Apuntes de la materia Espectroscopía Aplicada Transferencia de

Apuntes de la materia Espectroscopía Aplicada
Transferencia de Polarización.
Experimento INEPT
Uno de los problemas mas comunes presentes en la espectroscopía de RMN es la
sensibilidad. Los núcleos poco sensibles, como 13C, 15N o 103Rh, dependen de la abundancia
natural isotópica y de su constante giromagnética. Entre menor sea alguno de estos
parámetros, menor será la intensidad de la señal generada.
Una forma de lograr el aumento en la sensibilidad es incrementar la relación
poblacional entre los niveles de energía que generan el efecto de resonancia magnética
nuclear. Esta relación, está gobernada por la ecuación de la distribución de Boltzman:
Nβ/Nα = e -ΔE / KBT,
esta diferencia de energía aumenta al incrementar la intensidad del campo magnético
aplicado (por esta razón es común que se pretenda utilizar campos magnéticos mayores) o
disminuyendo la temperatura.
Otra forma de incrementar la sensibilidad de las señales registradas es empleando
secuencias de pulsos. Para comprender el aumento en la sensibilidad mediante estos
métodos se empleará el modelo que representa a un sistema de dos núcleos acoplados con
espín ½, sistema AX. Para lo cual se considera el sistema de un protón, núcleo muy
sensible, y un carbono-13, núcleo poco sensible. El diagrama de energías para este sistema
está representado en la Figura 1.
2
|ββ>
Cβ
13
4
Hβ
1
|αβ>
10
Cα
13
1
H
12
α
|βα>
13
CHβ
2
CH α
13
2
13
C
4
|αα>
Figura 1. Diagrama de niveles de energía para dos núcleos acoplados, 1H y 13C, en donde se muestran las
transiciones permitidas y los niveles poblaciones para cada núcleo asumiendo que el 1H se encuentra en una
proporción 4 veces mayor que la de 13C. Se indica la señal generada cuando se detecta 13C y su intensidad
relativa debida a la transición de los niveles poblacionales |αα> → |αβ> y |βα> → |ββ>. También se indica
la señal generada y la intensidad esperada si se desacoplan los 1H de 13C.
Las transiciones permitidas son las indicadas por las flechas. Se indica a que núcleo
específico representa cada transición. También, se ejemplifica una representación
poblacional de cada uno de los estados. Para ello, se consideró que la constante
giromagnética del protón es aproximadamente cuatro veces mayor que la de carbono-13. La
señal obtenida en el espectro de 13C sería un doblete con intensidades proporcionales a la
diferencia poblacional entre las transiciones (2 para cada transición).
1 + γA
1 - γA
γX
γX
INEPT
Oscar Yánez / Federico del Río
1
y para el núcleo de protón también se observaría un doblete con intensidades de 8 unidades
arbitrarias para cada señal.
Considérese el siguiente ejemplo: que el núcleo que se detecta sea el menos
sensible, 13C, observando un doblete por el acoplamiento con el núcleo de mayor
sensibilidad, 1H, de intensidades iguales. Sin embargo, lo que se desea es que la señal que
proviene del núcleo menos sensible, de alguna manera, se incremente. Esto se lograría si se
pudiese aplicar un pulso selectivo de 180° sobre una de las transiciones del núcleo de
mayor sensibilidad. Por ejemplo, aplicando un pulso de 180° sobre el protón en la
transición |αβ> → |ββ> se obtendrían los resultados mostrados en la Figura 2.
2
|ββ>
4
Hβ
1
180°
|αβ>
10
Cα
13
Hα
1
12
|αα>
10
Cβ
13
|ββ>
|βα>
Cβ
4
Hβ
1
|αβ>
2
10
13
|βα>
Hα
1
Cα
13
12
|αα>
-6
Figura 2. Excitación mediante un pulso selectivo de 180º sobre protón en la transición |αβ> → |ββ>. El pulso
de 180º invierte los niveles poblacionales de protón, con ello se consigue un incremento en la señal de 13C
cuando ésta es registrada. El doblete del núcleo de 13C tiene una intensidad de –6, debida a la transición |ββ>
→ |βα> y de 10 debida la transición |αα> → |αβ>. El incremento fue de –8 y +8 para cada señal con
respecto a la intensidad de la señal original.
El pulso de 180° invierte los niveles poblacionales sobre la transición que actúa.
La diferencia poblacional entre los estados |αα> → |αβ> generarían una señal con una
intensidad proporcional a 10, cambiaría de 2 en el espectro normal a 10 una vez realizada
esta excitación selectiva. La diferencia poblacional entre los estados |βα> → |ββ> generaría
una señal proporcional a –6, con intensidad negativa, se obtendría una señal en antifase,
pero cada una con un incremento en la sensibilidad de 8 en una y de –8 en la que se
encuentra hacia abajo. Esta secuencias de pulsos se le conoce como el experimento SPI
(Selective Population Inversion), el cual representa la transferencia de polarización de un
núcleo muy sensible a otro poco sensible.
Este fenómeno se conoce como transferencia de polarización y sólo se presenta en
sistemas que están acoplados.
El generar pulsos selectivos en transiciones específicas, no es una tarea fácil, es
por ello que se ha optado emplear secuencias de pulsos fuertes para obtener el mismo
resultado. El uso de la secuencia de pulsos INEPT (insensitive nuclei enhanced by
polarization transfer) logra dicho objetivo. Su secuencia de pulsos se muestra a
continuación:
INEPT
Oscar Yánez / Federico del Río
2
1
90x
H
180x
90y
τ
τ
180x
13
90x
C
Figura 3. Secuencia de Pulsos INEPT normal.
Para entender que ocurre con los espines tras aplicar esta secuencia de pulsos se
empleará el modelo vectorial y se representará al mismo tiempo el efecto de los pulsos
sobre esquemas de niveles de energía asumiendo solamente la presencia de dos espines.
El primer pulso de 90º aplicado a los 1H sobre el eje x rota la magnetización hacia
el eje y (los dos vectores corresponden a la magnetización del protón unido a los 13C con
espín alfa de color rojo y 13C con espín beta de color azul). Tras aplicar este pulso fuerte de
90° los niveles de energía igualanlos niveles poblacionales de las transiciones de protón
|αα> → |βα> y |αβ> → |ββ>. Como consecuencia, no existe magnetización sobre el eje z.
MHC
α
z
2
z
MHCβ
|ββ>
1
H
Cβ
4
1
Hβ
y
90°x
y
|αβ>
10
13
x
x
Cα
6
13
1
Hα
|ββ>
|βα>
8
1
H
90°x
|αβ>
6
12
|αα>
8
|αα>
Figura 4. Representación vectorial y mediante diagrama de niveles de energía del efecto de un pulso de 90º
sobre el sistema de espín en estado basal. El pulso de 90º rota la magnetización del eje z hacia el eje y y en el
diagrama de energía esto se representa mediante un igualación poblacional de los niveles de la transiciones
correspondientes a 1H, ya que el pulso de 90º es aplicado sobre 1H.
Los vectores sobre el eje y comenzarán a precesar durante el tiempo τ. Este
tiempo se define como el valor de 1/4J (si J = 125Hz, entonces τ es 2 ms), lo cual provoca
una separación entre ambos vectores de 90º (el ángulo formado entre dos vectores
acoplados después de un tiempo dado, τ, está dado por la ecuación Θ = 2πJτ).
Posteriormente se aplica un pulso de 180º sobre el eje x que invierte la orientación de los
vectores prevaleciendo el sentido de su rotación, Figura 5.
INEPT
Oscar Yánez / Federico del Río
3
|βα>
x
MHCα
MHCα
1
y
x
H
y
180°x
MHCβ
MHCβ
Figura 5. Movimiento de precesión de los vectores correspondientes a la magnetización de protones unidos a
carbono con espín alfa, MHCα, y de la magnetización de protones unido a carbono con espín beta, MHCβ.
Durante el primer tiempo τ dentro de la secuencia de pulsos los vectores presentes comienzan a precesar hasta
alcanzar un ángulo de 90º definido por τ = 1/4J. El pulso de 180º aplicado sobre protón invierte el sentido de
las magnetizaciones, pero se sigue conservando el sentido de los movimientos de rotación de cada vector.
Si se espera un tiempo τ nuevamente, estos dos vectores coincidirán nuevamente
sobre el eje –y, a esta coincidencia se le llama reenfoque de la magnetización, ya que no
importa el tiempo τ que se use, cualquier vector de magnetización terminará en la misma
posición. Sin embargo, se aplica un pulso de 180° sobre el núcleo de carbono lo cual
cambia la situación. Al aplicar un pulso de 180º sobre 13C se invierten las poblaciones de
13
C, el diagrama de niveles energéticos permite representar este proceso. La inversión de
estos niveles poblacionales implica que ahora la magnetización correspondiente a los
carbonos unidos a protones con espín alfa, MCHα, pasa a ser la magnetización de los
carbonos unidos a protones con espín beta, MCHβ. Esta representación en el modelo
vectorial es un cambio en la posición de los vectores MHCα y MHCβ que es como si cambiara
el sentido de giro de los vectores.
2
|ββ>
Cβ
4
1
Hβ
|αβ>
10
13
Cα
1
Hα
12
|αα>
4
13
MHCβ
|ββ>
|βα>
2
13
C
180°x
|αβ>
x
|βα>
y
12
10
|αα>
MHCα
Figura 6. Efecto del pulso de 180º aplicado sobre 13C. El pulso invierte los niveles poblacionales de los
estados |αα> → |αβ> y |βα> → |ββ> y en el modelo vectorial esto se representa como un cambio del vector
MHCα por MHCβ y viceversa.
Estos componentes precesan libremente en el tiempo τ = 1/4J generando un ángulo
de 180º entre ambos vectores, de tal forma que cada vector se encuentra ahora alineado a lo
largo del eje x. La aplicación del pulso de 90º, pero ahora sobre el eje y rota los vectores en
dirección del eje z, quedando un vector en sentido positivo y otro en sentido negativo.
INEPT
Oscar Yánez / Federico del Río
4
MHCβ
x
MHCα
1
y
z
H
y
90y°
x
MHCβ
MHCα
Figura 7. En el segundo tiempo de espera τ, las magnetizaciones se alinean sobre el eje x y el siguiente pulso
de 90º en 1H sobre el eje y, coloca las magnetizaciones sobre el eje z. Es en este paso donde se lleva acabo el
fenómeno llamado transferencia de polarización.
En este punto, MHCβ se encuentra invertida con respecto a MHCα. La
representación mediante los niveles de energía de este proceso nos indica que la transición
que corresponde a los protones con espín beta esta invertida, es decir, pareciera que en este
punto se hubiese aplicado un pulso selectivo de 180° sobre la transición |αβ> → |ββ>
(como lo era en el experimento SPI).
2
|ββ>
Cβ
4
1
Hβ
|αβ>
10
13
Cα
|ββ>
z
13
MH
|βα>
13
Cβ
Cα
4
1
Hβ
y
1
Hα
12
10
|αα>
2
1
Hα
13
Cα
MHCβ
x
|αβ>
||βα>
12
|αα>
Estado basal
Figura 8. En esta figura se muestra como se alcanza la transferencia de polarización. En analogía con el
experimento SPI, el pulso de 90º en 1H ha invertido de forma selectiva la magnetización de MHCβ, en niveles
de energía esto se representa como una inversión de los niveles poblacionales de |αβ> → |ββ>. Gracias a
ello, al observar como quedan los niveles poblacionales de 13C, se aprecia un incremento en la intensidad
relativa de la señal al momento de registrarla.
Este último diagrama de niveles energéticos, nos indica que cuando se detecte la
magnetización debida a 13C, se observará un incremento de la señal en una proporción –6,
en sentido negativo y otra en una proporción de 10 en sentido positivo con respecto a su
intensidad original. La representación vectorial se muestra en la Figura 9.
z
10
MC H
α
y
x
-6
MC H β
Figura 9. Representación de la magnetización de C-13 alcanzada después de aplicar un tren de
pulsos (INEPT). La información obtenida es la misma que la del experimento SPI, pero se evitó
utilizar pulsos selectivos.
INEPT
Oscar Yánez / Federico del Río
5
El siguiente pulso de 90ºx sobre el núcleo de carbono rota nuevamente los vectores
hacia los ejes “y” y “-y” con ello se generan señales observables. El resultado final es un
doblete con una señal en sentido positivo y otra en sentido negativo.
10
z
z
10
MC H
α
13
C
y
y
x
-6
90°x
x
MC H β
-6
Figura 10. El ultimo pulso de 90º en C-13 solamente hace que la señal se vuelva observable al rotarla hacia el
eje y. El resultado es un doblete con señales de signo contrario (señal en antifase) de intensidades –6 y 10. El
incremento en cada señal fue de –8 y +8 con respecto a la intensidad original de ambas señales (+2, +2).
En la secuencia de pulsos INEPT, no es conveniente encender el desacoplador al
momento de hacer la adquisición puesto que tenemos señales positivas y negativas. Estas
señales se sumarían provocando una cancelación de las señales eliminando el incremento
logrado. Esto es una limitante de esta secuencia, ya que es conveniente realizar el
desacoplamiento para moléculas complejas con varios 13C. El espectro generado en estas
condiciones generaría varios traslapes de señales muy difícil de resolver e interpretar.
Para lograr desacoplar este espectro de 13C de 1H sin que se cancelen las señales,
es necesario aumentar a la secuencia de pulsos INEPT normal dos pulsos de 180º y dos
tiempos de espera, Δ = 1/8J, en ambos núcleos después de los dos últimos pulsos de 90º y
posteriormente adquirir y desacoplar. La nueva secuencia de pulsos llamada INEPT
reenfocado, se muestra en la Figura 11.
90x
1
H
13
C
180x
τ
90y
τ
180x
τ
180x
Δ
90y
Δ
Δ
180x
BB
Δ
Figura 11. Secuencia de pulsos INEPT Reenfocado. A diferencia del experimento INEPT normal, el INEPT
Reenfocado cuenta con dos tiempos de espera y un pulso de 180º adicional para cada núcleo. Esto permite
poder desacoplar al momento de realizar la adquisición.
Esta secuencia se conoce como INEPT-Reenfocado. La función de los pulsos de
180º en ambos núcleos es precisamente reenfocar el desplazamiento y el acoplamiento
químico. El bloque en la secuencia de pulsos Δ-------180º------Δ reenfoca el desplazamiento
químico mientras que el bloque
INEPT
Oscar Yánez / Federico del Río
6
1
H
---Δ---------Δ---
13
C
-------180-------
reenfoca el acoplamiento protón-carbono-13.
Con este experimento se obtiene una señal completamente desacoplada, en fase y
amplificada por la transferencia de polarización.
El análisis vectorial se muestra en la Figura 12.
z
z
z
MC H
α
MC H β
MC H β
90ºy
y
x
C
MC H
y
y
13
α
MC H
MC H β
α
x
x
z
MC H
180ºx
z
α
MC H
y
1
H
MC H β
x
z
180ºx
α
MC H
α
y
13
C
x
MC H β
y
MC H β
x
Figura 12. Representación vectorial del INEPT Reenfocado mediante el modelo vectorial. El análisis
demuestra que mediante esta secuencia de pulsos es posible desacoplar el sistema de espín sin riesgo a que se
cancelen señales de antifase, además de seguir conservando el incremento en la intensidad de la señal del
núcleo de 13C.
Las magnetizaciones de carbono se encuentran alineadas en el eje z y –z una vez
que han sido incrementadas por la transferencia de polarización. Se le aplica un pulso de
90°y en 13C y se deja precesar un tiempo Δ, Figura 12. La representación vectorial indica en
donde se encuentran MCHβ y MCHα después del tiempo Δ, a un ángulo de 45° con respecto
al eje x. El pulso de 180º en 1H cambia su sentido de rotación cada una de las
magnetizaciones. El pulso de 180º en carbono rota a los vectores 180° sobre el eje x. Si se
deja precesar a las magnetización otro tiempo Δ, coincidirán sobre el eje +y ambas
magnetizaciones, lográndose el reenfoque de la señal. Si en este momento se desacopla la
señal de 13C, se obtendría una sola señal incrementada por la transferencia de polarización
con un factor de 2.5 veces a la señal que se tiene originalmente. La gran importancia de esta
secuencia de pulsos es simplicidad para entender los fenómenos que ocurren con un manejo
apropiado de los pulsos fuertes y de los tiempos de espera; así como es posible incrementar
las señales de núcleos sensibles mediante la irradiación de otros núcleos.
INEPT
Oscar Yánez / Federico del Río
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