Preparaciones en portaobjetos para la citología de líquido

Método Hettich
Preparaciones en portaobjetos
para la citología de líquido cefalorraquídeo
Preparaciones en portaobjetos para la citología de líquido cefalorraquídeo
En el diagnóstico del líquido cefalorraquídeo, la citología clásica de líquido cefalorraquídeo desempeña
un importante papel a la hora de reconocer y tipificar
enfermedades inflamatorias del SNC provocadas por
agentes patógenos, en la detección de hemorragias
en las cavidades subaracnoideas y en el reconocimiento
de células neoplásicas. Además, las preparaciones
citológicas se utilizan en estudios evolutivos y para
1)
controlar la terapia.
Como, por lo general, en el caso del líquido cefalorraquídeo se trata de un líquido con baja concentración
de células y de proteínas, a las pocas horas de la
punción aparecen ya daños celulares. Por lo tanto,
las muestras de líquido cefalorraquídeo con las cuales
se desee elaborar preparados en portaobjetos no
2)
deberían tener más de 2 horas.
Tanto la hora a la que se tomaron las muestras como
la técnica empleada para su preparación tienen una
influencia crucial en el valor diagnóstico de la preparación citológica. Por ese motivo, en la preparación
del líquido cefalorraquídeo debe procurarse un alto
rendimiento celular y evitarse a toda costa una pérdida
celular selectiva. Para poder identificar con total seguridad las diferentes poblaciones celulares, la morfología
de las células debe permanecer intacta.
Preparación
1. Preparación de la muestra
Como al procesar las muestras de líquido cefalorraquídeo con baja concentración de células y de proteínas, la calidad de la preparación suele ser insuficiente,
se recomienda añadir suero humano o solución de
albúmina a la muestra. Si el número de células es
inferior a 10/µl y los contenidos en proteínas, inferiores
a 3.000 mg/l, se considera necesario añadir proteínas
para la estabilización celular. Para garantizar una concentración de proteínas superior a 3.000 mg/l en una
muestra de líquido cefalorraquídeo de 400 µl, se deben
agregar 50 µl de suero natural con un contenido total de
proteínas de 70 g/l aprox. En este caso, no es necesario
3)
suero autólogo.
Además, para aumentar el rendimiento celular, puede ser
ventajoso utilizar portaobjetos revestidos. Para la rutina
y la tinción convencional se recomiendan portaobjetos
revestidos PolysineTM, para la detección inmunocitológica de marcadores celulares superficiales, sobre todo
4)
marcadores tumorales, portaobjetos Super Frost® Color.
(PolysineTM y Super Frost® son marcas registradas de la
empresa Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH
& Co. KG).
2. Selección de los accesorios adecuados
Ventajas del método Hettich
1. Procesamiento directo de la muestra de líquido
cefalorraquídeo para la preparación citológica
·A
daptación al variado contenido celular y a los
diferentes volúmenes hasta 8 ml
· Utilización del sobrenadante libre de células para
otros análisis
2. Consecución de una preparación de buena calidad
· Obtención óptima de la morfología
· Densidad de ocupación óptima
· Alto rendimiento celular
La cantidad disponible de la muestra y su contenido
celular determinan qué cámara emplear. Normalmente,
para muestras de líquido cefalorraquídeo se recomiendan las cámaras de 1 ml y 2 ml con superficies de sedimentación de 30 mm² y 60 mm² respectivamente.
Células/
muestra
hasta
2.000
2.000 – 20.000
más de
20.000
30 mm²
30 mm²
60 mm²
Volumen
100 µl – 1 ml
100 µl – 1 ml
400 µl – 2 ml
Añadir
proteínas
si
no
no
Tamaño de la
cámara
3. Montaje del adaptador citológico
El montaje de los accesorios citológicos puede consultarse en nuestro diagrama “El giro perfecto para la
preparación – el ZYTO-System de HETTICH”. En preparaciones en portaobjetos de líquido cefalorraquídeo por regla
general se necesita una fijación en seco.
1)
Kluge et al., Stellenwert der praktischen (klassischen) Liquorzytologie im Gesamtspektrum der Liquordiagnostik, in Kluge et al. (Hrsg.)
Atlas der praktischen Liquorzytologie, Stuttgart 2005, p. 2-3.
Ibídem, p. 7.
3) Ibídem, p. 8.
4)Recomendación del laboratorio de líquido cefalorraquídeo del Instituto para química clínica y diagnóstico de laboratorio (Catedr. Dr. Kluge, Dr. Roskos) del Centro clínico de la
Universidad Friedrich Schiller de Jena (Alemania).
2)
2
Preparaciones en portaobjetos para la citología de líquido cefalorraquídeo
d) Fijación y tinción
La preparación seca puede fijarse y teñirse sin dilación.
Por ello deberá montar el adaptador citológico con papel filtro
(véase el punto B1 del diagrama). En muestras infecciosas,
coloque la tapa nº. 1661 (véase el punto B2 del diagrama).
4. Centrifugación
a) Sedimentación
Las cámaras citológicas se centrifugan durante 3 minutos
a 275 x g (esto corresponde a 1.500 min-1 en el rotor de
6 posiciones y a 1.700 min-1 en el rotor de 4 posiciones).
Durante este primer paso de centrifugación tiene lugar la
sedimentación de todas las células en el portaobjetos.
b) Eliminación del sobrenadante libre de células
El sobrenadante exento de células todavía se encuentra
dentro de la cámara después de la centrifugación y se
elimina por aspiración cuidadosa de hasta el mínimo resto
de líquido. Es importante que no se arremoline el sedimento
durante la aspiración, ya que esto puede implicar pérdida
celular y merma de calidad. Por ello se recomienda aspirar
el sobrenadante desde arriba hacia abajo, siguiendo el
nivel del líquido, con una pipeta Pasteur. No deberá llevar
la pipeta hasta el fondo en el portaobjetos, sino que deberá
dejar una pequeña gota de líquido residual encima del
sedimento. En caso de que no se haya añadido ninguna
solución de proteínas, el sobrenadante obtenido estará
disponible para análisis bioquímicos.
c) Secado del sedimento
Para las tinciones Giemsa, utilizadas con frecuencia,
deberá secarse previamente el sedimento. Esto se
consigue mediante un segundo paso de centrifugación.
Después de eliminar el sobrenadante deberá aflojar el
anillo tensor, eliminándolo a continuación junto con la
cámara (véase el punto B4 del diagrama). Vuelva a colocar la placa de sujeción con el portaobjetos y el papel
filtro junto con el soporte, centrifugando el conjunto
durante 1 minuto a 1.100 x g (esto corresponde a
3.000 min-1 con el rotor de 6 posiciones y a 3.400 min-1
con el rotor de 4 posiciones).
El líquido residual es eliminado por la fuerza centrífuga,
recogiéndolo el papel filtro. Las células quedan en forma
de sedimento sobre el portaobjetos. Están bien conservadas y perfectamente extendidas. Gracias al secado
por centrifugación se evitan artefactos de evaporación
como puedan ser leucocitos atrofiados y la formación
de cristales.
Consejo:
En la tinción Giemsa o May-Grünwald-Giemsa, al
terminar, los portaobjetos se enjuagan con tampón
(Weise, Sörensen). A continuación deberán secarse.
Con el soporte Labora System para 6 portaobjetos (nº. ref.1285), esto sucede de forma
rápida y sencilla:
· los portaobjetos enjuagados con tampón Weise se
colocan en los soportes y se introducen en la centrífuga;
· la muestra se centrifuga durante 1 minuto a 275 x g
(esto corresponde a 1.500 min-1 en el rotor de 6 posiciones
y a 1.700 min-1 en el rotor de 4 posiciones);
· se extraen los soportes con los portaobjetos secos
de la centrífuga;
· las preparaciones están listas para utilizarlas en la
microscopía y/o cubrirlas;
· se secan los soportes frotándolos con un paño;
en el rotor de 6 posiciones pueden secarse
simultáneamente hasta un total de 36 portaobjetos.
Informaciones de pedido
Centrífuga
1206
UNIVERSAL 320 / UNIVERSAL 320 R
Selección de accesorios
5)
1401 / 1406
Nº. ref.
Rotor, 4 posiciones
1624
Rotor, 6 posiciones
1626
Soporte citológico
1660
Tapa adecuada para 1660
1661
Placa de sujeción con anillo de tensión
1662
Cámaras citológicas 1 x 1 ml (30 mm²)
1663
Cámaras citológicas 1 x 2 ml (60 mm²)
1664
Papeles filtro para 1663 y 1664, 1 UE: 200 unid.
1675
Soporte Labora System para 6 portaobjetos
1285
5)Nuestros
accesorios completos para la citología los encontrará en nuestro folleto
para citología, que le será facilitado gratuitamente a petición.
Andreas Hettich GmbH & Co. KG
Föhrenstr. 12
D -78532 Tuttlingen
Alemania
www.hettichlab.com
[email protected]
[email protected]
Nº. ref.
ROTOFIX 32 A
Tel.
Fax
+49 (0)7461 / 7 05 - 0
+49 (0)7461 / 7 05 - 1 22
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