Recuento de células somáticas (Prescott y Breed)

DEPARTAMENTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LA
LECHE
Ciclo Común Obligatorio 2014
Introducción:
 Todas las secreciones de los organismos vivos, la
leche también tiene células somáticas.
 El recuento de células somáticas (RCS) se refiere al
número de células que se encuentran en la leche.
¿Qué son las células somáticas (CS) en leche?
 Células epiteliales y leucocitos (Respuesta
inflamatoria de Gl. Mamaria)
 Macrófagos, linfocitos y neutrófilos, células epiteliales
de descamación del epitelio glandular en menor
proporción.
 98% de las CS corresponden a leucocitos y 2% a
células de descamación por envejecimiento.
Tipos de células somáticas
Habitualmente en un frotis se presentan en la
siguiente proporción:
•
MACROFÁGOS: 60%
•
LINFOCITOS: 30%
•
NEUTRÓFILOS: 10%
•
CÉLULAS EPITELIALES: 5%
Fuentes de Variación
 Principalmente presencia o no de infecciones
bacterianas en la glándula mamaria.
 Otras:
Parto, etapa de lactancia, estrés metabólico o
fisiológico, diferencias individuales o entre los cuartos
y errores en las técnicas de medición.
(Green et al., 2006)
Alto recuento de células somáticas

Sanidad de la ubre (individual/rodeo)

Presencia Mastitis Subclínica

Disminución de la producción de leche

Alteración de la composición

Disminución del rendimiento industrial
(rendimiento quesero)
Disminución de la producción de leche


o
Estructura y función van de la mano
A nivel de alvéolo mamario producción de leche depende de:
Proliferación células epiteliales alveolares
o Diferenciación bioquímica y estructural .
Disminución de la producción de leche

En mastitis subclínicas se asocia a:
RCS aumentado, migración de neutrófilos y
transformación de células del epitelio alveolar en no
secretorias.

La mastitis conduce a pérdida de la función debido a:
• la disrupción de la integridad de las células alveolares
• la muerte celular
• la inducción de la apoptosis
• la poca diferenciación celular generada
Disminución de la producción de leche
Alteración de la composición de la leche
Alteración de la composición de la leche
REGLAMENTACION
Pago por calidad en leche en la industria
Sistema Nacional de Calidad de leche. Decreto 55/99
Recuento
Categoría microbiano
(UFC/ml)
Recuento de células
somáticas (RCS)
A
< 200.000
< 800.000
B
200.000-800.000
800.000-1.000.000
C
800.000-1.000.000
> 1.000.000
REGLAMENTACION ACTUAL
Pago por calidad en leche en la industria
Sistema Nacional de Calidad de leche. Decreto 359/013
REGLAMENTACION ACTUAL
Evolución de RCS y RB en los últimos años en ROU
Año
Células
Somáticas
(miles/ml)
Unidades Formadoras
de Colonias (miles/ml)
1996
545.8
558.3
1997
543.4
300.9
1998
491.0
157.0
1999
453.5
126.3
2000
422.2
87.8
2001
397.0
77.2
2002
396.3
66.2
PAGO A NIVEL DE INDUSTRIA
Evaluación del contenido celular
de la leche.
 Clasificación de métodos según forma de medición en:
 Métodos de medición indirecta (interacción DNA-agente
tensoactivo).
 Métodos de medición directa (recuento de partículas).
 Métodos de medición indirecta son: California Mastitis Test
(CMT), Wisconsin Mastitis Test (WMT), Viscosímetro y
DNA-fíltro.
 Métodos de medición directa son: Recuento Microscópico
Directo (BREED), Recuento Celular Electrónico: Contador
de partículas Coulter Counter y el Fossomatic.
Metodos Medición Indirecta
 Clasificación de métodos según forma de medición en:
 Métodos de medición indirecta (interacción DNA-agente
tensoactivo).
 Métodos de medición directa (recuento de partículas).
 Métodos de medición indirecta son: California Mastitis Test
(CMT), Wisconsin Mastitis Test (WMT), Viscosímetro y
DNA-fíltro.
 Métodos de medición directa son: Recuento Microscópico
Directo (BREED), Recuento Celular Electrónico: Contador
de partículas Coulter Counter y el Fossomatic.
 Es un método semicuantitativo que emplea un reactivo
(detergente neutro alquil aril sulfonato), y un indicador
de pH (púrpura de bromocresol) para evaluar la
alcalinidad de la leche.
 La reacción del detergente con el ADN del núcleo de las
células, genera una determinada viscosidad.
 De acuerdo al grado de viscosidad se determinan
diferentes grados: T, 1, 2, 3

California Mastitis Test (CMT)
N= Negativo.
No hay
espesamiento
de la mezcla
T= Trazas.
Posible
infección
1= Positivo
débil.
Espesamiento
no se forma gel
2= Positivo
evidente.
Inmediato
espesamiento
con formación
de gel
 Observación al microscopio de un frotis de leche teñido con el
colorante Newman Lampert (azul de metileno), con el cual se
pueden observar el núcleo de los leucocitos
 Método de referencia, para nuevos procedimientos de RCS
(Bremel, 1980).
 Factores de variación :
 experiencia del operador con el método
 calidad del frotis
 cantidad de frotis que cuenta el operador.
Hasta 45% de error, promedio de 15% para leche con menos de
300.000 cél/ml.
Preparación del frotis:

Homogenizar y agitar la muestra (25 veces)
Colocar el portaobjetos (limpio y seco) sobre una superficie de
1cm2 delimitada previamente usada como patrón y calcarla

Colocar 0.01 ml de leche extendiendo la muestra en dicha
superficie


Secar la muestra en estufa a 40˚ C

Una vez seco retirar de la estufa

Fijar con alcohol –éter 2-3 minutos

Desengrasar con Xilol o cloroformo durante 1 minuto y dejar secar al aire

Colorear con azul de metileno durante 30 segundos

Lavar invirtiendo la lámina con agua de la canilla

Observar al microscopio con objetivo de inmersión

Contar células y microorganismos por campo observado
Examen Microscópico
Ubicar el centro de uno de los bordes del preparado y
recorrer horizontalmente contando por cada campo
observado los leucocitos que se observen

Efectuar la misma operación en
sentido vertical

Expresión de resultados
 Cálculo del número de leucocitos por ml
N˚ leucocitos / ml: N˚ de leucocitos contabilizados x F.M.
N˚ de campos observados
 F.M.: Factor de Microscopio
F.M:
10.000*
3,1416 x r2
* Conversión de superficie a volumen
Expresión de resultados
El Factor de Microscopio se calcula con un micrómetro
ocular con divisiones en 0.1 y 0.01 mm. Se coloca en la
platina de la misma forma que un portaobjetos


Se mide el diámetro del campo ocular y se calcula el radio
Ventajas

Rápido
 Los frotis se pueden guardar
 Exigencias de equipo mínimas
 Observación de diferentes microorganismos
Desventajas

Cansancio del operador
 Poca cantidad de muestra analizada
 No diferencia gérmenes viables de no viables
 Recuento Celular Electrónico, contador de partículas
 Clasificación y recuento de partículas en suspensión en un
medio electrolítico, en base a la variación de resistencia
eléctrica del electrolito.
Ventajas
 Leche fresca o preservada
 Exactitud
 Velocidad procesamiento




Desventajas
 Costo inicial
 Estandarización
 Técnicos especializados
Factores que generan más errores:
la dilución de la muestra
la calibración del contador electrónico
la homogeneización de la muestra
los disturbios electromagnéticos del aparato.
 Consiste en que, el ADN de las células somáticas de la
muestra de leche, al combinarse con el bromuro de etilo,
forman un complejo coloreado, que emite una fuerte
fluorescencia con una longitud de onda característica
cuando es irradiado mediante una luz azul por una
lámpara de xenón.
 La emisión de energía lumínica es detectada
electrónicamente, y el resultado es entregado y
registrado para cada muestra sucesivamente (Schmidt, 1975).
 Ventajas:
 Bajo costo/muestra
 Velocidad de procesamiento
 Exactitud, recomendable para laboratorios de referencia
(Heald y col ,1977)