metodo para detectar deficiencia de metiltioadenosina

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : C12Q 1/00, C12Q 1/68
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
C12P 19/34, C12N 15/00
A61K 35/14, A61K 38/00
C07K 1/00, C07K 17/00
C07H 17/00
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 95907260.4
kFecha de presentación: 22.12.1994
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 733 123
kFecha de publicación de la solicitud: 25.09.1996
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54 Tı́tulo: Método para detectar deficiencia de metiltioadenosina fosforilasa en células de mamı́fero.
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73 Titular/es:
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72 Inventor/es: Nobori, Tsutomu;
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74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
30 Prioridad: 29.12.1993 US 176855
The Regents of the University of California
1111 Franklin Street, 12th floor
Oakland, CA 94607-5200, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.11.2002
ES 2 174 927 T3
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.11.2002
Aviso:
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Carson, Dennis A. y
Takabayashi, Kenji
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Método para detectar deficiencia de metiltioadenosina fosforilasa en células de mamı́fero.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un método para detectar metiltioadenosina fosforilasa en células de
mamı́fero, un estado que es indicativo de cáncer
en esas células. La detección de células con deficiencia de esta enzima permite la actuación selectiva de la quimioterapia sobre estas células para
aprovechar la incapacidad de las células de convertir metiltioadenosina en metionina.
Historia de la invención
El aminoácido metionina (MET) es necesario
para el crecimiento de células normales y cancerosas En ciertas células cancerosas, este requisito
es absoluto, es decir, sin un suministro adecuado
de MET, las células mueren.
En las células de mamı́fero, la MET se obtiene a partir de tres fuentes. Puede obtenerse
en la dieta, o por sı́ntesis bioquı́mica de MET a
partir de L-homocisteı́na (homocisteı́na) o de metiltioadenosina (MTA) (un producto de la ruta
biosintética de poliamina). En el último caso, la
MTA se convierte en MET por la metiltioadenosina fosforilasa (MTAsa; EC 2.4.2.28).
En la última década, los investigadores han
identificado muchas lı́neas de células cancerosas
que carecen de MTAsa y que, por lo tanto, no
pueden convertir MTA en MET. Por ejemplo,
Katamari, y colaboradores, Proc. Nat’l Acad.
Sci. USA, 78: 1219-1223 (1981) notificaron que
23 % de 3 estirpes celulares de tumores malignos
humanos carecı́an de MTAsa detectable, mientras que la actividad MTAsa estaba presente en
cada una de las 16 estirpes celulares no cancerosas estudiadas. También se ha informado sobre
la deficiencia de MTAsa como una caracterı́stica
de cánceres pulmonares macrocı́ticos (véase, Nobori, y colaboradores, Cancer Res. 53:1098-1101
(1991)), en 6 estirpes celulares de linfoma y de
leucemia (id.), en estirpes celulares de tumor cerebral y en muestras de tejido de tumor cerebral primario (id.), y en otros tumores malignos (véase,
por ejemplo, Kries, y colaboradores, Cancer Res.
33:1866-1869 (1973), Kries, y colaboradores, Cancer Trmt. Rpts. 63:1069-1072 (1979), y Rangione, y colaboradores, Biochem. J. 281:533-538
(1992)). Las células MTAsa negativas principalmente satisfacen su necesidad de MET por medio
de la conversión de homocisteı́na. Sin embargo,
cuando no disponen de homocisteı́na, las células
generalmente mueren.
Se sabe que la L-metionina-L-desamino-y-mercaptometano liasa (ED 4.4.1.11; METasa) degrada no sólo la MET, sino también la homocisteı́na. Por lo tanto, teóricamente, se podrı́an destruir por inanición células cancerosas que carecen
de MTAsa (es decir, células MTAsa negativas)
degradando la MET y la homocisteı́na plasmáticas con METasa. Serı́a de esperar que las células
MTAsa positivas normales satisficieran su necesidad de MET por la conversión continuada de
MTA en MET.
Un obstáculo para el desarrollo de un procedimiento satisfactorio para la destrucción por inanición de células cancerosas debida a la falta de
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MET ha sido la necesidad de identificar qué tumores malignos son destinatarios adecuados para
la terapia; es decir, qué tumores malignos son
MTAsa negativos. Para este fin, se desarrolló
un ensayo que predice si un tumor maligno es
MTAsa negativo determinando si en un cultivo
celular está presente alguna actividad catalı́tica
(Seidenfeld, y colaboradores, Biochem. Biophys.
Res. Commun., 95:1861-1866, 1980). Sin embargo, debido a la falta de disponibilidad comercial del sustrato radioquı́mico requerido para el
ensayo, actualmente no es factible su uso en evaluaciones rutinarias. Además, el ensayo no tiene
en cuenta la labilidad catalı́tica de la MTAsa in
vitro detectando si algo de la enzima está presente
en el cultivo celular independientemente de si es
catalı́ticamente activa en el momento en el que se
realiza el ensayo.
Esta limitación del ensayo de actividad se
podrı́a evitar por medio del desarrollo de un inmunoensayo que fuera suficientemente sensible
como para detectar cantidades relativamente pequeñas de la enzima. Sin embargo, la purificación
de la enzima MTAsa a partir de fuentes naturales para preparar anticuerpos para uso en la detección inmunológica de MTAsa, ha resultado ser
un proceso laborioso que produce rendimientos
relativamente bajos (Rangione, y colaboradores,
J. Biol. Chem, 261:12324-12329, 1986).
La falta de un medio sencillo y eficaz para
identificar células deficientes en MTAsa ha contribuido en parte a la falta de disponibilidad continuada de un enfoque terapéutico eficaz para
la destrucción selectiva por inanición de células
cancerosas deficientes en MTAsa por ausencia de
MET in vivo. La presente invención soluciona
esta necesidad proporcionando un método para
detectar, en una muestra, la presencia o ausencia
del gen que codifica la MTAsa y proporcionando
un fuente recombinante de MTAsa.
Sumario de la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para la detección de células deficientes en MTAsa (que se considerarán las células en las que la proteı́na MTAsa no está presente
de forma detectable en una forma catalı́ticamente activa o catalı́ticamente inactiva). El método
de la invención se basa en la suposición de que
la deficiencia de MTAsa se debe a la supresión
del gen que codificarı́a la MTAsa del genoma del
mamı́fero que tiene un tumor maligno MTAsa negativo. Por lo tanto, el método de la invención se
dirige a la detección de un polinucleótido dentro
de la proteı́na MTAsa, que codifica el dominio del
genoma del mamı́fero que, si está presente, codifica la MTAsa pero, si está ausente, ocasiona el
desarrollo de células deficientes en MTAsa.
La invención proporciona un método para detectar la presencia de metiltioadenosina fosforilasa (MTAsa) catalı́ticamente activa y catalı́ticamente inactiva en células de mamı́fero, que comprende:
(a) obtener una muestra ensayable de células que se sospecha que son deficientes en
MTAsa,
(b) añadir sondas oligonucleotı́dicas marcadas
de forma detectable derivadas de la secuen-
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cia de ácido nucleico de la SEC. ID. No. 1,
sondas que hibridarán especı́ficamente con
cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican la MTAsa presentes en la muestra, y
(c) detectar la hibridación de las sondas con
cualquier ácido nucleico que codifique MTAsa
presente en la muestra, siendo indicativa la
presencia de dicho ácido nucleico de la presencia de MTAsa catalı́ticamente activa o
inactiva en una célula.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 localiza el gen para la MTAsa, e
indica la localización de los exones en el polinucleótido. Los supuestos exones están subrayados;
los supuestos intrones están indicados por una o
más sustituciones de bases de la secuencia polinucleotı́dica por “N”. La secuencia representada en
la Figura 1 corresponde a la secuencia contenida
en la SEC. ID. No. 1 adjunta.
Descripción detallada de la invención
A. Método para la amplificación de cualquier
MTAsa presente en una muestra de células
Como se ha indicado anteriormente, es una
suposición de la invención que la deficiencia de
MTAsa en células es el resultado de la supresión
del gen de un genoma de mamı́fero que normalmente codificarı́a la MTAsa. Como la invención
se refiere a la detección de la presencia o ausencia de este gen en una muestra de células que
se sospecha que son MTAsa negativas, los ácidos
nucleicos de la muestra preferiblemente se amplificarán para aumentar la sensibilidad del método
de detección. Esta amplificación preferiblemente
se realiza por medio del uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), aunque no es absolutamente necesario el uso de una reacción en
cadena en la etapa de polimerización.
Para uso en los métodos de la invención, se
obtiene una muestra biológica que se sospecha
que contiene células deficientes en MTAsa. Por
ejemplo, la muestra puede comprender un fluido
corporal o células, por ejemplo, de una estirpe celular, tejido o tumor. Tales muestras se obtienen
usando métodos conocidos en la técnica clı́nica,
por ejemplo, las células tumorales pueden adquirirse por biopsia o por resección quirúrgica. Preferiblemente, las células carecen esencialmente de
“contaminantes”; es decir, de células, proteı́nas
y componentes similares que tienen probabilidad
de falsificar el resultado del método de la invención. Por ejemplo, cuando se usan tumores
sólidos como fuente de ADN de MTAsa genómica,
las células normales no cancerosas y la MTAsa
que puede liberarse de estas células durante el
procedimiento realizado para obtener la muestra
biológica se considerarı́an contaminantes.
El ácido nucleico a amplificar en la muestra
constará de ADN genómico o de tipo natural que
en condiciones normales serı́a de esperar que contuviera MTAsa. Este ADN (en lo sucesivo “ADN
diana”) a amplificar se puede obtener a partir de
un organismo eucariota, preferiblemente a partir
de un mamı́fero. Lo más preferido es que el ADN
genómico se obtenga a partir de un ser humano.
El ADN genómico se aı́sla de acuerdo con
métodos conocidos en la técnica, por ejemplo,
el método descrito por Maniatis, y colaborado-
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res (Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Cold Spring Habor Laboratory, 1982). En este
documento se proporciona un ejemplo de trabajo
que muestra el aislamiento de un clon genómico
de MTAsa humana en el que se selecciona una
genoteca de cósmidos usando una sonda génica
de ADNc de MTAsa que se describe con más detalle más adelante. Sin embargo, los expertos en
la técnica reconocerán que pueden usarse otros
medios adecuados para obtener el ADN de la invención.
En la Lista de Secuencias adjunta se proporciona una secuencia de nucleótidos de longitud
completa del clon genómico para MTAsa como
la SEC. ID. No. 1; los exones de esta secuencia se representan en el mapa mostrado en la Figura 1. Una cepa de E. Coli que contiene el ADN
genómico de longitud completa para la MTAsa de
rata se ha depositado en la American Type Culture Collection, Rockville, MD. el 30 de diciembre de 1993, con el No. de Acceso 55536 (exón
“TC3”; nucleótidos 616-720 del gen de MTAsa);
55538 (exón “1.1”; nucleótidos 254-421 del gen
de MTAsa); 55537, 55539 y 55540 (respectivamente, “IX-7”, “4-3” y “7-2”; colectivamente, el
resto del gen de MTAsa). El hospedador para todos los depósitos es E. Coli. No se afirma ni se
sugiere que este depósito sea necesario para permitir la práctica de la invención. Sin embargo, el
depósito se mantendrá en forma viable durante el
periodo necesario o puede requerirse por las leyes
de patentes aplicables a esta descripción.
Una vez obtenido el ADN genómico, la muestra que lo contiene se somete a condiciones que favorecen la amplificación selectiva del ácido nucleico destinatario. Preferiblemente, el ácido nucleico destinatario será una porción de polinucleótido
del gen que codifica la MTAsa (es decir el “polinucleótido diana”). Los medios preferidos para
amplificar el polinucleótido diana es por PCR. La
PCR es un método in vitro para la sı́ntesis enzimática de secuencias de ADN o ARN especı́ficas, usando cebadores oligonucleotı́dicos que hibridan con secuencias especı́ficas de ácido nucleico y flanquean la región de interés en el ácido nucleico destinatario. Una serie repetitiva de ciclos
de desnaturalización del molde, hibridación de cebadores y extensión enzimática de los cebadores
hibridados produce una acumulación exponencial
de un fragmento de ácido nucleico especı́fico definido en sus extremos por los extremos 5’ de los cebadores. Los productos resultantes (productos de
PCR) sintetizados en un ciclo actúan como moldes para el siguiente; por consiguiente, en cada
ciclo, aproximadamente se dobla el número de copias de ácido nucleico destinatario.
En las Patentes de Estados Unidos 4.683.195
y 4.683.202 de Mullis y colaboradores, se describen técnicas básicas de PCR. Sin embargo, no se
pretende limitar la invención al uso de las técnicas
de PCR que se enseñan en la patente 4.683.202
de Mullis y colaboradores. Desde el desarrollo de
la técnica de Mullis y colaboradores, se han desarrollado muchos ensayos basados en PCR que
utilizan modificaciones de esta técnica. Estas modificaciones son bien conocidas en la técnica y, por
lo tanto, no se describirán con detalle en este documento. Sin embargo, para ilustrar el alcance
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de la técnica en este campo, a continuación se
describen varias de estas modificaciones.
En Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:27252729 (Gilliland y colaboradores, autores), se describe una técnica de PCR que proporciona un patrón de amplificación interno usando un molde
competidor que difiere del ácido nucleico destinatario en secuencia y tamaño. En Nuc. Acids.
Res. 21:3469-3472, (1993), (Kohsaka, y colaboradores, autores) se describe otra técnica
para realizar una PCR “competitiva” que utiliza moldes que difieren en secuencia pero no
en tamaño. Con esta técnica se prefiere particularmente el uso del ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para analizar el o los ácidos nucleicos amplificados. En
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 86:62306234 (Saiki, y colaboradores, autores) se describe una técnica de PCR no competitiva que
utiliza oligonucleótidos de localización especı́fica
para detectar mutaciones o polimorfismos en genes, que también puede aplicarse al método de
la invención. Cada una de estas técnicas tiene
la ventaja de utilizar sondas de hibridación que
ayudan a eliminar los resultados falsos positivos
derivados de cualquier amplificación no especı́fica
que pueda producirse durante la PCR.
Como antecedentes adicionales, los expertos
en la técnica pueden desear referirse a Innis, y
colaboradores, “Optimization of PCR’s”, PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications
(Acad. Press, 1990). Esta publicación resume
técnicas para influir sobre la especificidad, fidelidad y rendimiento de los productos de PCR deseados.
Se seleccionan cebadores oligonucleotı́dicos (al
menos un par de cebadores) que hibriden especı́ficamente con un tramo pequeño de pares de
bases en cualquier lado (es decir, 5’ y 3’) del polinucleótido diana de MTAsa (es decir, “secuencias flanqueantes”). Los expertos en la técnica
podrán seleccionar fácilmente cebadores adecuados sin experimentación indebida basándose en
la información de secuencia polinucleotı́dica indicada en la SEC. ID. No. 1 de la Lista de Secuencias adjunta y en la Figura 1.
Para el diseño del cebador, es importante que
los cebadores no contengan bases complementarias para que no puedan hibridar consigo mismos. Para evitar la amplificación de cualquier
material contaminante que pueda estar presente
en la muestra, preferiblemente los cebadores se
diseñan para extender exones (que, para el gen
de la MTAsa, se muestran en la Figura 1).
Como se ha indicado anteriormente, en esta
etapa de polimerización puede no ser necesario
utilizar la reacción en cadena para amplificar de
forma adecuada los ácidos nucleicos de la muestra. Por ejemplo, cuando se utiliza la técnica
descrita por Kohsaka, y colaboradores, supra, de
forma que la etapa de polimerización se realiza
sobre un medio de soporte en fase sólida y se continúa por hibridación con sondas especı́ficas del
polinucleótido diana, la sensibilidad del ensayo
será tal que todo lo que se necesita es una sola
polimerización del polinucleótido diana.
Una vez completada la etapa de amplificación,
los productos de PCR se ensayan para determi4
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nar si el gen que codifica MTAsa está presente
en la muestra. Preferiblemente, los productos de
PCR de doble hélices se unirán a la fase sólida
de forma que sus hélices puedan separarse por
desnaturalización, permitiendo de esta forma que
sondas especı́ficas de secuencia hibriden con la hebra complementaria unida del producto de PCR
para detectar el gen sustancialmente como se describe en Kohsaka, y colaboradores, supra. Como
alternativa, los productos de PCR se retirarán del
medio de reacción y se separarán de la mezcla de
amplificación antes de la adición de sondas para
la hibridación con los productos de PCR de doble hélice. En este último método, los productos
de PCR se separan de la mezcla de amplificación
de acuerdo con métodos conocidos en la técnica
con respecto al método particular elegido para la
detección; por ejemplo, por exclusión molecular,
electroforesis o cromatografı́a de afinidad.
La detección del producto amplificado puede
conseguirse usando sondas de hibridación que se
asocian de forma estable con un marcador detectable. Un marcador es una sustancia que puede
unirse covalentemente o asociarse firmemente con
una sonda de ácido nucleico, consiguiéndose la
capacidad de detectar la sonda. Por ejemplo,
un marcador puede ser un radioisótopo, un substrato o inhibidor enzimático, o una enzima, o una
sustancia radioopaca (incluyendo metales coloidales), un fluorescente, una molécula quimioluminiscente, liposomas que contienen cualquiera de
los marcadores anteriores, o un miembro de un
par de unión especı́fico. Un marcador adecuado
no perderá la cualidad responsable de la detectabilidad durante la amplificación.
Los expertos en la técnica de diagnóstico estarán familiarizados con los marcadores detectables adecuados para uso en ensayos de detección
in vitro. Por ejemplo, los radioisótopos adecuados para el uso in vitro incluyen 3 H, 125 I, 131 I,
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P, 14 C y 35 S. Los fragmentos amplificados marcados por medio de un radioisótopo pueden detectarse directamente por medio de un contador
gamma o por densitometrı́a de autorradiografı́as,
o por transferencia Southern de los fragmentos
amplificados combinada con densitometrı́a. Son
ejemplos de moléculas quimioluminiscentes adecuadas las acridinas o el luminol. Las secuencias
diana hibridadas con las sondas derivatizadas con
éster de acridinio se protegen de la hidrólisis por
intercalación. Son ejemplos de fluorescentes adecuados fluoresceı́na, ficobiliproteı́na, quelatos de
tierras raras, dansilo o rodamina.
Son ejemplos de substratos o inhibidores enzimáticos adecuados compuestos que se unen
especı́ficamente a la peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, β-galactosidasa, piruvato quinasa o
fosfatasa alcalina acetilcolinesterasa. Son ejemplos de sustancias radioopacas el oro coloidal o
partı́culas magnéticas.
Un par de unión especı́fico comprende dos moléculas diferentes, teniendo una de las moléculas un área sobre su superficie o en una cavidad
que se une especı́ficamente a una organización espacial y polar particular de otra molécula. Los
miembros del par de unión especı́fico a menudo
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se denominan ligando y receptor o ligando y antiligando. Por ejemplo, si el receptor es un anticuerpo, el ligando es el antı́geno correspondiente.
Otros pares de unión especı́ficos incluyen pares de
hormona-receptor, pares de enzima-substrato, pares de biotina-avidina y pares de glicoproteı́na-receptor. Se incluyen fragmentos y porciones de pares de unión especı́ficos que retienen especificidad
de unión, tales como fragmentos de inmunoglobulinas, incluyendo fragmentos Fab y similares.
Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Si como marcador se usa un miembro
de un par de unión especı́fico, el procedimiento
de separación preferido implicará cromatografı́a
de afinidad.
Si no puede detectarse el producto amplificado
en el ensayo descrito anteriormente, es indicativo
de deficiencia de MTAsa en las células presentes
en la muestra. Como es de esperar que las células
normales (es decir, no cancerosas) tengan MTAsa
en cantidades detectables, el hallazgo de deficiencia de MTAsa indica que el ADN genómico analizado se obtuvo a partir de células cancerosas.
El ensayo de la invención es particularmente adecuado para fines de diagnóstico, por ejemplo, para
la diagnosis de la deficiencia de MTAsa asociada
con neoplasmas, particularmente neoplasmas malignos.
Cuando se desee, la muestra puede preseleccionarse en busca de actividad catalı́tica de
MTAsa usando el método descrito por Seidenfeld, y colaboradores, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 95:1861-1866 (1980); véase también
el Ejemplo I, infra). El ensayo de la invención
después se usará para determinar si el gen que
codifica la MTAsa está presente en las células de
la muestra. La muestra también puede ensayarse
para determinar la presencia de proteı́na catalı́ticamente activa o inactiva para eliminar los contaminantes; es decir, las células no cancerosas presentes en la muestra. En Nobori, y colaboradores,
Cancer Res. 53:1098-1101 (1991) se describe un
inmunoensayo adecuado para uso a este respecto.
B. Producción de polinucleótidos y péptidos de
MTAsa sintéticos o recombinantes
Otro objeto es proporcionar polinucleótidos
(en particular, oligonucleótidos) que permitan
la amplificación de una secuencia de ácido nucleico especı́fica de MTAsa. La estrategia para
diseñar tales oligonucleótidos considerará los aspectos mencionados anteriormente. Tales oligonucleótidos son particularmente útiles para el
diagnóstico de la deficiencia de MTAsa asociada
con el tumor maligno.
Se proporcionan MTAsa sintética y recombinante, péptidos de MTAsa, ası́ como polinucleótidos que codifican la MTAsa y los péptidos
de MTAsa. Como se usa en este documento, “polinucleótido” se refiere a un polı́mero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en forma de
un fragmento separado o como un componente de
una construcción mayor. El ADN que codifica la
MTAsa o un péptido de MTAsa puede montarse
a partir de fragmentos de ADNc o de oligonucleótidos que proporcionan un gen sintético que
puede expresarse en una unidad transcripcional
recombinante. Las secuencias polinucleotı́dicas
de la invención incluyen secuencias de ADN, ARN
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y ADNc. Una secuencia polinucleotı́dica puede
deducirse a partir del código genético; sin embargo, debe tenerse en cuenta la degeneración del
código.
Los péptidos y polinucleótidos proporcionados incluyen derivados funcionales de MTAsa,
péptidos de MTAsa y nucleótidos que codifican
los mismos. Por “derivado funcional” se entienden los “fragmentos”, “variantes”, “análogos”, o
“derivados quı́micos” de una molécula. Un “fragmento” de una molécula, tal como cualquiera de
los polinucleótidos de la presente invención, incluye cualquier subserie de nucleótidos de la molécula. Una “variante” de tal molécula se refiere
a una molécula que se produce de forma natural
sustancialmente similar a la molécula entera o a
un fragmento de la misma. Un “análogo” de una
molécula se refiere a una molécula no natural sustancialmente similar a la molécula entera o a un
fragmento de la misma.
Se dice que una molécula es “sustancialmente
similar” a otra molécula si las secuencias de
aminoácidos, o en el caso de los polinucleótidos,
las secuencias producidas por las dos moléculas,
son sustancialmente iguales. Las moléculas de
aminoácidos sustancialmente similares poseerán
una actividad biológica similar. De esta forma,
siempre que dos moléculas posean una actividad
similar, se considerarán variantes, ya que este
término se usa en este documento aunque una de
las moléculas contenga restos aminoácidos adicionales no encontrados en la otra, o aunque la secuencia de restos aminoácidos no sea idéntica.
Como se usa en este documento, se dice que
una molécula es un “derivado quı́mico” de otra
molécula cuando contiene restos quı́micos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Tales restos puede mejorar la solubilidad,
absorción, vida media biológica, etc., de la molécula. Como alternativa, los restos pueden reducir
la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar
cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Se describen restos capaces de mediar
tales efectos, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a¯ Ed., Mack Publishing
Co., Easton, Penn. (1980).
Ciertas modificaciones minoritarias de la secuencia primaria de aminoácidos de la MTAsa
pueden producir proteı́nas con una actividad sustancialmente equivalente a la de la enzima MTAsa
y péptidos descritos en este documento. Tales
modificaciones puede ser deliberadas, tales como
por mutagénesis de localización dirigida, o pueden
ser espontáneas. Todas las proteı́nas y péptidos
producidos por estas modificaciones se incluyen
en este documento siempre que conserven la actividad biológica de la MTAsa. Además, la supresión de uno o más aminoácidos también puede
ocasionar una modificación de la estructura de la
molécula resultante sin alterar significativamente
su actividad biológica. Esto puede conducir al desarrollo de una molécula activa más pequeña que
tendrı́a mayor utilidad. Por ejemplo, se pueden
retirar los aminoácidos amino o carboxi terminales que no se requieran para que la enzima ejerza
la actividad catalı́tica o antigénica deseada.
La expresión “variación conservativa”, como
se usa en este documento, denota el reemplazo de
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un resto aminoácido por otro resto biológicamente
similar. Los ejemplos de variaciones conservativas
incluyen la sustitución de un resto hidrófobo tal
como isoleucina, valina, leucina o metionina por
otro, o la sustitución de un resto polar por otro,
tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina
por asparagina, y similares. La expresión “variación conservativa” también incluye el uso de un
aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido progenitor no sustituido, siempre que los anticuerpos inducidos contra el polipéptido sustituido
también presenten reacción inmunológica con el
polipéptido no sustituido.
También pueden obtenerse por varios métodos
secuencias de ADN para uso en la producción de
MTAsa y de péptidos de MTAsa. Por ejemplo,
el ADN puede aislarse usando procedimientos de
hibridación bien conocidos en la técnica. Éstos
incluyen, pero sin limitación: 1) hibridación de
sondas con genotecas o de ADNc para detectar secuencias de nucleótidos compartidas; 2) selección
de anticuerpos en bibliotecas de expresión para
detectar caracterı́sticas estructurales compartidas
y 3) sı́ntesis por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Los procedimientos de hibridación son útiles
para la selección de clones recombinantes por medio del uso de sondas oligonucleotı́dicas sintéticas
mixtas marcadas, siendo cada sonda potencialmente el complemento completo de una secuencia
de ADN especı́fica en la muestra de hibridación
que incluye una mezcla heterogénea de ADN de
doble hélice desnaturalizado. Para tal selección,
la hibridación preferiblemente se realiza en un
ADN de una sola hélice o en un ADN de doble
hélice desnaturalizado. La hibridación es particularmente útil en la detección de clones de ADNc
procedentes de fuentes en las que está presente
una cantidad extremadamente baja de secuencias
de ARNm relacionadas con el polipéptido de interés. En otras palabras, usando condiciones de
hibridación rigurosas dirigidas a evitar la unión
no especı́fica, es posible, por ejemplo, permitir
la visualización autorradiográfica de un clon de
ADNc especı́fico por medio de la hibridación del
ADN diana con esta sonda única en la mezcla.
Una biblioteca de ADNc que contiene MTAsa
puede seleccionarse inyectando los diversos ARNm
obtenidos a partir de ADNc en oocitos, dejando un tiempo suficiente para que se produzca la
expresión de los productos génicos del ADNc, y
ensayando para determinar la presencia del producto de expresión de ADNc deseado, por ejemplo, por medio del uso de anticuerpos especı́ficos
para la MTAsa o por medio del uso de sondas
para los motivos repetidos y un modelo de expresión de tejidos caracterı́stico de MTAsa. Como
alternativa, una biblioteca de ADNc puede seleccionarse indirectamente con respecto a los péptidos de MTAsa que tienen al menos un epı́topo,
usando anticuerpos especı́ficos para los polipéptidos. Como se describe en la Sección C más adelante, tales anticuerpos pueden ser policlonales
o monoclonales y pueden usarse para detectar el
producto de expresión indicativo de la presencia
del ADNc de MTAsa.
Los procedimientos de selección que se basan
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en hibridación de ácidos nucleicos hacen que sea
posible aislar cualquier secuencia génica a partir
de cualquier organismo, siempre que se disponga
de la sonda apropiada. Las sondas oligonucleotı́dicas, que corresponden a una parte de la secuencia que codifica la proteı́na en cuestión, pueden
sintetizarse quı́micamente. Esto requiere que se
conozcan tramos cortos de oligopéptidos de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de ADN
que codifica la proteı́na puede deducirse a partir
del código genético; sin embargo, tiene que tenerse en cuenta la degeneración del código. Es
posible realizar una reacción de adición mixta
cuando la secuencia es degenerada. Esto incluye
una mezcla heterogénea de ADN de doble cadena desnaturalizado. Para tal selección, la hibridación preferiblemente se realiza en ADN de
una sola cadena o en ADN de doble cadena desnaturalizado.
El desarrollo de secuencias de ADN especı́ficas
que codifican MTAsa o fragmentos de la misma
también puede conseguirse por: 1) aislamiento de
secuencias de ADN de doble cadena a partir del
ADN genómico; 2) fabricación quı́mica de una
secuencia de ADN para proporcionar los codones necesarios para el polipéptido de interés; y 3)
sı́ntesis in vitro de una secuencia de ADN de doble cadena por transcripción inversa del ARNm
aislado a partir de una célula eucariota dadora.
En el último caso, finalmente se forma un complemento de ADN de doble cadena que generalmente
se denomina ADNc.
El polinucleótido y cualquier variante del mismo que codifique MTAsa puede insertarse en un
vector de expresión recombinante. La expresión
“vector de expresión recombinante” se refiere a
un plásmido, virus u otro vehı́culo conocido en la
técnica que se ha manipulado por inserción o incorporación de las secuencias genéticas apropiadas. Tales vectores de expresión contienen una
secuencia promotora que facilita la transcripción
eficaz de la secuencia genética insertada del hospedador.
La transformación de una célula hospedadora
con ADN recombinante también puede realizarse
por técnicas convencionales que son bien conocidas para los expertos en la técnica. Las células
hospedadoras pueden ser eucariotas (tales como
células de ovario de hámster chino) o procariotas (tales como bacterias o levaduras). Cuando
el hospedador es procariota, tal como E. Coli,
pueden prepararse células competentes capaces
de captar el ADN a partir de células recogidas después de la fase de crecimiento exponencial y posteriormente tratadas por el método de
CaCl2, por procedimientos bien conocidos en la
técnica. Como alternativa, pueden usarse MgCl2
o RbCl2 . La transformación también puede realizarse después de formar un protoplasma en la
célula hospedadora o por electroporación.
El aislamiento y la purificación de la MTAsa
expresada por el microorganismo, o de fragmentos
de la misma, pueden realizarse por los expertos
habituales en la técnica usando medios convencionales, incluyendo cromatografı́a preparativa y separaciones inmunológicas que implican anticuerpos monoclonales o policlonales.
Basándose en la información contenida en
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SEC. ID. No. 1, la secuencia de aminoácidos
de longitud completa deducida para la MTAsa
puede deducirse fácilmente. Usando esta información, también pueden sintetizarse MTAsa y
péptidos de MTAsa sin experimentación indebida por métodos usados comúnmente tales como
protección con t-BOC o FMOC de grupos alfaamino. Ambos métodos implican la sı́ntesis por
etapas en la que se añade un solo aminoácido en
cada etapa partiendo del extremo C del péptido
(véase, Coligan, y colaboradores, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 991, Unit
9). Los péptidos de la invención también pueden sintetizarse por diversos métodos de sı́ntesis
de péptidos en fase sólida bien conocidos, tales
como los descritos en Merrifield, J. Am. Chem.
Soc., 85: 2149 (1962), y Stewart y Young, Solid
Phase Peptides Synthesis, (Freeman, San Francisco, 27-62, 1969), usando un copoli(estirenodivinilbenceno) que contiene 0,1-1,0 mmol de
aminas/g de polı́mero.
En este último método, después de la sı́ntesis
quı́mica, los péptidos pueden desprotegerse y escindirse del polı́mero por tratamiento con HF
lı́quido-anisol al 10 % durante aproximadamente
0,25-1 horas a 0◦ C. Después de la evaporación de
los reactivos, los péptidos se extraen del polı́mero
con solución de ácido acético al 1 % que después
se liofiliza para producir el material bruto. Éste
normalmente puede purificarse por técnicas tales
como exclusión molecular en Sephadex G-15TM
usando ácido acético al 5 % como disolvente. La
liofilización de las fracciones apropiadas de la columna producirá el péptido o derivados peptı́dicos
homogéneos, que después pueden caracterizarse
por técnicas convencionales tales como análisis de
aminoácidos, cromatografı́a de capa fina, cromatografı́a lı́quida de alta resolución, espectroscopı́a
de absorción ultravioleta, rotación molar y solubilidad, y cuantificarse por degradación de Edman
en fase sólida.
C. Producción de anticuerpos anti-MTAsa
La antigenicidad de péptidos MTAsa puede
determinarse por técnicas convencionales para determinar la magnitud de la respuesta de anticuerpos de un animal que se ha inmunizado con
el péptido. Generalmente, los péptidos MTAsa
que se usan para inducir los anticuerpos antiMTAsa son los que inducen la producción de altas titulaciones de anticuerpo con una afinidad
relativamente alta por MTAsa. Tales péptidos
pueden purificarse para uso como inmunógenos
usando, por ejemplo, el método descrito en Rangione, y colaboradores, (J. Biol. Chem., supra) o
los métodos para obtener los péptidos de MTAsa
descritos anteriormente.
Una vez que se han preparado los péptidos
antigénicos, se producen anticuerpos contra el
péptido de inmunización por medio de la introducción del péptido en un mamı́fero (tal como
un conejo, ratón o rata). Con fines ilustrativos,
las secuencias de aminoácidos de dos péptidos de
MTAsa antigénicos se proporcionan en la Lista
de Secuencias adjunta como SEC. ID. Nos. 2 y 3.
Los anticuerpos producidos por conejos inmunizados con estos péptidos mostraron 50 % de respuesta máxima ante la MTAsa purificada, a una
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dilución de, respectivamente, 1:1500 y 1:4000.
Se prefiere un protocolo de inmunización de
inyecciones múltiples para uso en la inmunización
de animales con los péptidos de MTAsa antigénicos (véase, por ejemplo, Langone, y colaboradores, eds., “Production of Antisera with Small
Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections”, Methods of Enzymology (Acad. Press,
1981). Por ejemplo, puede obtenerse una buena
respuesta de anticuerpos en conejos por inyección
intradérmica de 1 mg del péptido de MTAsa antigénico emulsionado en Adyuvante Completo de
Freund seguido varias semanas después de uno o
más refuerzos del mismo antı́geno en Adyuvante
Incompleto de Freund.
Si se desea, el péptido de inmunización puede
acoplarse a una proteı́na de soporte por conjugación usando técnicas que son bien conocidas en
la técnica. Tales portadores usados comúnmente
que se acoplan quı́micamente al péptido incluyen
hemocianina de lapa de cerradura (KLH), tiroglobulina, albúmina de suero bovino (BSA) y toxoide
tetánico. El péptido acoplado después se usa para
inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón o un
conejo). Como actualmente se cree que la MTAsa
se conserva entre especies de mamı́feros, se prefiere el uso de una proteı́na de soporte para aumentar la inmunogenicidad de proteı́nas MTAsa.
Los anticuerpos policlonales producidos por
los animales pueden purificarse adicionalmente,
por ejemplo, por unión y elución desde una matriz a la que está unido el péptido contra el
que se indujeron los anticuerpos. Los expertos
en la técnica conocerán diversas técnicas comunes en las técnicas de inmunologı́a para la purificación y/o concentración de anticuerpos policlonales, ası́ como de anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, Coligan, y colaboradores,
Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley
Interscience, 1991).
Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se prefiere la inmunización de un ratón o
rata. Se entiende que el término “anticuerpo”,
como se usa en esta invención, también incluye
moléculas intactas, ası́ como fragmentos de las
mismas, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab)’2 ,
que son capaces de unirse al determinante epitópico. Además, en este contexto, la expresión
“mAb de la invención” se refiere a anticuerpos
monoclonales con especificidad por MTAsa.
El método general usado para la producción
de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales (“mAb”) es bien conocido (Kohler y Milstein, Nature, 256:495, 1975). En resumen, como
se describe por Kohler y Milstein, la técnica comprendı́a obtener linfocitos aislados de ganglios
linfáticos drenantes regionales de cinco pacientes con cáncer distintos, con melanoma, teratocarcinoma, cáncer de cérvix, glioma, o cáncer de
pulmón, a partir de muestras quirúrgicas, reunirlos y después fusionarlos con SHFP-1. Se seleccionaron hibridomas para la producción de un anticuerpo que se unı́a a estirpes celulares de cáncer.
La confirmación de la especificidad por MTAsa
entre los mAb puede realizarse usando técnicas de
selección relativamente rutinarias (tales como el
ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima o
“ELISA”) para determinar el modelo de reacción
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elemental del mAb de interés.
También es posible evaluar sin experimentación indebida a un mAb, para determinar si
tiene la misma especificidad que un mAb que se
une a la MTAsa, determinando si el mAb que se
está ensayando impide la unión del mAb, que se
une a la MTAsa, a la MTAsa aislada que se ha
descrito anteriormente. Si el mAb que se está ensayando compite con el mAb que se sabe que se
une a la MTAsa, lo cual se demuestra por una
reducción de la unión por el mAb que se sabe que
se une a la MTAsa, entonces es probable que los
dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo
epı́topo o a un epı́topo muy relacionado.
Otra forma de determinar si un mAb tiene la
especificidad de un mAb que se sabe que se une a
la MTAsa, es preincubar el mAb que se sabe que
se une a la MTAsa con MTAsa como antı́geno,
y determinar si el mAb que se está ensayando se
inhibe en su capacidad de unirse al antı́geno. Si
el mAb que se está ensayando se inhibe, entonces,
con toda probabilidad, tiene la misma especificidad epitópica o una especificidad epitópica muy
relacionada con la del mAb que se sabe que se
une a la MTAsa.
D. Kits de detección de MTAsa
Pueden prepararse kits de detección de MTAsa
para uso en laboratorios y establecimientos clı́nicos, que incluyen reactivos útiles en los métodos
descritos anteriormente. Por ejemplo, un kit para
uso en el método de la Sección A, supra, preferiblemente incluirı́a cebadores oligonucleotı́dicos
(producidos como se ha descrito anteriormente en
la Sección B), sondas de hibridación marcadas detectables y placas de microtitulación recubiertas
con reactivo. El kit también incluirı́a los anticuerpos descritos en la sección C anterior para uso en
la detección inmunológica de la proteı́na MTAsa.
Habiéndose descrito la invención con detalle,
a continuación se proporcionan ejemplos que ilustran su puesta en práctica. Estos ejemplos deben
considerarse sólo ilustrativos y no limitantes del
alcance de la invención.
En los Ejemplos, se usan las siguientes abreviaturas: AS = sin sentido, DTT = ditiotreitol;
min = minutos; MTAsa = 5’-desoxi-5’-metiltioadenosina fosforilasa; PCR = reacción en cadena
de la polimerasa; S = con sentido; SSc = NaCl
0,3 M, citrato sódico dihidrato 0,03 M; v/v = volumen por volumen; SDS = dodecilsulfato sódico.
Ejemplo I
Ensayo de la actividad catalı́tica de MTAsa en
una muestra
La actividad de fosforolisis de la MTAsa se determinó midiendo la formación de [metil-14C] 5metiltiorribosa-1-fosfato a partir de [metil-14C]5’desoxi-5’-metiltioadenosina (Seidenfeld y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun, 95,
1861-1866, 1980). En un volumen total de 200
microlitros, la mezcla de reacción convencional
contenı́a tampón fosfato potásico 50 mM, pH 7,4,
[metil-14C] 5’-desoxi-5’-metiltioadenosina 0,5 mM
(2 x 109 CPM/mmol), DTT 1 mM y las cantidades indicadas de enzima. Después de la incubación a 37◦ C durante 20 min, la reacción se interrumpió por la adición de 50 microlitos de ácido tricloroacético 3 M y se aplicaron alı́cuotas
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de 200 microlitros a una columna de 0,6 x 2
cm de “Dowex” 50-H∗ (Marca Comercial Registrada), equilibrada con agua. La [metil-14C] 5metiltiorribosa-1-fosfato se eluyó directamente en
viales de centelleo que contenı́an 2 ml de HCl 0,1
M.
Ejemplo II
Purificación de MTAsa nativa a partir de hı́gado
de rata
La MTAsa se aisló a partir de hı́gado de rata
modificando el método de Rangione y colaboradores (J. Biol. Chem. 261, 12324-12329, 1986). 50 g
de hı́gado de rata fresco se homogeneizaron en un
Waring Blendor con 4 volúmenes de tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7,4, que contenı́a DTT
1 mM (Tampón A). El homogeneizado se centrifugó (1 hora a 15.000 x g) y el sobrenadante
resultante se sometió a fraccionación con sulfato
amónico. El precipitado con una saturación entre
55 y 75 % se recogió por centrifugación (15.00 x
g durante 20 minutos) y se disolvió en un volumen mı́nimo de Tampón A. Después, la muestra
se dializó durante una noche frente a tres cambios
de 100 volúmenes del mismo tampón.
La muestra se clarificó por centrifugación a
15.000 x g durante 30 minutos y después se
aplicó a una columna de DEAE-SephacrilTM (1,5
x 18 cm; Pharmacia) previamente equilibrada con
Tampón A. Después de lavar con 80 ml de tampón
de equilibrio, se aplicó un gradiente lineal (80
ml) de NaCl 0-0,3 M en tampón A. La actividad
MTAsa se eluyó entre NaCl 0,1 y 0,15 M. Las fracciones que contenı́an al menos 0,06 unidades/mg
de proteı́na se concentraron 20 veces por ultrafiltración (membranas Amicon PM-10, DiaflowTM)
y se dializaron extensivamente frente a tampón
fosfato potásico 25 mM, pH 7,4, que contenı́a
DTT 1 mM (Tampón B). La muestra después
se aplicó en una columna de hidroxiapatita (1
x 12 cm) (Bio-RadTM). Después de la elución
de las proteı́nas no absorbidas con Tampón B, la
columna se lavó con aproximadamente 40 ml de
tampón fosfato potásico 50 mM, pH 7,4, que contenı́a DTT 1 mM.
Después se eluyó la MTAsa usando un gradiente lineal (40 ml) de fosfato potásico 50-250
mM, pH 7,4. Las fracciones que contenı́an la actividad MTAsa se concentraron 30 veces por ultrafiltración y se liberaron del ditiotreitol por concentración y dilución repetidas con tampón fosfato potásico 50 mM, pH 7,4. La enzima parcialmente purificada después se aplicó a una columna (0,8 x 3 cm) de agarosa organomercurial
(Bio-RadTM) equilibrada con tampón fosfato 50
mM, pH 7,4. La elución de la columna se realizó por etapas con a) tampón fosfato potásico 50
mM, pH 7,4; b) tampón fosfato potásico 50 mM,
pH 7,4, y KCl 2 M; y c) tampón fosfato potásico
50 mM, pH 7,4, KCl 2 M, y 2-mercaptoetanol
40 mM. La enzima después se eluyó con tampón
fosfato potásico 50 mM, pH 7,4, KCl 2 M, y 2mercaptoetanol 200 mM. Las fracciones que contenı́an al menos tres unidades/mg de proteı́na se
reunieron, se concentraron hasta 1 ml por ultrafiltración y se dializaron durante una noche frente a
1000 volúmenes de tampón Tris/HCl 10 mM, pH
7,4, y DTT 1 M (Tampón C). Como etapa de pu-
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rificación final, se inyectaron alı́cuotas de la muestra (1 ml) a un caudal de 1 ml/min en una columna MONO QTM (Pharmacia) pre-equilibrada
con Tris/HCl 10 mM, pH 7,4, que contenı́a DTT
1 mM, y se recogieron fracciones de 0,5 ml. La
actividad MTAsa se eluyó entre NaCl 0,08 y 0,14
M en Tampón C. Las fracciones se concentraron
a 0,5 ml por ultrafiltración y se dializaron frente
a 1000 volúmenes de Tampón B.
Ejemplo III
Determinación de una secuencia de aminoácidos
parcial para MTAsa de rata
La muestra purificada se liofilizó, se disolvió
en 50 microlitros de un tampón de carga de muestra (1 % de dodecilsulfato sódico (SDS), 10 % de
glicerina, DTT 0,1 M y 0,001 % de azul de bromofenol) y se introdujo en un gel de SDS poliacrilamida al 10 % con un espesor de 0,5 mm (aparato
Bio-Rad MINIGELTM ). Después de la electroforesis, las proteı́nas se sometieron a electrotransferencia durante 2 horas sobre nitrocelulosa (con un
tamaño de poros de 0,45 milı́metros, Millipore) en
un sistema de transferencia de manchas Bio-Rad
usando tampón de transferencia (Tris 15 mM, glicina 192 mM y 20 % de metanol, pH 8,3) como
se describe por Towbin, y colaboradores (Proc.
Nat’l Acad. Sci. USA 76, 4340-4345, 1979).
Después de la transferencia, las proteı́nas
se tiñeron de forma reversible con Ponceau S
(Sigma) usando una modificación del método descrito por Salinovich y Montelaro (Anal. Biochem.
156, 341-347, 1987). El filtro de nitrocelulosa se
sumergió durante 60 segundos en una solución de
tinte Ponseau S al 0,1 % en ácido acético acuoso al
1 %. El exceso de tinte se retiró de la mancha por
agitación suave durante 1-2 min en ácido acético
acuoso al 1 %. La región que contenı́a la proteı́na
detectada por tinción se cortó, se transfirió a un
tubo Eppendorf (1,5 ml), se lavó con agua destilada y se incubó durante 30 minutos a 37◦C en 1,2
ml de polivinil-pirrolidona al 0,5 % (peso molecular medio = 40.000; PVP-40, Sigma) disuelta en
ácido acético 100 mM para prevenir la absorción
de la proteasa en la nitrocelulosa durante la digestión. El exceso de PVP-40 se retiró por lavado
extensivo con agua (al menos cinco cambios).
Después se cortaron las tiras de nitrocelulosa
en pequeñas piezas de aproximadamente 1 mm x 1
mm y se pusieron de nuevo en el mismo tubo. La
proteı́na en las piezas de nitrocelulosa se digirió
como se ha descrito anteriormente (Los y colaboradores, Science 243: 217-220, 1989). Se añadió
tripsina (10 pmol) en 100 microlitros de Tris-HCl
100 mM, pH 8,2/acetonitrilo, 95:5 (v/v) y la mezcla se incubó a 37◦ C durante una noche. Después
de la digestión, el sobrenadante que contenı́a el
péptido se acidificó con 30 microlitros de ácido
trifluoroacético al 10 %, se agitó rápidamente en
un Vortex y se centrifugó a 15.000 x g durante
1 minuto. El sobrenadante se retiró y se inyectó
inmediatamente en un sistema de HPLC de fase
inversa (Beckmann) equipado con una columna
analı́tica Brownlee Aquapore Bu-300TM (2,1 x
100 mm).
Se bombeó Eluyente D, ácido trifluoroacético
al 0,1 % (calidad sequenal en agua), a través de
la columna durante 5 minutos a un caudal de 200
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microlitros/minuto antes de reducir el flujo a 100
microlitros/minuto y se inició el gradiente con
Eluyente E (ácido trifluoroacético al 0,08-0,095 %
en acetonitrilo/H2O, 70:30 (v/v)). Basándose
en la absorción UV a 215 nm, se recogieron las
fracciones que contenı́an el péptido manualmente
en tubos Eppendorf. Las fracciones 60 y 77 representativas se sometieron a secuenciación de
aminoácidos (ABI 477A Protein SequencerTM con
120A Online PTH-AA AnalyzerTM ). De esta
forma, se obtuvieron secuencias de aminoácidos
parciales independientes de MTAsa de rata. Las
secuencias de aminoácidos de los péptidos denominados péptido 1 (fracción 60) y péptido 2
(fracción 77) se representan en las SEC. ID. Nos.
5 y 6.
Ejemplo IV
Amplificación de un fragmento de adn que codifica
parte del gen de MTAsa humano
Basándose en la secuencia de aminoácidos parcial de los péptidos 1 (SEC ID No. 4) y 2 (SEC
ID No. 5) se sintetizaron 2 series de cebadores oligonucleotı́dicos con diferentes polaridades.
Cada oligonucleótido se diseñó de forma que incluyera un solo sitio de restricción en su extremo
5’ (EcoRI o BamHI) para facilitar la posterior clonación del fragmento de ADN amplificado. Para
uso en la amplificación por PCR, se aisló el ADNc
total a partir de 1 millón de unidades formadoras de placas (pfu) de una biblioteca génica de
ADNc de placenta humana (Clontech) usando el
kit Lambda-TRAPTM (Clontech). La reacción de
PCR se realizó en un volumen total de 100 microlitros que contenı́a 1 microgramo de ADNc total
de la biblioteca génica de ADNc de placenta humana, 1 x tampón de PCR (KCl 10 mM, Tris-HCl
10 mM, pH 8,3, MgCl2 2,5 mM), una concentración 0,2 mM de cada dNTP, 100 mg de cada
uno de los cebadores con sentido y sin sentido
y 10 unidades de Taq ADN polimerasa (Stoffel
Fragment AMPLI TAQTM, Perkin-Elmer Cetus).
Se realizaron cuarenta ciclos con el GENE
AMPTM PCR System 9600 (Perkin-Elmer Cetus), constando cada ciclo de desnaturalización
(92◦C, 1 min), templado (55◦ C, 2 min) y extensión (72◦ C, 2 min). El producto de PCR se separó electroforéticamente en un gel de agarosa al
0,8 % en 1 x tampón TA (Tris-acetato 40 mM, Naacetato 20 mM, EDTA 2 mM, pH 7,9) y se amplificó un fragmento de ADN de 450 pb. El producto
de amplificación de PCR se digirió de forma doble con las enzimas de restricción EcoRI/BamHI,
se separó en un gel de agarosa al 0,8 % en 1 x
tampón TA, se recuperó del gel usando el kit
GENE CLEANTM (Bio101), se subclonó en el
vector pBluescript SK+ (Marca Comercial Registrada de Stratagene) cortado con EcoRI/BamHI
y se secuenció por el método de terminación didesoxi usando el cebador de secuenciación universal
SEQUENASETM Versión 1,0 (equipo de secuenciación de ADN, USB).
Ejemplo V
Selección de una biblioteca génica de ADNc de
placenta humana
El análisis de la secuencia del producto amplificado por PCR (Ejemplo IV) muestra una coincidencia perfecta con la secuencia de aminoácidos
9
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C-terminal del péptido 1 (SEC ID No. 5). Usando
el fragmento de ADN de 450 pb como sonda de
hibridación, se seleccionó una genoteca de ADNc
de placenta humana (Clontech). Para este fin,
se incubaron células hospedadoras E. coli de la
cepa Y1090 durante una noche con agitación vigorosa a 37◦ C en medio LB (por litro: 10 g de
triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de
NaCl) que contenı́a 0,2 % de maltosa y MgSP 10
mM. Para cada placa de cultivo, se mezclaron 0,3
ml del cultivo de células hospedadoras con 3 x 104
pfu de fago y se incubaron durante 20 minutos a
37◦C. Las mezclas de células hospedadoras y fago
se añadieron a 8 ml de medio LB que contenı́a
agarosa al 0,7 % (LB-top-agarosa), que se habı́a
precalentado a 48◦ C, y se vertieron en 20 placas
de agar (135 x 15 mm). Las placas fueron visibles
después de una incubación durante 6 a 8 horas a
37◦C y las placas se enfriaron a 4◦ C durante 1
hora. Las placas se transfirieron a membranas
de transferencia de nilón Colony/Plaque Screen
(NEN Research Products, Dupont Boston, MA)
durante 3 minutos, seguido de desnaturalización
(2 veces en NaOH 0,5 N durante 2 minutos), renaturalización (2 veces en Tris-HCl 1,0 M, pH 7,5,
durante 2 minutos) y fijación por secado al aire.
Se realizó una prehibridación de 20 membranas en
dos bolsas de plástico que contenı́an 10 membranas cada una, usando 20 ml de tampón de prehibridación (1 % de SDS, 2 x SSC; 10 % de sulfato
de dextrano, y 50 % de formamida desionizada)
durante 4 h a 42◦ C.
El fragmento EcoRI-BamHI de 450 pb del gen
MTAsa humano parcial se marcó con [alfa-32P]
dATP (3.000 Ci/mmol) usando un kit de traducción con muesca (Boehringer Mannheim), se separó de la radiactividad no incorporada en una
columna NICKTM (Pharmacia), se desnaturalizó
por calentamiento a 96◦C durante 10 minutos,
se enfrió en hielo y se añadió a las membranas
en las bolsas de plástico, siendo la concentración
de la sonda 106 dpm/ml. La actividad especı́fica de la sonda marcada era de aproximadamente
108 dpm/microgramo. La hibridación se realizó
durante una noche a 42◦ C. Después de la hibridación, las membranas se lavaron a temperatura
ambiente tres veces durante 5 minutos con un exceso de 2 x SSC, y después a 65◦ C durante 20
minutos con 2 x SSC y SDS al 0,1 %, y una vez
a temperatura ambiente durante 20 minutos con
0,2 x SSC y SDS al 0,1 %. Las membranas lavadas
se expusieron a una pelı́cula de rayos X durante
una noche.
Los lechos cortos de agar que contenı́an varias placas alrededor de una señal positiva se retiraron y se introdujeron en 1 ml de diluyente de
fago estéril (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M,
MgSO4 8 mM, gelatina al 0,01 %) y se volvieron a
examinar como se ha mencionado anteriormente,
hasta que se obtuvieron placas positivas puras. A
partir de la selección de aproximadamente medio
millón de placas, se obtuvieron 6 clones positivos
independientes. Después de la amplificación en
placas LB, cada ADN de fago de clones positivos se purificó usando un kit Lambda-TRAPTM
(Clontech). Los ADN de fago purificados se cortaron con la enzima EcoRI para obtener el inserto
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entero, pero a causa de la existencia de un sitio
EcoRI dentro del inserto, se cortaron dos bandas
de todos los clones.
Dos fragmentos de inserto de EcoRI (de 850
pb y 1100 pb) del clon del fago representativo, denominado MTAp-1, se subclonaron en el vector
pBluescript SK+ (Marca Comercial Registrada)
(Stratagene) cortado con EcoRI. Estos subclones se denominaron MTAP-2 (850 pb) y MTAP-3
(1100 pb), respectivamente. El análisis de restricción de la secuenciación de ADN de estos dos subclones revela que el subclon MTAP-2 tiene una
fase de lectura abierta que codifica 254 aminoácidos, que comprende la secuencia de aminoácidos
que corresponde al péptido 3 en su extremo C
(homologı́a 90 %). Como se calcula a partir del
peso molecular de la MTAsa humana de 32 kDa
(F.D. Rangione y colaboradores, J. Biol. Chem.
261: 12324-12329, 1986), cubre más del 85 % de
la proteı́na total. Faltan aproximadamente 50
aminoácidos (al menos 150 pb a nivel del ADN).
Ejemplo VI
Extensión de cebadores para obtener el ADNc del
extremo 5’ que falta de la MTAsa
Para obtener el fragmento de ADN 5’-terminal
que faltaba, se aplicó RACE (amplificación rápida
de extremos de ADNc) (Loh y colaboradores,
Science 243: 217-220, 1989; Frohman, y colaboradores PNAS 85: 8998-9002, 1988). Un microgramo de poli (A+) ARN de placenta humana
(Clontech) en 6,25 microlitros de H2 O se calentó
a 65◦C durante 5 minutos, se inactivó en hielo y se
añadió a 4 microlitros de 5 x tampón RTC (TrisHCl 250 mM, pH 8,15; MgCl2 30 mM, KCl 200
mM, y DTT 5 mM), 4 microlitros (0,4 mg/ml) de
actinomicina D (Boehringer), 1 microlitro de cada
dNTP (20 mM), 0,25 microlitros (10 unidades)
de RNasin (Boehringer), 1 microlitro de [alfa-35S]
dATP (1443 Ci/mmol), 1 microlitro de oligonucleótido sin sentido especı́fico de MTAsa humana
3 AS y 10 unidades de transcriptasa inversa del
virus de la mieloblastosis aviar (Boehringer). La
mezcla se incubó durante 2 horas a 42◦C.
Los excesos de cebador y de dNTP se retiraron como se indica a continuación; el conjunto de
ADNc de 20 microlitros se aplicó a una columna
NICKTM (Pharmacia) y se recogieron fracciones
de 2 gotas. Se reunieron las fracciones 5-8 con
respecto al primer pico de radiactividad, se precipitaron con 1/10 volúmenes de NHOAc 7,5 M
y 2,5 volúmenes de etanol a -80◦C durante 2 horas, se centrifugaron a 15.000 x g durante 30 minutos a 4◦ C, se lavaron con 0,5 ml de etanol al
80 %, se secaron a presión reducida (SpeedvacTM )
y se disolvieron en 20 microlitros de H2 O. Para
las fracciones de cola, se añadieron 1,5 microlitros
de dGTP (20 mM), 2,4 microlitros de CoCl12 (25
mM), 6 microlitros de 5 x tampón de cola (cacodilato potásico 1 mM, Tris-HCl 125 mM, pH
6,6, y albúmina de suero bovino a una concentración de 1,25 mg/ml) y 0,5 microlitros de (15
unidades) desoxinucleotidil transferasa terminal
(Boehringer).
La mezcla se incubó durante 1 hora 37◦ C, se
calentó durante 15 minutos a 65◦ C, se extrajo una
vez con el mismo volumen de tampón TE (TrisHCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM), se saturó
19
ES 2 174 927 T3
con fenol y después se precipitó con etanol como
se ha mencionado anteriormente. El conjunto de
ADNc de cola se disolvió en 20 microlitros de H0
y se usó 1 microlitro para la PCR. Para la amplificación se sintetizaron dos cebadores más. Un
cebador era una cebador sin sentido especı́fico de
MTAsa que se localiza 180 pb cadena arriba de la
posición del oligonucleótido 3AS. El otro era un
cebador para el extremo poli(G). La amplificación
se realizó durante 40 ciclos como se ha descrito
anteriormente. Cada ciclo constaba de desnaturalización (92◦C, 1 min), templado (50◦C, 2 min)
y extensión (72◦ C, 0,5 min).
El producto de PCR se separó por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %. El fragmento
de ADN de 520 pb obtenido se amplificó especı́ficamente. Después de la purificación en gel
preparativo de agarosa al 0,8 %, el fragmento de
ADN de 520 pb se digirió con Not I y Bcl I (estando presentes los sitios de restricción relevantes en el dominio solapante entre el fragmento de
ADN extendido y el fragmento original del subclon MTAP-2) y se subclonó en el vector pBluescript SK+ (Marca Comercial Registrada) (Stratagene) cortado con Not I/BamHI. El análisis de la
secuencia de tres subclones independientes, denominados MTAP-4, MTAP-5 y MTAP-6, respectivamente, reveló que cada uno de estos clones contenı́a una secuencia de aminoácidos exactamente
equivalente en el dominio solapante.
Las longitudes de estos tres subclones de
ADNc extendidos a partir de cebador son ligeramente diferentes. Esto implica que son productos
de PCR independientes y que sus secuencias reflejan la secuencia de ARNm correcta sin ninguna
incorporación errónea de bases durante la amplificación por PCR. La combinación de la nueva secuencia cadena arriba con el codón de iniciación
ATG (que codifica metionina) y la secuencia cadena abajo del subclon MTAP-2 genera una fase
de lectura abierta que codifica 283 aminoácidos.
Ejemplo VII
Expresión de MTAsa humana recombinante en
E. Coli
El ADNc de longitud completa de la MTAsa
humana se construyó añadiendo el fragmento de
ADNc extendido a partir del cebador del subclon
MTAP-4, que contiene el mayor inserto de los
tres subclones obtenidos en el Ejemplo VI, al extremo 5’ del inserto de ADN del subclon MTAP2, usando su sitio de restricción común HindII.
El fragmento de ADN Not I/HindII del subclon
MTAP-4 y el fragmento grande HindII/EcoRI del
subclon MTAP-2 se mezclaron y se subclonaron
en el vector pBluescript SK+ (Marca Comercial Registrada) (Stratagene) cortado con Not
I/EcoRI. El subclon obtenido que contenı́a un
ADNc de longitud completa de MTAsa humana
se denominó MTAP-7. Para comprobar la autenticidad de este clon de ADNc, la proteı́na recombinante se expresó usando el vector de expresión
de E. coli pKK223-3 equipado con el promotor
TaqTM (Pharmacia).
Para generar un nuevo sitio EcoRI en el extremo 5’ y un sitio Pst I en el extremo 3’ del
fragmento de ADNc, se usó PCR aplicando un
cebador oligonucleotı́dico 5’ que comprendı́a la
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secuencia de Shine-Dalgarno (SD) y otro cebador 3’. La amplificación se realizó durante 20 ciclos como se ha mencionado anteriormente, constando cada ciclo de desnaturalización (92◦ C, 1
min), templado (55◦ C, 1 min) y extensión (72◦ C,
1 min). El producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoRI/Pst I, se purificó electroforéticamente en un gel de agarosa al 0,8 % y
se subclonó en el vector pBluescript SK+ (Marca
Comercial Registrada) (Stratagene) cortado con
EcoRI/PstI.
Después de comprobar la secuencia completa
del inserto en el subclon denominado MTAP-8,
el fragmento EcoRI/Pst I se cortó y se subclonó en el vector pKK223-3 cortado con EcoRI/Pst
I que producı́a ADNc de MTAsa humana en un
vector de expresión de E. coli. El subclon, denominado MTAP-9, se utilizó para transformar la
cepa JM105 de E. coli. Se analizó la actividad
enzimática y el espectro de proteı́nas totales de
células transformadas con y sin inducción con isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Una
sola colonia transformada se inoculó en 2 ml de
medio LB y se incubó durante una noche a 37◦ C,
y se añadieron 20 microlitros de este cultivo de
una noche en dos tubos de plástico que contenı́an,
cada uno, 2 ml de medio LB reciente (dilución
1/100).
Después de la incubación a 37◦ C durante 1
hora, a un tubo se le añadieron 20 microlitros de
IPTG 0,1 M para la inducción, dando una concentración final de IPTG 1 mM, y se incubó a
37◦C durante 4 horas más. Después de recoger
las células por centrifugación a 15.000 x g durante 5 minutos, las células se resuspendieron en 100
microlitros de tampón fosfato (fosfato potásico 50
mM, pH 7,5, y DTT 1 mM), se rompieron por sonicación en hielo en la etapa 3 durante 0,5 minutos y se obtuvieron extractos celulares brutos por
centrifugación a 15.000 x g durante 10 minutos.
La concentración de proteı́na se determinó
usando el método Bradford (Bio-RadTM, Protein
Assay). La actividad enzimática se analizó en
las mismas cantidades de muestras con y sin inducción por IPTG y estas muestras se sometieron
a electroforesis en un gel de SDS poliacrilamida
al 10 %. El extracto bruto obtenido a partir de
las células inducidas con IPTG presentó una actividad MTAsa más de 5 veces mayor que la de las
células no inducidas. Además, en el gel de SDS
se detectó una nueva banda proteica inducida (31
kDa).
Ejemplo VIII
Clonación y caracterización parcial del clon genómico de MTAsa
Para conseguir la amplificación más eficaz
del fragmento de ADN por PCR para fines de
diagnóstico, su tamaño preferiblemente debe ser
menor de 500 pb. La secuencia de ADNc refleja la
suma de exones, que normalmente están separados por intrones que dificultan el descubrimiento
de una secuencia adecuada con el tamaño apropiado a partir de la secuencia de ADNc. Para solucionar este problema, se aisló un clon genómico
de MTAsa humana. Se seleccionó una biblioteca
génica de cósmidos construida a partir de ADN
de placenta humana (Clontech) usando una sonda
génicas de ADNc de MTAsa, el fragmento de Not
11
21
ES 2 174 927 T3
I/EcoRI del subclon MTAP-7. Las células E. coli
transformadas por la biblioteca se cultivaron en
placas LB que contenı́an ampicilina (50 mg/l) con
una densidad de colonias de 1-2 x 104 /placa de
135 x 15 mm.
Se realizaron los siguientes procedimientos
como se ha descrito en el Ejemplo IV. A partir de
medio millón de colonias, se aisló una sola colonia
positiva denomina MTAP-10 y se caracterizó parcialmente por análisis de PCR y por secuenciación
directa. Se sintetizaron dos cebadores, un oligonucleótido con sentido localizado 120 pb cadena
arriba del codón stop, y un oligonucleótido sin
sentido localizado 20 pb cadena abajo de codón
stop, y se usaron para el análisis de PCR. La PCR
se realizó durante 25 ciclos, constando cada ciclo de desnaturalización (92◦C, 1 min), templado
(55◦C, 2 min), y extensión (72◦ C, 5 min). Los
productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 0,8 %.
En la Figura 1 se representa la localización de
los exones identificados hasta la fecha en el gen de
MTAsa usando la técnica descrita anteriormente.
Ejemplo IX
Aplicación de oligonucleótidos especı́ficos de secuencia de MTAsa a lı́neas de células malignas
para detectar la presencia o ausencia de MTAsa
en las mismas
Para ensayar la utilidad de los oligonucleó-
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tidos, se aplicó PCR para varias estirpes celulares que se sabı́a que contenı́an células MTAsa
positivas y negativas. Los ADN genómicos se
aislaron como se describe en el Ejemplo VIII
y se usó 1 microgramo de los mismos para la
PCR. La amplificación se realizó durante 40 ciclos como se ha descrito anteriormente, constando cada ciclo de desnaturalización (92◦ C, 1 min),
hibridación (55◦ C, 1 min) y extensión (72◦ C,
0,5 min). Los productos de PCR se analizaron
en un gel de agarosa al 1,5 %. No se detectó
MTAsa en las estirpes celulares que se sabı́a que
eran MTAsa negativas, mientras que se detectó
MTAsa en las estirpes celulares MTAsa positivas.
Resumen de secuencias
La SECUENCIA ID. NO. 1 es el clon genómico para la metiltioadenosina fosforilasa (MTAsa).
La SECUENCIA ID. NO. 2 es un péptido de
MTAsa antigénico (“péptido 40”).
La SECUENCIA ID. NO. 3 es un péptido de
MTAsa antigénico (“péptido 51”).
La SECUENCIA ID. NO. 4 es un cebador
para amplificación por PCR del gen para la
MTAsa (“péptido 1”).
La SECUENCIA ID. NO. 5 es un cebador
para la amplificación por PCR del gen para la
MTAsa (“péptido 2”).
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REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar la presencia de
metiltioadenosina fosforilasa (MTAsa) catalı́ticamente activa y catalı́ticamente inactiva en células
de mamı́fero, que comprende:
(a) obtener una muestra ensayable de células que se sospecha que son deficientes en
MTAsa,
(b) añadir sondas oligonucleotı́dicas marcadas
de forma detectable derivadas de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEC.
ID. No. 1, sondas que hibridarán especı́ficamente con cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican la MTAsa presentes en la
muestra, y
(c) detectar la hibridación de las sondas con
cualquier ácido nucleico que codifique MTAsa
presente en la muestra, siendo indicativa
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la presencia de dicho ácido nucleico de la
presencia de MTAsa catalı́ticamente activa
o inactiva en una célula.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende además la etapa de someter la
muestra a condiciones que favorecen la amplificación selectiva de un ácido nucleico que codifica
la MTAsa y amplificar selectivamente cualquier
ácido nucleico que codifique MTAsa presente en
la muestra.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en el que las células proceden de un tumor maligno conocido.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación
3, en el que el tumor maligno también se ensaya para determinar la actividad catalı́tica de
la MTAsa.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación
2, en el que las condiciones empleadas comprenden una reacción en cadena de la polimerasa.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
65
Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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LISTAS DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
5
(i) SOLICITANTE: LA DIRECCIÓN DE LA UNIVERSIDAD DE CALIFORNIA
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE DEFICIENCIA DE
METILTIOADENOSINA FOSFORILASA EN CÉLULAS DE MAMÍFERO
10
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
15
(A) LONGITUD: 2763 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
20
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
25
(vii) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
30
(B) LOCALIZACIÓN: 1..2763
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
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1
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
60
(A) LONGITUD: 17 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
2
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(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
5
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vii) FUENTE INMEDIATA
(B) CLON: péptidos de metiladenosina fosfatasa
10
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: péptido
15
(B) LOCALIZACIÓN: 1..17
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
20
25
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
30
(A) LONGITUD: 13 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
35
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
40
(vii) FUENTE INMEDIATA
(B) CLON: péptidos de metiladenosina fosfatasa
(vii) CARACTERÍSTICAS:
45
(A) NOMBRE/CLAVE: péptido
(B) LOCALIZACIÓN: 1..13
50
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
55
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
60
(A) LONGITUD: 8 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
3
ES 2 174 927 T3
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
5
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vii) FUENTE INMEDIATA
(B) CLON: cebadores de metiladenosina fosfatasa
10
(vii) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: péptido
15
(B) LOCALIZACIÓN: 1..8
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
20
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:5:
25
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 9 aminoácidos
30
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
35
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vii) FUENTE INMEDIATA
40
(B) CLON: cebadores de metiladenosina fosfatasa
(vii) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: péptido
45
(B) LOCALIZACIÓN: 1..9
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
50
55
60
4