Determinacion de IgE Especifica

Determinación de la Ig E
Específica en el Laboratorio
Carlos Artaza Álvarez
MIR 1 F.H.Alcorcón
INTRODUCCION
• El sistema inmunológico se caracteriza
por reconocer sustancias extrañas (Ag) y
generar una respuesta para eliminarlas.
• En las alergias esta respuesta es excesiva
y finalmente produce daño en los tejidos.
• Intervienen elementos genéticos, celulares
y moleculares
SISTEMA INMUNOLOGICO
• Contacto inicial con el alergeno en un
individuo predispuesto: producción de IgE
que se fija a mastocitos y basófilos
(sensibilización).
• Un segundo contacto con alergeno
produce degranulación y liberación de
sustancias vasoactivas
REACCIÓN DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO I
1ª EXPOSICIÓN A UN ALERGENO
PREDISPOSICIÓN GENETICA
PRODUCCIÓN DE GRAN CANTIDAD DE IgE ESPECIFICA
FIJACIÓN A RECEPTORES DE MEMBRANA DE MASTOCITO
2ª EXPOSICIÓN A ALERGENO
UNIÓN DE ALERGENO A IgE ESPECIFICA EN LA SUPERFICIE
DEL MASTOCITO
LIBERACIÓN DE HISTAMINA Y OTROS MEDIADORES
MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Diagnóstico de la Alergia mediada por IgE
. HISTORIACLINICA
- Exploración física
. Pruebas objetivas de sensibilidad a
la IgE:
- Pruebas cutáneas
- Determinación SIgE
Peculiaridades de la IgE
-Permite detectar la sensibilización de un paciente
frente a un alergeno determinado
-Baja concentración sérica: aguja en un pajar
Propiedades Inmunológicas de las
Inmunoglobulinas
Concentración
Sérica (mg/dl)
Cantidad
sintetizada
(mg/Kg/día)
Vida Media
(días)
IgG
IgA
IgM
IgE
IgD
820
170
90
0,05
0,05
33
24
6,7
0,002
0,4
21
6
5
2
2
Detección de IgE: ensayo óptimo
-
Capacidad de detectar bajas concentraciones (UI = 2.4 ng)
- Ausencia de reactividad cruzada:
ni con otras Igs (IgG, IgM, IgA,…)
ni con otros alergenos no homólogos
- No interferencia con bilirrubina, Hb, lípidos…
- Calibración estable, con amplio rango de medida
- Precisión: CV intras. <10%,
CV inters. <15%
Detección de IgE: ensayo óptimo
• Altamente Sensible: “Detectar” pacientes con niveles IgE ↑
• Altamente Especifico: Excluir los no sensibilizados
• Calidad analítica: fiabilidad, estabilidad, reproducibilidad
• Estandarización (OMS)
• Reproducible (baja variación en la repetición de una
medida)
• Automatización: flexible, fácil manipulación.
• Amplio menú de alergenos
INMUNOENSAYOS
Inmunoensayo: reacción
Ag-Ac
Alergeno
IgE
Pilar del diagnóstico “in vitro” en el laboratorio
de alergia:
detección de IgE específica.
INMUNOENSAYOS:CONCEPTOS
BASICOS
•
•
•
•
•
•
Complejo Ag-Ac: Sistema en equilibrio
Ag + Ac
Ag-Ac
Afinidad
Heterogeneidad de la respuesta
Avidez
Reactividad cruzada
INMUNOENSAYOS MARCADOS:
GENERALIDADES
• Inmunoensayos en los que el Ag o Ac están
marcados
• Rápidos, menos de 24 h.
• Alta sensibilidad, de microgramos a
nanogramos.
• Automatizables, aplicaciones
• Clasificación:
»
»
»
»
Homogéneos
Heterogéneos
Competitivos
No competitivos
Inmunoensayos Marcados
Tipos
Inmunoensayos Marcados
Conjugado marcado*:
RIA
Fase
sólida
EIA
FIA
Alergeno
IgE
QIA
RADIOINMUNOENSAYOS
• Inmunoensayo marcaje radiactivo
– Radiacion beta: Tritio, carbono 14, etc.
– Radiación gamma: Iodo 125, Iodo 135, etc.
• Ensayos esencialmente competitivos
– Ensayos secuénciales
– Ensayos en equilibrio
• Contadores
FLUOROINMUNOENSAYO
• Determinación de proteínas, drogas y
hormonas.
• Ac se une covalentemente a una molécula
fluorescente.
• Absorben la luz de baja longitud de onda (200 a
400 nm)
• Emisión a longitud de onda mayor (400-700 nm)
• Método directo:
– Ac marcado directamente proporcional al Ag presente
• Método indirecto:
– Menor Ac fluorescente fijado, mayor será el Ag
presente
Fluoroinmunoensayo
Primer Paso
Incubación 37ºC
Eliminación
por lavado
Ac. Fase Sólida
Ag a medir
del paciente
Ag del paciente
ligado al Ac
Fluoroinmunoensayo
Segundo Paso
37ºC
Incubación
Reactivo anti-Ag
fluorescente
Medición de la
fluorescencia relativa
sobre la fase sólida
ENZIMOINMUNOENSAYO
• Ensayo marcado por una enzima.
• Heterogéneos. Paso intermedio o
separación:
• Competitivo. Ag Marcado
• No competitivo (Sándwich). Ac marcado
• Indirecto. Medición niveles de Ac
• Homogéneos. No paso intermedio
• Enzimas
• Bajo coste, alto nivel de pureza y interferencia
METODOLOGIAS
UniCap ®
(Pharmacia)
Advia Centaur ®
(Bayer)
Immulite 2000 ®
(DPC)
Sistema UniCAP (Phadia)
•
Alta capacidad de fijación del alergeno sobre una matriz.
•
Gran versatilidad, panel más amplio de alergenos (más de 450),
y permite un cribado múltiple de alergenos (Phadiatop, que
combina los neumoalergenos, o los alimentos más frecuentes
encontrados en clínica), e investigar aquellos pacientes con
resultado positivo (> 0.35 kU/L).
•
Diseño : se trata de un Fluoroenzimoinmunoensayo clásico de
tipo sandwich, alergeno fijado a fase sólida (matriz) y la anti-IgE
marcada con enzima beta-galactosidasa que hidroliza la 4-metilumbeliferil-beta-D-galactosa, liberando el producto fluorescente,
la 4-metil-umbeliferona.
•
Curva de calibración obtenida con 6 calibradores de IgE total.
Válida durante un mes en el que se controla con 2 puntos.
•
Tiempo de realización del ensayo : 2.5 horas.
ImmunoCAP 250 (Phadia)
Fluoro-Inmunoanálisis:
β-galactosidasa libera 4 metil-umbeliferona fluorescente.
Curva 6 IgE total
totalmente
automatizado
60 test/hora
Técnica de
referencia en la
detección in vitro
de IgE específica.
> 450 alergenos.
Sistema AlaSTAT - Immulite 2000
(Diagnostic Products Corporation)
•
Incorpora la tecnología de alergenos en fase líquida, están fijados
a polímeros solubles.
•
La unión a la fase sólida a través de la elevada afinidad de la
biotina (fijada también al polímero que porta al alergeno) por la
estreptavidina (que recubre la bola de poliestireno).
•
Tecnología de lavado patentada por centrifugación a 10.000 rpm :
mínimas uniones inespecíficas debido a la óptima separación
entre las fases ligada y no ligada.
•
Diseño : Se trata de un enzimo-quimioinmunoanálisis.
•
Conjugado anti-IgE marcado con fosfatasa alcalina y sustrato es
el ester fosfato de admantil-dioxetano que origina un producto
luminiscente.
•
Velocidad de trabajo del analizador : 100 determinaciones/hora.
Con un tiempo para el primer resultado de 65 minutos.
Immulite 2000 (DPC): sistema
AlaSTAT
Enzimo-quimioinmunoanálisis
Bola de poliestireno
recubierta de
Estreptavidina
Biotina
Luminiscencia, CPS
Sustrato
IgE
Enzima ALP
Sustrato:
Ester fosfato de
adamantil-dioxetano
(señal prolongada)
Anti-IgE
Alergeno
Alergeno en fase líquida
unido a un polímero soluble
que también lleva fijado biotina.
IMMULITE 2000 ® - EL TUBO DE REACCIÓN
Un elemento esencial es el tubo de Reacción, que junto con la
bola recubierta de estreptavidina, esta diseñado especialmente
para llevar a cabo
1. La reacción inmunológica
2. El lavado por centrifugación
3. El desarrollo de la señal quimioluminiscente
LA SEÑAL QUIMIOLUMINISCENTE
Mediante esta tecnología se genera una señal prolongada
permitiendo aumentar el rango y por tanto el número de
lecturas precisas (12, separando las 2 extremas) frente a la
quimioluminiscencia tradicional.
Immulite 2000 (DPC)
Velocidad de trabajo del autoanalizador: 100 det/h (1º en 65´)
Plataforma que permite determinar otros analitos
Curva master de calibración:
7 puntos IgE total
(códigos de barra del reactivo)
En la práctica
con 2 puntos se adapta
a cada ensayo
Sistema ADVIA-Centaur (Bayer)
•
Diseño de sandwich invertido : Es la Anti-IgE (y no el alergeno) la
que está fijada a la fase sólida (partículas paramagnéticas)
capturando sólo la totalidad de IgE que presenta el especímen
del paciente.
•
Es el alergeno el que va a portar el marcaje luminiscente, pero no
de forma directa, sino a través de la interacción biotinaestreptavidina.
•
El ester de acridinio sometido a un cambio de pH emite
luminiscencia.
•
Curva de calibración empleando IgE específica frente a una
proteína recombinante del alergeno de abedul (r Bet v 1)
•
Velocidad de trabajo del analizador : 120 determinaciones/hora.
Con un tiempo para el primer resultado de 47 minutos.
Advia-Centaur (Bayer)
Diseño sandwich invertido:
la Anti-IgE es la que se fija a la fase sólida
y el que lleva el marcaje es el alergeno, pero
no de forma directa.
IgE
pH: ac. nítrico y sosa
Anti-IgE
unida a partículas
paramagnéticas
Alergeno Ester de acridinio
unido a
unido a
biotina
Estreptavidina
Quimioluminiscencia, RLU
Advia-Centaur (Bayer)
Velocidad de trabajo del autoanalizador: 120 det/h (1º en 47´)
Flexibilidad analítica: hormonas, serología, marcadores
Curva master de calibración:
6 puntos s-IgE rbet
En la práctica
con 2 puntos se adapta
a cada ensayo
Interpretación resultados
resultados IgE
IgE específicos
específicos
Interpretación
Resultados
semicuantitativos
“Clases”
Resultados
cuantitativos
KUA/L
Nivel de Ac. SIgE
< 0.35
Ausente
o
0.35-<0.7
Bajo
1
0.7-3.5
Moderado
2
3.5-17.5
Alto
3
17.5-<50
Muy Alto
4
50-<100
Muy Alto
5
100 o +
Muy Alto
6
IgE específica y citometría de
flujo
Fundamento Citometría de
flujo
• Técnica de análisis celular multiparamétrico
• Flujo laminar suspensión de partículas (generalmente células) por delante de un
haz de láser focalizado.
• El impacto de cada célula produce señales (dispersión y fluorescencia) que son
recogidos por distintos detectores y digitalizadas para la medida simultánea de
varios parámetros
• Permite el análisis de un gran número de células en poco tiempo (5000
partículas / segundo).
Se trata de una técnica cualitativa y CUANTITATIVA.
Principales componentes
CMF
* Fluídica:
Flujo laminar.
* Sistema óptico
- Fuente de radiación monocromática
- Selección de la radiación
- Detección de las distintas señales
* Sistema de recogida y análisis de datos
Esquema Citómetro de flujo
IgE específica y citometría de
flujo
Anti-IgE
marcada
2 LASER
IgE sérica
FLUJO
LAMINAR
lolium olivo
gato
fila de partículas
Cada partícula porta
una especificidad
Un láser identifica la partícula
alergénica
por su espectro rojo-naranja.
El otro cuantifica el marcaje
con fluoresceína (verde).
Tecnología Multiplex
En un mismo pocillo de reacción,
para una muestra determinada,
realizamos
múltiples micro-inmunoensayos
simultáneamente.
Para cada paciente:
múltiples microensayos simultáneos
Bajos
CV
< 10%
analiza 50-200 esferas
de cada especificidad
Los Acs siguen siendo la
clave
CONJUGADO (marcado con fluorocromo)
contra la molécula a analizar
(contra un epítopo distinto al del 1º anticuerpo)
Marcador tumoral
Hormona
Antígeno
SUERO
DEL
PACIENTE
ANTICUERPO fijado a la esfera (soporte)
(contra la molécula a analizar)
Ventajas de CMF
- Volumen de muestra mínimo.
- Mayor precisión frente a las técnicas manuales: IFI
- Cuantifica: mayor rango analítico que EIA
- Homogeniza las múltiples pruebas existentes
- Análisis múltiple simultáneo (mismo conjugado)
- Disminuye drásticamente el tiempo de respuesta
- Ahorro de mano de obra
Tendencias en las pruebas de detección de sIgE
• Consolidar el mayor número de determinaciones
en un solo tubo y una sola estación de trabajo ó
plataforma analítica multifuncional.
• Utilización de metodología de alta sensibilidad,
precisión, garantía de no contaminación,
•Amplio menú de alergenos, amplio panel de
alergenos recombinantes.