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Ingeniería Genética
Guía de Ejercicios Nº 3
Guía Nº 3: Digestión
1) Dado el plásmido de la figura resuelva los siguientes items:
a- Esquematice el resultado esperado de una electroforesis realizada en un gel de
agarosa 0,8 % p/v teñido con bromuro de etidio, luego de sembrar una
digestión total de dicho plásmido con las siguientes ER:
i)
BamHI
ii)
PstI
iii)
HincII-PstI
b- Esquematice el resultado esperado de una electroforesis realizada en un gel de
agarosa 0,8 % p/v teñido con bromuro de etidio, luego de sembrar una
digestión parcial de dicho plásmido con las siguientes ER:
i)
BamHI
ii)
PstI
c- ¿Cuáles son los posibles tamaños de fragmentos que esperaría obtener
mediante una digestión parcial del plásmido pParc con PstI y HincII?
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Ingeniería Genética
Guía de Ejercicios Nº 3
d- Usted digiere el plásmido pParc con EcoRI para comprobar si tiene sitio de
reconocimiento para dicha enzima. Como resultado, usted encuentra que luego
de una digestión total con EcoRI se generan dos fragmentos: uno de 3150 pb y
otro de 3260 pb. Para determinar la ubicación física de dichos sitios en pParc
usted realiza digestiones dobles totales teniendo los siguientes resultados:
EcoRI-HincII: 1950 pb, 1750 pb, 1200 pb, 1000 pb, 510 pb.
EcoRI-PstI: 2150 pb, 1510 pb, 1050 pb, 1000 pb, 700 pb.
EcoRI-BamHI: 3150 pb, 1450 pb, 1060 pb, 750 pb.
Ubique en pParc los sitios de reconocimiento para EcoRI.
e- Obtenga el plásmido pParcII, mediante la elimininación del inserto contenido
en pParc. Detalle todos los pasos que debería hacer para lograrlo.
2)
Usted posee un fragmento que fue liberado de un vector mediante una
digestión con la enzima EcoRI. Para realizar un mapa físico de dicho fragmento
usted realiza simple y doble digestiones con las enzimas PstI, BamHI y XhoI y las
resuelve en un gel de agarosa 0.8 % p/v. También siembra en el mismo gel un
ladder de peso molecular. Luego de teñirlo con bromuro de etidio y revelarlo con
luz UV usted encuentra los siguientes resultados al analizar las distancias
migradas de cada banda:
pb
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1400
Ladder
distancia (cm)
3,96
3,25
2,7
2,45
2,1
1,8
1,5
1,3
1,1
0,8
0,2
ER
PstI
BamHI
XhoI
PstI-XhoI
XhoI-BamHI
PstI-BamHI
Distancia migrada (cm)
2,93 2,25 1,55
3,67 0,72
4,26 1,93 1,44
4,26 3,67 2,25 1,79
5,26 4,26 1,93 1,55
3,67 2,93 2,25 1,93
En base a los resultados obtenidos:
i)
Grafique el resultado de la electroforesis resuelta (incluya el ladder, los
controles y las digestiones).
ii) Construya el mapa físico del fragmento.
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3)
Guía de Ejercicios Nº 3
El DNA del plásmido pHUB1 es circular, de cadena doble y tiene 5,7 kpb. Este
plásmido lleva un gen cuyo producto proteico confiere resistencia a la bacteria
huésped al antibiótico tetraciclina (tetR). Además, este cccdsDNA tiene un sitio único
de corte para las enzimas de restricción, EcoRI, HpaI, BamHI, PstI, SalI y BglII. Por
otro lado, el clonado en los sitios BamHI y SalI anula el fenotipo resistencia a
tetraciclina, mientras que esto no sucede cuando se utilizan estrategias basadas en la
apertura con las otras endonucleasas mencionadas.
Con el objetivo de confeccionar el mapa físico del plásmido, se realizaron digestiones
con distintas combinaciones de enzimas de restricción. Los productos de dicha
reacción fueron fragmentos cuyos tamaños se muestran en la tabla.
Con toda esta información, dibuje el mapa correspondiente al plásmido pHUB1.
Enzimas de
Restricción
EcoRI
EcoRI, BamHI
EcoRI, HpaI
EcoRI, SalI
EcoRI, BglII
EcoRI, PstI
PstI, BglII
BglII, HpaI
Tamaño del
fragmento (kpb)
5,7
0,4-5,3
0,5-5,2
0,7-5,0
1,1-4,6
2,4-3,3
1,3-4,4
0,6-5,1
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