Cuantificación de la biomasa microbiana en la columna de agua

Universidad de Concepción
facultad de Cs. Naturales y Oceanográficas
Métodos de cuantificación
de la biomasa microbiana
en la columna de agua
Cristián Chandía V.
Paulina Contreras D.
Cristóbal Bravo M.
BIOMASA
• Se refiere a la cantidad de materia viva existente por unidad de
volumen o por unidad de superficie. Se puede medir y expresar su
valor mediante diferentes métodos como el peso fresco total ó el peso
seco total, entre otros.
• La biomasa microbiana esta en directa relación, al igual que la de
los demás organismos, con la cantidad de nutrientes disponibles para
metabolisar.
• Por lo dificil que resulta pesar los microorganismos es que se ha
optado por obtener relaciones directas entre recuento directo y peso
total.
• Ahora, con el desarrollo de nuevas tecnologías se puede obtener
valores mas reales de la masa utilizando como indice proteínas o
compuestos orgánicos presentes en las células.
Métodos para la determinación
de biomasa microbiana
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El peso seco
El peso húmedo
Determinación de ácidos nucleicos
Determinación de Nitrógeno
Incorporación de precursores radioactivos
Recuento microscópico por epifluorescencia
Mediante la determinación de ATP
PESO SECO
•
El peso seco (contenido de sólidos) de las
células bacterianas que se encuentran en una
suspensión se obtiene por el secado de un
volumen en un horno a 105°C hasta peso
constante.
•
Esta técnica es útil para grandes volúmenes
de muestra, debido a que diferencias del orden de
los miligramos representan el peso de un gran
número de bacterias.
PESO HUMEDO
• Se obtiene a partir de una muestra en suspensión
que es pesada luego de la separación de las células
por filtración o centrifugación.
• Es una técnica útil para grandes volúmenes de
muestra( por lo mismo que el anterior).
DETERMINACION DE
ACIDOS NUCLEICOS
• Es una técnica que permite determinar
indirectamente la masa de una población
bacteriana.
• Se determina la cantidad existente de un
determinado ácido nucleico (generalmente
ADN) y a partir de este dato se estima la
masa de la población.
DETERMINACION DE
NITROGENO
• Es una técnica que permite determinar
indirectamente la masa de una población
bacteriana.
• Existen distintas técnicas para determinar la
cantidad de nitrógeno que contiene una muestra en
relación al compuesto que se quiera determinar.
• Puede analizarse el nitrógeno no proteico mediante
el NO2-, NO3-,NH4+, el nitrógeno proteico
mediante absorción en UV, Reacción de Biuret,
Reacción de Lowry, o el nitrógeno total mediante la
digestión de Kjeldahl.
INCORPORACION DE
PRECURSORES RADIACTIVOS
• Es un técnica que permite determinar
indirectamente la masa de una población
bacteriana.
• En este técnica se adiciona al medio un
compuesto marcado radiactivamente que
puede ser incorporado a la célula, y luego se
determina la cantidad de marca incorporada
por toda la población.
RECUENTO MICROSCOPICO
POR EPIFLUORESCENCIA
• Es una técnica común, rápida y barata que
utiliza un equipamiento fácilmente disponible
en un laboratorio de microbiología.
• Para estos recuentos se utilizan generalmente
cámaras de recuento, aunque también pueden
realizarse a partir de muestras filtradas en
membranas y teñidas con colorantes
fluorescentes (por ejemplo naranja de
acridina).
DETERMINACIÓN DE LA
BIOMASA MICROBIANA A
TRAVÉS DE LA
DETERMINACIÓN DEL ATP
• Se calcula la biomasa a través de una relación
directa con la cantidad de ATP de la muestra.
•Relativamente contemporáneo y de fácil
entendimiento.
PROTOCOLO DE TRABAJO
• Muestreo
• Extracción de ATP
• Activación de la solución enzima-sustrato
(luciferin-luciferasa)
• Lectura de muestras
MUESTRAS:
• Se toma una muestra de agua con
instrumentos especiales (botella de Niskin,
Nansen u otros).
• Se filtra por un tamiz de 400 um, donde
todo lo que pase este proceso de filtrado se
considera microorganismo.
• Se filtra nuevamente en un filtro Whatman.
EXTRACCION DEL ATP:
• Se sumerge el filtro en 3 ml de solución
tampón Tris-HCl hirviendo
(Hidroximetil-aminometano + ácido clorhídrico)
• Se deja hervir por 5 minutos (~100ºC).
• Se agrega agua destilada para conservar el
volumen (3 ml)
• Se congela a -20ºC hasta la lectura de la
muestra.
Reacción entre luciferina y ATP
Luciferina
+ O2 + ATP
luciferasa
Oxiluciferina + CO2
+ AMP + P-P + LUZ
Gráfico de intensidad
lumínica vs tiempo
Ventajas del método estudiado.
• La distribución universal del ATP en todas
las células vivas.
• La rápida pérdida de éste en las células
muertas.
• Concentración relativamente constante en la
mayoría de los organismos (aprox. 2 mM en
células activas).
• Fácil extrapolación a variados parámetros de
biomasa.
Desventajas de este método
• Poca objetividad ya que el ATP no
discrimina.
• Riesgos de perdida de material biológico
durante la preparación de la muestra.
• Errores en la calibración pueden provocar
alteraciones en los resultados.
• Se entrega un resultado en base a una
estimación preconcebida.
BIBLIOGRAFIA:
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distribución espacial en el estrecho Bransfield (Antártica). Departamento de Biología
Molecular. Universidad de Concepción. Tesis para optar al título de Bíologo Marino. 56
pp.
 Holm-Hansen, O.; C. Booth. (1966). The measurement of adenosin triphosphate in the
ocean and its ecological significance. Limnology and Oceanography. 11:510-519
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Octava edición. Prentice Hall Iberia. Madrid. España. 1064 pp.
 Moffat, C (1999). Distribución de Biomasa y metabolismo por tamaño en un sistema
hipereutrófico: Laguna Rocuant, Talcahuano. Departamento de Oceanografía.
Universidad de Concepción. Seminario presentado para optar al titulo de Biólogo
Marino. 63 pp.
 Riffo, G.(1983). Variación estacional en la biomasa de Thioploca en la plataforma
continental frente a Dichato. Departamento de Oceanografía. Universidad de
Concepción. Tesis para optar al titulo de Biólogo Marino