MANTENIMIENTO CELULAR

MANTENIMIENTO CELULAR
Una de las principales características de una célula viva es su capacidad
de multiplicarse y ésta fue muchas veces el criterio para decidir si el
microorganismo estaba vivo o no. Los primeros trabajos realizados sobre
cultivos de microorganismos se llevaron a cabo en sistemas batch en los
cuales la población crece durante gran parte del cultivo a su máxima velocidad
y en un ambiente que cambia permanentemente. Bajo estas condiciones y en
presencia de una única fuente de C y energía los microorganismos toman dicha
fuente de C a una velocidad que es proporcional a la de crecimiento :
qs 
1
Yx / s

(1)
Sin embargo estudios posteriores realizados en sistemas de cultivo
continuo permitieron establecer dos aspectos importantes respecto a la
ecuación (1). En primer lugar se observó que Yx/s es constante con una única
fuente de C y energía y creciendo a  fija, utilizando distintos sustratos y
distintos microorganismos, pero varía con las condiciones del entorno y con ,
de modo que no es un parámetro realmente constante. En segundo lugar
según la ecuación (1) una gráfica de qs Vs  debería resultar una recta que
pasara por el origen, de modo que qs debería ser igual a 0 cuando  = 0. Sin
embargo en la gráfica como puede verse en la Fig. 1 el valor de la
extrapolación de qs para =0 es distinto de 0.
qs Vs. D
g sust/g biom/h
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
D (h'1)
Fig. 1
El consumo de sustrato observado cuando la velocidad de crecimiento
es nula representaría la fracción de la fuente de C y energía destinada a
producir energía no asociada al crecimiento. La misma representa el
consumo de sustrato que no redunda en un aumento de biomasa sino en el
mantenimiento de otras funciones vitales. Según Fig. (1) qs podría entonces
expresarse como:
qs  qcrecimiento  qmantenimiento
(2)
1
qs 

Y x / s
 ms x
(3)
donde,
Y’x/s = rendimiento teórico
ms = coeficiente de mantenimiento celular, [g sustrato/g biomasa/h]
Los destinos de esta energía de mantenimiento constituyen: el recambio
de ARN (se recambia hasta 4 veces en un t g) recambio de enzimas, proteínas,
componentes de pared celular, transporte de iones, mantenimiento de
gradientes de concentración (pH o presión osmótica), movilidad, etc.
Dividiendo la ec. (3) por  se obtiene
1
1
ms

+
Yx / s Y x / s

(4)
donde Yx/s es el valor del rendimiento medido experimentalmente. De modo que
una gráfica de 1/Yx/s Vs. 1/ (1/D en sistemas de cultivo continuo) debería dar
una línea recta de pendiente ms y ordenada al origen 1/Y’x/s. Esta es la
ecuación conocida como “Ecuación de Pirt”, que fue el primero en proponer el
uso de la doble recíproca para el cálculo del mantenimiento celular.
En bibliografía a Y’x/s suele llamársele “rendimiento verdadero o
máximo”, sin embargo es importante señalar, que tanto Y’x/s como ms son
esencialmente constantes matemáticas derivadas de un modelo, por lo que
es más conveniente la utilización del término “rendimiento teórico” ya que
resulta menos ambiguo ya que el único rendimiento “verdadero” es aquel que
se mide experimentalmente. También debemos tener en cuenta que aún, a
pesar que se observe una relación lineal de 1/Yx/s Vs. 1/D que indicaría que el
rendimiento es una constante a lo largo del cultivo, y que el crecimiento es
igualmente eficiente para todas las , no significa que esto resulte
fisiológicamente cierto. Es sabido que tanto la composición de las células,
como el metabolismo, y el mantenimiento celular se modifica con la velocidad
de crecimiento. De modo que, si bien la ecuación (2) formalmente es correcta y
se utiliza para cálculos a nivel tecnológico de Y’ x/s y ms, no resulta una acertada
interpretación en términos fisiológicos.
El crecimiento microbiano involucra el consumo y la transformación
química de unos pocos compuestos y elementos. La energía para este proceso
proviene principalmente de la oxidación de la fuente de C y energía. Si
consideramos entonces, el rendimiento en el contexto del metabolismo
principalmente de la fuente de C, los procesos involucrados en la conversión en
biomasa podrían esquematizarse del siguiente modo:
2
O2
H2O
poder
reductor
ATP
Otras funciones
Fte. de C
y Energ
esqueletos
carbonados
polímeros
biomasa
fte. N
sales
vitaminas, etc.
El ATP representado en el esquema de la Fig. (2) es el proveniente
tanto de las reacciones de fosforilación a nivel de sustrato, como de la
fosforilación oxidativa (cadena respiratoria).
Este esquema sugiere que la fuente de C y energía que entra a la célula
es catabolizada para producir poder reductor y esqueletos carbonados
(metabolitos intermediarios). Una porción de los equivalentes de reducción es
oxidado por los componentes de la cadena respiratoria resultando la síntesis de
ATP, y parte de éste junto con otra fracción de poder reductor, es utilizado para
convertir los metabolitos intermediarios en polímeros y biomasa. Otra fracción
del ATP formado es destinado a otras funciones vitales.
Este modelo demuestra también que solo cuatro componentes
medibles experimentalmente están asociados a la formación de energía que
son: la fuente de C y energía, el O2, el ATP y el CO2. De modo que existen
tres sustratos a los cuales es posible aplicarles las ecuaciones (3) y (4):
rs =
rx
 ms X
Y x / s
rO2 =
rATP =
rCO2 =
rx
+ mo X
Y x / o
rx
Y x / ATP
rx
Y x / CO2
(5)
(6)
 mATP X
(7)
+ mCO2 X
(8)
Debemos recalcar que la ec. de Pirt no es válida para representar la
velocidad de consumo de la fuente de Nitrógeno u otros sustratos distintos a
los tres arriba mencionados. En estos casos la velocidad de consumo estará
representada por la ec. (1).
Teniendo en cuenta el balance energético y la ecuación de Pirt es
3
posible obtener una expresión de ms en función de mo.
mo =
ms
 s
4
(9)
Hasta el momento hemos considerado el crecimiento de
microorganismos en aerobiosis y hemos despreciado la formación de
productos. Los productos que pueden formarse pueden ser clasificados en (a)
los que se encuentran asociados a la formación de biomasa, es decir son
productos finales del catabolismo o metabolismo energético y (b) aquellos que
no están asociados al crecimiento. Los productos del tipo (a) (generalmente
producidos en anaerobiosis) no requieren gastos extras de consumo de
sustrato para la formación del producto, por lo que la ecuación de Pirt sigue
siendo válida. Para los productos del tipo (b) (producidos por lo general en
aerobiosis) la ec. (3) debe ser corregida:
rs =
rx
rp
+
+ ms X
Y x / s
Y p / s
(10)
donde Y´p/s es el rendimiento teórico para la formación de producto. Son los g
producto / g sustrato consumido, si todo el sustrato se transforma en producto.
Factores que afectan el mantenimiento celular
El valor del mantenimiento celular depende del microorganismo utilizado
y puede ser modificado por factores del entorno como, pH, fuerza iónica,
temperatura. En la Tabla 1 se encuentran algunos ejemplos de cómo varía el
mantenimiento celular con algunos parámetros del entorno.
Como se mencionó anteriormente, si bien m s se considera desde el
punto de vista tecnológico como un parámetro constante, es importante señalar
que desde el punto de vista fisiológico no es así, ya que varía con la velocidad
de crecimiento. Despejando y´x/s de la ec. (4), se obtiene:
yx / s =
y´x/s
 + y x / s
 + ms y x / s
Es importante observar
que el mantenimiento celular se
hace importante a velocidades
espec. de crecimiento bajas.
Es decir que la fracción de fte de
C y E destinada a la formación
de biomasa es menor a bajos
valores de .
y´x/s
 (h-1)
4
Tabla 1. Factores que afectan el mantenimiento celular
Factor
Microorganismo
Condiciones
de cultivo
ms
(g sust./
g biom/h)
Aerobacte
cloacae
aerobio. Glucosa
como sust. limit.
0.094
Saccharomices
cerviceae
aerobio. Sacarosa
como sust. limit.
0.036
Saccharomices
cerviceae
Sacarosa.
NaCl 1M
0.36
Azotobacter
vinalandii
PO2= 0.021 at.
0.15
PO2= 0.21 at
1.5
pH= 6.5
0.025
pH=4.5
0.089
T = 18 C
0.022
T = 21 C
0.052
T = 27 C
0.078
Microorganismo
Presión
osmótica
Presión Parcial
de O2
(fijador de N2)
pH
Temperatura
Klebsiella
pneumoniae
Kluiveromyces
lactis
5
Otros destinos de la energía de mantenimiento
Hasta el momento hemos descripto los principales destinos de la
energía de mantenimiento. Sin embargo, bajo ciertas condiciones del entorno
la célula debe disponer de mecanismos adicionales para disipar continuamente
excesos de energía que la células no puede usar inmediatamente. Es sabido
que deben existir un número de funciones no asociadas al crecimiento cuyas
actividades pueden servir para consumir ATP a altas velocidades cuando las
condiciones para la síntesis de material celular es impedida. Cuál puede ser la
naturaleza de estas reacciones? Cómo están reguladas?
Se ha encontrado dentro de una misma célula un número de enzimas
que si actúan de manera concertada, podrían causar la hidrólisis de ATP sin
producir ninguna cambio neto en otros componentes. En la literatura este tipo
de reacciones en las que el balance neto es la hidrólisis de ATP a ADP se las
conoce como ¨ciclos fútiles¨. Un ejemplo clásico de un ¨ciclo fútil¨ constituye la
siguiente secuencia de reacciones observadas en cultivos de K. Pneumoniae
limitados en amonio. Los mismos son ricos en glutamina sintasa y glutamato
sintasa que, junto con 2-oxoglutarato producen glutamato.
glutamina sintasa
Glutamato + NH3 + ATP
Glutamina + 2-oxoglutarato + NADHPH2
glutamina + ADP + Pi
glutamato sintasa2
2-oxoglutarato+ NH3 + ATP + NADHPH2
glutamato + NADP
glutamato + NADP +ADP+Pi
Sin embargo cultivos limitados en amonio también contienen una
glutaminasa activa que escinde la glutamina en amonio y glutamato, de modo
que bloquea la síntesis neta de glutamato provocando la hidrólisis neta de
ATP.
Glutamato + NH3 + ATP
glutamina sintasa
glutaminasa
Glutamina
ATP
glutamina + ADP + Pi
glutamato + NH3
ADP + Pi
Todavía no se sabe qué mecanismo activa la actividad de la glutaminasa
durante el crecimiento de células en cultivos limitados en NH4.+ Sin embargo,
sería razonable suponer que el ¨ciclo fútil¨ funcionaría como un sensor del
amonio disponible manteniendo la enzima asociada con su asimilación
(glutamina sintasa) activamente funcionando en ausencia de sustrato exógeno.
El funcionamiento de este ciclo fútil seria “el precio la célula que debe pagar”
para mantenerse en un estado en el que puede responder rápidamente a
cambios bruscos en la disponibilidad del sustrato limitante (amonio).
6
De modo que, el término ¨ciclo fútil¨ describe una situación en la cual la
célula posee la maquinaria para llevar a cabo una transformación irreversible
de un proceso de transformación en una dirección y en la dirección opuesta. Si
ambas funcionan a distinto tiempo, el metabolismo es eficiente. Sin embargo si
actúan simultáneamente no habrá ninguna transformación neta, más que la
disipación de energía.
Otro gasto de fuente de C y energía no destinada al crecimiento es lo
que se conoce como el metabolismo de sobreflujo (¨overflow metabolism¨, o
¨spilling reactions¨ o ¨spillover¨). Existen entornos bajo los cuales los
microorganismos actúan como si el entorno en el que se encuentran
representara un suministro permanente de recursos, y la “filosofía” es “gastar
los recursos más que conservarlos para el futuro”. Las células toman las
fuentes de C y E la utilizan hasta cierto grado y luego la excretan aún cuando
no ha sido utilizada completamente. Por ejemplo, si a cultivos limitados en
glucosa los liberamos de dicha limitación temerariamente, no habrá una
inmediata aceleración de la velocidad de crecimiento, sin embargo el exceso de
glucosa es oxidado parcialmente y se liberan al medio un número importante
de metabolitos intermedios. El hecho que las bacterias no siempre regulan
precisamente la velocidad de consumo de los excesos de fuente de carbono se
observa más claramente en el crecimiento de bacterias en cultivos continuos
limitados por otros sustratos distintos a la fuente de C y energía.
La Tabla 2 muestra las velocidades de consumo de glucosa y formación
de algunos productos en cultivos de Klebsiella pneumoniae limitados por
distintos sustratos operados Este llamativo consumo de fuente de C y
eliminación de intermediarios que aún podrían ser utilizados es un modo
económico de defensa desde la perspectiva que es rápido, sencillo.
Existen otros destinos para la energía de mantenimiento que el
bioquímico o fisiólogo podría encasillar dentro de lo que se denomina
mantenimiento celular. Uno de ellos es la puesta en marcha por parte de la
célula de mecanismos que le permiten mantenerse ¨en guardia¨ frente a
posibles ¨ataques¨ de otras bacterias, virus, compuestos químicos tóxicos,
etc...También frente a importante fluctuaciones del entorno, las bacterias
pueden desarrollar modos de protegerse a si mismas, por ejemplo a través de
la formación de endosporas. No importa cuál sea el costo energético que
represente este proceso, la bacteria lo llevará a cabo aún a costa de sacrificar
su crecimiento, es decir, gastará energía a fin de proteger la longevidad de la
especie.
7
Tabla 2. Velocidades específicas de consumo de glucosa y
formación de distintos productos en cultivos continuos de K.
pneumoniae operados en sistema de cultivo continuo a D  0.17 h-1,
35 C, y pH 6.8.
sustrato limitante
Velocidades
específicas
Carbono
Nitrógeno
Azufre
Biomasa
 (h-1)
0.17
0.17
0.17
Glucosa
qs (mmol/g/h)
2.1
6.1
5.6
CO2
qCO2(mmol/g/h)
5.3
6.9
7.1
Acetato
qp(/g/h)
0
0.7
1.6
Piruvato
qp2(g g/h)
0
0.6
2.5
Succinato
qp3mmol/g/h)
0
0
0.2
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