S2-BIO07 INMOVILIZACION DE LA LIPASA TERMOALCALINA

INMOVILIZACION DE LA LIPASA TERMOALCALINA PRODUCIDA POR
Bacillus thermoleovorans CCR11
M.G. Sánchez O.a, G.Valerio O.a, H.S.,García G.a, R.Oliart R.a
a
Unidad de Investigación y Desarrollo en Alimentos. Instituto Tecnológico de Veracruz,
Miguel A. de Quevedo 2779, Veracruz, 91897 Veracruz, México.
RESUMEN
Las enzimas producidas por organismos extremófilos ofrecen nuevas herramientas para la biocatálisis debido
a su resistencia a condiciones extremas de reacción. Entre ellas, las lipasas microbianas tienen importantes
aplicaciones biotecnológicas (producción de detergentes, síntesis enantioselectiva de fármacos y
saborizantes). La inmovilización de enzimas permite mejorar su desempeño al aumentar su termoestabilidad,
facilitar su separación y permitir su reutilización1.
En el laboratorio de Bioquímica se aisló a la bacteria Bacillus thermoleovorans CCR11, cuya lipasa fue
parcialmente purificada por ultrafiltración-diafiltración. Se determinaron las condiciones de inmovilización en
polipropileno poroso, encontrando mayor actividad retenida a 25°C con 36 mg proteína/g soporte y pH6 y un
aumento de la termoestabilidad con respecto a la enzima soluble.
1. INTRODUCCIÓN
1.1 EXTREMOFILOS
Actualmente se sabe que los ambientes extremos, aquellos que se consideraban demasiado hostiles para
permitir la sobrevivencia de organismos vivos, son el hábitat natural de ciertos microorganismos llamados
extremófilos; a las enzimas que producen se les llama extremoenzimas. Dentro de esta clasificación se
encuentran los termófilos (temperatura óptima de crecimiento por arriba de los 45ºC), localizados en lugares
tales como las fuentes de aguas termales; psicrófilos (temperatura óptima de crecimiento por abajo de los
10ºC), habitando en las regiones polares; acidófilos (pH óptimo de crecimiento por abajo de 5),que pueden
crecer en suelos ácidos; alcalófilos (pH óptimo de crecimiento por arriba de 8), que habitan en lechos
alcalinos; halófilos (habitan medios hipersalinos), como los son los lechos marinos en evaporación; osmófilos
(viven a altas presiones osmóticas), resistentes a la radiación, y tolerantes a metales pesados 2. Las bacterias
termófilas crecen y se reproducen a temperaturas por encima de los 45°C y algunos de ellos, conocidos como
hipertermófilos, tienen sus temperaturas óptimas de crecimiento por encima de los 80°C. Los extremófilos
son una fuente de enzimas, conocidas como extremoenzimas, cuya aplicación como biocatalizadores es
atractiva por su alta estabilidad y actividad en condiciones que anteriormente se consideraban incompatibles
con materiales biológicos 1.
1.2. ENZIMAS TERMOFILICAS
La temperatura afecta la estructura de las proteínas, a temperaturas por arriba de 50°C la mayoría de las
enzimas de los organismos mesófilos se inactivan por la pérdida de su estructura secundaria seguida de su
precipitación, generalmente irreversible, lo que no sucede con las enzimas termofilicas. Los procesos
biotecnológicos llevados a cabo a temperaturas más elevadas tienen muchas ventajas, el incremento de la
temperatura tiene una influencia significativa en la biodisponibilidad y solubilidad de los compuestos
orgánicos, en la viscosidad y en la difusión de los mismos, de tal forma que esperaríamos velocidades de
reacción más elevadas.Un ejemplo de aplicación de enzimas termofílicas es el uso de la DNA polimerasa
(Taq polimerasa) de Thermus aquaticus en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), esta enzima resiste
temperaturas por arriba de los 90°C utilizadas para llevar a cabo la reacción. De igual forma las enzimas que
se utilizan actualmente en los detergentes (proteasas, celulasas y lipasas) son termófilas y alcalófilas para
resistir las condiciones de lavado necesarias para le remoción de grasas, aceites y de manchas de la ropa 3.
1.3 LIPASAS
Las lipasas (E.C. 3.1.1.3) son enzimas que catalizan in vivo la hidrólisis de triacilglicéridos. In vitro las lipasas
pueden catalizar la hidrólisis o síntesis de una gran variedad de ésteres, y la resolución de mezclas racémicas
con una alta enantio- y regioselectividad. Sin embargo la baja estabilidad de muchas lipasas a altas
temperaturas y pHs extremos limita su aplicación a nivel industrial, ya que los procesos pueden requerir el
uso de temperaturas elevadas o la utilización de solventes para disolver los sustratos. Esta limitación se puede
resolver usando lipasas de microorganismos termofílicos. Actualmente la mayoría de las lipasas termofílicas
que han sido purificadas y caracterizadas han sido obtenidas de especies del género Bacillus. Aún así el
desempeño de una enzima en una reacción dada no es suficiente para su aplicación en procesos industriales.
Las lipasas solubles (y todas las enzimas) presentan ciertos problemas para su utilización: tienen baja
estabilidad, su separación es difícil y su reutilización es muy limitada. Existen estrategias para mejorar el
desempeño de las lipasas entre las que se encuentra la inmovilización 4.
1.4 INMOVILIZACIÓN
La inmovilización de una enzima es un proceso en el que se confina o localiza en un soporte para dar lugar a
formas insolubles que retienen su actividad catalítica y pueden ser reutilizadas repetidamente, con la ventaja
de facilitar su separación, aumentar su estabilidad y la posibilidad de reutilizarla. También existen
inconvenientes en el proceso de inmovilización: la conformación de la enzima puede resultar alterada, el
sistema enzima-soporte puede contener fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de
uniones al soporte, y puede haber pérdida de la actividad durante el proceso. Los métodos de inmovilización
se pueden dividir en dos grandes grupos: atrapamiento y unión a superficie, este último incluye los métodos
por unión covalente, entrecruzamiento y adsorción 5. En la literatura existen trabajos de inmovilización de
lipasas termófilas y mesófilas por medio de la adsorción, en los que se reportan altos porcentajes de actividad
residual con respecto a la enzima soluble y un aumento en la termoestabilidad 6.
En el Instituto Tecnológico de Veracruz se purificó y caracterizó la lipasa producida por la bacteria termófila
Bacillus thermoleovorans CCR11, que fue aislada de las aguas termales “El Carrizal”, Veracruz. Esta bacteria
produce una lipasa termoalcalófila, ya que su temperatura óptima es 60ºC, y su pH óptimo es 9. Tiene un peso
molecular de 11 kDa, por lo que es la lipasa de menor peso molecular reportada en la literatura. Presenta
estabilidad al pH y la temperatura, y además es resistente a la presencia de solventes orgánicos, detergentes, y
algunos iones metálicos. Por lo tanto, esta lipasa resulta muy atractiva para su aplicación en procesos
industriales, y en biocatálisis en disolventes orgánicos. El objetivo del presente trabajo es establecer las
condiciones para la inmovilización por adsorción de la lipasa parcialmente purificada de Bacillus
thermoleovorans CCR11 y analizar su efecto sobre la termoestabilidad.
2. MATERIALES Y METODOS
2.1 PURIFICACION
Se cultivó Bacillus thermoleovorans CCR11 en medio de producción de lipasas utilizando 2.5% de aceite de
cártamo alto oleico como fuente de carbono. Una vez separado el paquete celular se procedió a filtrar con una
membrana de 0.45 m, a continuación se extrajeron los residuos liposolubles con hexano 1:1 y se realizó
ultrafiltración utilizando una membrana de polietersulfona con un corte de peso molecular de 500 KDa, en un
equipo Amicon. Enseguida se diafiltró lavando con dos volúmenes de buffer 0.05M de fosfatos. Se determinó
en cada caso la concentración de proteína por el método de Lowry y la actividad lipolítica usando p-nitrofenil-laurato como sustrato (30 min., pH6.5, 60°C) 7,8.
2
2.2 INMOVILIZACION
2.2.1. ISOTERMAS DE ADSORCION
Se prepararon soluciones de lipasa de concentraciones comprendidas en el intervalo de 6-60 mg de
proteína/ml, y se agregó polipropileno poroso (Accurel EP-20, Akzo Chemical) previamente tratado con una
mezcla etanol-agua 1:3; se sometió a agitación a 250 rpm durante el tiempo necesario para alcanzar el
equilibrio en la adsorción de proteína. El tiempo de agitación para lograrlo varió con respecto a la temperatura
y fue determinado en experimentos previos para cada temperatura, determinando proteínas y actividad
lipolítica del sobrenadante hasta que no hubiera cambios. Transcurrido el tiempo necesario para cada
temperatura el inmovilizado se analizó el sobrenadante para determinar proteínas y actividad y el
inmovilizado fue separado por filtración y lavado 4 veces con buffer de fosfatos 0.05 M. Al inmovilizado y al
sobrenadante se les determinó actividad lipolítica usando p-nitro-fenol-laurato como sustrato. Una vez
obtenida la concentración de proteína y la temperatura a la cual se encontró la saturación del soporte y la
máxima actividad lipolítica del inmovilizado, se procedió a realizar experimentos donde el pH del medio de
inmovilización varió en el intervalo 5-8. Se inmovilizó entonces la lipasa con las condiciones óptimas
obtenidas y se evaluó el efecto de la inmovilización sobre la termoestabilidad de la enzima.
3. RESULTADOS
En la figura 1 se muestran los resultados experimentales de la adsorción de proteína en el polipropileno a 25,
30, 40, 50, y 60°C
m g pr/m g pp
final
14
12
10
25 °C
8
30 °C
40°C
6
50°C
4
60 °C
2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
m g pr/m g pp inicial
Fig. 1 Isotermas de adsorción de proteína en polipropileno poroso
Las isotermas de adsorción obtenidas mostraron una mayor cantidad de proteína inmovilizada a 30 °C que a
25°C, 40°C, 50°C, 60°C, sin embargo los valores de actividad lipolítica del inmovilizado (U/g) fueron
mayores a 25°C. Esto coincide con lo reportado en la literatura por Malcata y col.(1992) 9, donde isotermas de
adsorción para la inmovilización de lipasa de Aspergillus níger en polipropileno en fibras reflejan que la
capacidad de adsorción de proteína del soporte disminuye al aumentar la temperatura, efecto que es notorio en
la actividad lipolítica adsorbida a menor temperatura, como se muestra en la figura 2 donde la actividad
lipolítica de los inmovilizados obtenidos a diferentes temperaturas es mayor conforme disminuye la
temperatura del proceso.
U/g pp final
40000
35000
30000
25 °C
25000
30°C
20000
40°C
15000
50°C
60°C
10000
5000
0
0
10
20
30
40
50
60
m g pr /g pp inicial
Fig. 2 Actividad (U/g soporte)
3
70
En la figura 3 se muestran los resultados experimentales de la adsorción de proteína en el soporte y la
actividad lipolítica del inmovilizado a diferentes pHs. Se encontró una mayor cantidad de proteína adsorbida
a pH 6.0 con respecto a los demás pHs, igualmente la actividad lipolítica en el inmovilizado preparado en
pH6.0 fue mayor que en las demás corridas experimentales, como se muestra en la figura 4.
m g/g pp final
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
4
5
6
7
8
9
pH en la inm ovilización
Fig. 3 Efecto del pH del medio de inmovilización en la cantidad de proteína adsorbida en el soporte (25°C,
250 rpm, 3 hrs)
U/g pp final
50000
40000
30000
20000
10000
0
4
5
6
7
8
9
pH en la inmovilizaciónr inicial
Fig.4 Efecto del pH del medio en la actividad lipolítica de los inmovilizados de lipasa.
Finalmente en la figura 5 se presentan los resultados de la evaluación de efecto de la inmovilización sobre la
termoestabilidad de la lipasa de Bacillus thermoleovorans CCR11. Se encontró un 93 % de actividad residual
en la enzima inmovilizada después de incubarla 1 hora a 70 °C a diferencia de la enzima soluble que solo
conservó el 48 % de la actividad inicial; de igual forma, a 80°C se conservó un 72% de actividad en la enzima
inmovilizada contra 13% de la enzima soluble y un 56% de actividad residual a 96°C contra la pérdida total
de la actividad lipolítica de la enzima soluble. Estos resultados coinciden con lo reportado por Dosanjh y
Kaur (2002)10, que inmovilizaron por adsorción lipasa de Bacillus sp. en diferentes soportes encontrando que
todos los inmovilizados un aumento de la termoestabilidad con respecto a la enzima soluble, aún a 70°C
donde todos los inmovilizados retuvieron 20% o más de actividad residual.
120
% Actividad
residual
100
80
Enz. Soluble
60
Enz. Inmovilizada
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Temperatura (°C)
Fig.5 Efecto de la inmovilización la sobre la termoestabilidad de lipasa de B. thermoleovorans CCR11.
(Lipasa incubada 1 hora a las diferentes temperaturas)
4
Por lo tanto se puede concluir que la inmovilización tuvo como efecto el incremento de la termoestabilidad de
la lipasa producida por Bacillus thermoleovorans CCR11, lo cual representa una ventaja para su aplicación
en procesos industriales.
BIBLIOGRAFÍA
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