso molecular (Tabla 1 y Figura 1), con cantidades de
polisacárido superiores al 75% con Kd menores o iguales que
0,25. La manifestación de estas distribuciones es muy
frecuente en los polisacáridos (6), así como la presencia de
problemas difusionales en matrices de este tipo, dadas por la
viscosidad de estas soluciones (11).
Tabla 1. Resumen de los parámetros utilizados para la caracterización físico-química del polisacárido Vi de
Salmonella typhi
Humedad
Residual
(%)
Contenido
O-acetilos
(mmol/g)
Cantidad
Polisac.
Kd < 0,25
(%)
7003
92,9
3,33
79,4
2,06
+ 19,51
7004
91,7
3,18
77,9
1,44
+23,64
7005
93,7
3,12
83,4
1,68
+22,32
Lote
VacciMonitor, Año 8 No. 5
Viscosidad
-1
(mL.mg )
Rotación
óptica específica
0
-2 -1
( .cm .g )
7
Figura 1. Cromatograma del polisacárido Vi de Salmonella typhi
en Sepharosa 4B (Lote 7003)
funcionales importantes en la inmunodominancia (9). La caracterización
realizada por este método en los tres
lotes de polisacárido Vi indica la
presencia de estructuras similares a los
polisacáridos de referencia presentes en
el National Institute for Biological
Standards and Control (NIBSC, Reino
Unido) (Figura 2). En la Figura 3 se
muestra el espectro protónico del
polisacárido Vi O-desacetilado cuando es
tratado con NaOH 0,5 N, lo que permitió
la cuantificación del grado de sustitución
de los grupos O-acetilo. Los resultados
obtenidos en los lotes 7003, 7004 y 7005
corroboran el alto contenido de grupos Oacetilos mayor de 95% y ausencia de
señales correspondientes a fragmentos
de LPS contaminantes, con cantidades
suficien-tes que pudieran ser detectadas
por este método.
Otra posibilidad del método analizado es
la detección de la presencia de residuos
de etanol (3,4 a 3,6 ppm) y de fenol (6,9 a
7,4 ppm) a través de los espectros
TOCSY (bidimensionales), cuando las
muestras no son secadas a vacío o si no
se intercambian dos veces en agua
deuterada por liofilización.
El parámetro viscosidad puede constituir una magnitud de la despolimerización de la
molécula de polisacárido Vi. Algunos autores han demostrado esta relación a través
de la irradiación ultrasónica
como alternativa para la disminución de sus
propiedades viscosas en el análisis espectroscópico por RMN (12). En la Tabla 1 se
muestran los valores de viscosidad reducida de los diferentes lotes de materia prima
-1
con un intervalo de confianza de 1,65 + 0,289 mL. mg .
Las transiciones “orden-desorden” en las estructuras polisacarídicas son muy
rápidas y pueden ser determinadas a través de parámetros suceptibles a estos
cambios, como la viscosidad y la rotación óptica específica (8). De ahí que sea
importante incluir las propiedades ópticas en la caracterización, si se tiene en cuenta
el uso que pueden tener en la evaluación de la estabilidad estructural de la
molécula. Los resultados indican propiedades dextrorrotatorias dadas por la
desviación del plano de la luz polarizada producida por los residuos derivados de
ácido α- D galactosaminurónico (Tabla 1), comportamiento que puede verse
0
afectado si se incuban las muestras a diferentes temperaturas (25 a 50 C) con la
pérdida de un 56,3% de los valores iniciales de actividad óptica.
Indudablemente que los espectros obtenidos por resonancia magnético nuclear en
los polisacáridos han permitido la determinación de sus estructuras primarias,
pureza e incluso, han constituído un indicador de la estabilidad de grupos
8
Como resultado del análisis de estos
lotes por electroforesis en geles de
poliacrilamida con tinción específica para
LPS,
se
presentan
bandas
electroforéticas con migraciones entre 45
y 54 kDa (si se refiere a un patrón
proteico de peso molecular) y un
contenido considerablemente menor de
lipopolisacárido que el detectado en el
lote 7002, el cual resultó pirogénico y no
cumplía con los Requisitos del Control de
la Calidad (Figura 4). De esta forma
podría sugerirse continuar la evaluación
de este método para la caraterización
cualitativa
y
cuantitativa
de
lipopolisacárido.
En resumen, la introducción, desarrollo y
validación de estos métodos en el control
de la calidad del polisacárido Vi, el
establecimiento de los materiales de
referencia y estudio de su correlación con
métodos de evaluación de su actividad
biológica,
podrían
enriquecer
el
conocimiento para su posible empleo
como antígeno vacunal.
VacciMonitor, mayo de 1999
Figura 2. Espectros protónicos de resonancia magnético nuclear (250 MHz) del polisacárido de Salmonella typhi.
A.
Polisacárido de referencia
B. Polisacárido lote 7004
A
B
VacciMonitor, Año 8 No. 5
9
Figura 3. Espectros protónicos de resonancia magnético nuclear (250 MHz) del
polisacárido de Salmonella typhi tratado con NaOH 0,5 N (Lote 7004)
Figura 4. Electroforesis en geles de poliacrilamida de muestras de polisacárido Vi
de Salmonella typhi para la detección de lipopolisacárido
116 250 Da
97 400 Da
66 200 Da
A
45 000 Da
31 000 Da
21 500 Da
14 400 Da
6 500 Da
1
10
2
3
4
5
6
7
VacciMonitor, mayo de 1999
116 250 Da
97 400 Da
66 200 Da
45 000 Da
B
31 000 Da
21 500 Da
14 400 Da
6 500 Da
1
2
A: Muestras secadas
1 y 4. Lote 7003,
2 y 5. Lote 7004,
3 y 6. Lote 7005,
7. Patrón de PM
3
4
5
6
7
B: Muestras sin secar
1 y 4. Lote 7002,
2. Lote 7003,
3. Lote 7004,
5. Patrón de PM
Conclusiones
•
El polisacárido Vi purificado con un alto contenido
de
humedad (92% a 94%) presenta un alto grado de
sustitución de los grupos O-acetilo (3,12 a 3,39 mmol/g de
peso seco), lo que equivale a más de un 95% de los
residuos sustituidos del ácido (1→4) N-acetil
α-D
galactosaminurónico y presencia de estructuras
determinadas por RMN, similares a los polisacáridos de
referencia internacionales.
•
Presenta características viscosas y actividad óptica que
puede afectarse con el inceremento de la temperatura.
•
La presencia de trazas de lipopolisacárido (como
contaminante) detectadas por electroforesis no afecta sus
propiedades apirogénicas.
Referencias
1.
Jennings HJ. Polysaccharide vaccines against disease
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Physico-chemical Characterization of Salmonella typhi Vi polysaccharide
Abstract
In the characterization of Salmonella typhi Vi polysaccharide, presented in this paper, some tools for the determination of the
structural properties that could strengthen the stability studies (viscosity, optical rotation, nuclear magnetic resonance), identity and
purity are discussed. The results suggest that it is a pyrogen-free, viscous product, with a high humidity content, a high degree of Oacetyl group substitution, with optical activity and structure similar to those of international standard polysaccharides, as determined
by nuclear magnetic resonance.
Keywords: Vi polysaccharide, Salmonella typhi, characterization
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VacciMonitor, mayo de 1999