TRABAJO PRACTICO Ng 1

2016
Prof. Titular Dra. Blanca Alicia Issé de Gómez
Prof. Asociada Dra. Sandra Stella Lazarte
Prof. Adjunta Dra. Gladis Susana Alvarez
JTP Dra. Ana Cecilia Haro
JTP Bioq. Esp. Emilse Ledesma Achem
JTP Dra. María Hortensia Zelaya
CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA I
INSTITUTO DE BIOQUÍMICA APLICADA
FACULTAD DE BIOQUÍMICA, QUÍMICA
Y FARMACIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TUCUMÁN
Balcarce 747. San Miguel de Tucumán. CP 4000.
Teléfono 0381-4310994.
1
Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia
Universidad Nacional de Tucumán
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº 1
Etapas preanalítica, analítica y postanalíticaObtención de sangre – Anticoagulantes Hemograma- Recuento de leucocitos Extendidos y coloraciones - Microscopía
2
BIOSEGURIDAD
INTRODUCCION
La palabra Bioseguridad deriva de seguro que, en su primera acepción,
significa libre y exento de todo peligro, daño o riesgo; al anteponer el prefijo bio
y construir bioseguridad evocamos inmediatamente el concepto de protección
de la vida.
Con fines prácticos se define Bioseguridad como la disciplina que se encarga
de prevenir accidentes en aquellos procesos en que está involucrado material
biológico. Incluye, por lo tanto todas las medidas y controles destinados a
disminuir el riesgo de exposición a diversos agentes infecciosos patógenos, en
un lugar donde se realiza atención o cuidado de pacientes o en un laboratorio.
Se entiende por material biológico al conjunto de materia orgánica (sangre,
exudados, tejidos, líquidos corporales, etc.) o materiales inorgánicos (gasas,
jeringas, etc.) que potencialmente pueden estar contaminados con agentes
biológicos patógenos.
La regla de oro en bioseguridad es la siguiente:
TODO MATERIAL DE ORIGEN HUMANO DEBE SER CONSIDERADO
CAPAZ DE TRANSMITIR INFECCION.
Por lo tanto las normas de bioseguridad deben implementarse en forma
permanente y universal.
MODOS DE INFECCION MÁS FRECUENTE
1. Auto-inoculación accidental debida a pinchazos o cortes con agujas,
pipetas, bisturíes u otros elementos punzantes.
2. Exposición de la piel o mucosas a sangre, hemoderivados u otros fluidos
biológicos contaminados especialmente cuando la permeabilidad de las
mismas se encuentra alterada por heridas, escoriaciones, eczemas, etc.
3. Inhalación de aerosoles producidos al agitar muestras, al destapar tubos, al
expulsar la última gota de una pipeta, durante la centrifugación,
especialmente cuando se emplean tubos abiertos o con mayor volumen del
aconsejado por el fabricante o cuando ésta es frenada abruptamente para
ganar tiempo.
4. Salpicaduras en los ojos o aspiración bucal.
RECOMENDACIONES GENERALES
1. La extracción de sangre debe hacerse siempre con guantes de látex, las
agujas deben descartarse en un recipiente resistente a punciones y las
jeringas se deben depositar en solución descontaminante. Bajo ningún
concepto las agujas serán retapadas, rotas o dobladas.
2. No se permitirá comer, beber, fumar y/o almacenar comidas así como el uso
de cualquier otro ítem personal (cosméticos, lentes de contacto) dentro del
área de trabajo.
3. Usar uniforme dentro del laboratorio, el cual deberá quitarse
inmediatamente antes de abandonar el área de trabajo.
3
4. Usar guantes de látex para todo manejo de material biológico. Cambiar los
mismos cuando hayan sido contaminados, lavarse las manos y ponerse
guantes limpios.
5. Bajo ninguna circunstancia se pipeteará sustancia alguna con la boca, para
ello usar propipetas.
6. Las superficies del área de trabajo deberán ser descontaminadas cuando se
termine la tarea diaria.
7. Todos los materiales usados en el laboratorio deberán ser adecuadamente
descontaminados. Dichos elementos serán posteriormente desechados o
lavados, secados y/o esterilizados según los requisitos que deba reunir su
reutilización.
8. El desecho de los fluidos orgánicos puede efectuarse por las cañerías
habituales una vez que estos hayan sido convenientemente
descontaminados.
9. Lavar las manos con jabón (líquido o sólido suspendido) y agua
inmediatamente después que el trabajo haya sido terminado.
10.Informe inmediatamente a su superior de cualquier accidente ocasionado
con elementos del laboratorio.
NOTA: La solución descontaminante recomendada por excelencia es el
hipoclorito de sodio. Se usa la misma en una dilución al 1% para la
descontaminación de superficies, mesadas, pisos, etc. Para todo material de
vidrio y descartable que contenga material biológico se usa hipoclorito de sodio
al 10%.
RIESGO OCUPACIONAL DE EXPOSICIÓN A SANGRE O FLUIDOS
CORPORALES
Actualmente, las enfermedades infecciosas más importantes y a las que
durante su práctica diaria se ven expuestos los trabajadores sanitarios con
mayor frecuencia son las de etiología vírica. Entre ellas se destaca el virus de
la hepatitis (HBV), hepatitis C (HCV) y el virus de la inmunodeficiencia humana
(HIV).
El riesgo de transmisión después de exposición a sangre infectada con virus
de hepatitis es
 Hepatitis B : 30%
 Hepatitis C : 4%
Existen vacunas para prevenir la infección por HBV, no así por HCV.
El riesgo de transmisión de HIV después de exposición a sangre infectada con
HIV es de aproximadamente 0,3%. No existen vacunas para prevenir dicha
infección.
CONCLUSIONES
Las prácticas seguras de trabajo son la única protección con que se cuenta por
el momento contra el riesgo de infección por HIV. Poner en práctica estas
normas significa tomar conciencia que además de nuestra propia salud
consideraremos la de los demás. Auto-cuidado es el compromiso de cada
individuo o grupo de trabajo de mantener el uso y cumplimiento de las normas
de bioseguridad en su labor diaria.
4
Se debe recordar que a pesar de la implantación de las precauciones
generales los trabajadores de la salud se enfrentan a múltiples maniobras que
pueden provocar accidentes, es decir que éstos siempre ocurrirán.
Toda exposición ocupacional debe ser considerada una urgencia médica,
concerniendo la administración a tiempo de la adecuada profilaxis postexposición a la institución de salud, la cual debe contar con un protocolo a
seguir luego de la misma.
ETAPAS PRE-ANALÍTICA Y POST-ANALÍTICA DEL ESTUDIO
HEMATOLÓGICO
La etapa pre-analítica comprende:






El pedido del análisis
La identificación del paciente (historia clínica, fecha de nacimiento o
número de afiliado)
El interrogatorio del paciente que permita una mejor interpretación de los
resultados (diagnóstico presuntivo, medicación que toma, alimentación,
estudios anteriores)
La variabilidad intraindividual: las variaciones biológicas no pueden
eliminarse porque el paciente es un ser vivo, pero pueden controlarse
las causas endógenas (ritmo circadiano de algunos parámetros) y
exógenas (ejercicio físico, ingestión de grasas y alcohol, hábito de
fumar) de variabilidad estableciendo pautas de horarios, hábitos y dieta,
a fin de que los resultados sean comparables
La preparación del material para la extracción y recolección de sangre
(elección adecuada del anticoagulante, uso de material plástico para
estudio de coagulación, material libre de iones para estudio del
metabolismo del hierro)
La recolección, conservación y/o el transporte de la muestra al
laboratorio
La etapa post-analítica involucra:




Valoración global que permite determinar si ocurrió algún error en el
ensayo por problemas técnicos o de calibración que desvía todos los
resultados en uno u otro sentido
Valoración individual que aprecia la coherencia de los resultados de
cada paciente
Confección del informe que debe contener lo siguiente: datos del
paciente, fecha de la toma de muestra, nombre de la práctica,
metodología, valores de referencia con las unidades correspondientes
La entrega efectiva del resultado del análisis al médico. Para ello, lo
ideal es el uso de un sistema de computadoras, que permita el acceso y
la impresión del resultado en el área clínica.
5
TOMA DE MUESTRA
La muestra de sangre para el estudio hematológico puede ser tomada por
medio de punción venosa o capilar.
1. SANGRE VENOSA: Existen precauciones estándares para la
recolección de sangre. Ante todo se debe recordar que la sangre es una
fuente potencial de infección, particularmente de hepatitis, sífilis y HIV. El
lavado de manos es el procedimiento más importante para prevenir la
diseminación de las enfermedades infecciosas, el cual debe llevarse a cabo
con un jabón no abrasivo y agua corriente cuando se produzca contacto con
fluidos biológicos. Si no se dispone de agua pueden utilizarse limpiadores
antisépticos. Los guantes son parte fundamental del equipo protector y deben
utilizarse cuando se realizan venopunciones. No es necesario que los mismos
sean estériles, si el paciente no está inmunocomprometido.
El material que se usa en la extracción debe ser estéril y descartable. Antes de
iniciar la extracción se debe preparar la orden de ingreso e identificar al
paciente, mediante la confirmación de su nombre y número de identificación. Si
corresponde, verificar alguna restricción de la dieta.
El paciente deberá:
a) Tener como mínimo 4 horas de ayuno.
b) Estar sentado o acostado; se localiza la vena adecuada para la punción, la
cual debe ser palpable. Las venas superficiales de la cara anterior del
antebrazo son las más comunes (se usa la mediana cubital, basílica o cefálica).
Se aplica la ligadura 7 a 10 cm por encima del sitio de punción, se pide al
paciente que cierre la mano, se desinfecta con alcohol y se espera que seque
al aire. Se canaliza la vena con la aguja en la misma dirección de ella y el bisel
hacia arriba, y se extrae la cantidad necesaria de sangre. Antes de retirar la
aguja se indica al paciente que abra la mano y se retira el torniquete. Se coloca
un algodón seco (el alcohol produce dolor y puede dañar la pared de la vena).
La aguja se debe desechar en un recipiente de paredes rígidas. Luego se
procede a cargar y rotular los tubos correspondientes.
Los frotis se realizan colocando una gota de sangre en portaobjetos antes de
separar la aguja de la jeringa y el extendido se efectúa de inmediato. Si el
guante no se ha manchado con sangre se puede reutilizar previo lavado con
agua y jabón.
2. SANGRE CAPILAR: es una mezcla de sangre venosa, sangre arterial y
líquido tisular. Dado que esta muestra puede generar resultados ligeramente
diferentes, debe especificarse la obtención por punción cutánea. Se realiza en
el pulpejo del dedo en los adultos o la planta del pie en un lactante (en las
regiones laterales). No debe usarse salvo que no se pueda obtener sangre
venosa, ya que los resultados pueden ser discrepantes. Por ejemplo no se
puede realizar recuento de leucocitos si la piel está fría, ya que puede dar más
alto; ni el de plaquetas (da más bajo). Además, el hematocrito puede estar
falsamente disminuido por una presión manual exagerada por lo que la sangre
debe fluir libremente. Al hacer la punción se debe asegurar que la piel esté tibia
y con buena perfusión. Se limpia con alcohol, se deja secar y se punza con
lanceta estéril; la sangre se recoge con tubos capilares para el
microhematocrito, si se hace fórmula leucocitaria, se deben hacer extendidos
en forma inmediata. Recordar que la primera gota debe ser desechada. Para
6
estudios cuantitativos como el dosaje de hemoglobina, la sangre debe ser
tomada directamente con pipeta.
3. VENOPUNCIÓN EN NIÑOS Y LACTANTES: la flebotomía pediátrica
requiere experiencia, destrezas especiales y sensibilidad al tacto. Se necesita
capacidad para las relaciones interpersonales, para tratar con los padres
angustiados y con niños que lloran, gritan o están asustados. El secreto para
una venopunción exitosa es: ¡Sujetar bien al niño!
Algunas complicaciones que pueden presentarse luego de la recolección de
sangre son las siguientes: equimosis, desmayos, hematomas, petequias,
convulsiones, vómitos y alergias.
EMPLEO DE ANTICOAGULANTES
Los anticoagulantes son sustancias que impiden la formación de coágulos
sanguíneos. La sangre se mezcla con el anticoagulante para evitar que los
elementos formes queden atrapados en la red de fibrina.
En el uso de anticoagulantes debe respetarse estrictamente la proporción entre
éstos y la sangre. Un exceso conduce a modificaciones en los elementos
sanguíneos, mientras que un defecto llevaría a la formación de microcoágulos
haciendo la muestra inadecuada para su estudio.
El anticoagulante idóneo debe cumplir los siguientes requisitos:
 No alterar el volumen de los eritrocitos
 No producir hemólisis
 Evitar la agregación de las plaquetas
 No alterar la morfología leucocitaria
Los anticoagulantes de uso más frecuente son:
EDTA (sal di o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético): actúa
fijando el calcio por formación de un quelato, impidiendo su disponibilidad para
iniciar la coagulación sanguínea. El International Council of Standardization in
Haematology (ICSH, 1993) recomienda usar la sal dipotásica en una
concentración indicada de 1,5 ± 0.25 mg/mL de sangre. En esa misma
concentración la sal tripotásica disminuye un 2-3 % el hematocrito y aumenta
gradualmente el volumen corpuscular medio con el almacenamiento.
Citrato sódico: es un quelante débil de calcio. Es usado en forma líquida, y el
indicado para estudios hemostáticos; se recomienda el uso de soluciones de 32
g/L (0,109 M) en una relación 9/1 entre volumen de sangre y anticoagulante.
Para la determinación de la eritrosedimentación pueden prepararse soluciones
de 38 g/L (0,124 M de C6H507Na3.2 H20) y se usa en una proporción de 1/4 (un
volumen de citrato y 4 de sangre).
Heparina: es un anticoagulante fisiológico, ideal para evitar la coagulación
sanguínea in vivo. Actúa como cofactor de la antitrombina III, que es el
inhibidor natural de la trombina. Tiene la ventaja de no alterar el volumen
eritrocitario. Puede usarse en forma seca o líquida, siendo aconsejable la
proporción de 15 - 20 UI (0,1 - 0,2 mg) de heparina por mililitro de sangre. No
deben realizarse frotis con esta muestra, ya que produce una coloración azul
de fondo. Es el anticoagulante de elección para la realización de la prueba de
resistencia osmótica eritrocitaria (ROE). No es recomendado para recuento de
leucocitos, ya que produce el agrupamiento de los mismos.
7
La sangre anticoagulada se deteriora fácilmente, por lo que entre la extracción
y el análisis no deben transcurrir más de 6 horas si es conservada a
temperatura ambiente o más de 24 horas a 4ºC.
Actualmente, en el mercado se encuentran tubos descartables para la
recolección de sangre con sistema de vacío o no, los cuales contienen el
anticoagulante en la proporción adecuada para las pruebas que se deseen
realizar. Los mismos también están disponibles en presentaciones pediátricas.
Casi todas las muestras que se reciben para las pruebas de rutina en la
sección de hematología se recolectan en tubos con tapón color lavanda, los
que contienen K2EDTA como anticoagulante.
HEMOGRAMA
Hemograma es una nomenclatura creada por Schilling para referirse al
recuento diferencial porcentual de los leucocitos. Hoy en día constituye uno de
los exámenes de laboratorio más solicitados, y comprende otras
determinaciones. Los parámetros que constituyen el hemograma son:
 Recuento celular (eritrocitos, leucocitos y plaquetas)
 Fórmula leucocitaria relativa y absoluta
 Concentración de hemoglobina
 Hematocrito
 Amplitud de distribución eritrocitaria
 Índices eritrocitarios
 Indices plaquetarios
 Observaciones cualitativas
MÉTODOS DE RECUENTO CELULAR SANGUÍNEO
El recuento celular es la determinación del número de células sanguíneas,
eritrocitos, leucocitos, plaquetas y reticulocitos por unidad de volumen
sanguíneo.
El recuento de plaquetas, eritrocitos y leucocitos puede ser realizado mediante
métodos ópticos con cámara cuentaglóbulos y microscopio óptico, o mediante
métodos electrónicos. Debe señalarse que el recuento celular sanguíneo en
cámara cuentaglóbulos constituye aún el método de referencia internacional de
recuento de leucocitos y plaquetas, siempre que se sigan las recomendaciones
del ICSH. Para el recuento de eritrocitos el ICSH recomienda como método de
referencia el recuento electrónico normalizado.
A)- MÉTODOS ÓPTICOS
Han constituido, hasta hoy, el método tradicional de recuento celular.
Material:
1-Sangre capilar o venosa
2-Líquido de dilución
3-Pipetas automáticas
4-Cámara cuentaglóbulos
5-Microscopio
8
El recuento de leucocitos mediante cámara cuentaglóbulos ha quedado
limitado hoy en día a situaciones tales como intensas leucopenias o
leucocitosis frente a las que el método electrónico pierde fiabilidad. También se
utiliza en el recuento de líquidos biológicos (cefalorraquídeo, ascítico, pleural y
otros).
-Para el recuento de leucocitos, el líquido de dilución empleado es el líquido
de Türk:
Ácido acético glacial
1 a 3 mL
Violeta de genciana o Azul de metileno (sol. acuosa al 1%)
1 mL
Agua destilada c.s.p.
100 mL
Esta solución tiene por objeto eliminar los hematíes por hemólisis y teñir
ligeramente el núcleo de los leucocitos. La dilución de que habitualmente se
realiza es de 1/20, empleándose normalmente 20 μL de sangre en 0,38 mL de
líquido de Türk.
-El método óptico para recuento de eritrocitos puede considerarse histórico,
dado el elevado error que se comete al usar la cámara cuentaglóbulos
(aproximadamente un 20%). Hasta la introducción de los métodos electrónicos
de recuento celular, la cifra de hematíes carecía de verdadero interés.
-Para el recuento de plaquetas, el líquido de dilución empleado es el oxalato
de amonio.
Cámara cuentaglóbulos-Cámara de Neubauer
Consisten en un portaobjetos de vidrio grueso (unos 3 mm), que lleva grabado
en su superficie tres prismas paralelos de los cuales el central está dividido en
dos hemiprismas idénticos y separados por un surco central. Sobre estos
últimos, hay trazados sendos retículos para el recuento celular.
Los prismas laterales se hallan sobreelevados respecto al central en una altura
de 0,1 mm, con lo que, colocando un cubreobjetos especial, queda constituido
el espacio en que se colocará la muestra diluida.
Cámara de Neubauer
El más utilizado es el retículo de Neubauer, que presenta 9 cuadrados
grandes de 1 mm2 de superficie cada uno. Los 4 de las esquinas, destinados al
recuento de leucocitos, están divididos en 16 cuadrados medianos cada uno
por líneas simples. El retículo central (cuadrado central) que presenta mayor
número de líneas de referencia, está destinado al recuento de plaquetas. A
nivel del mismo, la intersección de las líneas de referencia delimitan 400
cuadraditos pequeños con una superficie de 1/400 mm2 cada uno.
9
Existen dos tipos de retículo central, el original de Neubauer y el modificado.
El retículo original de Neubauer presenta en el cuadrado central 16
cuadrados medianos delimitados por triples líneas, conteniendo cada uno de
ellos 16 cuadrados pequeños, lo que hace un total de 256 (16 x 16). Los
restantes cuadrados pequeños, (400 - 256 = 144) se encuentran en las triples
líneas delimitantes. El retículo descripto es también llamado retículo de Thoma
(Figura N°1).
Las cámaras en venta actualmente presentan el retículo de Neubauer
modificado, en el retículo central hay 25 cuadrados medianos de 16
cuadrados pequeños cada uno, en total 400 cuadrados pequeños, separados
por líneas triples cercanas, que aparecen como líneas gruesas en la Figura 2.
El volumen es igual al retículo original, aplicándose el mismo criterio para los
cálculos.
FIGURA N°1: Retículo de Neubauer original
10
FIGURA N°2: Retículo de Nuebauer modificado
Sistemática del recuento leucocitario
Una vez efectuada la dilución correspondiente, se carga la cámara utilizando
una pipeta automática, dejando que el líquido se distribuya por capilaridad.
Luego de unos minutos, necesarios para la sedimentación de los leucocitos, se
procede al recuento de los que están depositados en los cuatro cuadrantes
laterales (superior derecho, superior izquierdo, inferior derecho e inferior
izquierdo), usando un objetivo seco (10 ó 40X). Deben contarse las células
ubicadas dentro de los 16 cuadrados medianos y las que están sobre las líneas
superior y derecha de cada uno de ellos, siguiendo el recorrido que se muestra
en el esquema; de esta forma se evita contar dos veces el mismo elemento.
11
Cálculo de los resultados
El área total de los cuadrados contados es 4 x 1 mm 2 = 4 mm2 mientras que la
altura de la cámara es 0,1 mm. De acuerdo a lo anterior, el volumen en que
fueron contados los leucocitos es 4 x 0,1 = 0,4 mm3.
Si en 0,4 mm3 se contaron A leucocitos, en 1 mm3 serán A / 0,4 = Nº de
leucocitos en 1 mm3
Este cociente debe ser referido ahora a 1 mm3 de sangre total, sin dilución, por
lo que se multiplicará por el factor de dilución.
Finalmente:
Nº de leucocitos en 1 mm3 de sangre = A x 20 = A x 50
0,4
Donde A es el número total de leucocitos contados en cámara.
0,4 mm3 el volumen en que fueron contados.
20 es el factor de dilución.
Nota: 1 mm3 = 1 µL (microlitro).
El error del recuento de leucocitos por método óptico es aproximadamente del
20%, por la distribución al azar de estos en la cámara, que es inevitable; cuanto
mayor sea el número de leucocitos, menor será el error.
En casos de recuentos de leucocitos elevados se realizará una dilución mayor
y en casos de recuentos bajos, una dilución menor para disminuir el error.
La presencia de eritroblastos interfiere en el recuento manual y automatizado
de leucocitos, debido a que los mismos no son lisados por los líquidos de
dilución. Si en la observación del frotis saguíneo, se encuentran eritroblastos,
se procede a contar su número con respecto a 100 leucocitos. Luego se corrige
el recuento de leucocitos con la siguiente fórmula:
Leucocitos reales = Leucocitos contados x 100
(Eritroblastos + 100)
Ejemplo:
Recuento GB: 10 x 109/L
Eritroblastos: 15 cada 100 leucocitos
Leucocitos reales = 10x109/L x 100 = 8,7x109/L
(15 + 100)
Causas de error al realizar el recuento celular mediante cámara
1- Pipetas mal calibradas, sucias o húmedas.
2- Llenado incompleto o deficiente de la pipeta (presencia de burbujas).
3- Insuficiente homogeneización de la sangre diluida o escaso tiempo de
espera antes de cargar la cámara.
4- No desechar las primeras gotas antes de cargar la cámara.
5- Cámara mal ajustada, sucia o mojada.
6- Llenado incompleto o deficiente de la cámara.
7- Células mal distribuidas en el fondo de la cámara. La diferencia en el
recuento entre los cuadrantes no debe ser superior a 5 elementos.
12
8- Recuento de un número insuficiente de células.
9- Errores al realizar el recuento.
10-Errores al efectuar los cálculos.
11-Uso de cubreobjetos deformable, no rígido.
B)- RECUENTO CELULAR AUTOMATIZADO
El sistema de recuento celular sanguíneo electrónico se basa en la medida del
tamaño u otras propiedades físicas de las células suspendidas en medio
líquido. El empleo de autoanalizadores ha permitido mayor rapidez, precisión y
exactitud en la determinación de los parámetros sanguíneos, introduciendo
también el cálculo sistemático de los llamados índices eritrocitarios, de gran
interés en el diagnóstico de las anemias.
Se basan en uno de los dos principios básicos:
1. La impedancia electrónica o resistencia eléctrica
2. La dispersión óptica
1. Impedancia electrónica o resistencia a la corriente continua
Se aspira la muestra de sangre en forma automática o manual y es diluida por
un diluyente isotónico. Por una serie de presiones y vacíos llega a
determinadas cámaras. Las células sanguíneas son poco conductoras de
electricidad a causa de la membrana celular, mientras que sí lo son algunos
diluyentes. Así la sangre se disuelve en una solución electrolítica y fluye a
través de una abertura en la cual se mantiene una corriente eléctrica continua
prefijada entre dos electrodos localizados a ambos lados del orificio, creando
una zona detectora. Cada vez que una célula atraviesa ese orificio se
interrumpe el flujo de corriente al desplazar al líquido conductor. Esto provoca
un aumento de la resistencia eléctrica, dando un pulso electrónico cuya
amplitud (ancho de la onda) y magnitud (altura) dependen del tamaño
(volumen) de la célula y del orificio de la zona detectora.
13
En un determinado período de tiempo el equipo cuenta cuantas células
pasaron, cual era la altura del pico (volumen de la célula), y va catalogando
cada partícula. El número de pulsos es proporcional al número de células
contadas. Los pulsos se reúnen y ordenan según su amplitud mediante
analizadores de la altura de los picos. Los datos se trazan en un gráfico de
distribución de frecuencia, o Histograma de distribución del tamaño, con el
número relativo en el eje y y el tamaño en el eje x. El histograma producido
representa la distribución del volumen de las células contadas.
Histograma de plaquetas
Histograma de glóbulos rojos
Histograma de glóbulos blancos
La muestra de sangre entera anticoagulada es aspirada y se divide en 2
porciones, cada una se diluye con solución isotónica. La primera dilución va a
la cámara de apertura de eritrocitos y la segunda a la cámara de apertura de
glóbulos blancos. En la 1ª cámara se cuentan eritrocitos y plaquetas, y se
diferencian por la impedancia eléctrica a medida que pasan a través de las 3
aperturas con sensores. Las párticulas entre 2-20 femtolitros (fL) se cuentan
como plaquetas, mayores a 36 fL, como eritrocitos. En la cámara de leucocitos,
se agrega un lisante de glóbulos rojos (GR) para liberar la hemoglobina (Hb),
antes de contar los leucocitos por impedancia en cada uno de las tres
aperturas sensoras. Las partículas entre 35 y 90 fL se consideran linfocitos,
14
entre 90 y 160 fL mononucleares (monocitos, blastos, granulocitos inmaduros y
linfocitos atípicos), y entre 160 y 450 fL, granulocitos; de esta forma es posible
realizar el cálculo de cifras relativas y absolutas de estas tres poblaciones.
Después que se completan los ciclos de recuento, la dilución de leucocitos
pasa al hemoglobinómetro para determinar la concentración de Hb (lectura de
T a 525 nm).
Los pulsos eléctricos generados en los ciclos de conteo, son enviados al
analizador. Se generan histogramas de distribución de tamaño de leucocitos,
eritrocitos y plaquetas.
El uso de reactivos líticos de marca registrada para controlar la contracción y la
lisis de tipos celulares específicos, permite separar y cuantificar los leucocitos
en sangre en tres poblaciones: linfocitos, células mononucleares y granulocitos.
Ejemplo: contador hematológico marca Coulter.
La radiofrecuencia o resistencia a la corriente electromagnética de alto voltaje a
veces se utiliza junto con la impedancia electrónica de la corriente continua.
Permite graficar en forma comparativa dos propiedades celulares diferentes,
como la impedancia y la conductividad, para la formación de un Histograma de
distribución bidimensional o un trazado de dispersión. Estos gráficos
muestran las poblaciones celulares como cúmulos, con el número de puntos en
cada uno que representa la concentración de ese tipo de células. El uso de
esta tecnología permite la separación diferencial de los leucocitos en 5
componentes: neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos.
Ejemplo: contador hematológico marca SYSMEX.
Informe de un hemograma mediante autoanalizador marca ABBOTT CELL-DYN
FIGURA 4
FIGURA 3
FIGURA 3: histograma de distribución de tamaño de glóbulos rojos. FIGURA 4: histograma de
distribución bidimensional, donde se grafica el tamaño celular versus complejidad y
granularidad versus lobularidad de los leucocitos.
2. Dispersión óptica (DO)
La DO puede usarse como metodología primaria o en combinación con otros
métodos. Este sistema consiste en analizar la dispersión de luz producida por
15
las células desde dos dimensiones gracias a sensores situados en ángulos
diferentes. Para el análisis, las células se hacen pasar individualmente a lo
largo de una cámara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz
de luz, que puede ser halógena o láser. A medida que las células atraviesan la
zona sensora e interrumpen el haz, la luz se dispersa en todas las direcciones.
La luz dispersa es el resultado de la interacción entre los procesos de
absorción, difracción, refracción y reflexión. La detección y la conversión de los
rayos dispersados en señales eléctricas se logran mediante fotodetectores en
ángulos específicos; los pulsos electrónicos se convierten en señales digitales
para el análisis computarizado. La DO se correlaciona con el volumen celular o
el tamaño y con el grado de complejidad de la célula. Ejemplo: contador
hematológico marca ABBOTT CELL-DYN y BAYER ADVIA.
Ya sea que el equipo utilice el método de impedancia electrónica o el de
dispersión óptica (primaria o en combinación con otros métodos), tienen
algunos componentes básicos comunes, como el sistema hidráulico
(aspiradores,
dispensadores,
diluyentes,
cámaras
de
recuento,
hemoglobinómetro, entre otros), el sistema neumático (cámaras de vacío y
presiones necesarias para el transporte de las muestras), y el sistema eléctrico
que controla las secuencias operacionales del sistema total (analizadores
electrónicos y circuitos computarizados que procesan los datos obtenidos).
Los instrumentos automatizados presentan las siguientes ventajas:
 Alta precisión y exactitud
 Aconsejable para número elevado de muestras
 Nuevos parámetros: RDW, PDW (amplitud de distribución plaquetaria según
el volumen) , VPM , PCT (plaquetocrito)
 Alarmas
Pero en el uso de los mismos es importante una técnica cuidadosa, es decir:
 Buena recolección de sangre (punción y extracción)
 Material de recolección descartable (asegurar limpieza y anticoagulante sin
partículas)
 Diluyente de muestra libre de partículas
 Adecuado mantenimiento del equipo
 Buen control de calidad
EL FROTIS SANGUINEO
La práctica de un frotis sanguíneo es de gran importancia en hematología, ya
que el diagnóstico de muchas enfermedades hematológicas puede realizarse
con sólo observar las características morfológicas de las células sanguíneas.
Debido a ello, la técnica de realización del frotis debe ser impecable,
procurando que éste no sea excesivamente fino ni excesivamente grueso. Con
esto se conseguirá una distribución adecuada de las células en las diferentes
áreas del frotis.
Deben tenerse en cuenta las siguientes consideraciones:
1.- Los portaobjetos deben estar escrupulosamente limpios y desengrasados.
2.- Si se parte de punción digital, no se empleará nunca la primera gota.
3.- Si se parte de punción venosa, el frotis se hará con la mayor rapidez posible
y con sangre no tratada con anticoagulante. Este produce hinchamiento nuclear
16
en los leucocitos con falso aumento del número de neutrófilos no segmentados,
vacuolización citoplasmática y aparición de diversos artefactos.
Técnica manual con dos portaobjetos en ángulo
Se pone una gota de sangre en la línea media del portaobjetos a un centímetro
de uno de sus extremos. Se coloca otro portaobjeto junto a la gota y formando
un ángulo de unos 45°C, se establece contacto con la gota de sangre, la cual
se extiende mediante un rápido movimiento de deslizamiento. La extensión
debe medir 3 a 4 cm de longitud. El extensor debe limpiarse una vez usado. La
extensión no debe ser demasiado fina y la cola de la misma ha de ser lisa. Por
lo general se observa una irregularidad cualitativa en la distribución: los
polimorfonucleares neutrófilos y los monocitos predominan en los márgenes y
en la cola; los linfocitos, en el cuerpo de la extensión. Esto depende quizás de
las diferencias en el grosor, tamaño y gravedad específica entre las distintas
clases de células (Figura N°6).
FIGURA N°6: Distribución de los leucocitos en el frotis sanguíneo
No se debe olvidar identificar el extendido con un lápiz de mina. Un buen frotis
debe ser homogéneo en toda su extensión, más angosto y más corto que el
portaobjetos, sin escotaduras ni agujeros, sin flecos ni estrías. Se han
propuesto diversos sistemas para realizar el recuento diferencial de leucocitos,
pero ninguno puede compensar las irregularidades macroscópicas de la
distribución en una extensión mal hecha.
Tinción del frotis sanguíneo
Los colorantes de Romanowsky son utilizados universalmente para la tinción
de rutina de las extensiones de sangre. Estas, después de secadas al aire y en
posición horizontal, deben ser fijadas y coloreadas
Los colorantes de Romanowsky tienen la propiedad de proporcionar sutil
distinción de matices de tinción, debido a una mezcla de eosina, azul de
metileno y derivados por oxidación de este último, los azures.
El mecanismo por el cual determinados componentes de las estructuras
celulares se tiñen por ciertos colorantes y otros no, depende de complejas
diferencias en la afinidad de los mismos, en la estructura química y en la
interacción con las moléculas del colorante. Tanto la eosina como el azul de
metileno son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes
estructuras celulares, de manera que las que tienen carácter básico fijan
17
preferentemente la eosina (colorante ácido), mientras que las de propiedades
ácidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante básico).
Los grupos ácidos de los ácidos nucleicos, las proteínas del núcleo celular y las
granulaciones primarias de los neutrófilos, las finas granulaciones de los
monocitos y las de algunos linfocitos (probable origen T), determinan su
apetencia por los azures, tiñéndose de color púrpura al igual que ciertas
inclusiones eritrocitarias como el punteado basófilo.
Los granulocitos neutrófilos en los que la granulación específica posee
componentes ácidos y básicos, fijan ambos colorantes simultáneamente, lo que
les da un carácter neutro. De esta propiedad deriva su nombre. El citoplasma
es ligeramente acidófilo, rosa pálido.
De la presencia de grupos básicos en las moléculas de hemoglobina de los
eritrocitos, arginina y lisina en la granulación específica del eosinófilo, resulta la
afinidad por colorantes ácidos y su tinción por la eosina. Lo que se tiñe con
eosina toma color pardo anaranjado.
Los granulocitos basófilos poseen sustancias de fuerte carácter ácido,
principalmente heparina, por lo que fijan colorantes básicos como el azul de
metileno, tiñéndose de azul intenso; a veces se puede observar una
degranulación parcial por efecto del lavado en el proceso de la tinción por ser
hidrosolubles. Cuando se tiñen con azul de toluidina los gránulos adquieren un
color rojizo; este comportamiento se conoce como metacromasia.
Dentro del grupo de colorantes tipo Romanowsky, los más utilizados son
Giemsa, May Grünwald-Giemsa y variantes, y Leishman.
Tinción de Giemsa.
Se basa en el empleo de una solución de azul de metileno, su derivado oxidado
en medio alcalino, el azur II, y eosina disueltos en alcohol metílico y glicerina.
Esta solución puede obtenerse comercialmente.
Método:
1.-Fijación con alcohol metílico 1 a 3 minutos.
2.-Lavar con agua.
3.-Colocar sobre la extensión solución de Giemsa al 10% en agua corriente o
ligeramente alcalina. Dejar actuar 10 a 15 minutos, controlando el tiempo
óptimo de coloración al microscopio.
4.-Lavar y dejar secar. Observar al microscopio.
Tinción de May Grünwald-Giemsa
Es una combinación a partir de la anterior, que recibe el nombre de coloración
panóptica. Requiere del reactivo de May Grünwald, que es una solución
metílica de eosinato de azul de metileno. Puede obtenerse comercialmente.
Método:
1.-Fijar el frotis con solución de May Grünwald durante 3 minutos.
2.-Agregar igual número de gotas de agua destilada sobre la solución anterior,
dejando actuar 1minuto.
3.-Volcar el líquido y, sin lavar, cubrir la preparación con solución de Giemsa
diluida 1/10 en agua corriente. Dejar actuar 10 a 15 minutos, controlando el
óptimo al microscopio.
Tinción de May Grünwald-Giemsa modificada
A partir de soluciones comerciales, se prepara el siguiente reactivo:
18
Para 100 mL
Solución de May Grünwald
40 mL
Solución de Giemsa
20 mL
Alcohol metílico de buena calidad 40 mL
Método:
1.-Fijar el extendido con el reactivo descripto durante 2 minutos.
2.-Agregar igual número de gotas de agua corriente sobre la solución.
Dejar actuar 10 a 15 minutos, controlando el tiempo óptimo de coloración al
microscopio cuando se prepara el colorante.
Tinción de Leishman.
El reactivo de Leishman puede adquirirse en el comercio. Se prepara:
Polvo de Leishman
0,2 g
Alcohol metílico puro
100 mL
Método:
1.-Fijar el extendido con el reactivo descripto durante 30 segundos.
2.-Agregar igual cantidad de gotas de agua destilada sobre la solución anterior.
Homogeneizar bien.
3.-Dejar actuar 10 a 15 minutos controlando el óptimo al microscopio.
Tinción automatizada
Existen equipos de tinción automática que permiten manejar grandes lotes de
portaobjetos. Pueden ser máquinas de tinción aisladas o formar parte de un
equipo más grande para el recuento sanguíneo automatizado. En muchos
casos, el equipo extiende, fija y tiñe las extensiones. Algunos equipos
automatizados que incorporan la tinción solo se pueden programar para
preparar y teñir una sola extensión por muestra. Otros pueden preparar y teñir
múltiples extensiones a partir de una única muestra sanguínea. Algunos
sistemas aplican las soluciones de tinción a los portaobjetos dispuestos
horizontalmente (tinción en lecho horizontal), mientras que otros sumergen el o
los portaobjetos en un baño de la solución colorante (técnica de “sumergir y
remojar”) o pulverizan el colorante sobre los portaobjetos en una cito centrifuga.
Los inconvenientes incluyen un aumento de la coloración del fondo, la tinción
inadecuada de los gránulos de los neutrófilos, la degranulación de los basófilos
y la coloración azul o verde en vez de rosada de los hematíes.
19
MORFOLOGIA DE LOS LEUCOCITOS
CITOPLASMA
Relación VN/VC
GRÁNULOS*
TIPO CELULAR
TAMAÑO
NEUTRÓFILOS
10-15µm
Rosa
pálido
Baja
Numerosos muy
finos, púrpuras o
violetas
Violeta oscuro,
usualmente 2-5
segmentos
EOSINÓFILOS
12-17µm
Celeste
pálido
Baja
Muchos, grandes,
redondos, pardo
anaranjados
Violeta,
usualmente 2
segmentos
Baja
Varios, grandes
irregulares, azul o
violeta intenso,
cubren el núcleo
Irregular,
usualmente 2
segmentos
Moderadamente
alta
Número variable,
finos y púrpuras
Varias formas
(redondo,
reniforme, forma
de C ó de U),
cromatina laxa
Alta o muy alta
**Escasos,
púrpuras y
gruesos
Violeta, redondo,
cromatina
homogénea y
condensada
BASÓFILOS
COLOR
8-10µm
Rosa
MONOCITOS
12-20µm
Celeste
grisáceo,
a veces
vacuolado
LINFOCITOS
7-12µm
(pequeños)
12-16µm
(grandes)
Azul pálido
NÚCLEO
Relación VN/VC: Volumen Nuclear/ Volumen Citoplasmático.
* Gránulos: descripción de gránulos específicos.
** Un bajo porcentaje de linfocitos presentan gránulos.
Cromatina condensada (heterocromatina): se refiere a la densidad elevada, que es la que
presentan generalmente los linfocitos.
Cromatina laxa (eucromatina): es la que predomina en los monocitos.
VALORES DE REFERENCIA
EDAD
1-3 días
1 semana
1 - 2 años
3 - 7 años
8-13 años
Adultos
LEUCOCITOS
( x 109 / L )
RANGO
MEDIA
9,0-30,0
18,1
5,0-21,0
12,2
6,0-17,0
11,5
5,0-14,5
8,5
4,5-13,0
7,9
4,5-10,0
7,2
20
EXPRESIÓN DE RESULTADOS EN HEMATOLOGIA
Actualmente diferentes organismos internacionales recomiendan expresar los
resultados de los parámetros biológicos de acuerdo al llamado Sistema
Internacional de Unidades (sistema SI).
El empleo del sistema SI en los laboratorios clínicos favorece la
estandarización de los métodos y unifica la forma de expresar los resultados,
facilitando con ello la comparación de estudios realizados en laboratorios
diferentes.
En hematología, la incorporación del Sistema Internacional de Unidades ha
instituido un cambio significativamente importante en la expresión de los
resultados. El Comité Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH),
la Federación Internacional de Bioquímica Clínica (IFCC), y la Asociación
Mundial de Sociedades de Patología (WAPS), han elaborado una declaración
conjunta sobre el uso del sistema SI, que consta de los siguientes apartados
fundamentales:
1.-Se reconoce la aceptación del sistema internacional de unidades SI.
2.-La unidad de volumen (o de capacidad) es el litro, que se expresa con el
símbolo "L".
3.-Para representar los múltiplos y submúltiplos de unidades, se emplearía
solamente el prefijo correspondiente.
4.-La concentración de sustancias se expresará siempre en relación al litro.
5.-En el caso de sustancias cuya composición química es conocida se
recomienda emplear el mol para indicar la cantidad de las mismas.
Prefijos recomendados para múltiplos y submúltiplos de unidades
básicas
Factor
1012
109
106
103
102
101
10-1
10-2
10-3
10-6
10-9
10-12
10-15
10-18
Prefijo
TeraGigaMegaKiloHectoDecaDeciCentiMiliMicroNanoPicoFemtoAtto-
Símbolo
T
G
M
K
H
D
d
c
m
µ
n
p
f
a
BIBLIOGRAFIA
 Manual de técnicas de laboratorio en hematología. Vives-Aguilar. 3ª edición. 2006.
 El laboratorio en el diagnóstico clínico. John Bernard Henry. 20ª edición. 2005.
 Dacie y Lewis Hematología Práctica. S. M. Lewis, B. Bain, I. Bates. 10 a edición.
Churchill y Livingstone. 2008.