ANALISIS INSTRUMENTAL TALLER DE CROMATOGRAFIA

ANALISIS INSTRUMENTAL
TALLER DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA Y GASEOSA
1. Lea cuidadosamente el siguiente párrafo y a partir de este responda las preguntas que se
encuentran al final del texto en una tabla.
Las condiciones cromatográficas empleadas para realizar el análisis por el método de la USP 27,
2004, son las siguientes: un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a
254 nm, un dosificador de 100 μL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realiza
isocráticamente sobre una columna Lichrospher 100, RP-8, 250 x 4mm, (5 µm). La fase móvil
consiste en una mezcla filtrada y desgasificada de 3 componentes:agua
destilada:metanol:acetonitrilo (40:30:30), con una velocidad de flujo de 1,0 mL/min.1
TIPO DE COLUMNA
ESPECIFICACIONES DE LA
COLUMNA
FASE MOVIL
FLUJO
TIPO DE ELUCION: ISOCRATICO
O POR GRADIENTE
EQUIPO UTILIZADO
DETECTOR
2. Lea cuidadosamente el siguiente párrafo y a partir de este responda las preguntas que se
encuentran al final del texto.
En el desarrollo del método analítico alternativo, se emplea un cromatógrafo (KNAUER) con
detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 254 nm, un dosificador de 200 μL e integrador
(SHIMADZU CR 8 A). La separación se realiza isocráticamente sobre una columna Lichrospher
100, RP-18, 250 x 4mm, (5 µm). La fase móvil consiste en una mezcla desgasificada de solución
de fosfato de amonio anhidro dibásico a pH= 8,0:metanol:tetrahidrofurano (62:50:13) con una
velocidad de flujo de 1,5 mL/min. 1
TIPO DE COLUMNA
ESPECIFICACIONES DE LA
COLUMNA
FASE MOVIL
FLUJO
TIPO DE ELUCION: ISOCRATICO
O POR GRADIENTE
EQUIPO UTILIZADO
DETECTOR
3. Dé ejemplos de los solventes típicos y columnas usados en cromatografía líquida de fase inversa
(RP‐HPLC) y fase normal (NP‐HPLC)
4. ¿Cuáles son las ventajas de realizar una elución en gradiente en HPLC? Porqué realiza siempre
un gradiente de menor a mayor fuerza del eluyente y no a la inversa?
5. Diga qué modo de cromatografía usaría para separar los componentes de una mezcla en los
siguientes casos:
a) moléculas neutras de bajo peso molecular (< 2000) solubles en hexano
b) moléculas neutras de bajo peso molecular (< 2000) solubles en metanol
c) moléculas iónicas de bajo peso molecular (< 2000).
6. Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia?
7. Tipos de Cromatografía Líquida:
8. Diagrama Básico de un sistema de HPLC
9. Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC: al menos 3
10. Los detectores más utillizados en HPLC y en cromatografía gaseosa son:
11. Defina: Cromatografía de exclusión por tamaño, Factor Capacidad, Tiempo Muerto, Tiempo
de Retención, Selectividad, fase estacionaria, fase móvil, cromatograma, línea base, tiempo
muerto, volumen de elución, cromatografía quiral, tiempo de retención ajustado(corregido)
12. Que tipo de moléculas eluyen en último lugar en Cromatografía de exclusión por tamaño
13. Ventajas de la cromatografía gaseosa con relación a la cromatografía de alta eficiencia
14. Para separar una mezcla de proteínas se utiliza una columna que posee una fase estacionaria
de celulosa carboximetilada. El diámetro interno de la columna es de 0.75 cm y su longitud de
20 cm. El flujo de la fase móvil está regulado a 1 mL/min. Se trata de una fase aniónica o, por el
contrario, de tipo catiónico?
15. El solvente recorre una columna en 3.0 min pero el soluto requiere 9 minutos. Calcular el factor
de retención, k.
16. Determinar el porcentaje de ceftriaxona base en cada ampolla utilizando cromatografía liquida
de alta resolución. A continuación se describe la preparación de la muestra y el estándar.
El estándar utilizado es ceftriaxona base y se preparó de la siguiente manera: se pesan 21.2 mg
del 82.4  de pureza y se diluyen con fase móvil hasta completar un volumen de 100 mL.
Muestra: Se utilizan 5 viales y se llevan a un volumen de 250 mL con fase móvil y
posteriormente se realiza una dilución de 1 mililitro en 50 mL (cada vial tiene 500 mg de
ceftriaxona base).
Procedimiento se inyectan cantidades iguales de muestra y estándar por separado y por
triplicado. A continuación se presenta una tabla con los resultados obtenidos.
MUESTRA
ESTANDAR
AREA PROMEDIO
11149.5
9919.19653
Que consideraciones debe tener en cuenta para realizar el respectivo calculo y además exprese si
los resultados son confiables.
17. Determinar el porcentaje de glibenclamida en cada tableta utilizando cromatografía liquida de
alta resolución. A continuación se describe la preparación de la muestra y el estándar.
El estándar utilizado es glibenclamida y se preparó de la siguiente manera: se pesan 10.7 mg
del 99.2  de pureza y se diluyen con fase móvil hasta completar un volumen de 25 mL.
Muestra: Se utilizan 10 tabletas se disuelven con fase móvil y se llevan hasta completar un
volumen de 100 mL (cada tableta tiene 5 mg de glibenclamida).
Procedimiento se inyectan cantidades iguales de muestra y estándar por separado y por
triplicado. A continuación se presenta una tabla con los resultados obtenidos.
Que consideraciones debe tener en cuenta para realizar el respectivo calculo y además exprese si
los resultados son confiables.
MUESTRA
ESTANDAR
AREA PROMEDIO
1490716.64
1479028.25
18. En la determinación de polisacáridos (almidón), compuestos con un peso molecular muy
elevado, es necesario eliminar previamente restos de glucosa (C6H12O6) y sacarosa (C12H22O11).
Estos compuestos son hidrosolubles.
a)
¿Qué tipo de separación cromatográfica se debe realizar?
b)
¿Qué características tiene la fase estacionaria que se utiliza durante esta
separación?
19. Al laboratorio llegó una muestra de aceite esencial de eucalipto para la separación, identificación
y cuantificación de 6 tipos de monoterpenos, los cuales son compuestos orgánicos volátiles. En
el laboratorio disponemos de los siguientes equipos y reactivos. Seleccione los indicados para
este tipo de análisis.
 Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC)
 Cromatógrafo gaseoso
 Columna capilar de 50 m
 Columna de fase reversa (RP) Superspher 100 RP-18
 Gas portador, hidrógeno (fase móvil)
 Fase estacionaria líquida soportadas en un sólido inerte
 Termostato (Horno)
 Fase móvil polar, MeOH-agua (50:50)
 Columna de fase normal (NP) LiChrosorb Si 60
20. A un laboratorio de ensayos clínicos llegó una muestra de sangre que tenía las siguientes
hormonas: prednisolona, testosterona, metiltestosterona y progesterona. La muestra fue
procesada y se obtuvo una disolución que contenía a estas hormonas, las cuales son
compuestos orgánicos no polares.
Si usted dispone en el laboratorio de los siguientes equipos y reactivos químicos. Seleccione las
condiciones de trabajo necesarias para realizar la separación, identificación y cuantificación de
estas sustancias.








Cromatógrafo de Gas
Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC)
Columna de fase normal (NP) LiChrosorb Si 60
Columna de fase reversa (RP) Superspher 100 RP-18
Fase móvil polar, AcN-agua (50:50)
Fase móvil apolar, n-Heptano/Dioxano (98:2)
Columna capilar
Termostato (Horno)
21. Los siguientes datos corresponden a una columna para Cromatografía de líquidos. Longitud del
relleno =24,7 cm; Caudal =0,313 mL/min; Vm = 1,370 mL y Vs = 0,164 mL. El cromatograma de
una mezcla de compuestos A, B, C y D proporciona los siguientes datos:
Tiempo de retención (tR), min.
Anchura del pico en la base (W), min
No retenido
3,1
-
A
5,4
0,41
B
13,3
1,07
C
14,1
1,16
D
21,6
1,72
Calcule:
El factor de retención para cada compuesto
La resolución.para (By C) y (CyD)
El factor de selectividad,  para (By C) y (CyD)
FORMULAS
t’r = t r – t m
 = (t’r2 / t’r1) = (k2 /k1)
k = (t r - tm )/ tm = (Vr - Vm )/ Vm
Convenciones
Tiempo de retención ajustado = t’r
Tiempo muerto = tm
Tiempo de retención = tr
Retención relativa = 
Factor de retención ó de capacidad = k
Volumen muerto = Vm Volumen de retención = Vr