PROBLEMAS DE GENÉTICA MOLECULAR (2015

PROBLEMAS DE GENÉTICA MOLECULAR (2015-2016)
T.1: “Ingeniería Genética en Procariotas
y Análisis Estructural y Funcional de Genomas.”
1. El plásmido pUC18, cuyo mapa genético se muestra en la figura 1, tiene un sitio de
clonaje múltiple (MCS) cuya secuencia y posición de dianas únicas de restricción se
indican en la figura 2. En este plásmido se inserta un fragmento de 1450 bp procedente
de un digerido con XbaI, que contiene una diana única HindIII a 450 bp de uno de los
extremos. Deducir los tamaños resultantes de digerir el recombinante con: a) EcoRI; b)
XbaI; c) HindIII. Considerar despreciable la distancia entre las dianas del sitio de clonaje
múltiple.
d) Un colega te ha enviado un fragmento de 4.5 kb para clonarlo en pUC19, obtenido por
digestión con PstI y BamHI y asegura que tiene una diana EcoRI a 490 bp del extremo
PstI. ¿Qué pasos darías para obtener el recombinante? ¿Cómo lo analizarías?
Figura 1:
Figura 2:
2. Se desea expresar la proteína eucariótica Shv en E. coli. Se indica la secuencia del cDNA
de shv. El codón de iniciación corresponde al primer ATG. El cDNA presenta dos dianas
EcoRI G↓AATTC en los extremos:
GAATTCAAGCCAAGCTAACTTACACATGCAC (428 nucleótidos) TGATAGTTGAATTC
Disponemos de tres plásmidos pORF1, pORF2 y pORF3, idénticos excepto en el número
de pares de bases que presentan entre el codón de iniciación ATG y la diana EcoRI, A
continuación se indican las secuencias desde antes del sitio de unión al ribosoma:
pORF1:
pORF2:
pORF3:
RBS
fMet
------------------------------ATCCTAGGAGTCACGCGATGGCGAATTCGGGGTAG
ATCCTAGGAGTCACGCGATGGGCGAATTCGGGTAG
ATCCTAGGAGTCACGCGATGGGGCGAATTCGGTAG
a) ¿En qué plásmido deberíamos clonar el cDNA para que se produzca la expresión de
Shv?
b) Una vez clonado el gen, determina el número de aminoácidos que tendría la proteína
de fusión resultante, sabiendo que los 428 nucleótidos cuya secuencia no se indica, no
tienen ninguna señal de terminación en la fase de lectura correcta.
c) ¿Qué habría que hacer para poderlos clonar en fase en los otros dos plásmidos?
3. Un fragmento de DNA se secuenció por el método
de los dideoxi; parte del gel de secuenciación se
muestra en la figura.
a) Deducir la secuencia del DNA de esta región
poniendo las dos bandas con su polaridad
correspondiente.
b) ¿Cuántas fases sin ningún codón de
terminación hay en esa región?
c) Diseña un oligo de 5 nucleótidos para
secuenciar la banda sintetizada anteriormente con
los dideoxis.
d) Dibuja el gel de secuenciación obtenido.
e) ¿Qué pasaría si: i) no pones dGTP en la
reacción; ii) la concentración de ddNTP es 100
veces mayor; iii,) la concentración de ddNTP es
100 veces menor.
4. Después de tu brillante paso por la Universidad de Copenhague, la prestigiosa empresa
biotecnológica danesa Novo Nordisk te ofrece un puesto de trabajo fijo. Tu objetivo
consiste en sobreproducir una proteína supresora de tumores cuyo gen está contenido en
el siguiente fragmento de DNA y cuyo triplete de iniciación corresponde al primer ATG.
El fragmento presenta dos dianas EcoRI (G↓AATTC) en los extremos (subrayadas):
GAATTCAAGCCAAGCTAACTTACACATGCA
GTAGATGACTAAGAATTC
(428
nucleótidos)
Para ello decides clonarlo en el plásmido pBluescript II KS, con el que estás muy
familiarizado y cuyo mapa, sacado de la página web de Stratagene, se muestra en la
figura. El fragmento lo digieres con EcoRI, lo ligas al plásmido linearizado con el mismo
enzima y con la mezcla transformas un cultivo de E. coli.
a) Indica detalladamente cómo aislarías los recombinantes.
b) Calcula el nº exacto de pares de bases del plásmido recombinante.
c) El fragmento lo has insertado en la orientación correcta en el sitio de clonaje múltiple
(MCS) conteniendo el comienzo del gen de lagalactosidasa. A la derecha se muestran
las dianas del MCS, así como los aminoácidos N-terminales de la -galactosidasa. Razona
si el inserto está en fase con la -galactosidasa. Si es así, determina el nº de aminoácidos
de la proteína de fusión, teniendo en cuenta que no hay ninguna señal de terminación en
los 428 nucleótidos que no se muestran. Si no es así, diseña una estrategia para ponerlos
en fase.