silvia pérez solana

MEMORIA
DE
PRÁCTICAS
SILVIA PÉREZ SOLANA
¾ DATOS DE LA EMPRESA
Instituto de Biotecnología y Biomedicina de Cantabria (CSIC-UCSODERCAN), Avda. Herrera Oria s/n. Santander.
El tutor CSIC fue Raúl Fernández López y el tutor de la Universidad
Fernando Leal Sánchez.
El periodo de las prácticas se inicio el 2 julio de 2008 finalizando las
prácticas el 29 agosto de 2008.
Las horas previstas al día son de 8 pero varían según las necesidades de
investigación.
Se trabaja de lunes a viernes.
Estas prácticas están dirigidas a alumnos de 5º curso de
Biología/Bioquímica.
¾ RESUMEN
Dentro de la Biología Sintética, uno de los procesos fundamentales es
la construcción y caracterización de partes (Biobricks), que una vez
construidas y analizadas se envían al Registro Biológico de Partes Estándar
(http://parts.mit.edu/registry/index.php/Main_Page).
A partir de estos Biobricks se diseñan y construyen dispositivos más
complejos para el desarrollo de diversos procesos biotecnológicos.
Los plásmidos son utilizados como “lanzaderas naturales” para
transportar estos dispositivos hasta las cepas de destino.
Un problema esencial para mejorar nuestra capacidad de transportar y
hacer funcionar con éxito dispositivos sintéticos en bacterias reside en
entender las relaciones que se establecen entre el plásmido lanzadera y la
bacteria hospedadora.
Los plásmidos naturales han desarrollado mecanismos que les
permiten residir en bacterias causando un impacto mínimo sobre su
capacidad de supervivencia.
Este proyecto tiene como objetivo estudiar las relaciones que
establece uno de estos plásmidos naturales, R388, con Escherichia coli, y
desarrollar partes sintéticas a partir de él.
¾ TÉCNICAS EXPERIMENTALES Y HABILIDADES A DESARROLLAR
Técnicas básicas de bioinformática: Diseño de oligonucleótidos,
construcción in silico de vectores, búsqueda de homología mediante BLAST,
optimización del uso de codones etc…
Técnicas básicas de biología molécular: PCR, electroforesis en geles
de agarosa, clonaje molecular, secuenciación etc…
Técnicas básicas de microbiología: cultivos bacterianos,
antibiogramas, ensayos de fitness y competición etc…
Técnicas básicas de biología de sistemas (microbianos): perfiles de
expresión por sondas fluorescentes, análisis de expresión por citometría de
flujo, análisis por PCR cuantitativa.
¾ DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS
Se quiere estudiar el comportamiento de dos cepas isogénicas de
E.coli B, son REL 606 y REL 607. Estas cepas se comportan exactamente
igual exceptuando que una no fermenta arabinosa (REL 606) y la otra sí
(REL 607). Se quiere ver la influencia de una cepa sobre otra, si afecta
positivamente o negativamente o no interfieren.
Así pues, el inicio de este estudio es el cultivo de ambas cepas de
forma conjunta en el mismo medio. Este inoculo inicial se plaquea en placas
petri con un medio especial para el estudio. Este medio es agar
convencional rico en arabinosa y contiene un colorante (tetrazolium). Estas
dos colonias se diferencian en la mezcla debido a que las Ara+ (fermentan
arabinosa) aparecen blancas y las Ara- rojas por la presencia de TTC
(tetrazolium) en el medio.
La mezcla de ambas cepas se cultiva (37ºC durante 24h) en el
tiempo y se hacen plaqueos cada día. Con esto, se hace un recuento del
numero de células que hay cada dia 24 horas (unas 20 generaciones). Se
ve si unas células decrecen, se mantienen o aumentan.
Contando las colonias que crecen en una placa y teniendo en cuenta
la dilución plaqueada, se consigue saber el número de células inicial, con el
que se comienza este estudio de competencia. Contando las colonias que
crecen en placas (que se flaquean cada 24 horas) seguimos el crecimiento
de las células en competición. Se va viendo como responde cada población
(REL 606 y REL 607) mientras crecen juntas.
Al mismo tiempo, se quiere estudiar como afecta el plásmido R388 a
la célula hospedadora. Aprovechando que tenemos dos cepas isogénicas con
el mismo fitness, se van a utilizar para este estudio.
Lo primero que hay que conseguir es tener el plásmido R388 dentro
de las cepas REL 606 y REL 607. Se hace por electroporacion. Las células
que hayan incorporado el plásmido serán resistentes a trimetropin (TMP),
las que no lo incorporen solo serán resistentes a estreptomicina (SM). Así
seleccionamos solo las que son resistentes a ambos antibióticos ya que
serán que te tengan incorporado el plásmido a estudiar.
El protocolo de este estudio es el mismo que el anterior, el cual sirve
para control negativo de este nuevo. Si la incorporación del plásmido no
afecta en absoluto a la cepa se debe comportar exactamente igual que si no
tuviera el plásmido (primer estudio).
Estos resultados esta sujetos a una interpretación muy objetiva, ya
que el conteo de las colonias (diferenciar entre rojas y blancas) se hace por
la persona encargada y no siempre es fácil diferenciar las dos cepas.
General mente, ambas cepas (ara+ y ara-) aparecen con un halo blanco a
su alrededor, pero unas tienen el interior rosa-fucsia y otras rosa-blanco.
Con el objetivo de medir de alguna forma el crecimiento de estas dos cepas
cuando lo hacen juntas, se estudio cada cepa con fluorescencia.
En este tercer estudio, se quiere introducir fluorescencia roja
(plásmido pBAD) en una cepa y fluorescencia verde (pBAD::GFP). Este
plásmido es introducido en la célula por electroporosis. Ahora las células
que incluyen este plásmido serán resistentes a Sm y Cm (cloranfenicol). Así
vamos a ser capaces de medir el crecimiento de ambas cepas conjuntas y
monitorizarlo a tiempo real. Se utiliza un aparato (VICTOR) capaz de medir
la D.O del cultivo y la fluorescencia roja y verde. Vamos a ser capaces de
describir el comportamiento de una cepa frente a otra a tiempo real.
A lo largo del estudio se plaquean las cepas que incluyen el plásmido
(con resistencia a uno u otro antibiótico) en placas con agar y el
correspondiente antibiótico, con la finalidad de seleccionar solo las células
que realmente lo han incorporado. Otra prueba que también se debe
realizar, son los antibiogramas.
Un antibiograma consiste en crecer un inoculo de una cepa en una
placa de agar en la cual se colocan discos de antibiótico a una determinada
concentración, a la cual se espere que nuestra cepa sea resistente (se
venden comercialmente).
Este estudio de competencia se ha realizado según el estudio llevado
a cabo por Richard Lenski de la Universidad Michigan State
(https://myxo.css.msu.edu/index.html).
Lo que se ha querido ver en el laboratorio de genética (Instituto de
Biotecnología y Biomedicina de Cantabria (CSIC-UC-SODERCAN)) es la
competencia entre cepas con el mismo fitness pero que una tiene
incorporado el plásmido R288 contra otra que no lo tiene.
¾ ESTUDIO DE LA CONJUGACION BACTERIANA
La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de
información genética desde una célula donadora a otra receptora,
promovido por determinados tipos de plásmidos, que portan un conjunto de
genes cuyos productos participan en el proceso, y que requiere contactos
directos entre ambas, con intervención de estructuras superficiales
especializadas y de funciones específicas (pili sexuales en los Gram
negativos, y contacto íntimo en los Gram positivos).
Algunos de estos plásmidos se comportan como episomas, es decir,
que pueden integrarse en el cromosoma; en este caso, si se produce la
conjugación, se puede transferir el propio plásmido más un segmento
adyacente del cromosoma, que a su vez podrá recombinarse con secuencias
homólogas del cromosoma del receptor, dando lugar a un cromosoma
híbrido.
Esquema de la conjugación bacteriana. 1La célula donante genera un pilus. 2-El pilus
se une a la célula receptora y ambas células
se aproximan. 3-El plásmido móvil se
desarma y una de las cadenas de ADN es
transferida a la célula receptora. 4-Ambas
células sintetizan la segunda cadena y
regeneran un plásmido completo. Además,
ambas células generan nuevos pili y son
ahora viables como donantes.
En la conjugación bacteriana, cuando una célula ha “cogido” un
plásmido, ya no “quiere” otro. Así, se sintetiza una proteína de membrana
que dice que ya ha recibido un plásmido. Esta proteína se ha denominado
“entry exclusión” (Eex).
El siguiente estudio que se va a realizar durante las prácticas es
conseguir eliminar el fragmento génico de esta proteína en el plásmido
R388. Se quiere eliminar la secuencia que pertenece a esta proteína.
Ahora se va a eliminar la secuencia de “Eex” mediante la introducción
en esa zona de R388, de la secuencia génica correspondiente a la
resistencia ante el antibiótico kanamicina (Kn).
El proceso consiste en tener la secuencia de la Kn (resistencia a este
antibiótico) amplificada. Se obtiene de un plásmido de resistencia a este
antibiótico, mediante una PCR común. Se comprueba el tamaño del
fragmento ampliado mediante un gel de agarosa. Si el tamaño es el
esperado (el numero de bases que tenga esa secuencia de resistencia a la
Kn), se purifica la banda en cuestión.
Este fragmento de resistencia a la Kn se introduce en las células por
electroporacion. Son unas células especiales ya que la maquinaria de
precombinación se induce a 40 ºC. Así que como no nos interesa que se de
precombinación ya que pueden eliminar el fragmento de su material
genético, se plaquean tras la electroporacion a 30ºc durante 24h. Se
flaquean en placa con los antibióticos adecuados para seleccionar colonias
que realmente hayan incorporado este fragmento de resistencia a la Kn, así
que plaquearan en TMP (la cepa ya es resistente a este) y en Kn.
Una vez que obtengo colonias resistentes a Kn (por la incorporación
del fragmento) y TMP (propio de la cepa), tengo que conocer en que lugar
del plásmido R388 se ha incorporado la secuencia de resistencia a Kn. Para
esto se realiza una nueva PCR y se comprueba el tamaño del fragmento
ampliado y de lo restante (que debe ser un único fragmento
correspondiente al plásmido R388 sin Eex).
Cuando ya sabemos que tenemos el fragmento de Kn incorporado en
R388 y en el sitio correcto (donde debería estar Eex), entonces eliminamos
este fragmento de resistencia a Kn mediante enzimas de restricción. El
objetivo es quitar la secuencia de Kn que se incorporo a R388 para eliminar
Eex; quedando como resultado final, el plásmido R388 sin Eex (y sin lo
correspondiente a Kn).
Cuando hayamos comprobado que la digestión de ese plásmido es la
correcta (el tamaño y numero de bandas en un gel de agarosa tiene que ser
lo esperado), se ligan los dos extremos 5’ con el 3’. Así se habrá construido
un plásmido al que se le ha eliminado la secuencia correspondiente a una
proteína en concreto.
La clave en todo este método (se sigue el método descrito por
Wanner) esta en el diseño de los oligos para realizar la PCR. Se debe
diseñar un oligo que podemos dividir en tres zonas.
1. la zona correspondiente con el inicio de la secuencia Eex. Aquí se
debe guardar una longitud de unos 40 pares de bases de homología
con dicha secuencia.
2. una zona que permita el corte a una determinada enzima de
restricción (la que se quiera usar).
3. la zona correspondiente al inicio de la secuencia de la Kn.
En la primera PCR el oligo diseñado se une al DNA (de donde
queramos obtener el fragmento de resistencia a Kn) por la parte aquí
descrita como 3. La parte aquí descrita como 1, es para que se reconozca la
zona donde empieza Eex y así el fragmento de Kn se introduzca ahí,
eliminando la secuencia de Eex. Para comprobar que se ha insertado en la
zona donde debería estar Eex se utiliza otra pareja de oligos (la pareja 5’-3’
y 3’-5’). Se utilizan oligos que amplíen una zona que empiece fuera de la
región Kn (la introducida). Así lo que se amplíe será el fragmento entero de
la Kn más unos pares de bases por delante y por detrás. Se esperara un
fragmento grande, ya que la secuencia para la resistencia a Kn es de unos
1000pb y la que se quiere eliminar, Eex, es de unos 350pb.
Como resultado final de este proceso (según wanner) será un
plásmido R388 sin la zona que codifica para la proteína Eex. Así las células
que tengan el plásmido con la deleción de Eex y ya ligados sus extremos,
serán estudiadas. Lo siguiente será ver como afecta la deleción de esta
proteína en las células receptoras. Ver como responden en conjugación
bacteriana sin la “señal” que informa de que ya tienen un plásmido
incorporado.