Laboratorio N°4: Detección de actividad enzimática por método discontinuo. Camila Rojas, Armando Norambuena Qui-132 Pontificia Universidad Católica Valparaíso Valparaíso, Chile, 14 de mayo de 2021. 1.0.- OBJETIVOS. 1.1.- OBJETIVO GENERAL. Determinar la actividad de la enzima –glucosidasa por método discontinuo. 1.2.- OBJETIVOS ESPECIFICOS. - Evaluar la actividad enzimática en función de la concentración final de producto obtenido al cabo de un tiempo determinado, en distintas condiciones de Temperatura. - Evaluar la actividad enzimática en función de la concentración final de producto obtenido al cabo de un tiempo determinado, en distintas condiciones de PH. 2.0.- DISEÑO EXPERIMENTAL. 2.1.- EQUIPO Y MATERIALES. - Baño termostatizado / termómetro Espectrofotómetro Cubetas de plástico Gradillas Micropipetas (p-1000) Puntas azules 1 pipeta graduada de 2 mL 1 cronómetro 1 pizeta 7 tubos de ensayo Eppendorf 2 mL 2.2.- REACTIVOS. Para distintas Temperaturas - 0,9 mL de pnitrofenil-D-glucopiranósido ( pNPG) 2,0 mM pH 5,0 - 0,1 mL glucosidasa - 2 mL Na2CO3 0,1 M Para distintos pH - 0,9 mL de pNPG 2,0 mM - 0,9 mL de pNPG 2,0 mM - 0,9 mL de pNPG 2,0 mM - 0,9 mL de pNPG 2,0 mM - 0,1 mL glucosidasa. - 2 mL Na2CO3 0,1 M pH 4,0 pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0 3.0.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. 3.1.- Obtención del coeficiente de extinción milimolar del p-nitrofenolato (pNF). De acuerdo a la tabla 1: Prepare 7 tubos rotulados. Agregue el volumen indicado de la solución de p-nitrofenol (0,2 mM) a los tubos 2S al 7S. Complete el volumen a 1,0 mL a cada tubo (1B, al 7S) agregando tampón fosfato pH 5,0. Agregue a cada tubo 2,0 mL de Na2CO3 1,0 M. Homogenice la solución. Mida la Absorbancia de los tubos 2S al 7S ocupando el blanco (1B) para calibrar el equipo y anótela en la tabla. Calcule y anote en la tabla la concentración de pNF. De acuerdo a los datos de Tabla 1, construya el gráfico Absorbancia versus [pNF]. Determine la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de regresión. Calcule el coeficiente de extinción milimolar. TUBO 1B 2S 3S 4S 5S 6S 7S Volumen pNF [0,2mM] (mL) -----0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Volumen Tampón fosfato (mL) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Volumen Na2CO3 (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Concentración Final pNF (mM) Abs405 nm (U.A) Tabla 1: Datos preparación experimental para obtención del coeficiente de extinción. 3.2.- Efecto de la temperatura en la velocidad de la reacción enzimática. Prepare 4 tubos rotulados (1RTº,2RTº,3RTº,4RTº). Agregue 0,9 mL de pNPG 2,0 mM pH 5,0 Preincube los tubos a una temperatura indicada en Tabla 2 por 3,0 minutos. Inicie la reacción agregando 0,1 mL de la enzima, inmediatamente homogenice y coloque en baño termorregulado a la temperatura correspondiente por 5,0 minutos exactos. Detenga la reacción sacando los tubos del baño, colocándolos en un baño frío (agua / hielo) y agregando 2,0 mL de Na2CO3 0,1 M, que además disocia el p- nitrofenol a p-nitrofenolato. Homogenice la solución. Repita la operación a las restantes temperaturas. Prepare los blancos a cada temperatura. Prepare los controles a cada temperatura. Lea a 405 nm la Absorbancia de los ensayos enzimáticos y de sus respectivos controles. Ocupe el blanco para calibrar el espectrofotómetro. Calcule la velocidad de la reacción de acuerdo a la Absorbancia obtenida utilizando la ecuación 4. Realizar gráfico de Actividad Catalítica, indicar temperatura óptima. Preparación Blanco. Preparar las soluciones blanco según la Tabla 2, a las temperaturas del ensayo (Tabla 3), preincubar el pNPG a cada temperatura por 3 minutos antes de agregar enzima y, luego de agregada la enzima, inmediatamente adicionar la solución stock Na2CO3, 0,1M con un volumen de 2 mL, registrar la Absorbancia a 405 nm. Repetir tres veces. Volumen (mL) Ensayo Temperatura ℃ pNPG 2,0 mM pH 5,0 0,9 1 25 Enzima 0,1 2 37 3 60 Na2CO3 0,1 M 2,0 4 90 Reactivo TABLA 2: Preparación de los Blancos. TABLA 3: Temperatura ensayos. Preparación Control. Preparar las soluciones Control según la Tabla 4, a las temperaturas del ensayo (Tabla 3), preincubar el pNPG a la temperatura del ensayo por 3 minutos antes de agregar enzima, luego de agregada la enzima inactivada, adicionar la solución stock Na2CO3, 0,1M con un volumen de 2 mL, registrar la Absorbancia a 405 nm. Repetir tres veces. Reactivo Volumen (mL) pNPG 2,0 mM pH 5,0 0,9 Enzima 0,1 Na2CO3 0,1 M 2,0 TABLA 4: Preparación de los Controles. 3.3.- Efecto del pH en la velocidad de la reacción enzimática. De acuerdo a la tabla 6: Prepare una batería de tubos rotulados (1R pH a 4R pH) para los ensayos enzimáticos. Agregue 0,9 mL de pNPG 2,0 mM a un pH indicado. Preincube los tubos a la 37ºC por 3,0 minutos. Inicie la reacción agregando 0,1 mL de la enzima, inmediatamente homogenice y coloque en un baño termorregulado a 37ºC por 5,0 minutos exactos. Detenga la reacción sacando los tubos del baño y colocándolos en un baño frío (agua / hielo) y transforme el p-nitrofenol en p-nitrofenolato con 2,0 mL de Na2CO3 0,1 M. Homogenice la solución. Repita la operación a los restantes pH. Prepare el blanco correspondiente a cada valor de pH (1B pH a 4B pH). Prepare los controles a cada valor de pH (1C pH a 4C pH). Lea a 405 nm la Absorbancia de los ensayos enzimáticos y de sus respectivos controles ocupando el blanco para calibrar el espectrofotómetro. Calcule la velocidad de las reacciones de acuerdo a los resultados y a la ecuación 4. Realizar gráfico de Actividad Catalítica, indicar pH óptimo. Preparación Blanco. Preparar las soluciones blanco según la Tabla 5, a los pH del ensayo (Tabla 6), preincubar el pNPG a una temperatura de 37℃ por 3 minutos antes de agregar enzima ,luego de agregada la enzima, inmediatamente adicionar la solución stock Na2CO3, 0,1M con un volumen de 2 mL, registrar la Absorbancia a 405 nm. Repetir tres veces. Volumen (mL) Ensayo pH pNPG 2,0 mM pH 5,0 0,9 1 4 Enzima 0,1 2 5 3 6 Na2CO3 0,1 M 2,0 4 7 Reactivo TABLA 5: Preparación de los Blancos. TABLA 6: pH ensayos. Preparación Control. Preparar las soluciones Control según la Tabla 7, a los pH del ensayo (Tabla 6), preincubar el pNPG a una temperatura de 37℃ por 3 minutos antes de agregar enzima, luego de agregada la enzima inactivada adicionar la solución stock Na2CO3, 0,1M con un volumen de 2 mL, registrar la Absorbancia a 405 nm. Repetir tres veces. Reactivo pNPG 2,0 mM pH 5,0 Volumen (mL) 0,9 Enzima 0,1 Na2CO3 0,1 M 2,0 TABLA 7: Preparación de los Controles. 4.- METODOLOGÍA DE CÁLCULOS Y RESULTADOS. 4.1.- Curva de calibrado pNF. Para los cálculos y gráfico se utiliza la Tabla 8 completada con los valores de la Absorbancia obtenidas experimentalmente. TUBO 1B 2S 3S 4S 5S 6S 7S Volumen pNF [0,2mM] (mL) -----0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Volumen Tampón fosfato (mL) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Volumen Na2CO3 (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Abs405 nm (U.A) 0,001 0,203 0,274 0,407 0,522 0,635 0,790 Tabla 8: Datos experimentales finales para curva de calibrado 4.1.1- Cálculo de la concentración final de pNF. Para calcular la concentración final de pNF en los tubos 2S a 7S se debe calcular, en primer lugar, el volumen final del tubo, mediante la ecuación 2. 𝑉𝑓 = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑝𝑁𝐹 0,2𝑚𝑀 𝑚𝐿 + 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑇𝑎𝑚𝑝ó𝑛 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜 𝑚𝐿 + 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑁𝑎2𝐶𝑂3 𝑚𝐿 Ecuación 1. Para el tubo 2S: 𝑉𝑓 = 0,1 𝑚𝐿 + 0,9 𝑚𝐿 + 2,0 𝑚𝐿 𝑽𝒇 = 𝟑(𝒎𝑳) Se realiza el mismo procedimiento para los tubos 3S a 7S, obteniéndose los resultados de la Tabla 9. TUBO 2S 3S 4S 5S 6S 7S Volumen pNF [0,2mM] (mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 TABLA 9: Volumen final en los tubos. Volumen Tampón fosfato (mL) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Volumen Na2CO3 (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Volumen Final pNF (mL) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Luego, se calcula la concentración final de pNF para la curva de calibrado usando la fórmula del estándar, ecuación 2: 𝑪𝒇= 𝑪𝒊 ∗𝑽𝒊 Ecuación 2. 𝑽𝒇 Donde: Cf es la concentración final de pNF desconocida en cada tubo. (mM) Ci es la concentración inicial de pNF en cada tubo. Vi es el volumen inicial en cada tubo. (mL). Vf es el volumen final que existe en cada tubo según Tabla 5. = 3,0 (mL) Cálculo Concentración final de pNF para el tubo 2S. Ci = 0,2 (mM) ; Vi = 0,1 (mL) ; Vf = 3,0 (mL) Utilizando la ecuación 2, se tiene: 𝐶𝑓 = 0,2 𝑚𝑀 ∗ 0,1 𝑚𝐿 3,0 𝑚𝐿 𝑪𝒇 = 𝟎, 𝟎𝟎𝟔𝟕 (𝒎𝑴) Se repite el mismo procedimiento para los tubos restantes, obteniendo los resultados en la tabla 10. TUBO 2S 3S 4S 5S 6S 7S Concentración Volumen inicial Volumen final (mL) inicial pNF (mM) (mL) 0,2 0,1 3,0 0,2 0,2 3,0 0,2 0,3 3,0 0,2 0,4 3,0 0,2 0,5 3,0 0,2 0,6 3,0 Tabla 10: Concentración final de pNF en cada tubo. Concentración Final pNF (mL) 0,0067 0,0133 0,0200 0,0267 0,0333 0,0400 4.1.2.- GRÁFICA, ECUACIÓN DE LA RECTA, COEFICIENTE DE EXTINCIÓN, INTERCEPTO, ÍNDICE DE CORRELACIÓN. Abs405 nm (U.A) 0,203 0,274 0,407 0,522 0,635 0,790 TUBO 2S 3S 4S 5S 6S 7S Concentración Final pNF (mL) 0,0067 0,0133 0,0200 0,0267 0,0333 0,0400 Tabla 11: Concentración final de pNF y Absorbancia por tubo. Gráfica curva de calibrado. Se construye la curva de calibrado usando la Tabla 11, donde el eje de ordenadas corresponde al valor de la Absorbancia y en el eje de las abscisas la concentración de pNF. A estos puntos se les aplica la regresión lineal, mediante el ajuste por mínimos cuadrados, para obtener la recta que los relaciona y su función. Este proceso estadístico y gráfico se realizó con Ms Excel, insertando un gráfico de dispersión con línea de tendencia lineal. Absorbancia [U.A] Curva de calibrado: Concentración de pNF vs Absorbancia. 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 17,72x + 0,058 R² = 0,992 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 Concentración pNF [mM] Gráfico n°1: Curva de calibrado: Concentración de pNF vs Absorbancia. 0,045 Obtención del coeficiente de extinción milimolar del p-nitrofenolato (pNF) En la ecuación de la recta: y = 17,72x + 0,058 la pendiente es m = 17,72, que corresponde a (𝜺 ∗ 𝓵 ), por lo tanto el coeficiente de extinción milimolar es : 𝜺= 𝟏𝟕,𝟕𝟐 [mM]-1 [cm]-1 𝓵 Ecuación 3 El intercepto es igual a 0,058 corresponde al valor de A0 (U.A). Coeficiente de extinción milimolar 𝜺 ( [mM]-1 [cm]-1) 17,72 / ℓ (𝜺 ∗ 𝓵) [mM]-1 Intercepto A0 (U.A) Índice de correlación R² 17,72 0,0582 0,9923 TABLA 12: Coeficiente de extinción milimolar del p-nitrofenolato (pNF) . 4.2.- Efecto de la temperatura en la velocidad de la reacción enzimática. 1 2 3 4 pNPG 2,0 mM pH 5,0 (mL) 0,9 0,9 0,9 0,9 Enzima (mL) Temperatura (ºC) Tiempo incubación (min) Na2CO3 0,1 M (mL) 0,1 25 5,0 2,0 0,1 37 5,0 2,0 0,1 60 5,0 2,0 0,1 90 5,0 2,0 Ensayo Tabla 13: Datos preparación experimental para efecto de la temperatura en la velocidad de la reacción enzimática. Temperatura ℃ Absorbancia (U.A) 1 25 0,356 2 37 0,865 3 60 0,230 4 90 0,098 Ensayo CONTROL 0,098 TABLA 14: Resultado experimental de ensayos con distintas temperaturas. Para visualizar el efecto de la temperatura en la velocidad de la reacción enzimática, se debe calcular las variables de la ecuación 4, para cada ensayo: 𝒗= 𝑨−𝑪𝟎 𝜺∗𝓵 𝟏 𝑽 ∗ 𝒕 ∗ 𝒗 ∗ 𝒇𝒅 ∗ 𝒇𝒆 Ecuación 4 Las Absorbancias A del ensayo y C0 del Control son resultados experimentales de Tabla 14. El Coeficiente de extinción milimolar del p-nitrofenolato (pNF), fue determinado previamente y registrado en Tabla 12. El tiempo de incubación se registró en Tabla 13. El Volumen (V) del ensayo es el volumen de la reacción antes del inhibidor, se calcula con la ecuación 5: 𝑉 = Volumen pNPG+ volumen enzima Ecuación 5 𝑉 = 0,9 mL + 0,1 mL 𝑽 =1,0 mL El volumen 𝒗, corresponde al volumen de enzima utilizado y, registrado en Tabla 13. El factor de dilución del ensayo 𝑓𝑑 𝒇𝒅 = 𝒇𝒅 = , se calcula según ecuación 6: (Volumen pNPG + volumen enzima +volumen Na 2CO 3) (Volumen pNPG + volumen enzima ) Ecuación 6 𝟑 𝒎𝑳 𝟏 𝒎𝑳 𝒇𝒅 = 𝟑 El factor de dilución de la enzima 𝒇𝒆 , es 1 porque no se diluyó antes de agregarla al sustrato: Ensayo Absorbancia (U.A) Control 1 2 3 4 0,098 0,356 0,865 0,230 0,098 Factor Temp. Volumen Volumen dilución ℃ Ensayo Enzima Ensayo (𝒇𝒅 ) (mL) (mL) ----25 37 60 90 ----1,0 1,0 1,0 1,0 -----0,1 0,1 0,1 0,1 Tabla 15: Parámetros cálculo velocidad de reacción. -----3 3 3 3 Factor dilución Enzima (𝒇𝒆 ) ------1 1 1 1 Tiempo incubación (min) 𝜺∗𝓵 [mM]-1 -----5 5 5 5 ---17,72 17,72 17,72 17,72 Cálculo velocidad de reacción: Usando ecuación 4 y valores de tabla 15, se tiene para tubo 1: 𝒗= 𝟎, 𝟑𝟓𝟔 − 𝟎, 𝟎𝟗𝟖 𝟏 𝟏, 𝟎 ∗ ∗ ∗𝟑∗𝟏 𝟏𝟕, 𝟕𝟐 𝟓 𝟎, 𝟏 𝒎𝑴 𝒗 = 𝟎, 𝟎𝟖𝟕 [ ] 𝒎𝒊𝒏 El mismo procedimiento se realiza con los ensayos 2, 3 y, 4. Resultados en la tabla 16. Temperatura ℃ VELOCIDAD DE REACCIÓN [mM/min] 1 25 0,0874 2 37 0,2597 3 60 0,0447 4 90 0,0000 Ensayo Tabla 16: Velocidad de reacción enzimática de la glucosidasa con efecto de temperatura. Velocidad de reacción [mM/min] Velocidad de reacción enzimática, efecto temperatura . 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 25 37 60 Temperatura [ ºC ] Gráfico 2: velocidad de reacción enzimática efecto de Temperatura. Temperatura óptima 37 ºC, velocidad de reacción 0,2597 [mM/min] 90 4.2.- Efecto del pH en la velocidad de la reacción enzimática. 1 2 0,9 ------0,1 5,0 2,0 --0,9 ----0,1 5,0 2,0 3 4 Ensayo pNPG 2,0 mM (ml) pH 4,0 pNPG 2,0 mM (ml) pH 5,0 pNPG 2,0 mM (ml) pH 6,0 pNPG 2,0 mM (ml) pH 7,0 Enzima (ml) Tiempo incubación (min). Na2CO3 0,1 M (ml) ----0,9 --0,1 5,0 2,0 ------0,9 0,1 5,0 2,0 Tabla 17: Datos preparación experimental para Efecto del pH en la velocidad de la reacción enzimática. Ensayo pH Absorbancia (U.A) 1 4,0 0,589 2 5,0 0,854 3 6,0 0,460 4 7,0 0,389 CONTROL 0,098 TABLA 18: Resultado experimental de ensayos con distintos pH. Para visualizar el efecto del pH en la velocidad de la reacción enzimática, se debe calcular las variables de la ecuación 4, para cada ensayo. Las Absorbancias A del ensayo y C0 del Control son resultados experimentales de Tabla 18. El Coeficiente de extinción milimolar del p-nitrofenolato (pNF), fue determinado previamente y registrado en Tabla 12. El tiempo de incubación se registró en Tabla 17. El Volumen (V) del ensayo es el volumen de la reacción antes del inhibidor, se calcula con la ecuación 8: 𝑉 = Volumen pNPG+ volumen enzima Ecuación 8 𝑉 = 0,9 mL + 0,1 mL 𝑽 =1,0 mL El volumen 𝒗, corresponde al volumen de enzima utilizado y, registrado en Tabla 17. El factor de dilución del ensayo 𝑓𝑑 𝒇𝒅 = , se calcula según ecuación 9: (Volumen pNPG + volumen enzima +volumen Na 2CO 3) (Volumen pNPG + volumen enzima ) Ecuación 9 𝒇𝒅 = 𝟑 𝒎𝑳 𝟏 𝒎𝑳 𝒇𝒅 = 𝟑 El factor de dilución de la enzima 𝒇𝒆 , es 1 porque no se diluyó antes de agregarla al sustrato: pH Ensayo Absorbancia (U.A) Control 1 2 3 4 0,098 0,589 0,854 0,460 0,389 ----4,0 5,0 6,0 7,0 Factor Volumen Volumen dilución Ensayo Enzima Ensayo (𝒇𝒅 ) (mL) (mL) ----1,0 1,0 1,0 1,0 -----0,1 0,1 0,1 0,1 -----3 3 3 3 Factor dilución Enzima (𝒇𝒆 ) ------1 1 1 1 Tiempo incubación (min) 𝜺∗𝓵 [mM]-1 -----5 5 5 5 ---17,72 17,72 17,72 17,72 Tabla 19: Parámetros para cálculo velocidad de reacción. Cálculo velocidad de reacción: Usando ecuación 4 y valores de tabla 19, se tiene para ensayo 1: 𝒗= 0,589 − 0,098 1 1,0 ∗ ∗ ∗3∗1 17,72 5 0,1 𝒗 =0,166[ 𝒎𝑴 ] 𝒎𝒊𝒏 El mismo procedimiento se realiza con los ensayos 2, 3 y, 4. Resultados en la tabla 11. Ensayo pH 1 4,0 VELOCIDAD DE REACCIÓN [mM/min] 0,166 2 5,0 0,256 3 6,0 0,123 4 7,0 0,099 Tabla 20: Velocidad de reacción enzimática de la glucosidasa con efecto de temperatura. Velocidad de reacción [mM/min] Velocidad de reacción enzimática efecto pH. 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 4 5 6 7 pH Gráfico 3: velocidad de reacción enzimática efecto grado de acidez pH. pH óptimo 5 , velocidad de reacción 0,256 [mM/min] 5.0.- DISCUSIÓN. Los experimentos de actividad catalítica, con efectos de la temperatura y el pH en la velocidad de reacción, determinaron que la reacción de pNPG con la enzima glucosidasa, se desarrolla en forma óptima a un pH de 5,0 y temperatura de 37ºC, a una velocidad de reacción de formación de pNF de 0,256 [mM/min]. Los puntos observados de Absorbancia fueron escasos, se debió considerar más puntos para claridad de gráfica. Sin embargo se puede apreciar claramente en las gráficas los puntos máximos de la curva, señalando los puntos de Temperatura y pH óptimos. Para que la temperatura tenga efecto positivo en la formación de producto en reacciones catalizadas por enzima glucosidasa, la temperatura debe estar cercana a 37ºC ya que por debajo o sobre este valor la actividad de la enzima glucosidasa disminuye. Por sobre 60ºC, según gráfica, comienza la desnaturalización de la enzima. El pH de la reacción, debe mantenerse entre 4 y 6, para la mejor actividad de la glucosidasa, siendo el óptimo un grado de acidez de 5. 6.0.- REFERENCIAS. Cárdenas, P. (Marzo, 2021). Qui-132 Bioquímica, Guía de Laboratorio Qui-132. Cárdenas, P. (Mayo, 2021). Qui-132 Bioquímica, Enunciado informe 4.
