Purificación de lipasas por interacción lipasa

PURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN DE LIPASAS
MEDIANTE SU ADSORCIÓN ESPECÍFICA
A LIPASAS INMOVILIZADAS
Ortiz, C.;Palomo, J.M .;Fernández–Lorente, G.; Fuentes, M.; Torres, R;
Guisán, J.M.;Fernández-Lafuente, R.
LABORATORIO DE BIOCATÁLISIS
INSTITUTO DE CATÁLISIS Y PETROLEOQUÍMICA-CSIC
Purificación de Enzimas
PURIFICACION DE ENZIMAS
E1
Reacción
R
a evitar
O
C
E2
Alta actividad volumétrica
N
H
R'
Reacción
deseada
R''
COO
E3
Reacción
a evitar
Reacciones indeseables
Oxidaciones…
Hidrólisis…
Purificación de Enzimas
PURIFICACION DE ENZIMAS A ESCALA LABORATORIO
UV280
Ve
9Adsorción de todas las enzimas (1mg de nuestra enzima/ml)
9Desorción selectiva de nuestra enzima
9Varios procesos cromatográficos…
9No importa tiempo ni dinero
Purificación de Enzimas
PURIFICACION INDUSTRIAL DE ENZIMAS
¾Métodos sencillos, rápidos y baratos
¾Pocos pasos cromatográficos
¾Columnas cromatograficas pequeñas
UV280
Ve
Adsorción selectiva ¨ 100 mg/ml columna
Conocer mucho mejor los mecanismos de interacción
Purificación de Lipasas
LIPASAS
Activación interfacial en presencia de interfases
Cara externa del Lid
Conformación cerrada
Conformación abierta
Interfase hidrofóbica
zona hidrofóbica
zona hidrofílica
Sitio activo
Cara interna del Lid
Conformación abierta
Lipasas
LIPASAS
Diferentes conformaciones de lipasas
Medios acuosos
Conformación cerrada
INACCESIBLE A SUSTRATOS
Interfases hidrofóbicas
Conformación abierta
ACCESIBLE A SUSTRATOS
Lipasas
LIPASAS
Las lipasas muestran actividad
esterásica en ausencia de interfases
zona hidrofóbica
zona hidrofílica
HIPÓTESIS: Equilibrio entre las distintas conformaciones
de lipasas en medios acuosos homogéneos
Purificación de Lipasas
LIPASAS
Adsorción interfacial sobre soportes a baja fuerza iónica
Soporte Hidrofóbico
Conformación cerrada
Conformación abierta
Pequeños bolsillo hidrofóbicos…
Solo se absorben a ÇFuerza Iónica
Purificación de Lipasas
Actividad Residual (%)
PURIFICACION DE LIPASAS POR ADSORCION SELECTIVA,
A BAJA FUERZA IONICA, SOBRE A SOPORTES HIDROFOBICOS
2000
1500
HLL
1000
500
0
0
30
60
Tiempo (minutos)
90
Actividad Residual (%)
Actividad Residual (%)
800
600
PFL
400
200
0
0
20
40
Tiempo (minutos)
60
800
600
RNL
400
200
0
0
30
60
Tiempo (minutos)
90
Purificación de Lipasas
Mecanismo de activación interfacial y
Purificación de lipasas
™ Las lipasas se adsorben específicamente a superficies
hidrofóbicas (a baja fuerza iónica)
™ Cada lipasa se adsorbe de una forma diferente a
soportes hidrofóbicos diferentes
™ Aumento de actividad hacia sustratos solubles pequeños y
alteración de su enantioselectividad
™ Purificación de lipasas de otras proteínas
(Adsorción selectiva sobre matrices hidrofóbicas)
™ Purificación de lipasas entre sí
(Desorción selectiva con detergentes o co-disolventes)
Lipasas
LIPASAS
Las lipasas muestran actividad
esterásica en ausencia de interfases
zona hidrofóbica
zona hidrofílica
HIPÓTESIS: Equilibrio entre las distintas conformaciones
de lipasas en medios acuosos homogéneos
Purificación de Lipasas
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
Lipasa1 Inmovilizada
Dimero Lipasa
Inmovilizada- Lipasa
Lipasa2 Soluble
Desarrollo del Soporte
NH2
LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS
Y SOPORTES GLIOXIL
NH2
H2N
H2N
H2N
pH 8.0 (NO)
H2N
pH 10.0 (NO)
NH2
H2N
Regiones muy ricas
en grupos aminos
H2N
H2N
H2N
pH 10.0 (SI)
Desarrollo del Soporte
PUNTO FINAL DE LA MULTI-INTERACCION ENZIMA-SOPORTE
O
O CH2
C
O CH 2
CH 2OH
O CH 2
CH 2
NH
O CH 2
CH 2
NH
O CH 2
CH 2
NH
O CH 2
CH 2OH
H
O CH2
CH
N
O CH2
CH
N
NaBH4
1mg/ml
O CH2
N
CH
O
O CH2
C
H
Metodología Experimental
Selección de la enzima adsorbente
CARA FRONTAL
CARA OPUESTA
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LIPASA DE Pseudomonas fluorescens (PFL)
™lipasa estable y capaz de formar dímeros
™lipasa con las lisinas en la cara opuesta a su centro activo
Metodología Experimental
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
H2N
O
O
H2N
O
H
H2N
H
H
Glioxil-agarosa
Tritón X-100
(pH 10, NaBH4)
Lipasa 1 estabilizada
Soporte inerte
Lavado con
agua
Lipasa-Soluble
Glioxil-Agarosa-lipasa 1-Lipasa 2
Glioxil-Agarosa-lipasa 1
(Soporte)
Resultados
100
A ctividad Residual (%)
Actividad Residual (%)
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
80
60
40
20
0
0
6
12
18
Tiempo (h)
24
94
67
100
80
43
60
30
40
20
20.1
0
0
1
2
3
Tiempo (h)
4
1
Inmovilización de PFL
sobre glioxil-agarosa
Blanco
Sobrenadante
Suspensión
Adsorción de PFL
sobre glioxil-agarosa-PFL
Blanco
Sobrenadante
2
3
SDS-PAGE
de PFL purificada
Línea 1. Marcadores de peso molecular
Línea 2. Extracto comercial de PFL
Línea 3. PFL adsorbida sobre
glioxil agarosaagarosa-PFL
Resultados
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
B
Actividad Residual (%)
A
Mr (kDa)
100
75
94
50
67
25
43
0
0
20
40
60
30
Tiempo (min)
20.1
Adsorción de BTL
sobre glioxil-agarosa-PFL
Blanco
Sobrenadante
1
Línea
Línea
Línea
1.
2.
3.
2
3
Marcadores de peso molecular
Extracto comercial BTL
Fracción BTL adsorbida a glioxil agarosa PFL
Adsorción del extracto enzimático de Bacillus thermocatenulatus (BTL)
Resultados
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
Mr (kDa)
94
67
Línea
Línea
Línea
Línea
Línea
Línea
Línea
43
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Marcadores de peso molecular
Extracto comercial RML
Fracción RML adsorbida a glioxil agarosa PFL
Extracto comercial HLL
Fracción HLL adsorbida a glioxil agarosa PFL
Extracto comercial ROL
Fracción ROL adsorbida a glioxil agarosa PFL
30
20.1
1
2
3
4
5
6
7
Lipasas purificadas a partir de los extractos comerciales de
•Rhizomucor miehei (RML)
•Humicola lanuginosa (HLL)
•Rhizopus oryzae (ROL)
Resultados
Desarrollo de Biocatalizador de lipasa 2 Inmovilizada sobre
Soporte glioxil-agarosa-lipasa1
Ser
(D-pNP)
Glioxil-Agarosa-lipasa 1
Lipasa 2
Glioxil-Agarosa- Lipasa 1-Lipasa 2
Modulación de las propiedades funcionales de lipasas
mediante interacción lipasa-lipasa
Resultados
Modulación de las propiedades funcionales de lipasas
mediante interacción lipasa-lipasa
Derivado
PFL
Actividad
Específica
(U/g)
Conversión
(%)
ee
E
Octil-agarosa-PFL
23
14.6
97
76 S
Glioxil-agarosa-PFL
0.019
15
81
9.6 S
Glioxil-agarosa-PFL*-PFL
0.077
9.4
99
>100 S
Hidrólisis enantioselectiva del (R,S) HPBEt 10 mM
con derivados de PFL, a pH 5 y 25 ºC
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
La lipasa de Pseudomonas fluorescens inmovilizada covalentemente
sobre soportes glioxil-agarosa resultó ser un excelente soporte
hidrofóbico para la adsorción selectiva de otras lipasas.
Es
posible
obtener
dímeros
glioxil-agarosa-PFL-Lipasa,
pudiéndose utilizar este método como estrategia de purificación e
inmovilización de diferentes extractos crudos de lipasas.
Diferentes derivados de una misma lipasa presentaron distintas
propiedades catalíticas (Actividad y Enantioselectividad) en las
mismas condiciones de reacción.
MUCHAS GRACIAS