DRAWID V0.26 Facilite su cariotipado Manual Kirov Ilya, Doctor Universidad Agraria Estatal Rusa - Academia Agrícola Timiryazev de Moscú | Timiryazevskay str., 49, 127550, Moscú, Federación Rusa 2017 Contribución de: Universidad Agraria Estatal Rusa - Academia Agrícola Timiryazev de Moscú Departamento de Genética, Biotecnología y Mejora Genética, Centro de Biotecnología Molecular Timiryazevskaya str. 49, 127550, Moscú, Rusia Instituto de Investigación Agrícola y Pesquera, Departamento de Genética Aplicada y Mejora Genética, Caritastraat 39, 9090, Melle, Bélgica Instituto Shemyakin-Ovchinnikov de Química Bioorgánica, Academia Rusa de Ciencias, Laboratorio de proteómica, Miklukho-Maklaya, 16/10,117997, Moscú, Federación Rusa Contenido Introducción....................................................................................................................................................3 Procedimiento general de aplicación de DRAWID ...................................................................................5 1. Cargar archivo de imagen jpeg .......................................................................................................5 2. Inicio de las mediciones cromosómicas .........................................................................................5 4. Recuperación de datos ....................................................................................................................6 5. Guardar imagen Idiograma.............................................................................................................6 Ajustes y funciones del idiograma .............................................................................................................7 Preguntas frecuentes........................................................................................................................................8 a. Cómo dibujar Idiograma a partir de tabla DRAWID xlsx previamente guardada.........................8 b. Cómo cambiar el orden de los cromosomas...................................................................................8 c. Cómo modificar el tamaño, la distancia y la anchura de los cromosomas .....................................8 Informes de errores.........................................................................................................................................8 Ejemplos.........................................................................................................................................................9 Construcción convencional de idiogramas................................................................................................9 Construcción del Idiograma Medio .........................................................................................................12 Construir 1n Idiograma ...........................................................................................................................13 Idiograma con señales FISH ....................................................................................................................15 Señales punteadas ..............................................................................................................................15 Señales en banda ................................................................................................................................16 Introducción El número de cromosomas y su morfología son una importante fuente de información para los estudios citogenéticos y filogenéticos comparativos. Las discrepancias en la morfología cromosómica entre individuos suelen ser el resultado de reordenamientos inter e intracromosómicos, que son una fuerza importante de la evolución y la especiación. El conocimiento de los reordenamientos cromosómicos y de los parámetros cromosómicos básicos (por ejemplo, índice de centrómero, relación de brazos, longitud relativa) puede ser útil para la integración de mapas físicos y genéticos, el estudio de la especiación y la evolución y el rastreo de rasgos deseables durante el proceso de fitomejoramiento. El número de cromosomas y la morfología suelen representarse esquemáticamente como un Idiograma. Un idiograma es una forma informativa de representar la longitud cromosómica, el índice de centrómero y la proporción de brazos cromosómicos, proporcionando información general sobre la estructura del cariotipo. Normalmente, para construir un Idiograma se miden un par de metafases y se utilizan los valores medios de longitud cromosómica e índice de centrómero. Para determinar el orden correcto de los cromosomas y los pares homólogos, a menudo se necesitan marcadores cromosómicos adicionales, como patrones de bandas y señales FISH. Las especies de plantas modelo como Arabidopsis, trigo y maíz suelen tener cariotipos e idiogramas estandarizados que facilitan los estudios citogenéticos de sus genomas. Sin embargo, la mayoría de las especies vegetales aún carecen de esta información y se necesitan mediciones cromosómicas para construir un cariotipo estandarizado. Además, los estudios ecológicos de la variabilidad del genoma basados en la citología requieren mediciones de cromosomas de un gran número de individuos. Para acelerar los estudios cariotípicos en plantas se han publicado pocos programas de software para mediciones cromosómicas, entre ellos MicroMeasure (Reeves, 2001), IdeoKar (Mirzaghaderi y Marzangi, 2015) y KaryoType (Altınordu et al., 2016). Sin embargo, no existen programas de libre acceso, fáciles de usar y multiplataforma para la medición simultánea de parámetros cromosómicos, posiciones de puntos de referencia cromosómicos (por ejemplo, bandas, señales FISH) y construcción de Idiogramas. Aquí presentamos el programa DRAWID (DRAWing Idiogram) para el análisis del cariotipo y la construcción del Idiograma. DRAWID es un software basado en java, fácil de usar y disponible gratuitamente (bajo licencia GNU General Public License), que facilita el análisis del cariotipo básico así como el basado en FISH. DRAWID está equipado con una interfaz gráfica de usuario intuitiva y bien diseñada. Toma un archivo de imagen o una tabla de datos generada por DRAWID como archivos de entrada y genera una tabla de Microsoft XL (2010), que contiene detalles de medición (índice de centrómero, relación de brazos, longitud relativa y absoluta de cromosoma y brazos cromosómicos, posiciones y tamaño de señal y banda si están disponibles), e Idiograma. El Idiograma puede ajustarse fácilmente para preparar una imagen de alta calidad adecuada para la publicación en revistas. Además, para facilitar el cariotipado de alto rendimiento el programa permite recoger datos de números de metafases, almacenarlos y utilizarlos para la construcción del Idiograma promedio decorado con barras de desviación estándar. DRAWID acelera el proceso de medición de cromosomas y simplifica la construcción de Idiogramas listos para su publicación. La versión actual de DRAWID es v0.2 y puede descargarse de la página web de la Universidad Estatal Agraria de Rusia-MTAA (Departamento de genética, biotecnología y fitomejoramiento): http://plantgen.com/DRAWID/. Procedimiento general de aplicación de DRAWID 1. Cargar archivo de imagen jpeg - mediante botón Aparecerá una nueva ventana para las mediciones cromosómicas. 2. Inicie las mediciones cromosómicas haciendo clic a lo largo de la longitud del cromosoma y eligiendo puntos de referencia cromosómicos si es necesario (por ejemplo, gen, centrómero, banda). Hay varias opciones disponibles (Tabla 1). Tabla 1. Botones de la ventana de medición y sus funciones Botones de la ventana de medición y sus funciones Botón Tecla de Explicación acceso rápido F Finalizar la medición del cromosoma actual - Dibujar Idiograma - Eliminar una de las medidas cromosómicas - Unir cromosoma roto. Nota. En primer lugar, una parte poseer centrómero debe medirse seguida de la segunda parte sin centrómero. Marcar la posición como centrómero C - Medición de bandas. Un primer clic en el botón inicia una medición de banda, mientras que un segundo clic indica el final de la banda. Después del segundo clic, el nombre de se anuncia la banda. Marcar como característica puntual (por ejemplo, gen único señal). Se pregunta el nombre de la función. Deshacer - Eliminar todas las medidas - Utilice el último segmento medido como barra. Permitirá escalar la longitud de los cromosomas medidos según la longitud de la barra. Mediciones por satélite. El primer clic en el botón inicia una medición por satélite, mientras que el segundo clic indica el final de la medición. B D - S 3. Haga clic en para dibujar el Idiograma 4. Recuperación de datos. Para obtener los datos haga clic en Datos -> Mostrar tabla de cromosomas (metadatos) -> Guardar como xslx -> elija carpeta y nombre. Se guardará el archivo de Microsoft XL con dos páginas a la vista: 1 Cromosoma, 2- Metadatos 5. Guardar imagen de Idiograma. Para guardar la imagen Idiograma, haga clic en Archivo -> Guardar figura Ajustes y funciones del idiograma Cuando el Idiograma se ha construido y es visible en la ventana principal, pueden aplicarse diferentes configuraciones para ajustar los parámetros del Idiograma (Tabla 2). El color y el nombre de un cromosoma individual pueden cambiarse seleccionando el cromosoma y pulsando el botón derecho del ratón. Tabla 2. Botones de la ventana principal y sus funciones Botones de la ventana principal y sus funciones Botón Explicación Cambiar el color de todos los cromosomas Cambiar el color del centrómero para todos los cromosomas Cargar imagen para mediciones Cambiar los nombres de los cromosomas por los números ordenados según el orden actual de los cromosomas Añadir el Idiograma actual a la base de datos Dibujar el Idiograma medio a partir del conjunto de Idiogramas almacenados en la base de datos. La función tomará los cromosomas con el mismo número (cromosomas homólogos) y hallar la media y la DE. A continuación, se dibujará un nuevo gráfico. Mostrar leyenda cromosómica (si algún gen o bandas fueron medido) Construye 1n Idiograma. Fusionará vecino cromosomas según el nivel de ploidía (por 2, 3, 4 ..) en uno y extraer la media y la DE para cada brazo y el índice de centrómero. Cambiar a otro Idiograma de la base de datos Mostrar todos los Idiogramas almacenados en la base de datos Leyenda (si se midieron genes o bandas) Preguntas frecuentes a. Cómo dibujar Idiograma a partir de tabla xlsx previamente guardada por DRAWID. Las tablas de datos generadas por DRAWID pueden utilizarse como archivo de entrada para volver a dibujar el Idiograma. Para haga clic y seleccione archivo. b. Cómo cambiar el orden de los cromosomas. Para cambiar el orden de los cromosomas, seleccione un cromosoma haciendo clic con el botón izquierdo y utilice las flechas izquierda y derecha del teclado para mover el cromosoma. c. Cómo cambiar el tamaño, la distancia y la anchura de los cromosomas. Esto sólo es posible si no se han medido señales. Seleccione Ajustes -> Parámetros del cromosoma Informes de errores. Envíe sus propuestas, comentarios e informes de errores a Kirov Ilya ([email protected]) Ejemplos Construcción convencional de idiogramas 1. Medición de los cromosomas (figura 1): Figura 1. Medición de la placa metafásica de Allium fistulosum mediante DRAWID. Para cada cromosoma, se repiten las siguientes acciones: a. Inicie la medición haciendo clic al principio de un cromosoma; b. Haga clic en el centrómero y pulse el botón C o . c. Finalice la medición haciendo clic en el extremo de un cromosoma; 2. Mida la barra (figura 2): Figura 2. Medición de barras a. Selecciona la barra pulsando al principio y al final b. Pulse c. Escriba la longitud real de la barra en la ventana abierta y pulse OK: 3. Haga clic en para obtener la imagen del Idiograma (Figura 3). Figura 3. Idiograma "bruto" tras la medición 4. Configuración del idiograma: a. Cambie el orden de los cromosomas si es necesario. Nota. El DRAWID ordena los cromosomas únicamente en función de su longitud y no tiene en cuenta el índice del centrómero. b. Pulse el botón para renombrar los cromosomas según su orden. c. Desplácese hacia abajo por todos los cromosomas eligiendo uno de ellos y pulsando el botón hacia abajo. d. Los colores del cromosoma y del centrómero pueden cambiarse utilizando y respectivamente. En este ejemplo, los colores del cromosoma y del centrómero se han cambiado a azul y gris, respectivamente. e. El color, el nombre y el color del centrómero de un cromosoma individual pueden cambiarse seleccionando el cromosoma, haciendo clic con el botón derecho y eligiendo el botón correspondiente (por ejemplo, "Cambiar el nombre del cromosoma"): f. Guardar figura: Archivo -> Guardar figura Imagen final del idiograma tras el recorte (Figura 4): Figura 4. Idiograma final Idiograma final Construcción del Idiograma Medio Para un Idiograma utilizando datos de varias metafases se utiliza el botón . Inicialmente este botón está inactivo porque es necesario añadir > 1 Idiograma a la base de datos. Siga estos pasos para cada placa metafásica: 1. Mida placas metafásicas individuales y construya el Idiograma como se muestra en la sección anterior. 2. Añada Idiograma a la base de datos haciendo clic en y escriba el nombre del gráfico Idiograma: vez añadidos todos los Idiogramas a la base de datos, pulse yelija los gráficos que desee incluir en el cálculo. Por último, obtendrá un Idiograma "medio" (Figura 5). Figura 5. Idiograma medio tras fusionar tres idiogramas. Las barras son la DE para el brazo corto, el brazo largo y el índice del centrómero. Construir 1n Idiograma Cuando se necesita construir 1n Idiograma se utiliza después de haber construido un Idiograma como se muestra en el Ejemplo 1. 1. Construye un Idiograma como se muestra en el Ejemplo 1; 2. Haga clic en 3. Tipo Nivel de ploidía Tras estos pasos aparecerá un nuevo Idiograma (Figura 6). Figura 6. Idiograma 1n de Allium fistulosum. Si las barras SD no son necesarias, puede eliminarlas desmarcando la casilla de verificación en Configuración -> Gráficos de estadísticas Figura 7. Idiograma 1n de Allium fistulosum sin barras SD. Idiograma con señales FISH Señales punteadas Hay algunas teclas de acceso rápido y botones diseñados para mostrar las posiciones de las señales/bandas/regiones NOR en los cromosomas. El ejemplo de abajo muestra medidas de los cromosomas teñidos por DAPI después de FISH con 5S rDNA (señales rojas). Los cromosomas sin señales se miden como se explica en el ejemplo 1. Los cromosomas que poseen señales FISH se miden de la misma manera, pero FISH Las señales se seleccionan haciendo clic en la señal y pulsando el botón D o . A continuación, se escribe el nombre de la señal (Figura 8). Figura 8. Medición del cromosoma con señal FISH. Señales en forma de banda Tanto las bandas como las regiones NOR tienen coordenadas iniciales y finales. Ambas son necesarias para medir correctamente las posiciones. Para ello es necesario hacer clic en el inicio de la banda (o región NOR) y pulse el botón(o Sencaso de NOR) o entonces se le pedirá que escriba el nombre de la banda (no para elbotón S) y después puede continuar con las mediciones de la banda y cuando termine pulse B (o S en caso de NOR) de nuevo (Figura 9). Figura 9. Medición del cromosoma con NOR. Señal y color de la banda, así como los nombres se pueden cambiar después de Idiograma fue construido.Utilice elbotón para abrir el menú de señales en el que puede realizar estos cambios. Las columnas izquierda y derecha se utilizan para cambiar el nombre y el color, respectivamente (Figura 10). Figura 10. Idiograma con señales FISH y posiciones NOR Idiograma con señales FISH y posiciones NOR Se muestra el menú para la corrección de la señal. En la versión actual de DRAWID, la leyenda no se añade al gráfico principal, sino que puede guardarse como un archivo independiente y luego fusionarse con otro programa (Photoshop, Power Punto, etc.) con el gráfico Idiograma. Para abrir la leyenda Idiograma pulse .
