Preparaciones en portaobjetos para la citología de derrames

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Preparaciones en portaobjetos para
la citología de derrames pleurales o ascitis
Preparaciones en portaobjetos para la citología de derrames pleurales o ascitis
El derrame pleural y la ascitis contienen, además de
células del epitelio celómico, linfocitos y granulocitos
eosinófilos y neutrófilos. El contenido en proteínas a
menudo es de unos 30 g/l. El contenido celular con
frecuencia varía mucho. En ambos líquidos se puede
encontrar sangre y en la ascitis es posible encontrar
grasa en suspensión.
Ventajas del método Hettich
1.Cámaras citológicas apropiadas para
diferentes contenidos celulares y volúmenes
2. Alto rendimiento celular
3. Buena representación celular
4. Densidad de ocupación óptima
Preparación
1. P
reparación de muestras
con alta proporción de eritrocitos
Como una proporción alta de eritrocitos tiene efectos
negativos sobre la calidad de la preparación, se
recomienda eliminarlos antes de la elaboración de una
preparación citológica utilizando un tampón para lisis.
a) Preparación del tampón para lisis
8,29 g de cloruro de amonio (NH4Cl)
1,0 g de bicarbonato potásico (KHCO3)
0,037 gde ácido etilenodiamintetraacético (EDTA) se
mezclan con agua destilada hasta obtener un
volumen de 1 litro.
Para mejorar la conservación se recomienda autoclavar
el tampón de lisis.
b) Lisis de los eritrocitos
·L
a muestra se centrifuga durante 10 minutos a
350 x g (esto corresponde a 1.700 min-1 en el rotor
de 6 posiciones y a 1.900 min-1 en el rotor de
4 posiciones.
·E
l sobrenadante se extrae con una pipeta y
se conserva.
·E
l sedimento se mezcla con el tampón de lisis
(1 parte volumétrica del sedimento con 10 partes
volumétricas de tampón).
·M
ezclar bien y dejar reposar durante 10 minutos a
temperatura ambiental. La hemoglobina liberada hace
que el líquido adquiera una tinción roja transparente.
·L
a reacción se interrumpirá añadiendo 10 veces la
cantidad de solución fisiológica de cloruro de sodio
(0,9% NaCl) o una solución de NaCl tamponada con
fosfato.
·C
entrifugar durante 10 minutos a 350 x g.
·E
liminar el sobrenadante con los eritrocitos lisados por
decantación y desecharlo.
· Introducir el sedimento en 10 ml de solución fisiológica
de NaCl 0,9 % (o PBS - phosphate buffered saline),
mezclar bien y volver a centrifugar durante 10 minutos
a 350 x g.
·E
liminar el sobrenadante y añadir el sedimento al
sobrenadante original de la muestra, mezclándolos
bien. Ahora podrá elaborarse una preparación
citológica a partir del material de muestra.
Importante: las células no deben dejarse durante
demasiado tiempo en el tampón para lisis, ya que sino
también se disolverían.
2.
Selección de los accesorios
adecuados
Para la centrifugación de un derrame pleural y
de la ascitis recomendamos la cámara de 2 ml
(nº ref. 1664), con una superficie de sedimentación de
60 mm2 y la cámara de 4 ml (nº ref. 1665) con
una superficie de sedimentación de 120 mm2. La
cámara de 2 ml es apropiada para muestras de hasta
un máximo de 100.000 células, la cámara de 4 ml
para muestras más ricas en células hasta un máximo
de 200.000 células.
3.
Montaje del adaptador citológico
El montaje de los accesorios citológicos puede consultarse en nuestro diagrama “El giro perfecto para
la preparación – el ZYTO-System de HETTICH”. En
preparaciones para portaobjetos a partir de derrames
pleurales y ascitis por regla general se necesita una
fijación en seco. Por ello deberá montar el adaptador
citológico con papel filtro (véase el punto B1 del diagrama). En muestras infecciosas recomendamos que
coloque la tapa nº 1661 (véase el punto B2 del
diagrama).
2
4.
Centrifugación
a) Sedimentación
Introduzca las muestras y centrifúguelas durante
10 minutos a 490 x g (esto corresponde a 2.000 min-1
en el rotor de 6 posiciones y a 2.200 min-1 en el rotor
de 4 posiciones.
b) Eliminación del sobrenadante exento de células
El sobrenadante exento de células todavía se encuentra
dentro de la cámara después de la centrifugación y se
elimina por aspiración cuidadosa.
Es importante que no se agite el sedimento durante la
aspiración, ya que esto puede implicar pérdida celular
y merma de calidad. Por ello se recomienda aspirar el
sobrenadante desde arriba hacia abajo, siguiendo el
nivel del líquido, con una pipeta Pasteur. ¡No deberá
llevar la pipeta hasta el fondo en el portaobjetos, sino
que deberá dejar una pequeña gota de líquido residual
encima del sedimento!
c) Secado del sedimento
Para las tinciones GIEMSA, utilizadas con frecuencia,
deberá secarse previamente el sedimento. Esto se
consigue mediante un segundo paso de centrifugación.
Después de eliminar el sobrenadante deberá aflojar el
anillo tensor, eliminándolo a continuación junto con la
cámara (véase el punto B4 del diagrama). Vuelva a colocar la placa de sujeción con el portaobjetos y el filtro
junto con el soporte, centrifugando el conjunto durante
1 minuto a 1.100 x g (esto corresponden a 3.000 min-1
con el rotor de 6 posiciones y a 3.400 min-1 con el rotor
de 4 posiciones). El líquido residual es eliminado por la
fuerza centrífuga, recogiéndolo el papel filtro. Las células
quedan en forma de sedimento sobre el portaobjetos.
Están bien conservadas y perfectamente extendidas.
Gracias al secado por centrifugación se evitan artefactos de evaporación como puedan ser leucocitos
atrofiados y la formación de cristales.
Consejo
En la tinción Giemsa o May-Grünwald-Giemsa, al
terminar los portaobjetos se enjuagan con tampón
(Weise, Sörensen). A continuación deberán secarse.
Con el soporte Labora System para 6 portaobjetos (nº ref.1285), esto sucede de forma rápida
y sencilla:
· los portaobjetos enjuagados con tampón Weise se
colocan en los soportes y se introducen en la
centrífuga;
· la muestra se centrifuga durante 1 minuto a 275 x g
(esto corresponde a 1.500 min-1 en el rotor de 6
posiciones y a 1.700 min-1 en el rotor de 4 posiciones;
·e
xtraiga los soportes con los portaobjetos secos de la
centrifuga;
· las preparaciones están listas para utilizarlas en la
microscopía y/o cubrirlas;
· s eque los soportes frotándolos con un paño;
en el rotor de 6 posiciones pueden secarse
simultáneamente hasta un total de 36 portaobjetos.
Informaciones de pedido
Centrífuga
1206
ROTOFIX 32 A
1401 / 1406
UNIVERSAL 320 / UNIVERSAL 320 R
Selección de accesorios
d) Fijación y tinción
La preparación seca puede fijarse sin dilación, pasando
a continuación a la tinción.
1)
Nº. ref.
Rotor, 4 posiciones
1624
Rotor, 6 posiciones
1626
Soporte citológico
1660
Tapa adecuada para 1660
1661
Placa de sujeción con anillo de tensión
1662
Cámaras citológicas 1 x 2 ml (60 mm2)
1664
Cámaras citológicas 1 x 4 ml (120 mm )
1665
Soporte Labora System para 6 portaobjetos
1285
2
1)
Nuestros accesorios completos para la citología los encontrará en nuestro folleto para citología, que le será facilitado gratuitamente a petición.
Andreas Hettich GmbH & Co. KG
Föhrenstr. 12
D -78532 Tuttlingen
Alemania
www.hettichlab.com
[email protected]
[email protected]
Nº. ref.
Tel.+49 (0)7461 / 7 05 -0
Fax+49 (0)7461 / 7 05 -11 22
Ventas nacional:
-12 00
Ventas internacional:
-12 01
Atención al cliente nacional:
-12 02
Atención al cliente internacional: -12 03
M-Pleura-ES.0814 © by Andreas Hettich GmbH & Co. KG
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