Inmunolocalización de Enzimas Degradadoras de Polisacáridos de

Inmunolocalización de Enzimas Degradadoras de Polisacáridos de Pared Celular de
Plantas Producidas por Cepas de Aspergillus sp.
Irene Rivera del Río
Tutor: Dr. Guillermo Aguilar Osorio
Departamento de Alimentos y Biotecnología
Introducción:
La pared celular de las plantas funciona como una primera barrera de protección a los
microorganismos patógenos. Al iniciarse el proceso de colonización, ya sea saprofítico o
patogénico, la fuente de carbono compleja más accesible es la pectina, presente en la lamela
media, la cual debe ser degradada para permitir la penetración y colonización. Un
microorganismo común en suelo y plantas es Aspergillus sp., hongo microscópico, saprofítico,
filamentoso.
La pectina es un heteropolisacárido constituyente de la pared celular de plantas, la cual presenta
una estructura molecular compleja debido a sus múltiples tipos de azúcares monómericos y a sus
múltiples enlaces. La molécula contiene homogalacturanos, ramnogalacturanos, polímeros
neutros como arabinanos, galactanos y arabinogalactanos. Su esqueleto consiste de una región
“lisa” de ácido α-(1?4)-D-galacturónico, interrumpidos por residuos de (1?2)-L-ramnopiranosilo
ramificado altamente sustituidas por residuos de azucares neutros. Dichas interrupciones se
denominan región “peluda”.
La hidrólisis de pectina involucra la producción de enzimas pectinolíticas por Aspergillus sp.. La
maquinaria enzimática debe ser tan versátil como la complejidad estructural de la pectina, entre
las enzimas producidas las más notables son la poligalacturunosa, pectin y pectato liasa y pectin
esterasas, dirigidas la región lisa. Las poligalacturonasas (E.C. 3.2.1.15) son enzimas que
hidrolizan el esqueleto no metilado, atacan los enlaces α-(1?4) que unen a las unidades de ácido
D-galacturónico. Esta enzima puede hidrolizar cualquier enlace de la cadena de polisacáridos y
producir varios oligómeros de ácido galacturónico, entonces la enzima se llamará
endopoligalacturonasa, ó hidrolizar el extremo no reductor de la cadena.
El objetivo del presente trabajo es optimizar la producción de la enzima endo-poligalacturonasa,
purificar la proteína y producir anticuerpos contra dicha enzima para inmunolocalizarla en
esporas y/o micelio de Aspergillus sp.
Desarrollo:
Producción enzimática (Microorganismo y condiciones de cultivo)
Se utilizó la cepa silvestre de Aspergillus sp. FP-500 aislada materia orgánica en estado de
descomposición. Los medios líquidos utilizados para la fermentación contenían medio basal
(Aguilar y Huitron, 1993) y pectina al 1% V/V o glucosa al 1%V/V como fuente de carbono. El
inóculo utilizado fue de 1x108 esporas/mL. La fermentación se lleva a cabo por 72 horas a una
temperatura de 37°C en agitación.
Purificación de la enzima.
Al término de la fermentación se separa por filtración el micelio y se recupera el filtrado
enzimático. La purificación de la proteína se realizará por cromatografía de intercambio iónico.
Determinaciones de Actividad Enzimática.
La actividad enzimática endopectinolítica fue determinada por el efecto de reducción de
viscosidad de pectina al 1% diluida en buffer acetatos-NaCl pH 4.2 a 30°C.
La caracterización de la enzimas se llevó a cabo por electroforesis PAGE-SDS en acrilamida
al 10% p/v y bis-acrilamida al 2.7% p/v (Bio-Rad Laboratories). Al terminar los geles fueron
teñidos con azul de Coomassie R-250 (Bio-Rad Laboratories).
Así mismo se llevó a cabo un zimograma con un gel SDS-PAGE renaturalizando las proteínas
con Tris 100mM pH 6.8 a 37 ºC y agitación de 20 rpm durante 1 a 1.5 horas. Posteriormente, se
sumerge en una solución de pectina al 1% p/v pH 5 durante una hora más a 37ºC. Finalmente, el
gel se tiñe utilizando rojo rutenio, lo cual permite observar bandas de proteína donde se degrade
la pectina, para así localizar la (s) banda (s) de enzimas pectinolíticas.
Obtención de anticuerpos
Los anticuerpos fueron obtenidos en conejos Nueva Zelanda blancos. Como antígenos se
utilizaron esporas no germinadas, micelio, filtrado enzimático y enzima purificada o
semipurificada. La prueba de anticuerpo vs. antígeno se llevó a cabo por el método de
inmunodifusión radial u Ouchterlony donde si existe reacción antígeno – anticuerpo se forma una
banda de precipitación o bien por medio Western Blot.
Resultados
Fermentaciones en glucosa y pectina como fuentes de carbono para obtener la enzima endo
pectinolíticas:
3
2.5
U/mL
2
Pectina 1%
1.5
Glucosa 1%
1
0.5
0
24h
48h
72h
Tiempo (h)
Figura 1. Actividad enzimática producida por Aspergillus sp. FP-500, en pectina y gluocas como fuentes de
carbono.
La actividad enzimática mas alta se produjo en el medio que contenía pectina como fuente de
carbono y con este filtrado se procedio a la purificación de la proteína por intercambio iónico, se
utilizó un filtrado enzimático con una actividad de endo poligalacturonasa inicial de 3.9074
U/mL.
Actividad endo pectinolítica (U)
250
200
150
100
50
0
Filtrado crudo
Resina S (SN)
Resina Q (SN)
Resina Q (E)
Tratamiento
Endo-PG
Figura 2. Seguimiento de los diferentes pasos de purificación de la Endo-PG y electroforesis de las diferentes
fracciones obtenidas.
Inmunoquímica.
Se prepararon diferentes anticuerpos a partir de diversos filtrados enzimaticos completos así
como de esporas y micelio. Con estos se llevó a cabo la detección inicial de la reacción antigenoanticuerpo por Western Blot en filtrados producidos por Aspergillus sp FP-500. Los resultados se
pueden observar en la Figura 3, donde se observan las zonas de reacción.
AA
BA
Figura 3. Zonas de reacción
detectadas por Western Blot
antígeno-anticuerpo
A: Reacción de anticuerpo anti-espora 0.02 mg/mL con antígeno a
8.33 µg/mL y 0.833 µg/mL
B: Reacción de anticuepo anti-filtrado enzimático (glucosa como
fuente de carbono) 0.02 mg/mL con antígeno a 8.33 µg/mL.C:
Reacción de anticuepo anti-filtrado enzimático (pectina como fuente
de carbono) 0.02 mg/mL con antígeno a 8.33 µg/mL y 0.833 µg/mL.
D: Reacción de anticuerpo anti-micelio 0.02 mg/mL con antígeno a
8.33 µg/mL.
CA
DA
Conclusiones
1. Se han probado que los anticuerpos que se obtuvieron reconocen estructuras de
Aspergillus sp. así como los filtrados enzimáticos.
2. Se han encontrado las condiciones de obtención de las más altas actividades enzimáticas
de la proteína de interés.
3. Se tienen fracciones enriquecidas de la enzima Endo-PG que nos permitirán producir
anticuerpos específicos contra dicha proteína para su posterior inmunolocalización.
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