00 Hoja Universidad v2 F - Universidad Politécnica de Madrid

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID
E.T.S.I. AGRÓNOMOS
BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA A
INSECTICIDAS EN LA MOSCA MEDITERRÁNEA DE LA
FRUTA Ceratitis capitata (WIEDEMANN)
TESIS DOCTORAL
FRANCISCO COUSO FERRER
Licenciado en Biología
2012
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA
E.T.S.I. AGRÓNOMOS
BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA A
INSECTICIDAS EN LA MOSCA MEDITERRÁNEA DE LA
FRUTA Ceratitis capitata (WIEDEMANN)
FRANCISCO COUSO FERRER
Licenciado en Biología
PEDRO HERNÁNDEZ CRESPO
Dr. en Ciencias Biológicas
Universidad de Córdoba
1993
- ÍNDICE Pág.
RESUMEN
I
ABSTRACT
V
Capítulo 1: INTRODUCCIÓN GENERAL
1
1.1. Ceratitis capitata
3
1.1.1. Descripción de la especie y distribución geográfica
3
1.1.2. Importancia como plaga
5
1.1.3. Métodos de lucha contra C. capitata
7
1.2. Resistencia a insecticidas
11
1.2.1. Definición de resistencia
11
1.2.2. La resistencia a insecticidas en números
12
1.2.3. Resistencia cruzada
14
1.2.4. Mecanismos de resistencia
15
1.2.4.1. Resistencia metabólica
1.2.4.1.1. Glutatión S-transferasas
16
1.2.4.1.2. Esterasas
16
1.2.4.1.3. Enzimas citocromo P450
17
1.2.4.1.3.1. Definición y nomenclatura
17
1.2.4.1.3.2. Identificación y diversidad
19
1.2.4.1.3.3. Estructura y función
21
1.2.4.1.3.4. Resistencia a insecticidas mediada por P450
21
1.2.4.2. Resistencia por modificación de la molécula diana
1.2.4.2.1. La acetilcolinesterasa
1.2.4.3. Otros mecanismos de resistencia
1.2.5. Resistencia en C. capitata y otras especies de la familia Tephritidae
1.3. Objetivos de la tesis
15
24
25
25
26
29
Pág.
Capítulo 2: SELECCCIÓN DE RESISTENCIA EN LABORATORIO Y SUSCEPTIBILIDAD A
INSECTICIDAS EN Ceratitis capitata
31
2.1. Introducción
33
2.2. Material y métodos
35
2.2.1. Ceratitis capitata en el laboratorio
35
2.2.1.1. Condiciones generales de cría
35
2.2.1.2. Mantenimiento de líneas de C. capitata bajo presión de selección
37
2.2.2. Líneas de laboratorio
38
2.2.3. Recogida de poblaciones de campo
40
2.2.3.1. Adaptación de las poblaciones de campo al laboratorio
2.2.4. Bioensayos de susceptibilidad a insecticidas
40
41
2.2.4.1. Condiciones generales
41
2.2.4.2. Bioensayos para estimar la CL50
43
2.2.4.3. Bioensayos de concentración discriminante
45
2.2.5. Bioensayos con el quimioesterilizante lufenurón
2.3. Resultados
2.3.1. Evaluación de la susceptibilidad a malatión y espinosad en poblaciones de campo
47
49
49
2.3.2. Selección de resistencia a malatión en el laboratorio: Establecimiento de las
líneas W-4Km y W-10Km
52
2.3.3. Resistencia cruzada en la línea W-4Km
55
2.3.4. Selección de resistencia a espinosad en laboratorio: Establecimiento de la línea
Xàbia-W-100s
2.4. Discusión
57
59
Capítulo 3: BASES PARA LA DETECCIÓN PRECOZ DE LA RESISTENCIA: DIVERSIDAD
DE GENES CYP
65
3.1. Introducción
67
3.2. Material y métodos
71
Pág.
3.2.1. Insectos
71
3.2.2. Extracción de DNA
71
3.2.3. Extracción de RNAT y RNAm
72
3.2.4. Síntesis de cDNA
73
3.2.5. Amplificación por PCR de los genes CYP
74
3.2.6. Electroforesis y extracción de bandas
75
3.2.7. Clonación, RFLP y secuenciación
75
3.2.8. Análisis de las secuencias
76
3.2.9 Bioensayos de exposición a fenobarbital
77
3.2.10. PCR cuantitativa en tiempo real
77
3.3. Resultados
79
3.3.1. Diversidad de genes CYP
79
3.3.2. Expresión de los genes CYP
90
3.3.3. Inducción por fenobarbital
94
3.4. Discusión
97
Capítulo 4: DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LOS GENES Ccace2 Y Ccae7 Y
DESARROLLO DE SISTEMAS DE DETECCIÓN PRECOZ DE ALELOS DE RESISTENCIA
101
4.1. Introducción
103
4.2. Material y métodos
107
4.2.1. Obtención de intrones mediante GenomeWalkerTM
107
4.2.2. Amplificación de los exones de Ccace2 y Ccae7
113
4.2.3. Desarrollo de un método de detección de la mutación AChE G328A
115
4.3. Resultados
119
4.3.1. Estructura del gen Ccace2
119
4.3.2. Estructura del gen Ccae7
120
4.3.3. Amplificación de Ccae7 y Ccace2 en individuos de distintas regiones geográficas
121
4.3.4. Método de detección del alelo Ccace2R portador de la mutación AChE G328A
122
Pág.
4.3.5. Distribución geográfica del alelo Ccace2R
124
4.3.6. Frecuencia genotípica de Ccace2 en las líneas de laboratorio resistentes a
malatión
130
4.4. Discusión
133
Capítulo 5: NUEVO MECANISMO DE RESISTENCIA A MALATIÓN EN Ceratitis capitata
137
5.1. Introducción
139
5.2. Material y métodos
143
5.2.1. Líneas de laboratorio y cruzamientos
143
5.2.2. Evaluación del número de copias del gen Ccace2
145
5.2.3. Cuantificación de la expresión de Ccace2
146
5.2.4. Análisis de la actividad AChE y su inhibición por malaoxón
147
5.2.5. Caracterización de los perfiles RFLP
148
5.2.6. Análisis de la mutación AChE G328A mediante secuenciación
149
5.2.7. Método PCR-RFLP para la detección de la duplicación Ccace2RS
149
5.2.8. Estimación del tiempo de desarrollo, porcentaje de emergencia y supervivencia de
los adultos pertenecientes a las líneas C y W-10Km
5.3. Resultados
151
153
5.3.1 Cruzamientos y descendencia de las líneas C y W-10Km
153
5.3.2. Determinación del número de copias del gen Ccace2
155
5.3.3. Cuantificación de la expresión de Ccace2
156
5.3.5 Caracterización del perfil RFLP de los individuos con fenotipo heterocigoto para la
mutación AChE G328A
158
5.3.6. Confirmación del genotipo asociado al perfil RFLP mediante cruzamientos y PCR
cuantitativa
161
5.3.7. Análisis de los patrones de secuenciación de la mutación AChE G328A
163
5.3.8. Detección de la duplicación Ccace2RS mediante un sistema de doble PCR-RFLP
165
5.3.9. Detección de la duplicación Ccace2RS en poblaciones de campo
167
Pág.
5.3.10. Comparación del desarrollo, porcentaje de emergencia y supervivencia de
adultos en las líneas C y W-10Km
169
5.4. Discusión
171
CONCLUSIONES
177
BIBLIOGRAFÍA
181
ANEXOS
215
I. Protocolo para la elaboración de la dieta para las larvas de C. capitata
217
II. Secuencias intrónicas de Ccace2 y Ccae7
219
ÍNDICE DE TABLAS
221
ÍNDICE DE FIGURAS
223
Resumen.
La mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) está considerada
una de las plagas clave para la fruticultura. El malatión es un insecticida organofosforado que fue
empleado mayoritariamente en España para el control de C. capitata hasta 2009, año en el que
dejó de utilizarse por no estar incluido en el anexo I de la Directiva Europea 91/414/ECC. El
incremento del uso del malatión, debido a las graves pérdidas económicas causadas por C.
capitata, provocó la aparición de poblaciones de campo resistentes. El estudio de una población
resistente a malatión, recogida en Castelló en 2004, permitió la identificación de dos mecanismos
de resistencia: una mutación puntual (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE) y un mecanismo de
resistencia metabólica, probablemente mediado por carboxilesterasas.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, nos propusimos estudiar los mecanismos
implicados en la resistencia a malatión en C. capitata. Además, durante el desarrollo de esta Tesis,
el malatión fue sustituido por otros insecticidas como el espinosad y la lambda-cialotrina para el
control de la plaga. En este nuevo contexto, es extremadamente importante analizar la
susceptibilidad de poblaciones de campo frente a espinosad y estudiar la posible existencia de
resistencia cruzada a estos insecticidas, así como sentar las bases para el estudio de futuros
mecanismos de resistencia.
En primer lugar, analizamos mediante bioensayos con dosis discriminante la susceptibilidad
a malatión y espinosad en doce poblaciones de C. capitata de Andalucía, Aragón, Cataluña,
Comunidad Valenciana e Islas Baleares; y nuestros resultados sugirieron la presencia de individuos
resistentes a malatión en la mayoría de las poblaciones analizadas. En el caso del espinosad,
observamos que la susceptibilidad a este insecticida de origen biológico fue elevada en la mayoría
de las poblaciones, sin embargo, la población recogida en Xàbia (Alicante) mostró un nivel de
susceptibilidad unas dos veces menor al resto de poblaciones. Mediante la selección en laboratorio,
obtuvimos dos líneas resistentes a malatión, W-4Km y W-10Km, con unos niveles de resistencia
con respeto a la línea susceptible C de 178 y 400 veces, respectivamente. Además, se seleccionó
por primera vez en C. capitata una línea altamente resistente a espinosad (Xàbia-W-100s), que
actualmente es unas 500 veces más resistente que la línea de laboratorio C.
I
Con el objetivo de escoger la estrategia más adecuada para el manejo de la plaga,
estudiamos la susceptibilidad a diferentes tipos de insecticidas en la línea resistente a malatión W4Km. En esta línea detectamos resistencia cruzada moderada a los organofosforados fentión,
diazinón, fosmet, triclorfón y metil-clorpirifos (de 7 a 16 veces) y frente al carbamato carbaril, al
piretroide lambda-cialotrina y al quimioesterilizante lufenurón (de 4 a 6 veces). Por otra parte, la
resistencia cruzada frente a espinosad fue baja (1,5 veces). Es importante destacar que los niveles
de resistencia estimados frente a todos los insecticidas fueron de uno o dos órdenes de magnitud
inferiores al observado en la línea W-4Km frente a malatión (178 veces), hecho que podría
deberse, al menos, a dos posibles hipótesis: que la mutación AChE G328A confiera mayor
insensibilidad al malaoxón (forma activa del malatión) que a otros insecticidas que tienen como
diana la AChE y/o, en segundo lugar, que el mecanismo de resistencia mediado por
carboxilesterasas hidrolice el malatión de manera más eficiente que los otros insecticidas
analizados.
En el estudio de nuevos mecanismos de resistencia en C. capitata, por un lado, analizamos
la diversidad de enzimas citocromo P450, asociadas con resistencia metabólica en otras especies, y
por otro lado, desarrollamos un sistema para la detección de nuevas mutaciones puntuales que
pudiesen aparecer en los genes que codifican la AChE (Ccace2) y la aliesterasa (Ccae7). Mediante
el empleo de cebadores degenerados obtuvimos 37 genes CYP, que codifican enzimas P450,
pertenecientes a cinco familias. Posteriormente, en un estudio de inducción con fenobarbital,
observamos que la expresión de cuatro de los seis genes analizados era susceptible de ser
inducida. Por otro lado, se puso a punto un sistema que permite amplificar y secuenciar, a partir
de DNA genómico, los exones de los genes Ccace2 y Ccae7 en los que se han encontrado
mutaciones relacionadas con resistencia a insecticidas en otras especies. Los resultados obtenidos
facilitarán el estudio de nuevos mecanismos de resistencia mediados por estas enzimas en C.
capitata.
Se diseñó un método PCR-RFLP para identificar los individuos portadores de la mutación
AChE G328A (alelo de resistencia Ccace2R) sin la necesidad de realizar bioensayos y que, además,
permite detectar resistencia cuando ésta se encuentra a baja frecuencia. Según el análisis
realizado, el alelo Ccace2R se observó en 25 de las 27 localidades españolas muestreadas en el
territorio español, incluyendo las Islas Baleares y Canarias. Sin embargo, este alelo no se detectó
en poblaciones procedentes de once países y de cinco continentes.
El análisis de la presencia del alelo Ccace2R en las líneas resistentes a malatión durante el
proceso de selección en el laboratorio mostró una rápida disminución de los homocigotos, tanto
para el alelo susceptible como para el alelo de resistencia, en favor de los individuos heterocigotos.
II
Así, después de 52 generaciones de selección, se observó que la totalidad de los individuos
analizados de la línea W-10Km presentaban un genotipo heterocigoto para la mutación AChE
G328A. Este desequilibrio contradice la segregación mendeliana esperada para un gen con dos
alelos pero podría ser explicado por la existencia de una duplicación del gen Ccace2. La
demostración de la presencia de esta duplicación se realizó mediante: i) el cruzamiento de
individuos heterocigotos de la línea W-10Km con homocigotos susceptibles de la línea C, que dio
lugar a una descendencia en la que el 100% de los individuos eran heterocigotos; ii) la evaluación
del número de copias del gen Ccace2 por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), que resultó dos
veces mayor en individuos de la línea W-10Km en comparación con los de la línea C; iii) el análisis
del nivel de expresión de Ccace2, que fue el doble en la línea W-10Km con respecto a la línea C, y
iv) el estudio de la actividad AChE, que resultó mayor en los individuos de la línea W-10Km. Según
los resultados obtenidos, una duplicación del gen Ccace2 provoca la coexistencia en un mismo
cromosoma del alelo silvestre y del alelo mutado y, además, las dos copias del gen Ccace2, al estar
ligadas, producen una heterocigosis permanente (Ccace2RS). De esta manera se explica que el
hecho de que 100% de los individuos de la línea W-10Km mostrasen un perfil de restricción
correspondiente a un individuo heterocigoto ya que, en realidad, eran homocigotos estructurales
para la duplicación (genotipo CCace2RS/RS). Se ha detectado un coste biológico asociado a la
duplicación que consiste en un incremento en la mortalidad acumulada de los adultos a partir del
séptimo día después de la emergencia. La descripción de la duplicación Ccace2RS supone la
identificación de un nuevo mecanismo de resistencia a malatión en C. capitata. Finalmente,
mediante el diseño de un método de doble PCR-RFLP se determinó la presencia de la duplicación
Ccace2RS en la mayoría de las poblaciones españolas. La proporción de individuos portadores de la
duplicación osciló entre el 5% y el 35%, observándose los mayores valores de frecuencia en las
poblaciones de C. capitata recogidas en la cuenca mediterránea.
Podemos por lo tanto concluir que la resistencia a malatión asociada a la mutación AChE
G328A y a la duplicación Ccace2RS está ampliamente establecida en las poblaciones españolas de
C. capitata. Nuestros resultados desaconsejan la utilización del malatión (si fuera de nuevo
autorizado) o de otros organofosforados para el control de esta plaga. Además, una de las líneas
resistentes a malatión mostró resistencia cruzada frente a insecticidas con diferentes modos de
acción y que se utilizan actualmente para el control de C. capitata, tales como lambda-cialotrina y
lufenurón. La alta susceptibilidad a espinosad observada en las poblaciones españolas, así como la
reducida resistencia cruzada estimada para este insecticida, sugieren que su utilización es
adecuada para el control de la plaga. Sin embargo, la utilización de un sólo insecticida puede
entrañar riesgos por favorecer la selección de resistencia, de hecho, mediante selección en
laboratorio se obtuvo una población altamente resistente a espinosad. Por tanto, es recomendable
implementar programas de control integrado y de manejo de la resistencia en C. capitata utilizando
III
distintos sistemas de control e insecticidas con diferentes mecanismos de acción que permitan su
sostenibilidad en el tiempo. Los sistemas de detección de alelos de resistencia desarrollados en
este trabajo permitirán la detección precoz de resistencia en campo, facilitando la decisión sobre el
sistema de control más adecuado. Además, los conocimientos generados podrán contribuir al
desarrollo de nuevos sistemas de detección para otros mecanismos de resistencia.
IV
Abstract.
The Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824), is considered one of the
most harmful pests in fruit crops. Until 2009, when malathion use was banned due to its not
inclusion in the Annex I of Directive 91/414/EEC, the application of this organophosphate (OP)
insecticide in Spain increased gradually due to the large economic losses caused by C. capitata.
The increase in the frequency of treatments resulted in the development of resistant field
populations. The study of a malathion-resistant population, collected in 2004 in Castelló
(Comunidad Valenciana), allowed the identification of two resistance mechanisms: a single point
mutation (G328A) in the target acetylcholinesterase (AChE), as well as a metabolic resistance
mechanism, most likely carboxylesterase-mediated.
Taking all the preceding into account, we studied the malathion resistance mechanisms in
C. capitata. During the development of this PhD Thesis malathion use was banned by the
European Union, being replaced by other insecticides, such as spinosad and lambda-cyhalotrin.
Within this new working frame, the need to analyse the possible existence of cross-resistance to
these insecticides and the susceptibility to spinosad in field populations was raised. This would
define the baseline for future studies on resistance mechanisms.
Firstly, through discriminant dose bioassays, we analysed malathion and spinosad
susceptibility in twelve C. capitata populations from Andalucia, Aragon, Cataluña, C. Valenciana
and the Baleares Islands. Our results suggest the presence of malathion-resistant individuals in
most of the populations analysed. Regarding spinosad, we noticed a high susceptibility to this
biologically derived insecticide in most of the populations, but in the one collected in Xabia
(Alicante), which had a susceptibility level two times lower than the rest of populations. Through
laboratory selection, we obtained two malathion-resistant strains, W-4Km and W-10Km, with
resistance levels 178- and 400-fold, respectively, compared to the control susceptible C strain.
Besides, a strain highly-resistant to spinosad (Xabia-W-100s), 500-times more resistant than
control C strain, was selected.
In order to decide the most appropriate management strategy for the pest, we studied the
susceptibility to different insecticides in the malathion-resistant W-4Km strain. We detected a
V
moderated cross-resistance to the OPs fenthion, diazinon, phosmet, trichlorphon and methylchlorpyrifos (7- to 16-fold), and to the carbamate carbaryl, the pyretroid lambda-cyhalotrin and the
chemosterilizer lufenuron (4- to 6-fold). On the other hand, cross-resistance to spinosad was low
(1.5-fold). It is important to note that resistance levels to all insecticides were one or two orders of
magnitude less than that observed against malathion in W-4Km strain (178-fold), a fact that might
be due to, at least, two possible causes: mutation AChE G328A may provide a higher insensitivity
to malaoxon (the active form of malathion) than to other insecticides having AChE as target,
and/or, secondly, the carboxylesterase-mediated resistance mechanism hydrolyzes malathion more
efficiently than all other analysed insecticides.
To investigate new resistance mechanisms in C. capitata we analysed the diversity of the
cytochrome P450 enzymes, which have been associated to metabolic resistance in insects, and we
developed a new method to detect single point mutations in acetylcholinesterase (Ccace2) and
aliesterase (Ccae7) genes that could appear. Using degenerate primers we obtained 37 CYP genes,
coding P450 enzymes, included in five families. Afterwards, in a phenobarbital-induction study, we
observed that the expression of 4 out of the 6 analysed genes could be induced. On the other
hand, a system was set up to amplify and to sequence from genomic DNA the exons of genes
Ccace2 and Ccae7 where mutations related to insecticide resistance have been found in other
species. The results obtained could facilitate the study of new resistance mechanisms in C. capitata
mediated by these enzymes.
A PCR-RFLP method was designed to detect the presence of the mutation AChE G328A
(resistance allele Ccace2R), with no need to perform bioassays and allowing detecting resistance at
low frequency. According to the analysis, the resistance allele was found in 25 out of 27 sampled
locations in Spain, including the Balearic and the Canary Islands. However, this allele was not
detected in other populations collected in 11 countries from 5 continents.
The follow-up of the presence of the allele Ccace2R in the malathion-resistant strains
during the selection process in the laboratory showed a quick decrease in homozygous individuals,
for both the susceptible and the resistant alleles, favouring heterozygous. Thus, after 52
generations of selection, all the individuals analysed from W-10Km strain showed a heterozygous
genotype for mutation AChE G328A, contradicting mendelian segregation as expected for a gene
with two alleles. Afterwards, we were able to demonstrate that this was caused by the presence of
a duplication of the gene coding acetylcholinesterase by: i) crossing heterozygous individuals from
W-10Km strain with susceptible homozygous from C strain, originating a F1 population in which
100% of individuals were heterozygous; ii) evaluating the number of copies of gen Ccace2 by
quantitative PCR in real time (qPCR), that happened to be twice higher in individuals from W-10Km
VI
strain when compared with C strain; iii) analysing the level of expression of Ccace2, twice in W10Km strain when compared to C strain; iv) studying the acetylcholinesterase activity, that was
higher in individuals from W-10Km strain. According to these results, duplication of gen Ccace2
originates the coexistence of the susceptible and the resistant allele in the same chromosome. The
two linked copies of the gene Ccace2 provoke the existence of permanent heterozygosis
(Ccace2RS). This explains why the 100% of individuals from W-10Km strain showed an
heterozygous restriction pattern since, in fact, they were structural homozygotes for the
duplication (genotype Ccace2RS/RS). A biological cost has been detected associated to this
duplication, consisting in a rise in accumulated adult mortality from the seventh day after
emergence. The Ccace2RS duplication described in this study represents a new resistance
mechanism to malathion in C. capitata. Finally, by the design of a double PCR-RFLP method, the
presence of Ccace2RS duplication was confirmed in most of the Spanish populations. We observed
that the proportion of individuals carrying the duplication oscillated between 5 and 35%, the
frequency being higher in those C. capitata populations collected in the area of the Mediterranean
basin.
Therefore, we can conclude that malathion resistance associated to mutation AChE G328A
and to Ccace2RS duplication are widely distributed in Spanish populations of C. capitata. Our results
advice against the use of malathion (if it came to be newly authorized for use) or other OPs for the
control of this pest. Besides, one of the malathion-resistant strains showed cross-resistance against
insecticides with diverse action modes that are currently used for pest control, such as lambdacyhalotrin and lufenuron. High susceptibility to spinosad in the Spanish populations, as well as the
reduced cross-resistance estimated for this insecticide suggests its adequacy for Medfly control.
However, the use of a single insecticide is a risky strategy since it favours the selection of
resistance. In fact, a population highly resistant to spinosad was obtained through laboratory
selection. Therefore, it is advisable to implement integrated pest management (IPM) and
resistance management programs for C. capitata control. Using insecticides with different modes of
action and diverse control systems would contribute to the sustainability of the pest control. The
resistance allele detection systems developed through this work will allow the early detection of
resistance in the field, making possible the selection of the most appropriate method for pest
control. Besides, the generated knowledge may also contribute to the development of new
detection systems for other resistance mechanisms.
VII
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Capítulo 1
INTRODUCCIÓN GENERAL
1
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
1.1. Ceratitis capitata.
1.1.1. Descripción de la especie y distribución geográfica.
Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824), comúnmente conocida como la mosca mediterránea
de la fruta, pertenece al orden Diptera, suborden Brachycera, familia Tephritidae. Dentro de esta
familia, que engloba a más de 5.000 especies, se encuentran las “verdaderas moscas de la fruta”,
que son un grupo de más de 1.400 especies que emplean frutas carnosas para su desarrollo. Los
principales géneros de tefrítidos son Ceratitis, Bactrocera, Anastrepha y Rhagoletis, y todos ellos
tienen especies que constituyen plagas (Aluja y Mangan, 2008). El género Ceratitis posee
alrededor de 78 especies, de las cuales C. capitata es la más importante. Es una especie polífaga,
que ataca a más de 300 especies frutícolas y hortícolas (Liquido et al., 1991; Copeland et al.,
2002), y es una de las principales plagas de los cultivos frutícolas en el mundo. Es una especie
multivoltina (Bateman, 1972), con tres o cuatro generaciones al año en zonas templadas con
inviernos fríos, y hasta ocho en zonas en las que las temperaturas mínimas en invierno están por
encima de los 0ºC (Ruiz-Castro, 1945), como es el caso de la vertiente mediterránea de la
Península Ibérica.
3
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
La duración de su ciclo biológico, cuando las condiciones ambientales son favorables, es de
aproximadamente un mes, aunque cuando la temperatura es baja puede durar entre dos y tres
meses (Christenson y Foote, 1960). La hembra de C. capitata penetra la piel del fruto por medio
del oviscapto (Fig. 1.1.a) y deposita en su interior de uno a diez huevos, que eclosionan
transcurridos entre dos y cuatro días (McDonald y McInnis, 1985). Las larvas, que pasan por tres
estadios, se alimentan de la pulpa de la fruta en la que se hospedan hasta que, una vez alcanzado
el tercer estadio, saltan del fruto para pupar en el suelo. Los individuos adultos emergen tras un
período de entre seis y once días, dependiendo de la temperatura, son de color pardo amarillento y
pueden alcanzar los 5 mm de longitud. Existen rasgos anatómicos que permiten una clara
diferenciación sexual a simple vista: las hembras presentan un ovipositor al final del abdomen
(Fig.1.1.b) y los machos tienen un par de quetas negras en forma de rombo situadas en la región
cefálica frontal. (Fig. 1.1.c/d).
a
b
c
d
Figura 1.1. Detalle del ovipositor de las hembras y de las quetas de los machos
de C. capitata. (a) Momento de la puesta de los huevos en el fruto por parte de la hembra. (b)
Detalle del ovipositor. (c) Cabeza de un macho de C. capitata. (d) Detalle de la queta característica
de los machos de la especie. Las micrografías, tomadas con microscopio electrónico de barrido,
han sido realizadas en el Servicio de Microscopía de la UCM.
C. capitata es una especie originaria de la zona subsahariana de África, desde donde se ha
extendido al resto del mundo (Fig. 1.2), principalmente a la región mediterránea y a zonas del
centro y sur de América, ocupando zonas templadas, tropicales y subtropicales (Fischer-Colibrie y
4
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Busch-Petersen, 1989). Aunque con una distribución más reducida, también se pueden encontrar
poblaciones de este tefrítido en EE.UU., México y zonas de Asia, Sudáfrica y Australia (Hagen et
al., 1981; Fimiani, 1989; Fletcher, 1989; Davies et al., 1999, EPPO, 2011), siendo considerada
actualmente como una importante plaga de cuarentena en numerosos países (Malacrida et al.,
2007). En España su distribución es amplia, encontrándose poblaciones tanto en la Península
Ibérica como en las Islas Baleares y Canarias (Fimiani, 1989; Beroiz et al., 2012).
Ampliamente distribuida
Distribución limitada
No presente
EPPO (European and Mediterranean
Plant Protection Organization), 2011
Figura 1.2. Distribución de la mosca mediterránea de la fruta.
Los tefrítidos han evolucionado hacia un estilo de vida de fitófagos oportunistas, por lo que
las plantas que utilizan como hospedador tienen una gran influencia tanto en la supervivencia de la
especies como en su dispersión geográfica. Además, debido a la combinación de factores naturales
y humanos, como la globalización del comercio, esta familia de dípteros ha logrado extenderse
rápidamente por todo el mundo (Malacrida et al., 2007).
1.1.2. Importancia como plaga.
La picadura de la hembra de C. capitata durante la oviposición produce un orificio en la
piel del fruto que favorece la entrada de microorganismos como hongos y bacterias en su interior.
Esto, junto con el efecto producido por las galerías originadas por las larvas, favorece una
prematura caída del fruto y su putrefacción, impidiendo que éste pueda ser empleado para el
consumo humano.
5
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Según la EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization) en Europa y
en la región mediterránea, algunos de los principales hospedadores de C. capitata son los cítricos
(Citrus spp.), los aguacates (Persea americana), los higos (Ficus carica), los kiwis (Actinidia
deliciosa), los mangos (Mangifera indica), los nísperos (Mespilus germanica) y los melocotones
(Prunus spp.) (EPPO, 2011). En España, desde 1955, el Ministerio de Agricultura considera a la
mosca mediterránea de la fruta como plaga de especial incidencia en la agricultura.
El censo agrario realizado en 2009 por el Instituto Nacional de Estadística (consultados en
INE, 2012) muestra que España dedica en torno a 300.000 ha al cultivo de cítricos, principalmente
en la Comunidad Valenciana, Región de Murcia, Andalucía, Islas Baleares y Cataluña. Según los
datos de la FAO del año 2010 (consultados en FAO, 2012), España es el primer productor europeo
de cítricos con más de cinco millones de toneladas y uno de los principales productores a nivel
mundial, sólo superado por China, Brasil, India, EE.UU. y México (Fig. 1.3).
Mundo
25000
Europa
6000
2010
2010
Cítricos
Mandarinas y naranjas
Mandarinas y naranjas
Producción (t x 1000)
Producción (t x 1000)
20000
Cítricos
5000
15000
10000
4000
3000
2000
5000
1000
0
0
China
Brasil
India
EE.UU. México España Turquía Egipto
España
Italia
Grecia
Portugal
Croacia
Figura 1.3. Principales países productores de cítricos. Datos del año 2010,
pertenecientes a la FAO.
Además, desde mediados de los años sesenta, España ha sido ininterrumpidamente el
mayor exportador de naranjas y mandarinas a nivel mundial. Por ejemplo, en 2009 exportó
alrededor de 3 millones de toneladas (Fig. 1.4), lo que representa un 56% de la producción total
de los cítricos del país, y cuyo valor de mercado superó en 2009 los dos mil trescientos millones de
euros (consultado en FAO, 2012).
Las pérdidas económicas directas ocasionadas por C. capitata en los cultivos de cítricos
españoles son muy elevadas debido al daño producido en la fruta tras el ataque de la plaga,
6
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
pérdidas que se han visto incrementadas en los últimos años tras la expansión de los cultivos de
variedades extra-tempranas de cítricos, muy sensibles al ataque de la mosca. Por ejemplo, en la C.
Valenciana, además de en los cítricos, C. capitata es capaz de desarrollarse en una gran cantidad
de frutos a lo largo del año: desde las frutas de primavera (níspero, ciruela, melocotón…) hasta las
de final de año (mandarinas, caqui…), pasando por una gran variedad de especies intermedias, lo
que mantiene activas las poblaciones de C. capitata durante todo el año, produciendo graves
pérdidas económicas en los cultivos citrícolas. Además de las pérdidas directas, se generan
pérdidas indirectas, causadas por las restricciones de cuarentena exigidas en algunos países para
la exportación y la comercialización. Actualmente, según la EPPO, C. capitata está considerada
como una plaga de cuarentena tipo A2, categoría que posee unos estrictos protocolos de
cuarentena. Concretamente el protocolo para C. capitata ha sido revisado recientemente,
incluyendo para su diagnóstico caracteres morfológicos y métodos moleculares (EPPO, 2011).
2009
Argentina
Mandarinas
Marruecos
Naranjas
China
Países Bajos
Grecia
Turquía
EE.UU.
Sudáfrica
España
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Cítricos exportados (t x 1000)
Figura 1.4. Principales exportadores de cítricos a nivel mundial. Datos del año
2009, pertenecientes a la FAO.
1.1.3. Métodos de lucha contra C. capitata.
Las principales estrategias de control de la mosca mediterránea de la fruta que se han
realizado en España durante los últimos años son el monitoreo de las poblaciones y el control
químico (Primo-Millo et al., 2003). El monitoreo de las poblaciones consiste en el empleo de
7
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
trampas que permiten, mediante la captura de individuos adultos, evaluar la abundancia de la
plaga a lo largo de una campaña. El control químico es el método más utilizado, ya sea
individualmente o combinado con otros métodos, y se basa en la aplicación de diferentes
compuestos insecticidas.
A continuación se describen brevemente algunos aspectos de los insecticidas que se han
empleado en este trabajo y que, a excepción del carbaril, han sido o están siendo aplicados en
España para combatir la mosca mediterránea de la fruta en los cultivos de cítricos:
· Organofosforados. Los organofosforados son un grupo de insecticidas que, junto con los
carbamatos, inhiben la actividad enzimática de la acetilcolinesterasa (Eto, 1974). En este trabajo
hemos estudiado los efectos de seis organofosforados: fosmet, aplicado en trampas; diazinón,
empleado para el tratamiento de la fruta caída al suelo; y malatión, fentión, triclorfón y metilclorpirifós, de aplicación aérea.
· Espinosad. El espinosad es un insecticida de origen biológico constituido por productos
(espinosinas) derivados de la fermentación realizada por una bacteria Gram + llamada
Saccharopolyspora spinosa. El mecanismo de acción consiste principalmente en la activación de los
receptores nicotínicos de la acetilcolina (Salgado et al., 1997), aunque también se han observado
efectos negativos sobre la función del receptor GABA (Salgado, 1998). Este insecticida se aplica en
una formulación que incluye un cebo de proteínas atrayentes y suele suministrarse a los cultivos
en bandas o en parcheo. Su utilización, junto con el piretroide lambda-cialotrina, es la más
extendida tras la prohibición del malatión a partir de 2009.
· Lambda-cialotrina. Este insecticida es un piretroide sintético que actúa modulando los canales
de sodio de las células nerviosas responsables de la transmisión del impulso nervioso (Narahashi,
1996). Su empleo frente a C. capitata se ha visto incrementado a partir de 2009 al no permitirse el
uso de malatión. La aplicación de este insecticida se realiza en formulación cebo.
· Carbaril. Es el único de los insecticidas ensayados en este trabajo que no ha sido autorizado
para su uso contra C. capitata en España. Pertenece a la familia de los carbamatos y su
mecanismo
de
acción
es
similar
al
de
los
organofosforados,
inhibiendo
la
actividad
acetilcolinesterasa (revisado por Oakeshott, 2005). El carbaril actúa por contacto, penetrando en el
insecto a través de la cutícula.
· Lufenurón. El lufenurón es una benzoilurea que actúa como regulador del crecimiento,
inhibiendo la biosíntesis de quitina y produciendo alteraciones en el desarrollo de los insectos
8
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
durante sus primeros estadios (Navarro-Llopis et al., 2004). Además, en C. capitata, este
insecticida posee una actividad quimioesterilizante (Casaña-Giner et al., 1999). El lufenurón se
emplea en trampas en combinación con un cebo atrayente y su uso se ha incrementado durante
las últimas campañas (Navarro-Llopis et al.; 2010).
En España, el tipo de estrategia empleada para el control de la plaga dependerá de la
especie de fruta afectada y de la comunidad autónoma en la que se lleve a cabo. En el plan de
actuación integral para el control de la mosca mediterránea de la fruta en la C. Valenciana, donde
el control de C. capitata es clave para la producción y exportación de cítricos se incluyen, además
del control químico y del monitoreo, otros métodos de control como son el trampeo masivo, la
técnica del insecto estéril (TIE) y la quimioesterilización (Castañera, 2003). Además, una práctica
muy útil para disminuir los efectos de la plaga es la de eliminar toda la fruta caída en el suelo o
que queda en el árbol tras la recolección para evitar la supervivencia de la mosca en su interior.
El trampeo masivo consiste en capturar el mayor número de individuos de C. capitata que
sea posible mediante trampas que contienen un cebo atrayente. Esta metodología se emplea
normalmente a finales de la primavera y principios del verano, época en la que se produce un pico
en la abundancia poblacional de la plaga. Su aplicación es especialmente útil en los terrenos
próximos a las zonas urbanas, donde la aplicación de los tratamientos insecticidas por vía aérea es
complicada (Alemany et al., 2004; Navarro-Llopis et al., 2008; Muñoz y García-Marí, 2009).
La técnica del insecto estéril (TIE) o control autocida comenzó a aplicarse mediante un
programa piloto en el municipio valenciano de Lliria durante los años 2003-2006. Desde 2006
hasta la actualidad el programa de actuación se ha extendido a toda la C. Valenciana. Este método
de lucha consiste en la suelta de millones de machos estériles que se introducen en las poblaciones
salvajes apareándose con las hembras y produciendo huevos infértiles (Gilmore, 1989). En estos
momentos la capacidad de producción de la biofactoría, situada en Caudete de las Fuentes
(Valencia), es de aproximadamente 500 millones de pupas a la semana. La principal ventaja de
esta técnica es su elevada especificidad, ya que los machos estériles únicamente afectarían a la
reducción de la descendencia de su misma especie. Sus principales desventajas son dos: sólo es
eficaz cuando la abundancia de las poblaciones salvajes de la mosca es baja, por lo que su
utilización ha de ser complementada con la de otros métodos de control (Argilés y Tejedo, 2007), y
conlleva un elevado coste económico, al requerir la producción de millones de insectos a la
semana.
La reciente incorporación del quimioesterilizante lufenurón a las trampas con cebo
atrayente también ha contribuido a una reducción significativa de las poblaciones de C. capitata
9
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
(Navarro-Llopis et al., 2004; 2010). La esterilidad provocada por este insecticida se ha observado
tanto en hembras que han ingerido lufenurón, como en las que han copulado con machos que han
ingerido el quimioesterilizante (Casaña-Giner et al., 1999).
El control biológico, basado en la importación y el establecimiento de especies exóticas de
depredadores y parasitoides, ha sido utilizado con éxito frente a varias plagas de cítricos (Wharton,
1989; Jacas et al., 2006). El control biológico de C. capitata se basa principalmente en la suelta
masiva de parasitoides, método que tuvo mucho éxito en Hawai (Wong et al., 1991) y que
actualmente, combinado con la liberación de machos estériles, se está aplicando en México,
Guatemala y Costa Rica (Gurr y Kvedaras, 2009). En España, en el año 2002, se importaron dos
especies de parasitoides bracónicos de los géneros Diachasmimorpha y Fopius y se realizaron
ensayos para determinar su potencial como agentes de control de la mosca mediterránea de la
fruta (Beitia et al., 2007). Además, se han realizado estudios para establecer el papel de los
depredadores autóctonos en el control de las poblaciones de C. capitata (Urbaneja et al. 2006;
Monzó et al., 2009; 2011).
Incluso con la existencia de tan diversas técnicas, la aplicación de productos químicos
sigue siendo el método más empleado contra C. capitata en España. El Ministerio de Agricultura,
Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA), elabora periódicamente una lista con los productos
fitosanitarios aptos para su aplicación contra la mosca mediterránea de la fruta en España
(http://www.magrama.gob.es/es/agricultura/temas/medios-de-produccion-/productos-fitosanitarios
/fitos.asp). Durante la campaña 2007-2008 los insecticidas aprobados por el Ministerio frente a C.
capitata
fueron
fentión,
malatión,
espinosad
y
lambda-cialotrina.
De
los
insecticidas
organofosforados fentión y malatión, fue este último el más utilizado y se aplicó en su formulación
malatión-cebo en tratamientos aéreos y terrestres con una frecuencia que, en algunas zonas,
alcanzó los diez tratamientos por año. A partir de 2009, debido a la no inclusión del malatión en el
anexo I de la Directiva Europea 91/414/ECC, se prohibió el uso de malatión y se aplicaron
fundamentalmente espinosad y lambda-cialotrina. Además, a partir de la campaña 2008-2009 se
incrementó el uso del trampeo masivo con atrayentes y la aplicación del quimioesterilizante
lufenurón (Navarro-Llopis et al., 2010). A mediados de 2010 (Directiva Europea 2010/17/UE) se
aprobó de nuevo el malatión para su utilización en cultivos de fresas y de especies ornamentales,
pero no para su aplicación contra C. capitata. Es importante destacar que las poblaciones de C.
capitata analizadas en esta tesis fueron recogidas antes de 2009, época en la que el uso de
malatión estaba autorizado.
10
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
1.2. Resistencia a insecticidas.
1.2.1. Definición de resistencia.
Según el IRAC (The Insecticide Resistance Action Committee) la resistencia se puede
definir como una disminución heredable en la susceptibilidad de una plaga a un determinado
insecticida que se refleja en un fallo continuado para alcanzar los niveles de control esperados aun
cuando el insecticida se aplica en las concentraciones recomendadas (IRAC, 2012). La resistencia
surge como una respuesta evolutiva natural al estrés ambiental y, aunque su aparición puede ser
retrasada, difícilmente puede ser evitada (Hoy, 1998). Por ello, el control de plagas debe ir
acompañado de un programa de manejo de la resistencia, siempre en el contexto del control
integrado de plagas.
A finales de los años cuarenta, pocos años después de su primera aplicación como
insecticida, se describió el primer caso de resistencia a DDT en Musca domestica (Sacca, 1947).
Este
fenómeno
se
ha
ido
repitiendo
con diferentes
insecticidas
hasta
la
actualidad,
independientemente del mecanismo de acción y de la aparición de nuevas formulaciones (Whalon
et al., 2012). Se han descrito casos de resistencia frente a los principales grupos de insecticidas:
ciclodienos; carbamatos; DDT y análogos; organofosforados y piretroides; y más recientemente
frente a los nuevos insecticidas neonicotinoides y espinosinas. El empleo de un determinado
insecticida favorece la selección de aquellos individuos portadores de genes que confieren
resistencia a dicho insecticida. La descendencia de estos individuos resistentes heredará esta
característica, aumentando así el número de individuos resistentes en una determinada población,
lo que provocará dificultades en el control de la plaga. Además, la pérdida de efectividad del
insecticida, debida al aumento de la resistencia de la población, suele ir asociada a un incremento
en la frecuencia de los tratamientos, lo que produce un coste ambiental y una disminución de la
diversidad biológica del ecosistema.
11
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
1.2.2. La resistencia a insecticidas en números.
A partir de la base de datos de Arthropod Pesticide Resistance Database (Whalon et al.,
2012) se puede realizar un análisis de la evolución de los casos de resistencia a lo largo del
tiempo, así como de la distribución de los casos entre los diferentes taxones de insectos y ácaros.
Desde los primeros descubrimientos de fallos en el control químico de los artrópodos plaga a
principios del siglo XX, el número de especies en los que se han identificado casos de resistencia a
insecticidas y/o acaricidas ha incrementado de manera exponencial hasta alcanzar las 573 especies
en la actualidad (Fig. 1.5).
600
nº especies
500
400
300
200
100
0
1900
1920
1940
1960
1980
2000
2020
año
Figura 1.5. Evolución de la resistencia a pesticidas. Se representa el número
acumulado de especies de artrópodos en las que se ha detectado resistencia a insecticidas y/o
acaricidas durante el último siglo (datos tomados de Whalon et al., 2012).
Hasta el año 2012 se han descrito 8.795 casos de resistencia a insecticidas en 488
especies de insectos pertenecientes a 96 familias de 13 órdenes. El orden Diptera engloba el 40%
de las especies descritas implicadas en procesos de resistencia, seguido de los órdenes
Lepidoptera, Coleoptera y Homoptera (Fig. 1.6.A). Dentro del orden Diptera, la familia Culicidae
contiene la mayoría de las especies relacionadas con resistencia (Fig. 1.6.B) y el 20% del total de
los casos detectados. Esto se debe, problablemente, a que esta familia está muy estudiada, ya que
dentro de ella se encuentran los géneros Anopheles y Aedes, vectores de enfermedades como la
malaria, la fiebre amarilla o el dengue, además del género Culex, implicado en la transmisión de la
enfermedad de la fiebre del Nilo.
12
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Hymenoptera
3%
Otros
7%
Tephritidae
2%
A
B
Chironomidae
3%
Hemiptera
5%
Calliphoridae
3%
Diptera
40%
Homoptera
12%
Otras
14%
Anthomyiidae
3%
Agromyzidae
4%
Simuliidae
7%
Culicidae
64%
Coleoptera
15%
Lepidoptera
18%
DÍPTEROS
INSECTOS
Figura 1.6. Distribución de las especies de insectos en los que se han
identificado casos de resistencia. Se indica la proporción de las especies de insectos en los
órdenes de la clase Insecta (A) y la distribución de las especies de dípteros en las diferentes
familias (B). Datos tomados de Whalon et al. (2012).
Es importante tener presente que dentro de las casi seiscientas especies de artrópodos en
las que se han descrito casos de resistencia no todas presentan el mismo número de citas de
poblaciones resistentes. Así, del total de casos de resistencia a pesticidas detectados hasta la
fecha, únicamente nueve especies de insectos y un ácaro representan el 35% del total de los casos
(Tabla 1.1).
Tabla 1.1. Principales especies de artrópodos ordenadas según el número de
casos de resistencia. (%) Representa el porcentaje de casos de cada especie con respecto al
total de casos observados en los artrópodos. Datos tomados de Whalon et al. (2012).
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Especie
Familia
Orden
Nº casos
%
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Helicoverpa armigera
Noctuidae
Lepidoptera
639
6
Plutella xylostella
Plutellidae
Lepidoptera
453
5
Bemisia tabaci
Aleyrodidae
Homoptera
428
4
Myzus persicae
Aphididae
Homoptera
391
4
Tetranychus urticae
Tetranychidae
Acari
389
4
Aedes aegypti
Culicidae
Diptera
267
3
Culex quinquefasciatus
Culicidae
Diptera
256
3
Spodoptera litura
Noctuidae
Lepidoptera
238
2
Musca domestica
Muscidae
Diptera
227
2
Blattella germanica
Blattellidae
Dermaptera
213
2
______________________________________
TOTAL
3501
35
______________________________________________________________________________________________________________________________________
13
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
1.2.3. Resistencia cruzada.
Una determinada población presenta resistencia cruzada cuando la resistencia que posee
frente a un determinado insecticida favorece la resistencia frente a otros insecticidas, aunque la
población no haya sido expuesta jamás a dichos insecticidas (IRAC, 2012).
En el orden Diptera la mayoría de citas de resistencia cruzada a insecticidas pertenecen a
estudios realizados en mosquitos (géneros Anopheles, Culex o Aedes), debido al gran interés en
conocer la susceptibilidad a diferentes insecticidas de estos géneros que incluyen varios vectores
de enfermedades infecciosas. Uno de los primeros trabajos de resistencia cruzada lo realizó
Davidson en 1958 estudiando la susceptibilidad a diferentes tipos de insecticidas en tres especies
del género Anopheles. En él, por ejemplo, describió que una población de A. gambiae altamente
resistente al organoclorado dieldrina mostraba resistencia cruzada a otros ciclodienos, pero no
frente a DDT. Además, en este género de mosquitos, se han descrito recientemente poblaciones
resistentes a piretroides con resistencia cruzada a DDT (Fonseca-González et al., 2009). Por otro
lado, en una población de C. pipiens resistente al organofosforados temefós se observó que
mostraba resistencia cruzada a otros organofosforados y a DDT (Bisset et al., 1997). En el género
Aedes se han descrito poblaciones resistentes a temefós de A. aegypti con resistencia cruzada a
varios organofosforados (Rodríguez et al., 2002).
En el suborden Brachycera del orden Diptera, que engloba a las moscas propiamente
dichas, se ha detectado resistencia cruzada a varios organofosforados en Lucilia cuprina (Campbell
et al., 1998a). Además, se ha descrito resistencia cruzada frente a otros piretroides en una
población de M. domestica resistente a permetrina (Liu y Yue, 2000). Asimismo, se ha descrito
resistencia cruzada al quimioesterilizante lufenurón en una línea de laboratorio de Drosophila
melanogaster resistente a DDT (Daborn et al., 2002; Le Goff et al., 2003). Una de las escasas
especies de importancia agrícola en la que se ha estudiado el fenómeno de resistencia cruzada ha
sido en Bactrocera dorsalis, en la que una población resistente a espinosad no mostró resistencia
cruzada frente a los diez insecticidas ensayados, entre los que había organofosforados, piretroides
y un carbamato. En cambio, si que se observó cierta resistencia cruzada con respecto a espinosad
(> 5 veces) en dos líneas de laboratorio de esta especie resistentes a los organofosforados
malatión y naled (Hsu y Feng, 2006).
14
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
1.2.4. Mecanismos de resistencia.
Existen diferentes mecanismos mediante los cuales los insectos puedan desarrollar
resistencia a los insecticidas. El conocimiento de los distintos mecanismos de resistencia es
esencial para definir la estrategia más adecuada para su manejo. Sin embargo, hay que tener en
cuenta que una determinada población puede presentar más de un mecanismo de resistencia,
provocando mayores niveles de resistencia (Scott y Georghiou, 1986). Por ejemplo, frente al
organofosforado malatión, además de haber sido descrita la resistencia debida a mutaciones
puntuales en la molécula diana, también se ha observado que la resistencia puede estar provocada
por un incremento en la actividad metabólica del insecto, ya sea mediada por las citocromo P450
(Welling et al., 1974; Morton y Holwerda, 1985; Maitra et al., 2000), por las glutatión Stransferasas (Wool et al., 1982; Taskin y Kence, 2004) o por las esterasas (Campbell et al., 1998b;
Hemingway y Karunaratne, 1998).
Los mecanismos de resistencia se clasifican en cuatro grandes grupos: resistencia
metabólica, resistencia por modificación de la molécula diana, resistencia a la penetración y
resistencia por comportamiento o etológica (Scott, 1991; Feyereisen, 1995; Hemingway et al.,
2004; Feyereisen, 2005).
1.2.4.1. Resistencia metabólica.
La resistencia metabólica es el tipo de resistencia más habitual en insectos y se produce
cuando un insecticida, hidrolizado o transformado bioquímicamente, disminuye o pierde su
capacidad de interaccionar con la molécula diana. Además, dentro de este tipo de resistencia se
puede incluir el secuestro del insecticida por parte de una enzima. En una línea resistente, la
detoxificación del insecticida se puede producir porque exista una enzima que metabolice más
eficientemente dicho insecticida, o debido a que la cantidad de enzimas encargadas de metabolizar
el xenobiótico sea mayor que la presente en una línea susceptible. La resistencia metabólica se
debe principalmente a la implicación de tres grandes familias de enzimas: las glutatión Stransferasas (GSTs), las esterasas y las citocromo P450 (Hemingway, 2000; Ranson et al. 2002;
Feyereisen, 2005). Además, es importante tener en cuenta que la resistencia metabólica no se
produce exclusivamente por la acción de estas tres familias de enzimas, por ejemplo,
recientemente se ha descrito un nuevo tipo de resistencia metabólica a insecticidas mediada por
15
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
una familia de glicoproteínas transportadoras de membrana que modulan el paso de sustancias a
través de las membranas (Buss, 2008; Gahan et al., 2010; Labbé et al., 2011).
Los sinergistas son compuestos que incrementan la efectividad de los insecticidas mediante
el bloqueo de los sistemas de detoxificación que pudiesen inactivar al insecticida (Bernard y
Philogene, 1993). El empleo de sinergistas ha sido útil para averiguar los mecanismos de
resistencia en varias especies de artrópodos (Liu y Yue, 2000; Ahmad y Hollingworth, 2004;
Espinosa et al., 2005). Los sinergistas más empleados, que inhiben a las tres principales familias
de enzimas implicadas en detoxificación, son el DEM (maleato de dietilo) como inhibidor de las
glutatión
S-transferasas
(Mulder
y
Ouwerkerk-Mahadevan,
1997);
el
DEF
(SSS-
tributilfosforotritioato) que inhibe a las esterasas (Oakeshott et al., 2005); y el PBO (butóxido de
piperonilo) que inhibe la acción de las citocromo P450 (Feyereisen, 2005).
1.2.4.1.1. Glutatión S-transferasas.
Las glutatión S-transferasas (GSTs) conforman una familia de enzimas implicadas en la
detoxificación de multitud de xenobióticos. Estas enzimas catalizan la unión de una molécula de
glutatión al insecticida, dando lugar a un compuesto hidrosoluble que se excreta más fácilmente.
Además, las GSTs pueden utilizar el glutatión como cofactor para catalizar la deshidrocloración de
algunos insecticidas (revisado por Enayati et al., 2005). En los dípteros, las GSTs se han
relacionado con la resistencia a organofosforados, organoclorados, piretroides y DDT, tanto por
sobreexpresión como por duplicación génica (Ranson et al., 2001; Ortelli et al., 2003; Enayati et
al., 2005; Lumjuan et al., 2005). Hasta el momento se han descrito siete genes implicados en
resistencia que codifican para GSTs, cinco de ellos se sobreexpresan en líneas resistentes y dos de
ellos han sufrido una duplicación génica (Li et al., 2007).
1.2.4.1.2. Esterasas.
Las carboxilesterasas o esterasas constituyen una gran familia de enzimas que son
responsables el metabolismo lipídico y de la detoxificación de xenobióticos, entre otras funciones.
En insectos se agrupan en clados filogenéticos ya que el origen de las diferentes esterasas se debe
a la duplicación de un gen ancestral y a su posterior divergencia, organizándose finalmente en
clusters (revisado por Oakeshott et al., 2005). Las esterasas están implicadas en resistencia a
16
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
organofosforados, carbamatos y piretroides debido a mutaciones puntuales, duplicaciones génicas,
a regulación de la expresión, o a una combinación de los tres mecanismos (Li et al., 2007). La
duplicación de determinados genes que codifican para esterasas produce un incremento en la
degradación y el secuestro de los insecticidas, mecanismo que ha sido descrito en dípteros
(Raymond et al., 1998; Karunaratne et al., 1998) y hemípteros (Field y Devonshire, 1998; Field et
al., 1999; Vontas et al., 2000). Además, se han descrito casos de resistencia por sobreexpresión de
las esterasas tanto en dípteros (Mouches et al., 1987; Hemingway y Karunamaratne, 1998; Qiao et
al., 1998; Hemingway et al., 1998; Guerrero, 2000; Hawkes y Hemingway, 2002; Tao et al. 2006)
como en pulgones (Field y Devonshire, 1998; Field et al., 1999; Pan et al., 2009). Finalmente, se
han encontrado poblaciones resistentes a organofosforados de dípteros (Whyard et al., 1995;
Campbell et al., 1998b; Claudianos et al., 1999) e himenópteros (Zhu et al., 1999), en los que una
mutación puntual incrementa la capacidad hidrolítica de las esterasas disminuyendo al mismo
tiempo su actividad carboxilesterasa. Una de las esterasas más importantes en resistencia es la
aliesterasa, localizada dentro del cluster de las alfa-esterasas. Se han identificado dos mutaciones
puntuales implicadas en procesos de resistencia en L. cuprina y M. domestica (Newcomb et al.,
1997; Claudianos et al., 1999; Taskin y Kence, 2004; Hartley et al., 2006). Concretamente, la
mutación Gly137Asp confiere resistencia a organofosforados en general, mientras que la mutación
Trp251Ser/Leu es la responsable de resistencia específica a malatión (Campbell et al., 1998a,
1998b; Taskin y Kence, 2004).
1.2.4.1.3. Enzimas citocromo P450.
El capítulo 3 de esta tesis se centra exclusivamente en el estudio de esta familia de
enzimas de detoxificación, por lo que se ha realizado una descripción más exhaustiva de ellas en
los siguientes apartados, basada en la revisión bibliográfica realizada por Feyereisen (2012).
1.2.4.1.3.1 Definición y nomenclatura.
Las proteínas P450 son el producto de la traducción de los genes CYP que codifican para
las enzimas monooxigenasas. Todas ellas presentan un pico de absorción a una longitud de onda
de 450 nm, característica que da nombre a esta familia proteica (Omura y Sato, 1964). La principal
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1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
reacción que realizan estas enzimas es la transferencia de un átomo de oxígeno desde el oxígeno
molecular hasta un determinado sustrato, tal y como generaliza la siguiente reacción:
RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+
Sin embargo, esta transferencia del átomo de oxígeno no es la única reacción catalítica
que realizan estas enzimas. Las citocromo P450 poseen una gran variedad de actividades
enzimáticas (oxidasa, reductasa, isomerasa…) y en conjunto pueden catalizar más de 60
reacciones químicas (Ortiz de Montellano, 1995; Mansuy, 1998; Guengerich, 2001).
Las citocromo P450 conforman una de las familias proteicas más numerosas y están
presentes en todos los organismos: bacterias, hongos, plantas y animales (Werck-Reichhart y
Feyereisen, 2000). El genoma humano incluye 57 genes CYP, mientras que en insectos su número
varía desde los 36 genes identificados en el piojo humano Pediculus humanus (Lee et al., 2010)
hasta los 170 genes descritos en el mosquito Culex quinquefasciatus (Arensburgeret al., 2010). La
gran diversidad de genes P450 es el resultado de sucesivas duplicaciones en el genoma seguidas
de un proceso de divergencia evolutiva en las secuencias duplicadas.
La primera nomenclatura de los genes y proteínas P450 de insectos se realizó cuando sólo
se conocían 65 secuencias, y en ella se nombraban los genes en función del grado de homología
que tenían entre sí las secuencias proteicas que codificaban para dichos genes (Nebert et al.,
1987). Las reglas de nomenclatura han sido revisadas varias veces (Nebert et al., 1991; Nelson et
al., 1993) hasta su formato actual (Fig. 1.7), donde cada gen, escrito en cursiva, se nombra con la
raíz CYP seguida de un número arábigo que indica la familia, de una letra mayúscula que indica la
subfamilia, y finalmente un número arábigo que identifica cada uno de los genes (Nelson et al.,
1996).
CYP: raíz de los genes P450
Familia: >40% identidad con otras proteínas CYP4
Subfamilia: >55% identidad con otras proteínas CYP4U
CYP4U2
Identificador de Gen
Figura 1.7. Nomenclatura de un gen CYP. Reglas consensuadas para la asignación de las
diferentes categorías en las que se clasifican las proteínas P450 (Feyereisen, 2005).
18
1. Introducción general
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Las proteínas codificadas por los genes CYP siguen la misma nomenclatura que los genes
pero se escriben sin cursiva. De esta manera, la nomenclatura actualmente consensuada para los
genes CYP no sigue la nomenclatura consensuada para otros genes (genes en minúscula y
cursiva). Los genes P450 de D. melanogaster (Lindsley y Zimm, 1992) si mantienen la
nomenclatura clásica, únicamente la primera letra del gen se escribe con mayúscula. Así por
ejemplo, hablaríamos del gen CYP6A1 en M. domestica pero del gen Cyp6a2 en D. melanogaster
(revisado por Feyereisen, 2011). Los diferentes alelos de un mismo gen se nombran con un sufijo
“vn”, donde n es un número arábigo que identifica el alelo (Cohen et al., 1992).
1.2.4.1.3.2. Identificación y diversidad.
En 1982 se clonó y secuenció el primer gen P450 (CYP2B1) en la rata común (FujiKuriyama et al., 1982). En insectos, los primeros genes identificados fueron CYP6A1, en M.
domestica (Feyereisen et al., 1989), y Cyp4d1 (Gandhi et al., 1992) y Cyp6a2, en D. melanogaster
(Waters et al., 1992). La amplificación por PCR empleando cebadores degenerados, basados en
secuencias consenso de regiones conservadas, fue el primer paso para aislar cDNA de P450 en
insectos y garrapatas (Feyereisen, 2005). Tomando como referencia la hélice I y la región
conservada que flanquea a la cisteína del grupo hemo para el diseño de los cebadores
degenerados, se pueden obtener productos de PCR de un tamaño aproximada de media kilobase,
lo que representa la región central de los genes P450 y aproximadamente un tercio de la totalidad
de su tamaño (Snyder et al., 1996). Siguiendo esta metodología se han descrito 17 nuevos genes
CYP4 en Anopheles albimanus (Scott et al., 1994) y se ha ampliado la diversidad de genes P450 en
varias especies de insectos (Feyereisen, 2005). El gran número de secuencias parciales obtenidas
produjo dos problemas, en primer lugar, se infravaloró el número de genes encontrados ya que,
debido al pequeño tamaño de las secuencias que se comparaban, genes diferentes fueron
nombrados inicialmente como alelos de un mismo gen. En segundo lugar, el hecho de que las
secuencias identificadas sólo representasen un tercio del total del gen, dificultó el cálculo del
porcentaje de similitud, en el cual se basa la nomenclatura de los genes CYP.
Gracias a la secuenciación del genoma completo de D. melanogaster (Adams et al., 2000)
se pudo concretar el número de genes P450 para esta especie. Se identificaron un total de 90
genes de los cuales 83 codificaban proteínas potencialmente funcionales y los otros siete eran
secuencias parciales o pseudogenes (Tijet et al., 2001). En 2002 se secuenció el genoma de A.
gambiae (Holt et al., 2002) y se identificaron 111 genes CYP, entre los que se describieron cinco
pseudogenes (Ranson et al., 2002). Existe una necesidad de estandarizar las reglas para la
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1. Introducción general
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identificación de los genes P450 (Claudianos et al., 2006; Strode et al., 2006; Lee et al., 2010) ya
que normalmente se producen errores en la descripción de los genes a partir del banco de
secuencias de un genoma debido, por ejemplo, a la fusión de la secuencia parcial de dos genes
próximos (genes con secuencias similares) para dar lugar a un gen híbrido incorrecto. Es muy
importante comparar la estructura intrón/exón de genes similares para facilitar su identificación.
Actualmente, mediante nuevas técnicas de secuenciación, se ha estudiado la diversidad de genes
P450 de varias especies sin necesitad de secuenciar el genoma completo. Así, en 2009 Zagrobelny
et al. obtuvieron gran cantidad de transcritos P450 para larvas de Zygaena filipendulae y Pauchet
et al. en 2010 identificaron 36 nuevos genes CYP en Manduca sexta. Aunque cada vez las técnicas
de secuenciación y los ensamblajes son más precisos, el número de genes CYP identificados en
cada especie puede variar con las revisiones de los ensamblajes de los bancos de secuencias, por
lo que es necesario confirmar la secuencia completa de cada uno de los genes mediante su
amplificación por PCR.
El número de genes CYP identificados en insectos asciende a 1675, repartidos en 59
familias y 338 subfamilias (Nelson, 2009). El conjunto de todos los genes CYP de un determinado
taxón, en analogía con los términos genoma, proteoma o transcriptoma, recibe el nombre de
CYPoma (Lamb et al., 2002). La evolución de los CYPomas se basa en la duplicación génica
seguida de la correspondiente divergencia o de la deleción del gen a lo largo del tiempo evolutivo
(Feyereisen, 2011). Debido al elevado número de genes existentes dentro de un CYPoma, éstos se
dividen en clados filogenéticos o clanes, formados por varias familias CYP. Concretamente en
insectos, los genes se distribuyen en cuatro clanes: CYP-2, CYP-3, CYP-4 y mitocondrial
(Feyereisen, 2006). El clan CYP-2 incluye genes que intervienen en funciones fisiológicas básicas
para los insectos. El clan CYP-3 es el que engloba el mayor número de genes CYP de insectos,
repartidos en unas 30 familias. Las principales familias del clan CYP-3 son CYP6, CYP9 y CYP28.
Los genes de este clan tienen como característica común que intervienen en la respuesta a las
condiciones ambientales externas (Berenbaum, 2002). Los genes incluidos en el clan CYP-4 son
inducibles por xenobióticos y son el grupo de enzimas P450 menos estudiadas en insectos.
Finalmente, el clan mitocondrial incluye P450 de insectos, de vertebrados y otros metazooos
(Feyereisen, 2011), y de las familias englobadas en este clan, la CYP12 es la más importante.
En cuanto a la diversidad observada dentro de la familia Tephritidae, se han identificado
genes CYP en los géneros Ceratitis y Bactrocera. Así, han obtenido secuencias parciales de genes
CYP en B. oleae (Tsoumani et al., 2011) y en B. papayae (ref. GB: AF532768). En B. dorsalis,
recientemente, han clonado y caracterizado los genes CYP6A41 y CYP6EK1 (Huang et al., 2012) y
se ha publicado el resultado de la secuenciación de su transcriptoma, donde se ha estimado que
existen 90 genes CYP (Hsu et al., 2012a). En el único estudio realizado en C. capitata se
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1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
identificaron 14 genes CYP, entre los que se obtuvo la secuencia completa del gen CYP6A10 y la
secuencia parcial del extremo 3’ de 5 genes de la familia CYP4, 8 de la familia CYP6 y un gen sin
clasificar (Danielson et al., 1999).
1.2.4.1.3.3. Estructura y función.
Las citocromo P450 presentan en su estructura génica intrones de pequeño tamaño con la
organización típica GT/AG. La variación en la secuencia aminoacídica es de una magnitud tal que el
único residuo absolutamente conservado en todas la proteínas P450 de distintos organismos es la
cisteína del grupo hemo (Rupasinghe et al., 2006). Estas grandes diferencias observadas en la
secuencia aminoacídica contrastan con el relativamente alto grado de conservación en la
estructura terciaria presente en las proteínas P450 cristalizadas hasta el momento. En proteínas
P450 de insectos se han descrito varias regiones conservadas que coinciden con los principales
motivos que participan en la estabilización global de la estructura terciaria de la proteína: el motivo
ExLR, localizado en la hélice K y el motivo PxxFxPE/DRF.
Las P450 de los insectos se localizan tanto en las membranas de los microsomas como en
las mitocondrias, pero su localización subcelular no está asociada con una determinada función
catalítica. En general, las enzimas citocromo P450 de insectos son conocidas por su capacidad de
metabolizar insecticidas, sin embargo, algunas de estas enzimas poseen además funciones
fisiológicas de vital importancia para los insectos. Por ejemplo, algunas de ellas están implicadas
en el catabolismo de ácidos grasos, mientras que otras participan en la biosíntesis de la hormona
juvenil, de la ecdisona o de diferentes feromonas (Feyereisen, 2005).
La regulación de la transcripción de los genes P450 puede producirse tanto por la
influencia de un metabolito endógeno como de un xenobiótico. Las sustancias exógenas, como
ocurre por ejemplo con algunas sustancias producidas por las plantas, pueden provocar la
inducción de las enzimas P450. Algunos ejemplos de inductores de origen natural aplicados a los
insectos son alcaloides, como la nicotina (Snyder et al., 1995) o la cafeína (Bhaskara et al., 2006) y
terpenoides como el mentol, el α-pineno, el aceite de menta (Ranasinghe et al., 1997) o el
limoneno (Giraudo et al., 2010).
En cuanto a los xenobióticos de origen artificial, el inductor más empleado es el
fenobarbital, capaz de activar la sobreexpresión de una treintena de genes CYP. El efecto del
fenobarbital sobre la expresión de diferentes genes CYP en insectos ha sido evaluado tanto
21
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
mediante Northern blot (Snyder et al., 1995; Dunkov et al., 1997; Danielson et al., 1997, 1998; Li
et al., 2000, 2002) como por microarrays (Le Goff et al., 2006, Willoughby et al., 2006; Sun et al.,
2006) o mediante PCR cuantitativa en tiempo real (Le Goff et al., 2006, Sun et al., 2006; Zhou et
al., 2010; Chung et al., 2011), variando su efecto inductor según sea el sexo del individuo y el gen
analizado (Le Goff et al., 2006). Recientemente se ha demostrado que la aplicación de diferentes
sustancias químicas sobre D. melanogaster provoca la inducción de aproximadamente una tercera
parte de los genes de su CYPoma (Giraudo et al., 2010). Esto pone de manifiesto la gran
importancia a nivel bioquímico, genético y fisiológico que poseen las P450 en la relación entre los
insectos y el entorno en el que habitan (Feyereisen, 1999).
La gran diversidad de las enzimas P450 y la inducción de su expresión en respuesta a
diferentes xenobióticos contribuyen a incrementar la plasticidad adaptativa que poseen los
insectos, por lo que las P450 pueden influir en el control de los insectos plaga. Está demostrado
que un insecto tendrá diferentes respuestas ante un insecticida según el tipo de planta del que se
esté alimentando (Ahmad, 1986), respuestas que responden a la inducción, entre otras, de
enzimas P450. Por ejemplo, varios productos naturales suministrados a larvas de Helicoverpa zea
produjeron la inducción de los genes CYP6B8 y CYP321A1, provocando una disminución de su
susceptibilidad a diazinón y carbaril (Zeng et al., 2007; Wen et al., 2009). Además, se ha descrito
que incluso los disolventes presentes en los herbicidas o insecticidas podrían actuar como
inductores de genes CYP (Kao et al., 1995; Miota et al., 2000).
1.2.4.1.3.4. Resistencia a insecticidas mediada por P450.
El primer estudio que demostró la inducción de las P450 en insectos en respuesta a la
exposición a insecticidas se realizó en el chinche hematófago Triatoma infestans, en el que el DDT
aplicado inducía la enzima NAD-quinasa (Agosin y Dinamarca, 1963), ahora incluida en la familia
de enzimas P450. A principios de los años setenta se describió por primera vez la posible
implicación de las P450 en procesos de resistencia a insecticidas (Perry y Buckner, 1970). Durante
los siguientes años se realizó la caracterización y comparación de los espectros de absorción de los
insectos susceptibles y resistentes para estudiar la resistencia mediada por P450 (Perry et al.,
1971; Philpot y Hodgson, 1972; Tate et al., 1973). Posteriormente, se emplearon sinergistas como
el PBO (butóxido de piperonilo) para relacionar las enzimas P450 con fenómenos de resistencia
(Feyereisen, 2005). En los últimos años, mediante el empleo de nuevos métodos moleculares se ha
incrementado el conocimiento sobre este grupo de enzimas y su implicación en la resistencia a
insecticidas.
22
1. Introducción general
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En insectos, el incremento en los niveles de expresión de uno o varios genes CYP ha sido
descrito en líneas resistentes de varias especies. El orden Diptera es el que posee más casos de
variación en la expresión de genes CYP en líneas resistentes, concretamente se ha detectado la
sobreexpresión de más de cuarenta genes en las nueve especies del orden estudiadas (Feyereisen,
2005). El primer caso identificado de sobreexpresión de un gen CYP en insectos fue en la línea
Rutgers de M. domestica, en la que se describió que el gen CYP6A1 era inducible por fenobarbital
y se sobreexpresaba con respecto a una línea susceptible (Feyereisen et al., 1989). Sin embargo,
no se confirmó su relación con la resistencia al organofosforado diazinón hasta que se expresó el
gen en Escherichia coli y se observaron sus patrones redox (Sabourault et al., 2001).
Posteriormente se han detectado otros genes CYP implicados en resistencia a insecticidas, como
por ejemplo el gen CYP6D1, que está relacionado con la resistencia a piretroides en M. domestica
(Liu y Scott, 1996), o el gen Cyp6a2, sobreexpresado en la línea 91-R de D. melanogaster
resistente a DDT y malatión (Waters et al., 1992). Además, se ha descrito la sobreexpresión de
genes CYP frente a propoxur (Daborn et al., 2002) y lufenurón (Daborn et al., 2002; Bogwitz et al.,
2005) en D. melanogaster, y frente a imidacloprid en D. melanogaster (Daborn et al., 2002) y D.
simulans (Le Goff et al., 2003). Por último, en el suborden Nematocera, se ha detectado
sobreexpresión de determinados genes CYP en poblaciones resistentes a DDT y piretroides en seis
especies de mosquitos (Feyereisen, 2012).
Por otra parte, mediante el empleo de microarrays se ha analizado la expresión de
múltiples genes de las diferentes familias génicas implicadas habitualmente en la detoxificación de
insecticidas. Además, se ha identificado el nexo entre la resistencia a insecticidas y el incremento
en los niveles de RNAm o de determinadas proteínas P450 (Bogwitz et al., 2005; Feyereisen, 2005;
Wee et al., 2008; Hardstone et al., 2010). El uso de sistemas de expresión heteróloga, sobre todo
en E. coli y nucleopoliedrovirus, se ha utilizado para establecer una relación entre la
sobreexpresión de un determinado gen P450 y su contribución a la resistencia (Yang et al., 2008;
Karunker et al., 2009). El reciente empleo de RNA de interferencia (RNAi) para silenciar un gen
CYP concreto, permite mostrar claramente la función detoxificante de un determinado gen (Yang
et al., 2007; Bautista et al., 2009; Zhu et al., 2010), pero es una técnica que no muestra la misma
eficacia de interferencia en todas las especies de insectos.
En la familia Tephritidae existen muy pocos estudios en los que se ponga de manifiesto la
implicación de las P450 en la adquisición de resistencia. Únicamente se ha detectado, en una línea
multiresistente de B. dorsalis, la implicación indirecta de las P450 en fenómenos de resistencia a
insecticidas mediante el empleo de sinergistas (Hsu et al., 2004a), pero no se ha relacionado
ningún gen CYP concreto con la resistencia.
23
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
1.2.4.2. Resistencia por modificación de la molécula diana.
Otro de los principales mecanismos de resistencia a insecticidas se debe a la modificación
de la molécula diana o insensibilización del punto de acción del insecticida. La resistencia por
modificación de la molécula diana conlleva modificaciones genéticas en el DNA que provocan
cambios en la secuencia aminoacídica de la molécula que, a su vez, originan una variación
estructural y/o funcional en la proteína, disminuyendo así la acción tóxica del insecticida. Las
moléculas diana más estudiadas son el canal de sodio, el receptor del ácido gamma-aminobutírico,
la acetilcolinesterasa y los receptores nicotínicos de la acetilcolina (ffrench-Constant, 1999; ffrenchConstant et al., 1998; 1999, 2004; Watson et al., 2010).
1.2.4.2.1. La acetilcolinesterasa.
La acetilcolinesterasa (AChE, EC 3.1.1.7) es la principal enzima del sistema colinérgico y su
función es regular los niveles de acetilcolina durante la transmisión del impulso nervioso (Fournier,
2005). La AChE hidroliza la acetilcolina en acetato y colina durante la transducción del impulso
nervioso en la sinapsis colinérgica (Kozaki et al., 2002). En insectos, según los estudios realizados
en D. melanogaster (Toutant, 1989; Adams et al., 2000) se asumía que sólo existía un gen ace que
codificaba para la enzima acetilcolinesterasa, pero trabajos posteriores demostraron la existencia
de dos genes ace en insectos no dípteros (Villatte y Bachmann, 2002) y en mosquitos (Bourguet et
al., 1996a; Weill et al., 2002). Actualmente, se considera que existe un único gen ace en los
dípteros del suborden Brachycera (moscas propiamente dichas), mientras que en el resto de
dípteros y en la mayoría de los demás órdenes de insectos existen dos genes (Huchard et al.,
2006). Se denominan ace1 a los genes ortólogos al gen Agace1 descrito en A. gambiae, y ace2 a
los genes ortólogos al gen Dmace2 encontrado en D. melanogaster (Weill et al., 2002). Estudios de
interferencia mediante RNA de doble cadena (RNAi) llevados a cabo en insectos que poseen ambos
genes ace sugieren que ace1 es el gen responsable de la mayor parte de la actividad
acetilcolinesterasa; aunque ambos genes pueden tener un papel esencial en la supervivencia y en
la interacción con insecticidas (Revuelta et al., 2009; 2011).
La AChE es la molécula diana de los organofosforados y los carbamatos, ya que estos
compuestos tienen la capacidad de unirse al centro activo de la enzima y actúan como inhibidores
funcionalmente irreversibles por fosforilación o carbamilación del grupo hidroxilo de una serina del
centro activo, esencial para su mecanismo catalítico. Esta inhibición provoca la acumulación de
24
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
acetilcolina en el espacio sináptico, lo que produce la muerte del insecto (Aldridge, 1950). Desde la
primera descripción de una disminución en la susceptibilidad de la acetilcolinesterasa frente a
insecticidas (Smissaert, 1961) se han descrito multitud de casos de resistencia a organofosforados
y carbamatos en los que las mutaciones puntuales en la AChE son el mecanismo de resistencia
más habitual (Mutero et al., 1994; Walsh et al., 2001; Oakeshott et al., 2005). Concretamente en
los dípteros, se han relacionado con resistencia varias mutaciones puntuales que alteran la
actividad AChE en D. melanogaster (Fournier et al., 1993; Fournier y Mutero, 1994; Mutero et al.,
1994; Villatte et al., 2000; Menozzi et al., 2004); en M. domestica (Feyereisen, 1995; Walsh et al.,
2001; Kozaki et al., 2001); en B. oleae (Vontas et al., 2002), en B. dorsalis (Hsu et al., 2006), en
C. capitata (Magaña et al., 2008) y en los mosquitos A. gambiae y C. pipiens (Weill et al., 2003).
Estas mutaciones puntuales se han localizado principalmente en los exones E3, E4, E5, E6 y E7 del
gen ace2, siguiendo la numeración de exones de este gen de D. melanogaster. En aquellas
especies que presentan los dos genes ace, las mutaciones se han descrito fundamentalmente en el
gen ace1 (Fournier, 2005; Kono y Tomita, 2006).
1.2.4.3. Otros mecanismos de resistencia.
La resistencia a la penetración o la resistencia por comportamiento son dos mecanismos
de resistencia a insecticidas poco conocidos debido a su dificultad de estudio. El primero de ellos
se produce cuando la cutícula externa del insecto actúa de barrera frente al insecticida por haber
desarrollado la capacidad de evitar su incorporación al cuerpo o disminuir la velocidad a la que
ocurre su entrada. Este mecanismo de protección es no selectivo, por lo que los insectos que
presenten este tipo de resistencia son menos susceptibles a la penetración de diferentes
insecticidas. Por si sólo este mecanismo no aporta elevados niveles de resistencia pero la
combinación con un segundo mecanismo puede provocar un incremento multiplicativo de la
resistencia, como ocurre en Blatella germanica o en M. domestica (Scott y Georghiou, 1986; Wen y
Scott, 1997; Wu et al., 1998).
La resistencia por comportamiento se produce en aquellos insectos que son capaces de
evitar la exposición al insecticida. Se ha descrito este mecanismo de resistencia frente a varios
tipos de insecticidas como organofosforados, carbamatos o piretroides, en los que los insectos
evitan ingerir alimentos que contengan el insecticida, o huyen de las zonas en las que ha habido
fumigación (Sparks et al., 1989). Existen estudios en los que la resistencia se debe a la repulsión o
irritación que provoca el insecticida, como ocurre en la mosca Haematobia irritans frente a
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1. Introducción general
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piretroides (Quisenberry et al., 1984). Este mecanismo de resistencia suele producirse en
combinación con otros tipos de mecanismos, por lo que su identificación puede ser compleja.
1.2.5. Resistencia en C. capitata y otras especies de la familia
Tephritidae.
Hasta la fecha, dentro de la familia Tephritidae, se ha detectado resistencia a insecticidas
en tres especies del género Bactrocera: B. cucurbitae, B. dorsalis y B. oleae, (Vontas et al., 2011);
y en C. capitata (Magaña et al., 2007).
En 1971 Krimbas y Tsakas describieron en B. oleae el primer indicio de resistencia frente a
organofosforados en tefrítidos. Posteriormente varios autores han relacionado esta resistencia con
diversas alteraciones en la acetilcolinesterasa, tanto en B. oleae (Vontas et al., 2001; 2002; Kakani
et al., 2008) como en B. dorsalis (Hsu et al., 2006). En cuanto a la resistencia metabólica, se han
descrito varios casos en poblaciones de B. oleae resistentes a organofosforados (Tsakas y Krimbas,
1970, Stasinakis et al., 2001). En B. dorsalis la implicación de las esterasas en la resistencia a
organofosforados se ha confirmado mediante estudios con sinergistas (Hsu et al., 2004a). En la
literatura científica existen muy pocos casos de resistencia frente a insecticidas piretroides en la
familia Tephritidae. En B. dorsalis se han descrito dos casos de resistencia a lambda-cialotrina
después de seleccionar en el laboratorio poblaciones recogidas en Taiwan (Hsu y Feng, 2002; Hsu
et al., 2004b). Por el contrario, sí se detectó una elevada resistencia al piretroide alfa-cipermetrina
en poblaciones de campo de B. oleae en Grecia (Margaritopoulos et al., 2008). En cuanto a los
estudios de resistencia a espinosad, los datos son muy escasos. En la familia Tephritidae
únicamente se ha detectado resistencia a espinosad en el género Bactrocera y en todos los casos
descritos los niveles de resistencia son bajos. Así, se ha observado cierta resistencia en poblaciones
de campo de B. oleae en California (EE.UU.) y en Grecia (Kakani et al., 2010). Además,
recientemente se ha observado una baja susceptibilidad a espinosad en poblaciones de campo de
B. cucurbitae en Hawai y en Taiwan (Hsu et al., 2012b). En el resto del orden Diptera sólo se ha
descrito resistencia a espinosad en líneas de laboratorio de D. melanogaster, M. domestica y en
una población de campo de Liriomyza trifolii (Sparks et al., 2012; Markussen y Kristensen, 2012).
En 1982 Viñuela y Arroyo realizaron bioensayos con poblaciones de campo de C. capitata
recogidas en diferentes regiones españolas y observaron que la mosca mediterránea de la fruta no
26
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
presentaba resistencia a tres organofosforados ampliamente usados para su control: malatión,
diazinón y triclorfón. A finales de los años noventa se realizaron nuevos estudios en los que no se
detectó ningún fallo en el control químico de la plaga (Viñuela, 1998). Durante las últimas décadas,
el incremento de la frecuencia de los tratamientos de malatión como insecticida frente a C. capitata
en España ha provocado la aparición de poblaciones resistentes (Magaña et al., 2007). Este
hallazgo, supone el primer caso de resistencia a insecticidas en poblaciones de campo de la mosca
mediterránea de la fruta. Esta resistencia ha sido relacionada con dos mecanismos de resistencia.
El primero se debe a una mutación puntual en la acetilcolinesterasa, molécula diana del malatión.
Concretamente la mutación AChE G328A, que ya había sido relacionada con resistencia a
insecticidas en D. melanogaster (Menozzi et al., 2004) y M. domestica
(Walsh et al., 2001),
provoca una modificación en uno de los residuos próximo a la tríada catalítica, reduciendo la
afinidad de la acetilcolinesterasa por el organofosforado malatión (Magaña et al., 2008). El
segundo mecanismo de resistencia descrito en C. capitata está relacionado con la resistencia
metabólica mediada por carboxilesterasas (Magaña et al., 2008).
27
1. Introducción general
______________________________________________________________________________________________________________________________________
1.3. Objetivos de la tesis.
La existencia de poblaciones españolas de Ceratitis capitata resistentes a malatión
aconseja el desarrollo de métodos de detección que faciliten su seguimiento y que puedan ser
utilizados para la elección de la estrategia más adecuada para el manejo de esta plaga. Para ello,
es necesario profundizar en el conocimiento de los mecanismos asociados a la resistencia a
insecticidas.
Durante el desarrollo de esta Tesis el malatión dejó de ser utilizado en la Unión Europea
contra la mosca mediterránea de la fruta, siendo sustituido por otros insecticidas como el
espinosad y la lambda-cialotrina. En este nuevo contexto se planteó la necesidad de estudiar la
posible existencia de resistencia cruzada a estos insecticidas, analizar la susceptibilidad de
poblaciones de campo a espinosad y sentar las bases para el estudio de posibles nuevos
mecanismos de resistencia
Los objetivos de esta Tesis son:
1) Evaluar la susceptibilidad a malatión y espinosad en poblaciones españolas de C. capitata y
obtener líneas resistentes mediante selección en el laboratorio.
2) Sentar las bases para el estudio de mecanismos de resistencia en C. capitata mediados por
enzimas P450 a través de la identificación de genes CYP y el estudio de su inducción por
xenobióticos.
3) Desarrollar un método molecular para determinar la presencia de alelos de resistencia a
malatión en C. capitata y determinar la dispersión geográfica de dichos alelos en poblaciones de
campo.
4) Caracterizar un nuevo mecanismo de resistencia a malatión identificado en una de las líneas de
laboratorio altamente resistente a este insecticida.
29
Capítulo 2
SELECCIÓN DE RESISTENCIA EN LABORATORIO
Y SUSCEPTIBILIDAD A INSECTICIDAS EN
Ceratitis capitata
Parte de los resultados mostrados en este capítulo forman parte de la
siguiente publicación:
Couso-Ferrer, F; Arouri, R; Beroiz, B; Perera, N; Cervera, A; Navarro-Llopis, V; Castañera, P;
Hernández-Crespo, P; Ortego, F. (2011). Cross-resistance to insecticides in a malathion-resistant
strain of Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). J. Econ. Entomol.; 104(4): 1349-1356.
31
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2.1. Introducción.
La mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) está considerada
como una de las plagas más importantes para los cultivos frutícolas a nivel mundial. En dos
estudios realizados en España en los años ochenta y noventa se analizó la susceptibilidad de esta
especie frente a varios insecticidas organofosforados y no se detectó ningún fallo en su control
químico (Viñuela y Arroyo, 1982; Viñuela, 1998). En España, y más concretamente en la
Comunidad Valenciana, se incrementó el uso del organofosforado malatión para combatir a C.
capitata durante las dos últimas décadas debido a las grandes pérdidas económicas que
ocasionaba esta plaga en los cultivos de cítricos. Este incremento, tanto en la concentración de
malatión como en la frecuencia de los tratamientos, provocó la aparición de poblaciones de campo
resistentes (Magaña et al., 2007), lo que supuso la primera descripción de un fenómeno de
resistencia a insecticidas en poblaciones de campo de esta especie.
Hasta 2008 el insecticida más empleado en los cultivos de cítricos frente a C. capitata fue
el organofosforado malatión. Sin embargo, la Directiva Europea 91/414/ECC prohibió su uso frente
a la mosca mediterránea de la fruta a partir del año 2009. Actualmente, los insecticidas más
utilizados para el control de C. capitata en cítricos, en sustitución del malatión, están basados en
dos sustancias activas: la lambda-cialotrina y el espinosad. Además, aunque en menor media, se
33
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
emplea el lufenurón, en el denominado control por quimioesterilización (Navarro-Llopis et al.,
2010).
El estudio de la línea de C. capitata resistente a malatión (línea W), que provenía de una
población de campo recogida en 2004 en Castelló, permitió la identificación de dos mecanismos
asociados a esta resistencia: una mutación puntual (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE),
molécula diana de los organofosforados, y un mecanismo de resistencia metabólica mediado por
carboxilesterasas (Magaña et al., 2008). No obstante, en los estudios de Magaña y colaboradores
(2007 y 2008), no se determinó la importancia relativa de cada uno de los dos mecanismos sobre
la resistencia a malatión observada en las poblaciones españolas.
Los dos mecanismos de resistencia a malatión descritos en C. capitata podrían conferir
resistencia cruzada a otros insecticidas. Por ello, es importante conocer si la efectividad de los
insecticidas utilizados actualmente puede verse comprometida por la resistencia existente en
campo. Por un lado, la resistencia mediada por una mutación en la AChE puede influir sobre la
susceptibilidad a otros organofosforados y carbamatos, ya que comparten la misma enzima como
diana (Oakeshott et al., 2005) y por otro lado, un mecanismo de resistencia metabólica mediada
por
carboxilesterasas
podría
conferir
resistencia
cruzada
a
distintos
insecticidas,
independientemente de la diana a la que van dirigidos, ya que actuaría favoreciendo la hidrólisis o
el secuestro de la materia activa (Hemingway, 2000; Oakeshott et al., 2005). En los estudios de
resistencia cruzada realizados por Magaña y colaboradores (2007) en la línea W, resistente a
malatión, sólo se emplearon dos insecticidas: frente al organofosforado fentión se observó
resistencia cruzada, mientras que no existieron diferencias significativas en la susceptibilidad a
espinosad.
Con el objetivo de estudiar, por una parte, la distribución en España de las poblaciones de
C. capitata resistentes a malatión y, por otra, la posible existencia de diferentes mecanismos de
resistencia frente a este organofosforado, se analizó la susceptibilidad a malatión y se emplearon
sinergistas en poblaciones españolas de distintas áreas geográficas. Además, en la mayoría de
estas poblaciones, se evaluó la susceptibilidad a espinosad. Al mismo tiempo, se seleccionaron dos
líneas de laboratorio resistentes a malatión y a espinosad, con la finalidad de estudiar los
mecanismos involucrados en la resistencia a estos insecticidas. Finalmente, en la línea seleccionada
con malatión, se analizó la posible existencia de resistencia cruzada frente a diferentes tipos de
insecticidas.
34
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2.2. Material y métodos.
2.2.1. Ceratitis capitata en el laboratorio.
2.2.1.1. Condiciones generales de cría.
En una jaula de cría se colocaron pupas de C. capitata, en una placa Petri, de las que
posteriormente emergerían los adultos. Los adultos de cada generación se mantuvieron en las
jaulas durante un periodo de entre tres y cuatro semanas. En el interior de cada jaula se colocó un
bebedero y un comedero (Fig. 2.2.1.a). El bebedero consistió en una botella de plástico de 250 ml
llena de agua con una ranura en su tapa. A través de la ranura se colocó una tira de material
absorbente que estaba siempre en contacto con el agua del recipiente y que sobresalía por la
ranura de la tapa. El comedero era una placa Petri que contenía una mezcla de azúcar molido con
extracto de levadura de cerveza (Laboratorios Conda S.A., Torrejón de Ardoz, Madrid, España, Cat.
1702) en una proporción 4:1 respectivamente. Se emplearon dos tipos de jaulas de cría de
metacrilato transparente, las jaulas pequeñas, que eran unos cubos de 20 cm de arista, y las
jaulas grandes con unas dimensiones de 30x30x50 cm. Una de las caras de las jaulas era una
malla de nailon a través de la cual las hembras, adaptadas a la puesta en malla, introducían su
ovipositor y depositaban los huevos, que caían en un recipiente con agua situado debajo de la
35
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
jaula (Fig. 2.2.1.b). Las jaulas de cría se mantuvieron en un insectario con un ciclo de
luz/oscuridad de 16/8h y a una temperatura de 25±2ºC.
Los primeros huevos, resultado de las cópulas producidas entre el tercer y quinto día
después de la emergencia de los adultos, se desecharon. Las siguientes puestas de huevos se
recogieron sucesivamente cada dos días con una jeringa y se depositaron en una dieta artificial
para larvas a base de agua, azúcar, levadura de cerveza, salvado de trigo, agentes antimicrobianos
y antifúngicos (Ver anexo I). Aproximadamente se sembraron 0,2 ml de huevos en 250 g de dieta
que se colocaron en una caja de plástico de 12x5x2 cm cubierta con una lámina de papel de
aluminio a modo de tapa (Fig. 2.2.2.a). Esta caja de plástico se colocó, apoyada en una placa
Petri, dentro de otra caja mayor de plástico transparente de 25x15x4 cm que tenía en su tapa dos
orificios tapados con papel de filtro para permitir la ventilación. Los huevos y las larvas se
mantuvieron en cámaras climatizadas Sanyo MLR-350 (Sanyo Electric Biomedical Co., Japón) a una
temperatura de 25±1ºC (o de 20±1ºC, para ralentizar el desarrollo) y con un ciclo de
luz/oscuridad de 16/8h (Fig. 2.2.2.b).
a
b
Figura 2.2.1. Jaula de cría para adultos. (a) Esquema de la jaula de cría donde se
colocaron las pupas de C. capitata. Se observa el recipiente con agua y la placa Petri con la dieta
para los adultos. (b) Fotografía de la cara de la jaula recubierta por una malla de nailon, a través
de la cual las hembras depositaron los huevos, y del recipiente con agua donde se recogía la
puesta.
36
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
a
b
c
Figura 2.2.2. Cría de larvas. (a) Fotografía del sistema de cajas empleado para el desarrollo
de C. capitata desde larva a pupa. (b) Cámara climatizada donde se mantuvieron las puestas de
huevos hasta la aparición de las larvas. (c) Último estadio larvario en el que las larvas saltan de la
dieta antes de pupar.
El desarrollo larvario de C. capitata transcurre por tres estadios. Al finalizar el último estadio,
las larvas realizan un salto desde el sustrato de alimentación hacia la caja externa, donde pupan
(Fig. 2.2.2.c). Las pupas se retiraron cada dos días y se colocaron en cajas transparentes de
plástico de 2,5 cm de alto por 9 cm de diámetro con un respiradero de 2 cm de diámetro en la
tapa cubierto con papel de filtro. Dos o tres días antes de la emergencia de los adultos, las pupas
se colocaron en una placa Petri en el interior de una jaula de cría en el insectario, donde emergían
los adultos.
2.2.1.2. Mantenimiento de líneas de C. capitata bajo presión de
selección.
La selección mediante insecticidas se realizó sobre adultos de entre tres y cinco días de edad
en el interior de las jaulas grandes en el insectario. Antes de comenzar el tratamiento con
insecticida, se extrajeron de la jaula las pupas no emergidas para evitar la emergencia de nuevos
individuos con posterioridad al inicio del tratamiento. El tratamiento de selección consistió en la
sustitución del comedero con dieta normal por otra placa Petri que contenía nueve gramos de dieta
mezclada con 1 ml de insecticida a la concentración deseada. Generalmente el tratamiento duró 48
h, pero en algunas ocasiones, si la mortalidad observada era baja, se renovaba el insecticida y se
37
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
prolongaba el tratamiento durante 24 o 48 h más. Finalizado el tiempo de exposición, se extrajo el
insecticida de la jaula y se sustituyó por el comedero con dieta sin insecticida. La recogida de los
huevos se inició 48 h después de haber finalizado el tratamiento insecticida para recoger
únicamente la puesta de aquellos individuos más tolerantes al insecticida. El mantenimiento de las
líneas después del tratamiento de selección siguió el procedimiento descrito en el apartado
anterior. Para la selección con malatión se utilizó Malafin® 50 CE (Agrodan S.A.) y para la selección
con espinosad se suministró Spintor-Cebo® (Dow AgroSciences), que contiene como componente
insecticida una mezcla de espinosinas A y D.
2.2.2. Líneas de laboratorio.
A continuación se describen las líneas de laboratorio de la mosca mediterránea de la fruta
con las que se han realizado los experimentos que se describen en esta tesis. Para la nomenclatura
de las líneas seleccionadas se empleó un término que define el origen de la población seguido de
un valor numérico que muestra la concentración de insecticida aplicada durante la selección, y de
una letra que indica el insecticida aplicado. En la figura 2.2.3 se puede observar, en forma de
diagrama de flujo temporal, el origen y el desarrollo de las líneas de laboratorio estudiadas.
· Línea C: Línea utilizada como control susceptible en los diferentes experimentos. Proviene de
una población recogida con anterioridad al incremento intensivo del uso del malatión.
Concretamente se recogió en los campos adyacentes al Instituto Valenciano de Investigaciones
Agrarias (IVIA) de Moncada (Valencia, C. Valenciana) en 2001 (Magaña et al., 2007) y ha sido
mantenida en el CIB desde 2004 sin haber recibido ningún tipo de tratamiento insecticida.
· Línea W-4Km: Resulta de la selección de una población resistente a malatión recogida en el
municipio de Castelló (C. Valenciana) en octubre de 2004 (Magaña et al., 2007). Las hembras de la
línea W (primeras trece generaciones de selección) depositaban los huevos en manzanas, pero
posteriormente fueron adaptadas a realizar la puesta a través de una malla de nailon. Esta línea
fue mantenida bajo una presión creciente de selección frente a malatión según lo descrito en el
apartado 2.2.1.2. Esta línea adquirió la denominación de W-4Km cuando en la generación F30 se
fijó la presión de selección con malatión en un tratamiento de 4.000 ppm durante 48 horas.
38
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
Línea W-10Km
Selección con malatión
(10.000 ppm)
a partir de la F40
Selección con malatión
(4.000 a 10-000 ppm)
hasta la generación F40
Línea Xàbia-W-100s
Selección con espinosad
(100 ppm)
a partir de la F36
Selección con esiponad
(2,5 a 100 ppm)
hasta la generación F36
Línea Xàbia-W
Cruce con F38 de W-4Km
39
(Magaña et al., 2007, 2008)
Línea C
desde 2004 en el CIB
No tratada
(Magaña et al., 2007)
Selección con espinosad
(1 a 2 ppm)
durante 10 generaciones
+
Línea IVIA
(2001)
proviene de campos
valencianos no tratados
Población Xàbia
(2007)
Figura 2.2.3. Líneas de laboratorio. Origen y evolución de las líneas empleadas en esta tesis.
Línea W-4Km
Selección con malatión
(4.000 ppm)
a partir de la F31
Adaptación a la puesta
en malla
Selección con malatión
(2.000 a 4.000 ppm)
hasta la F31
(Magaña et al., 2008)
Línea W
Estudio de los
mecanismos de resistencia
Selección con malatión
(1.000 a 3.000 ppm)
durante 13 generaciones
(Magaña et al., 2007)
Población Castelló
(2004)
resistente a malatión
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
· Línea W-10Km: Esta línea se obtuvo a partir de la línea W-4Km mediante una presión
creciente de selección con malatión (ver apartado 2.2.1.2). A partir de la generación F40 se fijó la
presión de selección en un tratamiento de 10.000 ppm de malatión durante 48 horas.
· Línea Xàbia-W-100s: Procede de los adultos de C. capitata que emergieron a partir de la
fruta infestada recogida en Xàbia (Alicante, C. Valenciana) en junio de 2007 (población JAV, ver
tabla 2.2.1). Inicialmente la población JAV se adaptó a la puesta en manzana y en la generación
F10 se cruzaron hembras vírgenes de la población JAV con machos vírgenes de la generación F38
de la línea W-4Km y viceversa. La descendencia de estos dos cruzamientos se juntó en la siguiente
generación, estableciéndose la línea Xàbia-W. Esta línea se mantuvo bajo presión creciente de
selección frente a espinosad según lo descrito en el apartado 2.2.1.2. A partir de la generación F36
la concentración aplicada para la selección se fijó en 100 ppm de espinosad durante 48 horas.
2.2.3. Recogida de poblaciones de campo.
En diferentes parcelas de frutales y cítricos se recolectó fruta infestada por C. capitata. Se
estudiaron un total de doce poblaciones localizadas en las comunidades autónomas de Andalucía,
Aragón, Cataluña, C. Valenciana e Islas Baleares. En la tabla 2.2.1 se muestra su código de
nomenclatura, la fecha de recogida, el tipo de fruto hospedador y los tratamientos aplicados en
cada parcela en el caso de conocerse. La fruta se mantuvo entre una y dos semanas en el
insectario en unas cajas de plástico con ventilación de 30x20x20 cm. En el fondo de las cajas se
colocaron varias hojas de papel secante que evitaron la acumulación del líquido procedente de la
descomposición de la fruta. Las cajas se revisaron diariamente, recogiendo y procesando las pupas
según el protocolo de cría descrito en el apartado 2.2.1.1. Los adultos que emergieron de esas
pupas se emplearon en bioensayos de susceptibilidad (apartado 2.2.4) o se utilizaron para
establecer nuevas líneas de laboratorio (apartado siguiente).
2.2.3.1. Adaptación de las poblaciones de campo al laboratorio.
Para establecer una línea de laboratorio a partir de individuos procedentes de la fruta
recogida en el campo, los adultos se mantuvieron en condiciones similares a las descritas en el
apartado 2.2.1.1, pero previamente las hembras fueron adaptadas a realizar la puesta a través de
40
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
la malla de nailon de las jaulas de cría. Durante las primeras generaciones en el laboratorio, en el
interior de las jaulas se colocaron manzanas de la variedad Royal Gala donde las hembras
realizaban la puesta. Las manzanas se recogieron cada dos días y en ellas se desarrollaron las
larvas tal y como se describe en el apartado 2.2.3. Al cabo de varias generaciones, se forzó la
puesta en malla de una parte de la población eliminando la manzana del interior de algunas jaulas
de cría e impregnando la malla con zumo de manzana. Cuando una proporción alta de hembras
puso sus huevos a través de la malla de nailon, se eliminaron las manzanas del interior del resto
de jaulas y se prosiguió con el método de cría explicado en el apartado 2.2.1.1.
2.2.4. Bioensayos de susceptibilidad a insecticidas.
2.2.4.1. Condiciones generales.
Para realizar los bioensayos de susceptibilidad a insecticidas, los adultos de C. capitata se
introdujeron durante 10-15 minutos en una nevera a 4ºC para facilitar su manejo. Con unas pinzas
entomológicas se depositaron entre 12 y 15 adultos, de entre 3 y 5 días de edad, en el interior de
cajas transparentes de plástico de 2,5 cm de alto por 9 cm de diámetro, que contaban con un
orificio de 2 cm de diámetro cubierto con papel de filtro a modo de respiradero (Fig. 2.2.4). En el
interior de cada caja se colocaron dos recipientes de 1,5 cm de alto y 2,5 cm de diámetro, uno con
una mecha de material absorbente con agua y otro con dieta (0,9 g de azúcar y extracto de
levadura de cerveza en proporción 4:1), a la que se le habían añadido 100 µl del insecticida diluido
en agua. El tiempo de duración del bioensayo de susceptibilidad fue de 48 h y se mantuvo en el
interior de las cámaras climáticas con un fotoperiodo de 16/8h de luz/oscuridad y a una
temperatura de 25ºC. En general, se realizaron cuatro réplicas experimentales por bioensayo, a no
ser que se especifique lo contrario. Tras cumplirse el tiempo de duración del bioensayo, se
anotaron los individuos muertos con respecto al número total de individuos de cada una de las
cajas. Se consideraron como muertos, además de los inmóviles, aquellos individuos que,
presentando indicios de estar afectados por el insecticida, no recuperaron la postura normal sobre
sus patas al ser tocados con unas pinzas entomológicas. Todos los bioensayos para los diferentes
insecticidas se realizaron por ingestión, con la excepción del bioensayo de susceptibilidad a
carbaril, donde la aplicación del insecticida fue tópica. Esto fue debido a la imposibilidad de disolver
el producto comercial a concentraciones suficientemente elevadas para obtener efecto tóxico
41
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
Valle de Río Verde (Granada) RIO
VIY
JAV
Vila Joiosa (Alicante)
Xàbia (Alicante)
MAR
MUR
Marratxí (Mallorca)
Muro (Mallorca)
Islas Baleares
W07
ALC
Castelló’07 (Castellón)
C. Valenciana
Alcanar (Tarragona)
Cataluña
Villalengua (Zaragoza)
VIG
Jun, 2007
GIB
Gibraleón (Huelva)
Aragón
Sep, 2008
AYA
Ayamonte (Huelva)
Nov, 2007
Nov, 2007
Jun, 2007
May, 2007
Dic, 2007
Oct, 2007
Sep, 2007
Sep, 2008
Jun, 2007
GOL
Almuñecar (Granada)
Dic, 2008
Fecha
MAY
Código
Algarrobo Costa (Málaga)
Andalucía
Localidad (Provincia)
Cítricos
Naranja
Naranja
Naranja
Naranja
42
Mandarina
Melocotón
Níspero
Mandarina
Mandarina
Níspero
Chirimoya
Hospedador
2005 y 2006: Fentión. 2007: Espinosad y metil-clorpirifos
2005 y 2006: Fentión. 2007: Metil-clorpirifos y fentión
No tratada
No tratada
2005 y 2006: 5-10 T malatión. 2007: No tratada
2005 y 2006: 7 T Malatión. 2007: λ-cialotrina y 2 T malatión
No tratada
No tratada
2006 y 2007: 7-8 T malatión. 2008: 3 T malatión y 2 T espinosad
2003 a 2008: 7-8 T espinosad y 3 T λ-cialotrina
No tratada
No tratada
Tratamientos en campo (T)
recolección y el fruto recogido (hospedador). El código hace referencia a la nomenclatura abreviada asignada a cada población (adultos que emergen
de la fruta recogida en un mismo campo de cultivo). En los tratamientos (T) se indica el historial de los insecticidas aplicados en cada año dirigidos
contra C. capitata y la frecuencia de aplicación en el caso de conocerse.
Tabla 2.2.1. Lugares de muestreo de C. capitata. Se indican las localidades en la que se recogió fruta infestada de C. capitata, la fecha de
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
por ingestión. El carbaril se disolvió en acetona (Merck KGaA, Alemania) y se aplicó tópicamente un
volumen de 0,5 µl en el tórax de las moscas con un microaplicador semiautomático Burkard
Precisor Miniaplicator 900X (Burkard Manufacturing Co., Inglaterra). La elaboración de un
bioensayo se asumió correcta cuando la mortalidad de los controles no superaba el 10%
(normalmente entre 0-5%).
2.2.4.2. Bioensayos para estimar la CL50
Se estudió la susceptibilidad de la línea de laboratorio W-4Km frente a los insecticidas
enumerados en la tabla 2.2.2 (ver estructura química de los compuestos en la figura 2.2.5). Se
analizaron seis insecticidas organofosforados (malatión, fentión, diazinón, fosmet, triclorfón y
metil-clorpirifos), el piretroide lambda-cialotrina, el carbamato carbaril (único de los insecticidas
analizados no aprobado para su uso contra C. capitata), y un insecticida de origen biológico
(espinosad). En el diseño del bioensayo se aplicaron entre cinco y siete concentraciones crecientes
de insecticida y un tratamiento control sin insecticida. En aquellos casos en los que se empleó por
primera vez un insecticida, se realizó un preensayo en las mismas condiciones del propio
bioensayo. El preensayo consistió en aplicar un rango amplio de concentraciones y, una vez
observados los datos de mortalidad, se ajustaron las concentraciones para el bioensayo definitivo.
Figura 2.2.4. Caja de bioensayo. Caja empleada en la realización de los bioensayos. Cada
caja contenía un bebedero con agua y un comedero en el que se introducía la mezcla de dieta e
insecticida.
43
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
MALATIÓN
FENTIÓN
FOSMET
TRICLORFÓN
DIAZINÓN
METIL-CLORPIRIFOS
LAMBDA-CIALOTRINA
ORGANOFOSFORADOS
PIRETROIDE
Espinosina A: R = H
Espinosina D: R = CH3
CARBARIL
ESPINOSAD
R
LUFENURÓN
CARBAMATO
ESPINOSINA
*
BENZOILUREA
Figura 2.2.5. Insecticidas. Estructura química de los compuestos insecticidas empleados en
los bioensayos de susceptibilidad. (*) No se realizaron bioensayos de susceptibilidad para el
lufenurón, si no que se evaluó su efecto quimioesterilizante en el apartado 2.2.5.
Los porcentajes de mortalidad obtenidos en cada bioensayo de susceptibilidad fueron
analizados con el programa PoloPlus v.1.0 (LeOra Software). Dicho programa calcula, corrigiendo
la mortalidad según Abbott (1925), las concentraciones letales 50 (CL50) y su intervalo de
confianza al 95% para cada población e insecticida. La CL50 indica la concentración de insecticida
aplicada en dieta que provoca una mortalidad del 50% de los individuos en el tiempo que dura el
bioensayo. Con el objetivo de comparar las CL50 de diferentes poblaciones o líneas de laboratorio
se calculó la razón de las concentraciones letales 50 (RCL) y su intervalo de confianza al 95%. La
RCL consiste en tomar como referencia una población, normalmente la línea más susceptible, y
calcular la proporción de cada una de las poblaciones o líneas con respecto a ella. Si el intervalo de
confianza generado para una determinada población no incluye el valor 1 quiere decir que existen
diferencias significativas entre dicha población y la población susceptible tomada como referencia
(Robertson y Preisler, 1992).
44
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2.2.4.3. Bioensayos de concentración discriminante.
Teniendo en cuenta la susceptibilidad frente a malatión en las líneas susceptible C (CL50 = 18
ppm) y resistente W (CL50 = 1.460 ppm) (Magaña et al., 2007), se seleccionó una concentración
de insecticida que pudiera ser utilizada para discriminar entre poblaciones de campo resistentes y
susceptibles. Concretamente se emplearon 1.500 ppm de malatión, ya que experimentalmente se
ha comprobado que concentraciones superiores a 300 ppm producen el 100% de mortalidad en la
línea C. En el caso del espinosad se utilizó 1 ppm ya que la CL50 de la línea susceptible C fue igual
a 0,4 ppm y la CL90 estimada fue de 1,3 ppm (Magaña et al., 2007).
Además, en el caso del malatión y con el objeto de obtener información sobre el posible
mecanismo de resistencia, se analizó el efecto de la administración de tres sinergistas: el maleato
de dietilo (DEM), inhibidor de las glutatión S-transferasas (producto técnico al 97%, Aldrich
Chemical Co); el SSS-tributilfosforotritioato (DEF), inhibidor de esterasas (producto técnico al 98%,
Chem. Service Inc.); y el butóxido de piperonilo (PBO), inhibidor de las monooxigenasas (producto
técnico al 90%, Aldrich Chemical Co).
Estos bioensayos de insecticidas con sinergistas se realizaron siguiendo la metodología
descrita en el apartado 2.2.4.1. Los sinergistas se aplicaron dos horas antes de la exposición al
malatión, mediante un microaplicador semiautomático Burkard Precisor Miniaplicator 900X, para
permitir la acción del sinergista antes de la aplicación del insecticida. La dosis correspondiente de
sinergista disuelto en acetona se aplicó depositando 0,5 µl sobre el tórax de las moscas. Mediante
ensayos previos se ajustaron las dosis aplicables por insecto, que fueron de 1 µg de DEM, 1 µg de
DEF y 3 µg de PBO. Los resultados de mortalidad observados fueron corregidos según la fórmula
propuesta por Abbott (1925).
45
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
®
Lufenurón (QE)
Adress
GF-120* NF
Espinosad (SP)
®
Keyvin 80 pm
®
Karate King
®
Reldan E
®
Dipterex
Imidan WP
®
Agrozinon
®
Lebaycid 50 LE
®
Malafin 50
®
Nombre comercial
Carbaril (CA)
λ-cialotrina (PI)
Metil-clorpirifos (OP)
Triclorfón (OP)
Fosmet (OP)
Diazinón (OP)
Fentión (OP)
Malatión (OP)
Materia activa
3% (p/p)
0,02% (p/v)
80% (p/p)
2,5% (p/p)
22,4% (p/v)
50% (p/v)
50% (p/p)
60% (p/v)
50% (p/v)
50% (p/v)
Concentración
46
Syngenta Agro S.A.
Dow Agrosciences LLC
Industrial Química Key, S.A.
Syngenta Agro S.A.
Dow Agrosciences Ibérica, S.A.
Bayer Hispania, S.A.
Kenogarg, S.A.
Agrofit Sociedad Cooperativa
Tecniagro, S.L.
Agrodán, S.A.
Fabricante
30.000
40 - 133
(2)
100 - 125
3.000 - 4.000
4.000 - 5.000
3.000
1.200
1.000 - 2.000
2.000 - 3.000
C.R.F.
(1)
Ingestión
Ingestión
Tópica
Ingestión
Ingestión
Ingestión
Ingestión
Ingestión
Ingestión
Ingestión
Aplicación
Tabla 2.2.2. Listado de insecticidas empleados en los bioensayos de susceptibilidad. Se utilizaron insecticidas organofosforados (OP), un
piretroide (PI), un carbamato (CA), una mezcla de espinosinas A y D (SP) y un quimioesterilizante (QE). La concentración indica el porcentaje de principio
activo en el producto comercial en peso/peso (p/p) o en peso/volumen (p/v). (1) Muestra la concentración de insecticida recomendada por el fabricante
(C.R.F.) para su uso contra C. capitata, en ppm. (2) El carbaril no se emplea específicamente contra C. capitata. Se indica además el método de aplicación
empleado en los bioensayos de susceptibilidad.
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2.2.5. Bioensayos con el quimioesterilizante lufenurón.
El lufenurón (Fig. 2.2.4) es un regulador del crecimiento que interfiere en la síntesis de la
quitina de los insectos, afectando tanto a la muda como al correcto desarrollo de los huevos, por
tanto, uno de sus efectos insecticidas es la quimioesterilización (Wilson y Cryan, 1997). El
bioensayo con lufenurón fue realizado por el grupo del Dr. Vicente Navarro Llopis de la Universidad
Politécnica de Valencia. Se prepararon, para cada concentración de lufenurón, cuatro jaulas de
10x10x10cm de metacrilato con una cara cerrada con una tela de nailon. En cada jaula se
introdujeron cinco hembras adultas de siete días de edad, que previamente habían copulado, y que
habían estado sometidas a un periodo de ayuno de 24 horas. En total se ensayaron cinco
concentraciones crecientes de lufenurón en la dieta, además de un control sin lufenurón. La dieta
suministrada fue una mezcla en proporción 4:1 de azúcar y extracto de levadura de cerveza,
respectivamente, y 0,5 ml de acetona por gramo de dieta sólida. En el caso de las jaulas tratadas
con el quimioesterilizante, se disolvió el lufenurón en acetona y posteriormente, con la ayuda de
un mortero, se homogeneizó con la dieta dejando evaporar la acetona. La duración del bioensayo
fue de 24 horas, y se realizaron cuatro réplicas experimentales de cada tratamiento. Transcurrido
el tiempo del bioensayo, se reemplazó la dieta con lufenurón por la dieta sin tratamiento. A partir
de las 24 horas desde la retirada del lufenurón se recogió la puesta de las 24 horas posteriores.
Los huevos se sembraron sobre agar y se mantuvieron a 26ºC durante 3 días. Al cuarto día se
observaron los huevos eclosionados mediante una lupa binocular. Se observaron cincuenta huevos
sembrados y se anotaron aquellos que habían eclosionado, calculando así el porcentaje de huevos
no desarrollados con respecto al total de huevos.
Los datos de esterilidad obtenidos fueron analizados con el programa PoloPlus v.1.0 (LeOra
Software) de manera similar a la descrita en el apartado 2.2.4.2., calculándose la concentración
esterilizante 50 (CE50) y su intervalo de confianza al 95%. La CE50 indica la concentración de
quimoesterilizante aplicada en dieta que provoca una esterilidad del 50% de los huevos en las
condiciones del bioensayo. La razón de las concentraciones esterilizantes 50 (RCE) y su intervalo
de confianza al 95% se calcularon según lo descrito por Robertson y Preisler (1992).
47
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2.3. Resultados.
2.3.1. Evaluación de la susceptibilidad a malatión y espinosad
en poblaciones de campo.
Mediante un bioensayo de concentración discriminante (apartado 2.2.4.3), realizado sobre
individuos adultos procedentes de fruta recogida en campos comerciales, se evaluó la
susceptibilidad a malatión y espinosad. Además, con el objetivo de obtener información sobre la
posible existencia de resistencia a malatión mediada por enzimas de detoxificación, se realizaron
bioensayos con tres sinergistas.
La mortalidad observada en los tratamientos control sin insecticidas osciló entre el 2% y
11% en la mayoría de poblaciones analizadas y sólo superó estos valores en las poblaciones
recolectadas en Almuñecar (Granada) y Marratxí (Mallorca) (24 y 28% respectivamente) (Tabla
2.3.1). En ninguno de los bioensayos con 1.500 ppm de malatión se obtuvo una mortalidad del
100%, oscilando entre el 64 y el 97%. Las mortalidades más bajas (64% a 73%) se encontraron
en las poblaciones de Xàbia (Alicante), Marratxí (Mallorca) y Alcanar (Tarragona).
49
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Además, tampoco se alcanzaron mortalidades del 100% cuando se combinó la aplicación
tópica de un sinergista (DEM, DEF o PBO) con el tratamiento de malatión en la dieta. En ninguna
de las poblaciones estudiadas se observó una alteración en la susceptibilidad frente a malatión tras
la aplicación del sinergista, a excepción de lo observado en la población mallorquina de Muro,
donde el PBO redujo la susceptibilidad significativamente.
En los tratamientos con 1 ppm de espinosad las mortalidades observadas estuvieron por
encima del 60% en la mayoría de las poblaciones estudiadas, con dos excepciones: las poblaciones
de Xàbia (Alicante) y Marratxí (Mallorca), donde los porcentajes de mortalidad fueron del 36% y
17%, respectivamente. La disponibilidad de un número suficiente de individuos pertenecientes a la
población de Xàbia nos permitió realizar un bioensayo de susceptibilidad para estimar la CL50 frente
a espinosad, así como establecer la población en el laboratorio y comenzar el proceso de selección
de resistencia a espinosad, proceso que se describe posteriormente en el apartado 2.3.4.
50
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
ALC
ALM
MAY
AYA
CAS
GIB
MAR
MUR
RIO
VIY
VIL
JAV
Alcanar (Tarragona)
Almuñecar (Granada)
Algarrobo Costa (Málaga)
Ayamonte (Huelva)
Castelló’07 (Castellón)
Gibraleón (Huelva)
Marratxí (Mallorca)
Muro (Mallorca)
Valle de Río Verde (Granada)
Vila Joiosa (Alicante)
Villalengua (Zaragoza)
Xàbia (Alicante)
260
369
372
354
257
76
132
94
90
86
369
586
n
75
(40)
71
(39)
83
(56)
90
(54)
96
(60)
93
(60)
94
(57)
96
(59)
95
(40)
85
-
-
-
-
-
(53)
(26)
73
(44)
97
(47)
89
(30)
97
(42)
93
93
(55)
95
(58)
66
(101)
64
+DEM
(98)
M
(40)
80
(58)
95
(60)
94
(52)
98
(40)
92
-
-
-
-
-
(59)
98
(97)
70
+DEF
(40)
77
(52)
94
(58)
93
(51)
98
(40)
67 *
-
-
-
-
-
(55)
98
(102)
57
+PBO
(41)
36
(58)
71
(60)
89
(60)
86
(44)
77
(25)
17
(44)
74
-
(30)
63
-
(60)
80
(88)
77
Espinosad (1 ppm)
51
________________________________________________________________________________________________________________________
CÓD.
Población
Malatión (1.500 ppm)
% de Mortalidad
Tabla 2.3.1. Análisis de la susceptibilidad a malatión y espinosad en poblaciones de campo de C. capitata. En la evaluación de
la susceptibilidad a malatión, además de la aplicación de dicho insecticida en solitario (M), se realizó un tratamiento combinado con los sinergistas DEM
(maleato de dietilo), DEF (SSS-tributilfosforotritioato) y PBO (butóxido de piperonilo). Se indica el número total de insectos del bioensayo (n) y los
porcentajes de mortalidad, corregida según Abbott (1925), para los insecticidas malatión y espinosad. Entre paréntesis se indica el número de insectos
utilizados en cada bioensayo. (*) Diferencias significativas con respecto a M ( χ 22g .l . = 25,4 > 3,841 , p<0,05).
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2.3.2. Selección de resistencia a malatión en el laboratorio:
Establecimiento de las líneas W-4Km y W-10Km.
A partir de la población Castelló, resistente a malatión (Magaña et al., 2007) se estableció
en el laboratorio la línea W, mantenida bajo presión de selección con dicho organofosforado.
Inicialmente su cría se realizaba sobre manzanas pero, a partir de la generación F13, las hembras
fueron adaptadas a realizar la puesta a través de una malla de nailon, gracias a lo cual se facilitó el
manejo de los insectos. La respuesta de esta línea a la presión de selección con malatión se puede
observar en la tabla 2.3.2. En la generación F0, la CL50 estimada de la población Castelló recogida
en campo fue de 1.874 ppm (Magaña et al., 2007). Durante las primeras doce generaciones la
concentración de malatión empleada para la selección fue de 1.500-2.000 ppm, estimándose una
CL50 de 3.962 ppm de malatión en la generación F13. A lo largo de las siguientes diez generaciones
(entre la F13 y la F23) se suspendió el tratamiento insecticida y se observó que, en ausencia de
presión de selección, la resistencia revertía a niveles muy bajos (163 ppm), disminuyendo más de
diez veces respecto a la resistencia estimada en la F0 (RCLF0 = 0,09; intervalo de confianza [IC]:
0,02-0,30). En la generación F24 se aplicó de nuevo una concentración de selección de 2.000 ppm
de malatión, y en cuatro o cinco generaciones la susceptibilidad de la línea W disminuyó
rápidamente, alcanzando la CL50 un valor de 2.398 ppm. En la generación F30 se dividió la línea W
en dos líneas sometidas a presiones de selección distintas. En la primera se fijó la concentración de
selección en 4.000 ppm de malatión durante 48 horas, denominándose a partir de ese momento
línea W-4Km. La resistencia a malatión estimada en la generación F32 de la línea W-4Km (CL50 =
6.170 ppm) respecto a la generación F0 se incrementó 3,3 veces (IC: 1,5-7,4), resultando ser 154
veces (IC: 78-304) más resistente a malatión que la línea susceptible de laboratorio.
En la segunda línea de selección, la concentración de malatión empleada se incrementó
paulatinamente hasta alcanzar las 10.000 ppm en la generación F40 (Tabla 2.3.3), denominándose
a partir de este momento línea W-10Km. La presión de selección se mantuvo constante en 10.000
ppm de malatión a partir de esta generación, donde la CL50 se estimó en 16.163 ppm. El aumento
en la presión de selección aplicado en la línea W-10Km respecto a W-4Km provocó que los niveles
de resistencia se incrementasen en mayor medida en la línea W-10Km en relación a la F0 de
Castelló (RCL 8,6, IC: 4,9-15,2), que fue 403 veces (IC: 288-564) más resistente a malatión que la
línea susceptible de laboratorio.
.
52
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
0
0
0
2.000
2.000
2.000
2.000
2.000
F21
F22
F23
F24
F25
F26
F28
F30
4.000
0
F19
F32
0
F18
4.000
2.000
F13
F31
2.000
F9
Línea W-4Km
1.500
F2
(2)
Línea W
-
CS
F0
(1)
Generación
Castelló
Población/Línea
(3)
302
314
302
362
287
281
305
278
241
248
187
270
194
211
210
208
n
53
1,2 ± 0,3
1,1 ± 0,2
0,8 ± 0,1
0,8 ± 0,1
1,2 ± 0,1
1,1 ± 0,1
0,8 ± 0,1
1,1 ± 0,1
0,8 ± 0,1
0,9 ± 0,2
1,2 ± 0,3
0,7 ± 0,1
0,9 ± 0,2
0,7 ± 0,1
0,9 ± 0,1
0,9 ± 0,1
m ± E.E.
(4)
(5)
(IC 95%)
6.170 (3.326 - 15.513)
5.456 (3.129 - 8.646)
2.398 (1.255 - 4.336)
6.146 (3.065 - 22.567)
627 (292 - 1.160)
671 (399 - 1.131)
1.769 (960 - 3.861)
896 (596 - 1.324)
613 (226 - 1.299)
223 (84 - 404)
163 (26 - 335)
310 (42 - 811)
3.962 (1.950 - 10.176)
1.237 (387 - 4.317)
1.406 (633 - 3.150)
1.874 (1.190 - 3.300)
CL50
◊
◊
◊
◊
18
18
18
14
22,5 ◊
16,1 ◊
17,6 ◊
18
22
18
18
18
17
14
22
22
19
32
22
g.l.
31,6
38,5
30,8 ◊
27,2
◊
12,3 ◊
25,1
20,6
14,0
34,6
13,7
30,1
62,1
20,5 ◊
2
χ
(6)
Tabla 2.3.2. Selección de resistencia a malatión en líneas de laboratorio de C. capitata: Establecimiento de W-4Km. (1)
Indica el número de la generación durante el proceso de selección. (2) Concentración de malatión utilizada en la selección en ppm. (3) Número de
individuos utilizados en el bioensayo. (4) Pendiente (m) y error estándar (E.E.) de la recta probit. (5) Concentración letal 50 (CL50) expresada en ppm
de malatión con el intervalo de confianza (IC) al 95%. (6) Grados de libertad. (◊) Los datos se ajustan al modelo probit (p>0,05).
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
W-10Km
Línea
F40
F37
F30
(1)
Generación
(2)
10.000
7.000
4.000
CS
(3)
309
261
310
n
54
2,1 ± 0,2
1,6 ± 0,3
0,9 ± 0,1
m ± E.E.
(4)
(5)
(IC 95%)
16.163 (12.565 - 22.382)
8.427 (4.233 - 13.498)
1.201 (697 - 1.849)
CL50
27,6
18
14
21,2 ◊
◊
18
g.l.
15,8 ◊
2
χ
(6)
10Km. (1) Indica el número de la generación durante el proceso de selección. (2) Concentración de malatión utilizada en la selección en ppm. (3)
Número de individuos utilizados en el bioensayo. (4) Pendiente (m) y error estándar (E.E.) de la recta probit. (5) Concentración letal 50 (CL50)
expresada en ppm de malatión con el intervalo de confianza (IC) al 95%. (6) Grados de libertad. (◊) Los datos se ajustan al modelo probit (p>0,05).
Tabla 2.3.3. Selección de resistencia a malatión en líneas de laboratorio de C. capitata: Establecimiento de la línea W10Km. Partiendo de la línea W-4Km e incrementando la concentración de selección hasta 10.000 ppm de malatión, se estableció la población W-
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2.3.3. Resistencia cruzada en la línea W-4Km.
En la línea W-4Km se analizó la posible existencia de resistencia cruzada a varios
insecticidas. Se seleccionaron por su modo de acción y su estructura química un total de nueve
insecticidas y se calculó para cada uno de ellos la razón de las concentraciones letales 50 (RCL) en
relación a la línea susceptible C (Tabla 2.3.4). Además, se evaluó la capacidad esterilizante del
lufenurón mediante el cálculo de la concentración esterilizante 50 (CE50) y de la razón de las
concentraciones esterilizantes (RCE) con respecto a la línea susceptible C. La línea W-4Km fue 178
veces más resistente a malatión que la línea C, alcanzando unos niveles de resistencia (CL50 =
5.456 ppm) del rango de las concentraciones recomendadas por el fabricante del Malafin® 50 CE
(2.000 - 3.000 ppm). Se detectaron diferencias de susceptibilidad entre ambas líneas a todos los
insecticidas organofosforados estudiados (OP), aunque las RCL fueron menores que en el caso del
malatión, ya que oscilaron entre 7 veces para el triclorfón y el metil-clorpirifos, y 16 veces para el
diazinón, siendo todos los valores estadísticamente significativos. En el caso del carbamato carbaril
no fue posible calcular la CL50 en la línea W-4Km pero, según los datos observados (17% de
mortalidad con 2,56 ppm de carbaril), con la máxima dosis aplicada la resistencia sería mayor de 4
veces con respecto a la línea susceptible C.
Además, se observó una RCL significativa 6 veces mayor con respecto a la línea control C
cuando se analizó la susceptibilidad al piretroide λ-cialotrina y una RCE significativa de 6 veces más
cuando se analizó la susceptibilidad al quimioesterilizante lufenurón. Cuando se comparó la
susceptibilidad de ambas líneas frente al espinosad, aunque hubo diferencias significativas al
evaluar la RCL, esta diferencia fue muy baja (1,5 veces).
Con el objeto de determinar si las diferencias de susceptibilidad detectadas al comparar las
CL50 de las líneas C y W-4Km eran debidas a la alta susceptibilidad de la línea C, se analizó la
susceptibilidad frente al organofosforado malatión y el piretroide lambda-cialotrina de una
población recogida en la finca de La Mayora (Algarrobo Costa, Málaga), finca experimental del
CSIC en la que nunca se habían realizado tratamientos con insecticidas frente a C. capitata (Tabla
2.3.4, población MAY). En el caso del malatión, se observó que no existían diferencias significativas
entre la CL50 de la población MAY y la CL50 de la línea susceptible de laboratorio C. Sin embargo,
en el caso de la lambda-cialotrina, la RCL calculada para la población de MAY fue similar a la
estimada para la línea W-4Km, siendo ambas poblaciones unas 6 veces más resistentes que la línea
susceptible C.
55
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
C
W-4Km
MAY
4.000 - 5.000
Triclorfón (OP)
Metil-clorpirifos (OP) 3.000 - 4.000
λ-cialotrina (PI)
40 - 133
3.000
Lufenurón (QE)
(5)
Espinosad (SP)
Carbaril (CA)
C
W-4Km
3.000
Fosmet (OP)
1.000 - 1.250
C
W-4Km
1.200
Diazinón (OP)
C
W-4Km
C
W-4Km
C
W-4Km
C
W-4Km
C
W-4Km
C
W-4Km
1.000 - 2.000
Fentión (OP)
Línea
C
W-4Km
MAY
C.R.F.
2.000 - 3.000
Insecticida
Malatión (OP)
(1)
1.250
2.416
305
379
288
291
264
235
208
345
306
271
255
321
187
317
313
219
319
n
217
314
203
4,5 ± 0,5
1,9 ± 0,4
4,4 ± 1,0
4,0 ± 0,4
1,0 ± 0,2
-
1,0 ± 0,1
1,0 ± 0,2
1,8 ± 0,5
3,8 ± 0,4
1,9 ± 0,3
4,8 ± 1,2
3,1 ± 0,6
2,6 ± 0,4
-
2,7 ± 0,3
1,1 ± 0,2
1,0 ± 0,3
2,7 ± 0,4
m + E.E.
1,5 ± 0,4
1,2 ± 0,3
1,1 ± 0,2
56
(9 - 12)
(110 - 229)
(0 - 5)
(8 - 14)
(6 - 11)
(40 - 70)
0,6 (0,5 - 0,7)
0,9 (0,8 - 1,0)
(6)
9
52
-
(36 - 110)
(253 - 1.249)
(280 - 959)
(4 - 5)
(23 - 41)
(20 - 27)
(127 - 195)
0,6 (0,3 - 1)
66
466
463
5
32
23
166
133 (108 - 160)
(4)
-
10
166
1
11
(2)
CL50 (IC 95%)
31 (15 - 57)
5.456 (3.129 - 8.646)
76 (39 - 134)
◊
90,1
221,8
12,2
18,9 ◊
◊
20,0 ◊
-
19,7
16,2 ◊
10,7 ◊
◊
6,5
13,2 ◊
◊
12,3
22,1 ◊
11,2
-
◊
19,9
7,2 ◊
18
25
18
22
18
18
18
14
9
13
17
13
18
18
14
18
18
17
14
18,5 ◊
20,5 ◊
◊
g.l.
18
18
9
2
χ
21,2 ◊
16,1 ◊
5,3 ◊
(3)
(IC 95%)
6 (5 - 7) *
1,5 (1,3 - 1,9) *
>4
6 (2 - 17) *
6 (2 - 17) *
7 (5 - 10) *
7 (5 - 10) *
> 15
16 (10 - 25) *
8 (5 - 11) *
178 (82 - 272) *
2 (1 - 4)
RCL
laboratorio: C susceptible y W-4Km resistente a malatión. Además se estudió una población de campo no tratada recogida en Málaga (MAY). Se
aplicaron insecticidas organofosforados (OP), un piretroide (PI), un carbamato (CA), una espinosina (SP) y un quimioesterilizante (QE). Excepto el
bioensayo con carbaril que se realizó tópicamente, el resto de insecticidas se aplicaron por ingestión. (1) Concentración de insecticida recomendada por
el fabricante contra C. capitata, en ppm. (2) La concentración letal 50 expresada en ppm, para el lufenurón se indica la CE50. (3) Razón de las
concentraciones letales 50 respecto a la línea susceptible C. (4) Aplicando una concentración máxima de 2.000 ppm de fosmet, la mortalidad fue del
30%. (5) El carbaril no se emplea específicamente contra C. capitata. (6) Aplicando una dosis máxima de 2,56 ppm de carbaril, la mortalidad fue del
17%. (◊) Los datos se ajustan al modelo probit (p>0,05). (*) La concentración letal es significativamente diferente (p<0,05) si RCL no incluye el 1.
Tabla 2.3.4. Susceptibilidad de C. capitata frente a diferentes insecticidas. Se analizaron individuos adultos de las líneas de
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2.3.4. Selección de resistencia a espinosad en laboratorio:
Establecimiento de la línea Xàbia-W-100s.
Los individuos provenientes de la fruta recogida en Xàbia (Alicante) mostraron, junto con
los de Marratxí (Mallorca), los menores valores de susceptibilidad frente a espinosad (36% con 1
ppm, ver tabla 2.3.1). Para confirmar este resultado se realizó un bioensayo de susceptibilidad a
espinosad con la población Xàbia (F0), estimando una CL50 de 1,6 ppm (Tabla 2.3.5). Los
individuos supervivientes de los bioensayos de susceptibilidad a espinosad realizados en Xàbia (ver
apartado 2.3.1) se mantuvieron en una jaula de cría con el objetivo de establecer una línea de
laboratorio resistente a espinosad. Inicialmente fue mantenida sobre manzana y a partir de la
cuarta generación se adaptó a la puesta en malla. Durante las primeras diez generaciones se aplicó
una presión de selección de 1 ppm de espinosad durante 48 horas. Debido a un descenso en el
número de individuos, posiblemente provocado por la presión de selección, se cruzó la generación
F10 de la línea Xàbia con la generación F38 de la línea W-4Km, resistente a malatión. Hasta la
generación F24 los niveles de susceptibilidad a espinosad de la línea Xàbia-W fueron similares a los
de la población inicial, a pesar de que la selección se realizaba con concentraciones crecientes de
espinosad, que llegaron hasta 4 ppm. Sin embargo, en la generación F25, cuando se seleccionaba
con 6,5 ppm de espinosad, se observó una leve disminución en la susceptibilidad (CL50 =3,4 ppm).
En la generación F29, la CL50 aumentó drásticamente hasta 187 ppm de espinosad, con una RCL
de 499 (IC: 344-723) con respecto a la línea C, lo que supuso un incremento de 120 veces en la
resistencia frente a espinosad con respecto a la población inicial. A partir de la generación F30 se
fijó la concentración de selección en 100 ppm de espinosad, manteniéndose la susceptibilidad de la
línea seleccionada, como se puede observar en la CL50 de la generación 36 (Tabla 2.3.5).
57
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
6,5
10,0
F25
F29
100,0
4,0
F21
F36
3,0
F20
Xàbia-W-100s
2,5
F14
(2)
Xàbia-W
-
CS
F0
(1)
Generación
Xàbia
Población/Línea
(3)
366
329
189
302
363
262
244
n
58
1,9 ± 0.3
2,0 ± 0,4
2,5 ± 0,3
4,2 ± 0,6
3,5 ± 0,4
2,5 ± 0,4
2,4 ± 0,4
m ± E.E.
(4)
(5)
(IC 95%)
156,6 (126,2 - 207,1)
187,0 (151,7 - 261,6)
3,4 (2,8 - 4,3)
1,4 (1,2 - 1,6)
1,5 (1,2 - 1,8)
0,6 (0,5 - 0,8)
1,6 (0,9 - 2,2)
CL50
◊
28,0
◊
12,5 ◊
20,4
15,1
◊
22
18
18
14
18
14
11,4 ◊
35,6
18
g.l.
22,1 ◊
2
χ
(6)
número de la generación durante el proceso de selección. (2) Concentración de espinosad utilizada en la selección en ppm. (3) Número de individuos
utilizados en el bioensayo. (4) Pendiente (m) y error estándar (E.E.) de la recta probit. (5) Concentración letal 50 (CL50) expresada en ppm de malatión
con el intervalo de confianza (IC) al 95%. (6) Grados de libertad. (◊) Los datos se ajustan al modelo probit (p>0,05).
Tabla 2.3.5. Selección de resistencia a espinosad en laboratorio: Establecimiento de la línea Xàbia-W-100s. (1) Indica el
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2.4. Discusión.
En un estudio previo, el análisis de nueve poblaciones de C. capitata recogidas durante los
años 2004 y 2005 en la C. Valenciana, Cataluña y La Rioja, se mostró que todas las poblaciones de
campo analizadas presentaban una susceptibilidad a malatión significativamente inferior a la de
dos líneas de laboratorio, observándose que los niveles más bajos de susceptibilidad se
encontraban en la C. Valenciana, niveles que estaban relacionados con la alta frecuencia de
tratamientos con malatión (Magaña et al., 2007). En este trabajo, hemos analizado la
susceptibilidad a malatión de poblaciones españolas recogidas durante los años 2007 y 2008, un
periodo en el que el malatión estaba siendo utilizado de forma indiscriminada y única. En el estudio
de susceptibilidad, en esta ocasión, hemos utilizado concentraciones discriminantes y hemos
ampliado el área de muestro a las comunidades autónomas de Andalucía, Islas Baleares y Aragón.
La concentración discriminante de malatión escogida (1.500 ppm) provocó el 100% de mortalidad
en una población susceptible de laboratorio. En las poblaciones estudiadas la mortalidad osciló
entre el 63 y el 97%. La menor mortalidad observada correspondió a las poblaciones de Alcanar
(Tarragona) y Xàbia (Alicante) y sugiere la existencia de resistencia frente a malatión en estas
localidades. La mortalidad estimada en Marratxí (Mallorca) fue también baja pero, debido al bajo
número de individuos analizados, debe ser interpretada con cautela. En el resto de poblaciones la
susceptibilidad fue mayor, pero la existencia de individuos supervivientes a la concentración
discriminante aplicada podría ser compatible con la existencia de individuos resistentes a malatión
59
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
en la mayoría de las localidades. Se debe tener en cuenta que los bioensayos de susceptibilidad
realizados en este capítulo únicamente permiten detectar poblaciones resistentes cuando la
frecuencia del alelo que confiere resistencia es alta, por lo que los datos de mortalidad se deben
interpretar con precaución. Por ejemplo, la CL50 de malatión estimada para una población no
sometida a tratamientos insecticidas (población MAY) no fue significativamente distinta a la de la
línea susceptible C, sin embargo, se detectaron supervivientes (7%) en el tratamiento con una
dosis discriminante de malatión que provocaría el 100% de mortalidad en individuos susceptibles.
En la actualidad se está poniendo mucho énfasis en otro tipo de aproximaciones como la detección
de alelos de resistencia mediante métodos moleculares (Vontas et al., 2011), que permiten estimar
la frecuencia de un determinado alelo de resistencia en una población y pueden detectar
resistencia cuando ésta se encuentra en niveles no detectables por los bioensayos de
susceptibilidad (por ejemplo Menozzi et al., 2004; Nardi et al., 2006: Alou et al., 2010; Kawada et
al., 2011).
Dos mecanismos distintos han sido asociados a la resistencia a malatión observada en una
población recogida en Castelló en 2004: la mutación puntual G328A en la acetilcolinesterasa
(AChE) y un mecanismo de detoxificación mediado por carboxilesterasas, sugerido por una
disminución de la actividad aliesterasa y por el sinergismo del DEF, que provocaba una disminución
de la CL50 de aproximadamente 8 veces (Magaña et al., 2008). La ausencia de sinergismo en el
tratamiento con DEF sobre las poblaciones analizadas en este trabajo sugiere que el mecanismo de
resistencia mediado por carboxilesterasas no es el responsable de los bajos niveles de
susceptibilidad encontrados en las poblaciones de Xàbia o Alcanar, donde se debería haber
observado un claro incremento en la mortalidad al aplicar el sinergista. Por otro lado, el
tratamiento realizado con los sinergistas DEM y PBO en las poblaciones estudiadas tampoco
produjo en ningún caso un aumento significativo de la mortalidad, lo que sugiere que la resistencia
no está mediada por las enzimas de detoxificación GSTs y P450, respectivamente. Por el contrario,
sí se observó una disminución significativa de la mortalidad en la población de Muro en el
tratamiento con PBO. La disminución de la mortalidad provocada por el PBO, que podría ser debida
a la inhibición de la transformación del malatión en su forma activa (malaoxón) por parte de las
enzimas P450, ha sido observada anteriormente en C. capitata y no ha sido asociada a un
mecanismo de resistencia (Magaña et al., 2007). El análisis del segundo mecanismo de resistencia
descrito, es decir, la presencia de la mutación G328A en la acetilcolinesterasa, se abordará en el
capítulo 4.
Mediante la selección con malatión en el laboratorio se obtuvieron dos líneas resistentes: la
línea W-4Km y la W-10Km. La línea W, que provenía de una población de campo recogida en
Castelló en 2004 (Magaña et al., 2007), fue adaptada a la puesta en malla y fue sometida a un
60
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
proceso de selección con concentraciones crecientes de malatión. Este proceso derivó en el
establecimiento de la línea resistente W-4Km, que triplicó los niveles de resistencia de la población
original. A partir de la línea W-4Km, aumentando la presión de selección, se estableció una
segunda línea resistente denominada W-10Km, cuya CL50 estimada (16.163 ppm) fue superior a la
concentración de malatión recomendada por el fabricante (2.000 - 3.000 ppm) e incluso a la
concentración (7.500 ppm) que se aplicó en campo (Primo-Millo et al., 2003). La estabilización de
la línea W-4Km nos permitió realizar los estudios de resistencia cruzada presentados en este
capítulo, así como otros estudios que se abordarán en los capítulos 4 y 5 de esta tesis. Además, el
proceso de selección, que resultó en el establecimiento de la línea W-10Km, nos permitió estudiar
los individuos que presentaban los mayores niveles de resistencia a malatión, dando lugar al
descubrimiento de un nuevo mecanismo de resistencia que se detallará en el capítulo 5.
Debido a la prohibición del uso del malatión contra C. capitata, desde 2009 se ha
incrementado el uso de otros insecticidas como son el espinosad y la lambda-cialotrina. La
aplicación de estos insecticidas alternativos, con mecanismos de acción diferentes al del malatión,
debería favorecer el control de la plaga, pero esta mejora en el control sería necesario corroborarla
realizando estudios que clarifiquen si existe o no resistencia cruzada a los nuevos insecticidas
empleados. De esta manera se podrá seleccionar el insecticida o insecticidas más aptos así como el
conjunto de estrategias de manejo para el correcto control de la plaga. En este trabajo hemos
analizado la susceptibilidad de la línea W-4Km, resistente a malatión, frente a diez insecticidas: los
organofosforados malatión, fentión, diazinón, fosmet, triclorfón y metil-clorpirifos; el piretroide
lambda-cialotrina;
el
carbamato
carbaril;
la
espinosina
espinosad;
y
la
benzoilurea
quimioesterilizante lufenurón. La evaluación de estos insecticidas puede aportar información sobre
los mecanismos asociados con la resistencia frente a malatión y sobre los insecticidas a emplear
como alternativas a este organofosforado, evitando así el incremento de los alelos de resistencia.
Actualmente en España, según el registro de productos fitosanitarios del Ministerio de Agricultura,
Alimentación y Medio Ambiente, de los insecticidas empleados en este trabajo se aprueba contra C.
capitata la utilización de metil-clorpirifos, triclorfón, fosmet, espinosad, lambda-cialotrina y
lufenurón. No está aceptado el uso de diazinón y malatión, aunque éstos si se han utilizado frente
a esta plaga en campañas anteriores (Beitia et al., 2011). El único insecticida analizado en este
estudio no dirigido específicamente frente a la mosca mediterránea de la fruta es el carbaril.
La línea W-4Km presentó resistencia cruzada moderada (7-15 veces) frente a los
organofosforados analizados y frente al carbamato carbaril, sin embargo, estos niveles de
resistencia son muy inferiores a los niveles detectados en la línea W-4Km frente a malatión (178
veces). Esta diferencia podría deberse a dos posibles hipótesis: en primer lugar, la mutación AChE
G328A puede conferir mayor insensibilidad a malaoxón (forma activa del malatión) que frente a
61
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
otros insecticidas que tienen como diana la AChE, tal y como ha sido demostrado en Musca
domestica (Walsh et al., 2001) y en Drosophila melanogaster (Menozzi et al., 2004); y en segundo
lugar, que el mecanismo de resistencia mediado por carboxilesterasas (Magaña et al., 2008)
hidrolice de un modo más eficiente el malatión (Campbell et al., 1998b) que el resto de insecticidas
analizados. Un fenómeno similar ocurre en la mosca Lucilia cuprina en la que la resistencia a
malatión y a otros organofosforados está asociada a una mutación puntual en la aliesterasa E3
(Campbell et al., 1998b). Sin embargo, en la secuenciación del gen de la aliesterasa de C. capitata
realizada en individuos de la población W no se encontraron las mutaciones que habían sido
asociadas con la resistencia a organofosforados en L. cuprina, aunque se encontraron otras
mutaciones que no pudieron ser asociadas con la resistencia (Magaña et al., 2008). En cuanto a
los insecticidas estudiados que no tienen a la acetilcolinesterasa como molécula diana, hemos
detectado resistencia cruzada en la línea W-4Km tanto a lufenurón como a lambda-cialotrina. La
resistencia a estos dos insecticidas difícilmente podría ser explicada por la presencia de la mutación
G328A en la AChE, sin embargo, las carboxilesterasas, que intervienen en el segundo mecanismo
previamente descrito, sí podrían estar implicadas en la resistencia al piretroide y al lufenurón, ya
que se sabe que estas enzimas pueden detoxificar los insecticidas por hidrólisis y/o por secuestro
(Hemingway 2000, Oakeshott et al., 2005). Los piretroides contienen un enlace éster en su
estructura y, en algunos casos, se ha descrito resistencia cruzada entre malatión y piretroides
asociada a un incremento en la actividad esterasa (Chen y Sun 1994, Bisset et al., 1997, Heidari et
al., 2005). En el caso de las benzoilureas, no poseen enlaces tipo éster y, además, el principal
mecanismo de resistencia a lufenurón identificado está mediado por la sobreexpresión de genes
P450 (Daborn et al., 2002, Bogwitz et al., 2005). Sin embargo, en estudios in vivo realizados en
insectos se ha descrito la ruptura del enlace entre los grupos amida y carboxilo de las benzoilureas
(Ivie y Wright, 1978; El Saidy et al., 1989) y, según el resultado de bioensayos con sinergistas, se
sugiere que la hidrólisis de dichos grupos está mediada por esterasas (El Saidy et al., 1989;
Ishaaya, 1993).
En el bioensayo de susceptibilidad en campo al piretroide lambda-cialotrina, realizado en
individuos procedentes de la finca de La Mayora (MAY), se observó que el nivel de resistencia en
esta población no tratada fue idéntico al estimado para la línea W-4Km, siendo en ambos casos
seis veces superior al de la línea C. Por el contrario, la susceptibilidad a malatión fue similar en la
población MAY y en la línea susceptible C. Aunque en la finca de La Mayora no se han realizado
tratamientos insecticidas dirigidos contra C. capitata, la población MAY podría estar, en parte,
formada por individuos que hubiesen migrado de alguna parcela próxima a la finca donde sí se
hubiesen empleado piretroides. Este dato de susceptibilidad podría sugerir la existencia en España
de poblaciones de campo de C. capitata resistentes a lambda-cialotrina. Para confirmar este
62
2. Selección de resistencia en laboratorio y susceptibilidad a insecticidas en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
resultado sería necesario recoger poblaciones de C. capitata en diferentes regiones españolas y
realizar bioensayos de susceptibilidad al piretroide lambda-cialotrina.
Hasta la fecha no se han descrito poblaciones de C. capitata resistentes a espinosad,
aunque sí se ha encontrado resistencia a este insecticida, aunque moderada, en otras dos especies
de tefrítidos: Bactrocera oleae y B. cucurbitae (Hsu y Feng, 2006; revisado por Vontas et al., 2011;
Hsu et al., 2012b). El espinosad ha sido propuesto como una buena alternativa al malatión para el
control de C. capitata en cítricos, en comparación con el fosmet y la lambda-cialotrina, tanto por su
efectividad como por su bajo impacto sobre la fauna auxiliar (Urbaneja et al., 2009). Además, su
uso contra C. capitata se ha incrementado desde la retirada del malatión. Con anterioridad a este
trabajo, no existían datos sobre la susceptibilidad de las poblaciones de campo de C. capitata a
este insecticida, con la excepción de la CL50 estimada para la población resistente a malatión
analizada por Magaña et al. (2007), cuya CL50 fue similar a la de la línea susceptible de laboratorio.
Nuestros resultados indican que, a pesar de que la susceptibilidad a espinosad en la población de
campo es elevada y de que la resistencia a malatión no parece conferir resistencia cruzada a
espinosad, el desarrollo de resistencia a este insecticida es posible a medio plazo si no se emplea
racionalmente frente a C. capitata. De hecho, la pequeña diferencia de susceptibilidad frente a
espinosad observada inicialmente en la población recogida en Xàbia (Alicante) ha resultado,
después de haber sido seleccionada durante 30 generaciones en el laboratorio, en una línea
resistente cuya CL50 (157–187 ppm) se encuentra en torno a la concentración de espinosad
recomendada para el tratamiento con el insecticida GF-120 frente a C. capitata (133 ppm). Los
resultados sugieren que existe un mecanismo de resistencia a espinosad en las poblaciones
españolas, pero que posiblemente se encuentre en estos momentos en baja frecuencia.
En conclusión, la resistencia a malatión parece estar ampliamente presente en las
poblaciones españolas de C. capitata. Además, por selección en laboratorio de poblaciones de
campo, se han podido obtener en este trabajo líneas altamente resistentes a malatión y espinosad.
Estos resultados ponen de manifiesto la necesidad de establecer métodos de detección precoz de
la resistencia en poblaciones de campo para elegir el insecticida más adecuado. En los siguientes
capítulos se muestran diferentes estrategias para lograr esa detección precoz de la resistencia.
63
Capítulo 3
BASES PARA LA DETECCIÓN PRECOZ DE LA
RESISTENCIA: DIVERSIDAD DE GENES CYP
65
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
3.1. Introducción.
Las citocromo P450 constituyen un grupo numeroso de enzimas que se han asociado a
resistencia metabólica (Feyereisen, 2005). Las P450 poseen una gran variedad de actividades
enzimáticas (oxidasa, reductasa, isomerasa…), bioquímicamente se definen como monooxigenasas
y son el producto de la traducción de los genes CYP (revisado por Feyereisen, 2011). Este grupo
de enzimas presenta un pico de absorción a una longitud de onda de 450 nm, característica que da
nombre a esta familia proteica (Omura y Sato, 1964). Debido a su función de detoxificación, por
oxidación de los xenobióticos, poseen un papel importante en el metabolismo de los insecticidas.
En los años sesenta se describió por primera vez que las citocromo P450 estaban
implicadas en el metabolismo de xenobióticos en insectos (Agosin, 1985) y a principios de los
setenta se confirmó su implicación en procesos de resistencia a insecticidas (Perry y Buckner,
1970). Actualmente, se ha demostrado que las P450 están implicadas en la resistencia frente a los
principales grupos de insecticidas, tales como organofosforados, piretroides, etc. (Feyereisen,
2012). En la familia Tephritidae, hasta el momento, no se ha encontrado una relación directa entre
un gen CYP concreto y la resistencia a insecticidas, ya que sólo se ha detectado la implicación de
las P450 de un modo indirecto en una línea multiresistente de Bactrocera dorsalis (Hsu et al.,
2004a) y en varias poblaciones de campo de B. oleae recogidas en Grecia (Margaritopoulos et al.,
2008).
67
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
La secuenciación completa de los genomas de varios insectos ha permitido estudiar tanto
la diversidad como la evolución de los CYPomas, cuyo número total de genes varía desde los 36
del piojo humano (Lee et al., 2010) a los 170 genes descritos en el mosquito Culex pipiens
(Arensburger et al., 2010). La diversidad de genes CYP existente en una determinada especie se
debe a los fenómenos de divergencia, convergencia y/o desaparición de genes que hayan tenido
lugar durante el proceso evolutivo de dicha familia génica. A partir de un ancestro común se
pueden originar genes parálogos a través de varios mecanismos: duplicaciones génicas en tándem,
entrecruzamientos desiguales, recombinaciones no homólogas, duplicaciones cromosómicas o
retroposiciones (Feyereisen, 2011). Debido a su elevado número, las citocromo P450 se dividen
jerárquicamente en clados, familias y subfamilias según la homología que presentan las proteínas
codificadas por los genes CYP. Concretamente en insectos, existen cuatro grandes clados: CYP-2,
CYP-3, CYP-4 y CYP mitocondrial (Feyereisen, 2006).
Un estudio realizado en Drosophila melanogaster demostró que aproximadamente la
tercera parte de su CYPoma está constituido por genes inducibles por xenobióticos (Giraudo et al.,
2010), lo que pone de manifiesto la importancia de su regulación a nivel fisiológico. Uno de los
compuestos más empleados en los estudios de inducción de las citocromo P450 es el fenobarbital,
cuyo efecto ha mostrado un amplio rango de variación sobre la expresión de diferentes genes CYP
en insectos, dependiendo tanto del sexo del individuo como del gen analizado (Le Goff et al.,
2006).
En la familia Tephritidae sólo se han aislado genes CYP en los géneros Bactrocera y
Ceratitis. En el género Bactrocera se ha obtenido, mediante ESTs, una secuencia parcial de un gen
CYP de B. oleae (Tsoumani et al., 2011) y un fragmento de un gen CYP en B. papayae (ref. GB:
AF532768). En B. dorsalis, recientemente, se han clonado y caracterizado los genes CYP6A41 y
CYP6EK1 (Huang et al., 2012) y, además, se ha publicado su transcriptoma, donde se han
identificado un total de 90 genes CYP (Hsu et al., 2012a). En C. capitata se conoce la secuencia
parcial de 14 genes pertenecientes a las familias CYP4 y CYP6, y la secuencia completa del gen
CYP6A10 (Danielson et al., 1999).
El conocimiento existente sobre la diversidad de los genes CYP en los insectos facilita la
descripción de su expresión funcional y de los procesos de detoxificación de insecticidas en los que
podrían participar. Por ello, el objetivo de este trabajo fue, en primer lugar, ampliar el
conocimiento de la diversidad de genes CYP existentes en una especie plaga como es la mosca
mediterránea de la fruta y, en segundo lugar, caracterizar los niveles basales de expresión y la
posible inducción por fenobarbital de algunos de los genes CYP identificados, genes seleccionados
68
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
por su homología con otros genes CYP que previamente han sido asociados a resistencia a
insecticidas en otros insectos.
69
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
3.2. Material y métodos.
3.2.1. Insectos.
Tanto en los ensayos realizados para estudiar la diversidad de genes CYP, como en el
estudio de la inducción de la expresión por fenobarbital, se emplearon individuos adultos de entre
tres y cinco días de edad de la línea susceptible de laboratorio C de C. capitata (descrita en el
apartado 2.2.2).
3.2.2. Extracción de DNA.
Previamente a la extracción de DNA, los insectos fueron congelados en nitrógeno líquido y
almacenados a -80ºC. El DNA se extrajo de individuos completos siguiendo el método de
extracción de fenol-cloroformo. Cada individuo se introdujo en un tubo eppendorf de 1,5 ml. A
dicho tubo se le añadieron 500 µl de la solución de lisis (10 mM Tris pH 8, 25mM EDTA, SDS
0,5%) y se disgregó el tejido con un bastón homogeneizador de plástico. Una vez homogeneizado
71
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
se añadieron 30 µl de proteinasa K (10 mg/ml) y tras una ligera agitación manual de 5 s, se
mantuvo a 37ºC durante toda la noche. Tras la incubación, al tubo de 1,5 ml se le añadieron 600
µl de fenol y se mezcló manualmente por volteo varias veces antes de centrifugarlo durante 5 min
a 5.800 xg en una centrífuga Eppendorf 5424 (Eppendorf, Hamburgo). La fase superior se pasó a
un nuevo tubo que contenía 600 µl de una solución de fenol:cloroformo (1:1); después de
mezclarlo manualmente por volteo durante 20 o 30 s, tras una nueva centrifugación durante 5 min
a 5.600 xg, se retiró la fase superior a un nuevo tubo eppendorf que contenía 550 µl de
cloroformo. Después de mezclarlo y centrifugarlo 4 min a 5.800 xg, la fase superior se llevó a un
nuevo tubo eppendorf de 1,5 ml al que se le añadió 1 volumen de isopropanol y se homogeneizó
de nuevo por volteo. El tubo se centrifugó durante 5 min a 7.200 xg para sedimentar el DNA y se
eliminó el isopropanol por decantación. Se añadió al tubo una disolución de lavado de etanol al
70% que se retiró después teniendo especial cuidado de no verter el precipitado de DNA o pellet.
Posteriormente, se realizó un secado del pellet dejando el tubo abierto en la campana de flujo
laminar Microflow H 1.20 (T.D.I., Alcobendas, Madrid) durante 10 min. Para resuspender el pellet
de DNA se añadieron 100 µl de TE 0,1X y 2 µl de RNasa (1mg/ml). La concentración de DNA se
midió con un NanoDrop (Thermo Scientific, Massachusetts, EE.UU.). El DNA se mantuvo
almacenado a -20ºC hasta su utilización.
3.2.3. Extracción de RNAT y RNAm.
La extracción de RNA total (RNAT) se realizó a partir de individuos completos, previamente
conservados a -80ºC, utilizando TRIzol® Reagent (Life Technologies, Van Allen Way, Carlsbad,
California, EE.UU.) y siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración del RNAT se midió
con un NanoDrop (Thermo Scientific, Massachusetts, EE.UU.). A partir del RNAT se extrajo el RNA
mensajero (RNAm) con el mRNA Purification Kit (Amersham Biosciences, Friburgo, Alemania). Así,
haciendo pasar el RNAT a través de unas columnas de celulosa que contenían oligonucleótidos poli
T, se separó el RNAm del resto de RNA. Las extracciones de RNAm se almacenaron a -80ºC para
su uso posterior.
72
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
3.2.4. Síntesis de cDNA.
La obtención de DNA complementario (cDNA) a partir del RNAm se realizó mediante el
MarathonTM cDNA Amplification Kit (BD Biosciences-Clontech, California, EE.UU.) con el fin de
elaborar una librería de cDNA. El proceso de síntesis tuvo lugar en dos fases: en la primera se
sintetizaron todas las cadenas simples de cDNA a partir del RNAm del transcriptoma y, en la
segunda fase, se realizó la síntesis de la cadena complementaria. Así, en la primera fase se
sintetizó la cadena simple de cDNA con la enzima transcriptasa inversa AMV RT, siguiendo las
instrucciones del fabricante, partiendo de entre 1,5 y 2 µg de RNAT y utilizando 1,7 µg del cebador
reverso poli-T Marathon cDNA synthesis primer (Tabla 3.2.1). En la segunda fase de la síntesis,
para obtener cDNA de doble cadena mediante la DNA polimerasa T4 (Promega Co, Wisconsin,
EE.UU.), se empleó como molde el cDNA de cadena simple sintetizado anteriormente. Finalmente,
se realizó la ligación de unos adaptadores en los extremos de las cadenas de cDNA para facilitar la
amplificación de los genes CYP por PCR RACE.
Tabla 3.2.1. Cebadores empleados en el estudio de diversidad de genes CYP. Se
indica los cebadores ordenados alfabéticamente por su nombre. La secuencia nucleotídica se
muestra en sentido 5’
3’ indicando el número de bases del oligonucleótido (b). El código de
nomenclatura de los nucleótidos sigue los criterios de la IUPAC (Cornish-Bowden, 1985), la letra I
indica inosina. (1) Cebador obtenido del estudio de Scott et al., 1994.
Nombre
Secuencia (5’
3’)
b
dFCyp4a
ACITTYATGTTYGARGGIYAYGAYACNAC
29
dFCyp6a
CARGCITTYITITTYTWYIYIGCYGGNTT
29
dFCyp9a
GCYCAGTGYYTIITNTTYTTYTTYGCNG
28
dFCyp12a
MTGGAYWTSCTMWTIGCIGGWGYGGA
26
dFCyp18a
GAYYTITTYWSIGCNGGIATGGARAC
29
dFCyp28a
ACMTTYMTIYTIGAYGGIYTIGAIACNAC
29
dRHemo4
CCIATRCARTTICKIKGICCIGCISWRAAIGG
32
dRHemo6_9
ATGCARYTICKIKGICCIDCICCRAANGG
29
dRHemo12_18
CACATICKISKICCIAMICCRAANGG
26
CTGICCGATRCAGTTICGBGGICCIGCSIWGAABGG
36
M13F
GTAAAACGACGGCCAGT
17
M13R
GGAAACAGCTATGACCATG
19
Poli-T
TTCTAGAATTCAGCGGCCGC(T)30N-1N
51
dRScott94
(1)
___________________________________________________________________________________________________________________________________
73
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
3.2.5. Amplificación por PCR de los genes CYP.
Con el objetivo de obtener el mayor número de genes CYP se realizó la amplificación por
PCR empleando una mezcla de cebadores, de aquí en adelante llamada cebadores degenerados,
tanto a partir del DNA complementario (cDNA) como del DNA genómico. Los cebadores
degenerados son una mezcla de cebadores similares entre sí que contienen mínimas variaciones en
su secuencia para lograr amplificar varias secuencias nucleotídicas que codifican un mismo
aminoácido. Como referencia para el diseño de los cebadores degenerados se emplearon las
secuencias de aminoácidos de las familias CYP4, CYP6, CYP9, CYP12, CYP18 y CYP28 de D.
melanogaster (Tabla 3.2.1), seis de ellos en sentido directo (cebadores dFCyp) a partir de la región
hélice I, y cuatro cebadores en sentido reverso (cebadores dRHemo) basados en el grupo hemo.
El tamaño esperado para el producto de PCR tras la amplificación, tomando cDNA como
molde, tendría un tamaño aproximado de entre 400 y 500 pb (Fig. 3.2.1). En el caso de las
amplificaciones realizadas sobre DNA genómico, el tamaño del amplicón aumentaría en función del
tamaño del intrón existente en la región amplificada. Se ensayaron todas las posibles
combinaciones entre los cebadores degenerados directos y los reversos con el objetivo de
amplificar la mayor diversidad de genes CYP. La reacción de PCR se realizó en un termociclador
Gene Amp® PCR System 2700 (Applied Biosystem, Foster City, EE.UU.) empleando la enzima
Amplitaq Gold® (Roche Molecular Systems, Inc., New Jersey, EE.UU.) y con las siguientes
condiciones de amplificación: inicialmente un periodo de desnaturalización a 95ºC durante 5 min,
seguido de 35 ciclos de 94ºC 45 s, 46-52ºC 45 s, 72ºC 45 s y finalizando con un periodo de 72ºC
durante 7 minutos.
P450s (1700 pb)
5’-UTR
Hélice I
G. Hemo
3’-UTR
400 - 500 pb
dFCyp
dRHemo
Figura 3.2.1. Estructura de un cDNA que codifica una P450. Se muestra la
localización de las regiones conservadas hélice I y grupo hemo en el cDNA de un gen CYP.
Situación de los cebadores en sentido directo (dFCyp) y reverso (dRHemo) empleados en la
amplificación por PCR de DNA genómico y cDNA de C. capitata.
74
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
3.2.6. Electroforesis y extracción de bandas.
Los productos de PCR fueron migrados electroforéticamente para su separación por
tamaño en un gel de agarosa D2 (Lab. Conda, Torrejón de Ardoz, Madrid, España) al 1,5% en TAE
1X modificado (Tris 10mM, EDTA 0,1mM pH 8.0), que contenía además 2 µl de bromuro de etidio
(1 mg/ml) por cada 100 ml de gel. El marcador molecular referencia de 100 pb en escalera fue
O’GeneRulerTM 100 bp Plus (Fermentas, Thermo Scientific, Massachusetts, EE.UU.). El DNA se
migró en una cubeta electroforética Bio-Rad® Sub Cell (Bio-Rad Laboratories, California, EE.UU.).
Los productos de PCR se visualizaron en un transiluminador UV/digitalizador GelDoc Universal
Hood II (Bio-Rad Laboratories, Milán, Italia) y las bandas correspondientes en tamaño a los
amplicones esperados se extrajeron del gel de agarosa y fueron purificadas usando las columnas
Ultrafree-DA (Millipore Corporation, Massachusetts, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Cada uno de los productos resultantes de la purificación de las bandas se almacenó a 20ºC para su posterior clonación.
3.2.7. Clonación, RFLP y secuenciación.
Los productos de PCR purificados se clonaron empleando el sistema pGEM-T Easy Vector
(Promega Corporation, Wisconsin, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las colonias
positivas a la clonación, es decir, aquellas que podían contener insertos en el plásmido, fueron
seleccionadas en base al color claro de las mismas, y fueron analizadas mediante PCR con los
cebadores M13F y M13R (Tabla 3.2.1). El producto de PCR resultante se migró en un gel de
agarosa al 1,5% para determinar el tamaño del inserto clonado (Fig. 3.2.2).
a
b
Figura 3.2.2. Clonación y comprobación del inserto. (a) Placa Petri con colonias
resultado de la clonación de uno de los productos de PCR obtenidos a partir de una determinada
combinación de cebadores degenerados. Cada colonia positiva a la clonación fue analizada por PCR
para confirmar la presencia de inserto y el tamaño del mismo (b). Los amplicones con un tamaño
de 600-800 pb (ejemplo, en azul) fueron seleccionados para su posterior análisis por RFLP.
75
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Los productos de PCR de aquellas colonias que contenían un inserto de 400-600 pb fueron
analizados mediante RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) con las enzimas
de restricción Rsa I y Hpa II (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania). La digestión se realizó
en un volumen total de 25 µl en el buffer L, a 37ºC durante 2 horas, con una unidad de cada una
de las enzimas. Finalmente, el producto de PCR digerido se migró electroforéticamente en un gel
de agarosa D2 (Laboratorios Conda S.A., Torrejón de Ardoz, Madrid) al 2% en TAE 1X (Tris 40mM,
EDTA 1mM pH 8.0). Los clones que presentaron distintos perfiles de restricción fueron enviados al
servicio de secuenciación Secugen S.L. (Madrid) y secuenciados en un secuenciador automático
ABI PRISM 377 (Applied Biosystems, California, EE.UU.).
3.2.8. Análisis de las secuencias.
Los cromatogramas que contenían las secuencias nucleotídicas de los genes CYP de C.
capitata fueron revisados mediante el programa Chromas V1.45 (Griffith University, Queensland,
Australia), realizándose las correcciones manuales apropiadas. Una vez corregidas las secuencias
nucleotídicas se realizó la identificación de los intrones presentes en el DNA genómico mediante la
comparación de dichas secuencias con el genoma de D. melanogaster en un servidor web
(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). Después de eliminar las regiones intrónicas se
realizó la traducción tanto de estas secuencias como de las obtenidas a partir del cDNA. Con el
objeto de definir, por homología, la familia y subfamilia de cada uno de los genes obtenidos, se
compararon las secuencias aminoacídicas obtenidas con las de D. melanogaster existentes en el
servidor The Insect P450 Site del Institut Nationale de la Recherche Agronomique (INRA)
(http://p450.sophia.inra.fr/blast/blast.html). Finalmente, se elaboró un árbol filogenético Neighbor
Joining con el programa ClustalX V.1.85 (Thompson et al., 1997), donde se mostraros las
relaciones existentes entre los genes CYP de D. melanogaster y los genes descritos para C.
capitata en el presente trabajo. En análisis filogenético se realizaron 1000 réplicas de boostrap,
indicando en los nodos del árbol sólo aquellos valores iguales o superiores a 500.
76
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
3.2.9. Bioensayos de exposición a fenobarbital.
Con el objetivo de estudiar la posible inducción de los genes CYP por xenobióticos se
expusieron adultos de C. capitata a un agente inductor de la expresión. El inductor seleccionado
fue el xenobiótico fenobarbital (Sigma P-5178, Chemical Co., Missouri, EE.UU.). La estructura
química molecular de este xenobiótico se muestra en la figura 3.2.3.
Figura 3.2.3. Estructura química del fenobarbital.
Las condiciones del bioensayo de inducción con fenobarbital son similares a las condiciones
generales de los bioensayos mostradas en el apartado 2.2.4.1. Se introdujeron 20 insectos en cada
caja y se administró, mezclándolo con la dieta, fenobarbital al 1% y al 3%, realizando 4 réplicas
experimentales y tomando como referencia un control al que no se le había aplicado fenobarbital.
Después de 72 horas se anotó la mortalidad y se corrigió por Abbot con respecto a la mortalidad
observada en el tratamiento control, que siempre fue inferior al 10%. Los individuos supervivientes
fueron congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC para su posterior análisis.
3.2.10. PCR cuantitativa en tiempo real.
Para el estudio de inducción por fenobarbital se seleccionaron aquellos genes CYP de C.
capitata con mayor homología a genes CYP que habían sido previamente relacionados con
resistencia a insecticidas en otros dípteros. Se analizó la expresión en machos y hembras adultos
de tres a cinco días de edad mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). El gen empleado
como control interno fue el gen que codifica la proteína ribosomal Ccp0 (ref. GenBank Y18444;
Gagou et al., 2000). El RNAT se extrajo a partir de los insectos almacenados a -80ºC utilizando
TRIzol® Reagent y siguiendo las instrucciones del fabricante. La extracción de RNAT se realizó en
grupos de cinco insectos machos y cinco hembras. Se observó el efecto de los diferentes
tratamientos con fenobarbital analizando la expresión de dichos genes en grupos de cinco insectos
77
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
para cada sexo y tratamiento, incluido el control sin fenobarbital. La primera cadena de cDNA se
sintetizó a partir de 1 µg de RNAT utilizando iScript cDNA Syntesis Kit (Bio-Rad Laboratories,
California, EE.UU.). La reacción de amplificación en tiempo real para cada gen CYP y para el gen
control interno CCp0 se realizó en un detector continuo de fluorescencia DNA Engine Opticon2
(Bio-Rad Laboratories, California, EE.UU.). Se ensayaron varias parejas de cebadores para cada
uno de los genes estudiados, seleccionando como óptimas aquellas parejas que tuviesen una
eficiencia de amplificación entre el 80% y el 120% (ver tabla 3.3.3.). Además, para descartar la
presencia de DNA genómico, el cual podría interferir en la cantidad de cDNA analizado en la qPCR,
algunas de las parejas de cebadores se diseñaron de tal modo que flanqueasen una región
intrónica, por lo que si existiese DNA genómico contaminando la extracción de RNA, observaríamos
un amplicón doble en la qPCR.
La reacción de PCR (15 µl) contenía 7,5 µl de qPCR MasterMix Plus for SYBR® Green
(Eurogentec, Seraing, Bélgica), 1,25 µl de cada cebador 3,6 µM y 5 µl de cDNA diluido 100 veces
en agua. El ciclo de amplificación estandarizado para todos los genes fue el siguiente: inicialmente
95ºC durante 10 min para desnaturalizar el cDNA y a continuación se realizó cuarenta veces el
ciclo 95ºC 20s, 63ºC 20s y 72ºC 20s. La expresión de cada uno de los genes analizados se calculó
siguiendo el método de ∆Ct (Pfaffl, 2001). Los resultados de expresión de los genes CYP se
normalizaron con el valor de la expresión del gen Ccp0. El valor final de expresión para cada gen
se calculó realizando la media aritmética de las expresiones obtenidas en cada una de las tres
réplicas experimentales. La comparación estadística de los valores de expresión se realizó
mediante la prueba t de Student o test de Dunnett, según corresponda, con el paquete estadístico
SPSS v. 17.0, según corresponda.
78
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
3.3. Resultados.
3.3.1. Diversidad de genes CYP.
Empleando cebadores degenerados, diseñados a partir de las secuencias aminoacídicas de
las familias CYP4, CYP6, CYP9, CYP12, CYP18 y CYP28 de D. melanogaster, y partiendo de cDNA y
DNA genómico de C. capitata, se obtuvieron por PCR amplicones susceptibles de contener genes
CYP de aproximadamente 400-600 pb (Fig. 3.3.1).
1
2
3
4
5
6
7
M
8
9
10 11 12 13
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
a
b
Figura 3.3.1. Amplificación por PCR de genes CYP. Migración electroforética en gel de
agarosa al 1,5% de los productos de PCR resultado de la amplificación con cebadores degenerados
de DNA genómico (a) y cDNA (b). Los amplicones obtenidos poseen un tamaño alrededor de los
500 pb, según el marcador de 100 pb empleado (M). En el gel (a) se muestran las combinaciones
de cebadores que produjeron amplicones con DNA genómico como molde (calles 1 a 13). En el gel
(b) se indica la totalidad de las 24 combinaciones, obsérvese que no todas las combinaciones de
cebadores degenerados produjeron amplificación (calles 2 a 5).
79
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
De las 24 combinaciones de cebadores, 17 dieron lugar a amplicones del tamaño esperado
y, de éstas, 12 produjeron la amplificación de genes CYP, por lo que la mitad de las combinaciones
de cebadores degenerados empleadas amplificaron genes CYP (Tabla 3.3.1). La mayoría de las
amplificaciones que contenían fragmentos de genes CYP (63%) fueron el resultado de las seis
combinaciones correspondientes a los cebadores directos dFCyp4a y dFCyp6a con los reversos
dRSCott94, dRHemo4a y dRHemo6_9a. En el caso del cebador reverso dRHemo12_18, aunque se
obtuvieron por PCR fragmentos del tamaño esperado, no se obtuvieron amplicones de genes CYP
en ninguna de sus combinaciones con los cebadores directos.
Tabla 3.3.1. Combinaciones de cebadores degenerados para P450s. Se muestran
las combinaciones de cebadores degenerados empleados en las PCR que, por su tamaño, dieron
lugar a amplicones susceptibles de contener genes CYP (b
b); y las combinaciones de cebadores
con las que no se obtuvo producto de amplificación (-). Entre paréntesis se indica el porcentaje de
clones con insertos de genes CYP obtenidos con cada combinación de cebadores.
dFCyp4a
dFCyp6a
dFCyp9a
dFCyp12a
dFCyp18a
dFCyp28a
dRScott94
b(19%)
b(10%)
-
-
-
-
dRHemo4a
b(11%)
b(13%)
-
b(7%)
b(16%)
b(5%)
dRHemo6_9
b (6%)
b (4%)
b(2%)
b(3%)
-
b(4%)
dRHemo12_18
b (0%)
b (0%)
b(0%)
-
b (0%)
b(0%)
__________________________________________________________________________________________________
Los productos de PCR con el tamaño esperado (400-600 pb) se clonaron y, del total de
clones obtenido, se seleccionaron alrededor de 2.000 clones como susceptibles de poseer insertos
de genes CYP según el tamaño del inserto que contenía cada clon (Fig. 3.2.2). Con el objetivo de
evitar la secuenciación de clones con el mismo inserto, los 2000 clones se analizaron por RFLP con
las enzimas Rsa I y Hpa II (Fig. 3.3.2) y se seleccionaron para su secuenciación un total de 500
clones, pertenecientes a doce combinaciones de cebadores degenerados. Aproximadamente el
70% de los clones secuenciados procedían de la amplificación de cDNA y el 30% restante se
obtuvieron a partir de DNA genómico.
80
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
A B C D A E D C F D G H D A I E
500 pb
Figura 3.3.2. Análisis RFLP de los clones. Migración electroforética, en un gel de agarosa
al 2%, de la digestión con las enzimas de restricción Rsa I y Hpa II. Se muestra un ejemplo
representativo del análisis realizado con los clones procedentes de la clonación de un determinado
amplicón, originado a partir de una combinación de cebadores degenerados. Se realizó la
secuenciación de aquellos clones con perfiles de restricción diferentes (letras diferentes). Como
ejemplo, se resaltan tres clones con el perfil A, de los que sólo se secuenció uno de ellos.
Las secuencias procedentes de la amplificación del DNA genómico contuvieron pequeños
intrones con un tamaño que varió entre 58-80 pb. El tamaño de las secuencias nucleotídicas
obtenidas, una vez eliminados los intrones, osciló entre 370 y 480 pb, codificando fragmentos
proteicos de 123 a 160 aminoácidos. El alineamiento de las secuencias proteicas permitió
identificar aquellas secuencias de nucleótidos que codificaban la misma proteína y descartarlas así
para el estudio de diversidad de genes CYP en C. capitata. En la figura 3.3.3 se muestra, a modo
de ejemplo, el alineamiento de 11 secuencias aminoacídicas, de las 500 analizadas, en el que se
pueden observar los motivos ExLR y PERF, característicos de las citocromo P450. Además, a la
derecha del motivo ExLR se observa una región muy variable que se corresponde con una zona de
la enzima que está asociada con el reconocimiento del sustrato (Feyereisen, 2005).
ExLR
PERF
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Figura 3.3.3. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas obtenidas a partir
de los genes CYP de C. capitata. Se muestra el alineamiento de 11 secuencias proteicas en
el que se observan los motivos ExLR y PERF, característicos de las citocromo P450. Los haplotipos
1 a 4 pertenecen a la familia CYP4, del 5 al 9 a la CYP6 y el 10 y 11 a la CYP9.
81
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Una vez realizado el análisis de las 500 secuencias aminoacídicas se obtuvieron un total de
72 haplotipos diferentes de genes CYP. Aquellas secuencias proteicas con un porcentaje de
similitud igual o superior al 95% se consideraron como variantes alélicas de un mismo gen. Según
este criterio, se identificaron un total de 35 posibles variantes alélicas, por lo que los restantes
haplotipos se consideraron posibles genes CYP. A cada uno de los 37 genes se le puso un nombre
según las normas de nomenclatura vigentes (Nelson et al., 1996) y, tomando como referencia el
CYPoma de D. melanogaster, se le asignó una familia y, si se pudiese, una subfamilia y/o un gen.
Los 37 genes se distribuyeron en cinco familias: doce se incluyeron en la familia CYP4, diecisiete
en la familia CYP6, tres en la familia CYP9, cuatro en la familia CYP12 y un gen en la familia CYP18
(Fig. 3.3.4 y tabla 3.3.2).
7
1
1
22
6
4
Familias P450
CYP4
CYP6
CYP9
CYP12
CYP18
12
3
17
25
D. melanogaster
C. capitata
Figura 3.3.4. Distribución de los genes CYP en las cinco familias estudiadas. Se
indica el número de genes CYP existentes en D. melanogaster y el número de genes encontrados
en este trabajo en C. capitata en cinco de las principales familias CYP de insectos.
Las relaciones entre los distintos genes CYP de C. capitata y D. melanogaster se muestran
en un árbol filogenético Neighbor Joining generado a partir de las secuencias de aminoácidos (Fig.
3.3.5). Así, los 37 genes CYP identificados en C. capitata se dispusieron en los diferentes clados de
la siguiente manera: un gen en el clado CYP-2, veinte genes en el clado CYP-3, doce genes en el
clado CYP-4 y cuatro genes en el clado mitocondrial (nomenclatura de los clados según Feyereisen,
2006).
82
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
02P2O
03QP7
02P2K
031OK
02T2A
021DJ
02P2C
02P24
03QP2
02P2D
031OJ
031NP
03YM8
02P28
03QOD
03QPU
021D3
02P2B
031OL
031P6
03YOD
CYP4 (I) like
CYP4 (II) like v1
v1
CYP4AC like
CYP4AE like v1
v2
CYP4C3 like v1
v2
CYP4D (I) like v1
v1
CYP4D (II) like v1
v2
CYP4D (III) like v1
v2
CYP4G like v1
v2
CYP4G1 like v1
v2
CYP4G15 like
CYP4P like
CYP6 like
JQ045589
JQ031144
JQ031143
JQ031141
JQ031142
JQ031139
JQ031140
JQ031138
JQ067922
JQ031137
JQ067921
JQ031136
JQ067920
JQ067918
JQ067919
JQ067916
JQ067917
JQ031135
JQ031134
JQ067915
JQ031133
Ref. GB
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Clado CYP
cDNA (379)
cDNA (376)
cDNA (379)
cDNA (382)
cDNA (382)
cDNA (382)
cDNA (382)
cDNA (377)
DNA (377)
cDNA (385)
DNA (385)
cDNA (379)
DNA (379)
DNA (376)
DNA (376)
DNA (373)
DNA (373)
cDNA (364)
cDNA (370)
DNA (370)
DNA (373)
Origen (pb)
69
71
67
74
74
59
59
80
69
Intrón (pb)
Cyp6a14 (Q9V4U7)
Cyp4p1 (AAL49206)
Cyp4g15 (AAF76522)
Cyp4g1 (AAL13523)
Cyp4g1 (AAL13523)
Cyp4d2 (CAA80549)
Cyp4d2 (CAA80549)
Cyp4d1 (AAB71162)
Cyp4c3 (Q9VA27)
Cyp4ae1 (AAL13679)
Cyp4ac1 (AAF52232)
Cyp4e1 (NP_524771)
Cyp4d2 (CAA80549)
Gen CYP Dm
48
56
88
87
86
69
69
56
55
64
64
70
70
85
84
54
54
65
48
48
51
% Similitud
83
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Haplotipo
Gen CYP Cc
por PCR procede de DNA genómico o cDNA, con el tamaño del amplicón en pares de bases (pb), entre paréntesis. Se indica el tamaño del intrón
detectado en el caso de las amplificaciones de DNA genómico. Las secuencias aminoacídicas de Cc obtenidas en este trabajo se compararon con las de
D. melanogaster (Dm); se muestra el nombre del gen y la referencia en Genbank de la secuencia más próxima de esta especie, así como el porcentaje
de similitud entre ambas. Entre paréntesis se refleja el porcentaje de similitud con respecto a la secuencia de CYP6A10 de C. capitata de aquellos genes
más próximos a este gen.
Tabla 3.3.2. Diversidad de genes CYP en C. capitata. Se muestran, ordenados alfabéticamente, los genes CYP y las variantes alélicas
detectadas en C. capitata (Cc), indicando su referencia en Genbank y el clado CYP al que pertenecen. La columna origen muestra si el gen amplificado
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
02T1W
03QPH
031OT
021DS
02T11
02T21
03QPE
02P2Z
02P3F
02T12
031OY
02P3I
03QOT
02P33
03QOM
021DB
F12.03VM7
03YLX
03YM1
03YMC
D2.03VM7
02T22
03QPJ
02P3C
02T0N
02P3H
CYP6A (I) like
CYP6A (II) like v1
v2
v2
CYP6A (III) like v1
v2
CYP6A (IV) like v1
v1
CYP6A (V) like v1
v2
CYP6A (VI) like v1
v1
v2
v3
CYP6A (VII) like v1
v2
CYP6A (VIII) like v1
v2
CYP6A (IX) like v1
v2
CYP6A (X) like v1
v2
CYP6A (XI) like v1
v2
v3
v4
JQ045601
JQ067934
JQ067935
JQ067936
JQ045600
JQ067933
JQ045598
JQ045599
JQ045596
JQ045597
JQ045595
JQ067932
JQ045593
JQ067930
JQ045594
JQ067931
JQ067928
JQ067929
JQ045592
JQ067927
JQ067925
JQ067926
JQ045590
JQ045591
JQ067924
JQ067923
Ref. GB
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Clado CYP
cDNA (391)
DNA (391)
DNA (391)
DNA (391)
cDNA (390)
DNA (391)
cDNA (392)
cDNA (394)
cDNA (388)
cDNA (382)
cDNA (388)
DNA (388)
cDNA (382)
DNA (388)
cDNA (392)
DNA (386)
DNA (388)
DNA (388)
cDNA (388)
DNA (388)
DNA (391)
DNA (391)
cDNA (391)
cDNA (391)
DNA (391)
DNA (391)
Origen (pb)
72
72
72
61
78
67
67
58
58
66
59
61
58
59
Intrón (pb)
Cyp6a2 (AAB36782)
Cyp6a8 (Q27593)
Cyp6a23 (Q9V771)
Cyp6a23 (Q9V771)
Cyp6a23 (Q9V771)
Cyp6a14 (Q9V4U7)
Cyp6a14 (Q9V4U7)
Cyp6a14 (Q9V4U7)
Cyp6a13 (AAK93147)
Cyp6a13 (AAK93147)
Cyp6a2 (AAB36782)
Cyp6a2 (AAB36782)
Cyp6a9 (Q27594)
Cyp6a2 (AAB36782)
Gen CYP Dm
53
54
54
53
53
56
59
59
58
56
60
58
56
56
55
55
51
51
59
59
53
53
63
65
65
58
% Similitud
84
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Haplotipo
Gen CYP Cc
Tabla 3.3.2. Diversidad de genes CYP en C. capitata. (Continuación).
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
03QOQ
03QPC
03QPD
03YOA
03QOE
021DD
03QPO
02T16
02T1N
031NF
02T1E
03YO7
03QOS
031P1
031OZ
03QOP
03YMF
03QOU
03QOV
03QOW
02T27
G3.03VMG
A5.03VMG
00H90
CYP6A10 like v2
v3
v4
CYP6D (I) like
CYP6D (II) like v1
v1
v2
v3
v4
v5
v6
CYP6D (III) like
CYP6G like v1
v2
v3
CYP9 like
CYP9B (I) like
CYP9B (II) like v1
v2
CYP12B like v1
v1
CYP12C (I) like
CYP12C (II) like
CYP12E like
JQ045619
JQ045618
JQ045617
JQ045616
JQ067942
JQ045614
JQ045615
JQ045613
JQ045612
JQ045609
JQ045610
JQ045611
JQ045608
JQ045606
JQ067937
JQ045607
JQ067938
JQ067939
JQ067940
JQ067941
JQ045605
JQ045602
JQ045603
JQ045604
Ref. GB
Mitoc.
Mitoc.
Mitoc.
Mitoc.
Mitoc.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Clado CYP
cDNA (392)
cDNA (412)
cDNA (411)
cDNA (397)
DNA (480)
cDNA (408)
cDNA (407)
cDNA (407)
cDNA (403)
cDNA (413)
cDNA (403)
cDNA (403)
cDNA (370)
cDNA (373)
DNA (373)
cDNA (376)
DNA (373)
DNA (379)
DNA (373)
DNA (376)
cDNA (388)
cDNA (391)
cDNA (388)
cDNA (388)
Origen (pb)
61
63
63
63
63
63
Intrón (pb)
Cyp12e1 (NP_650003)
Cyp12c1 (Q9VVR9)
Cyp12c1 (Q9VVR9)
Cyp12b2 (Q9V8M2)
Cyp9b2 (Q9V4I1)
Cyp9b2 (Q9V4I1)
Cyp9b2 (Q9V4I1)
Cyp6g2 (AAR88134)
Cyp6d5 (NP_650327)
Cyp6d4 (NP_651082)
Cyp6d2 (AAQ22467)
Cyp6a9 (Q27594)
Gen CYP Dm
54
52
56
56
57
60
60
60
52
51
51
51
64
62
62
62
62
62
61
61
59
71 (97)
70 (96)
69 (95)
% Similitud
85
CYP18A1 like
03YPC
JQ045620
2
cDNA (376)
Cyp18a1 (CAL69940)
88
___________________________________________________________________________________________________________________________
Haplotipo
Gen CYP Cc
Tabla 3.3.2. Diversidad de genes CYP en C. capitata. (Continuación).
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
CYP- 4
CYP
Mitoc.
CYP- 2
CYP- 3
Figura 3.3.5. Disposición de los genes CYP de C. capitata. Representación
esquemática del árbol filogenético Neighbor Joining de las secuencias aminoacídicas de los genes
CYP de C. capitata, representados con trazos negros, y de D. melanogaster, en colores. Los genes
CYP de C. capitata se agruparon en los cuatro clados existentes en insectos: CYP-4 (rojo), CYPmitocondrial (amarillo), CYP-2 (verde) y CYP-3 (azul).
86
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
En el clado CYP-4 (Fig. 3.3.6) se identificaron doce genes CYP de C. capitata, de los cuales
tres se agruparon significativamente con Cyp4c3, Cyp4g1 y Cyp4g15 de D. melanogaster. Además,
cuatro genes se incluyeron dentro de las subfamilias CYP4AC, CYP4AD, CYP4G y CYP4P, mientras
que los genes CYP4 (I) like, CYP4 (II) like, CYP4AE like, CYP4D (I) like y CYP4D (III) like no se
relacionaron significativamente con ninguna de las subfamilias conocidas de D. melanogaster.
0,01
Figura 3.3.6. Clado CYP-4. Árbol Neighbor Joining correspondiente al clado CYP-4 para los
genes CYP de D. melanogaster (Dm) y C. capitata (Cc). En el análisis filogenético se empleó, para
cada gen, un fragmento de 120-130 aminoácidos comprendido entre la región hélice Ι y el grupo
hemo. Los valores de los nodos indican el valor de bootstrap para un total de 1000 réplicas.
87
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
En el clado mitocondrial (Fig. 3.3.7), según su homología con las secuencias aminoacídicas
de D. melanogaster, se identificaron cuatro genes CYP de C. capitata: uno en la subfamilia CYP12B
(CYP12B like) y tres genes que no se agruparon significativamente con subfamilias de D.
melanogaster (CYP12C (I) like, CYP12C (II) like y CYP12E like).
0,01
Figura 3.3.7. Clado Mitocondrial. Árbol Neighbor Joining correspondiente al clado
mitocondrial para los genes CYP de D. melanogaster (Dm) y C. capitata (Cc). En el análisis
filogenético se empleó, para cada gen, un fragmento de 120-130 aminoácidos comprendido entre
la región hélice Ι y el grupo hemo. Los valores de los nodos indican el valor de bootstrap para un
total de 1000 réplicas realizadas.
En el clado CYP-3 se identificaron un total de veinte genes de C. capitata pertenecientes a
las familias CYP6 y CYP9 (Fig. 3.3.8). La distancia entre los genes de C. capitata y los de D.
melanogaster en este clado fue, en términos generales, mayor que en los otros clados. Dentro de
la familia CYP6, trece de los genes identificados se agruparon en la subfamilia CYP6A de D.
melanogaster, entre los que se encuentran CYP6A10, descrito anteriormente en C. capitata
(Danielson et al., 1999), y tres posibles variantes alélicas de CYP6A10 identificadas en este trabajo.
Además, tres genes de C. capitata (CYP6D (I) like, CYP6D (II) like, CYP6D (III) like) se agruparon
con genes de la subfamilia CYP6D. El gen CYP6G like fue el único que no se agrupó con genes de
alguna de las subfamilias del clado CYP-3 de D. melanogaster. Finalmente, dentro de la familia
CYP9 se identificaron tres genes próximos a la subfamilia CYP9B (CYP9B (I)-(II) like) y, CYP9 like.
88
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 3.3.8. Clado CYP-3. Árbol Neighbor Joining del clado CYP-3 para los genes CYP de D.
melanogaster (Dm) y C. capitata (Cc). En el análisis filogenético se empleó, para cada gen, un
fragmento de 120-130 aminoácidos comprendido entre la región hélice Ι y el grupo hemo. Los
valores de los nodos indican el valor de bootstrap para un total de 1000 réplicas.
89
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
En el clado CYP-2 (Fig. 3.3.9) se identificó un único gen (CYP18A1 like) que se agrupó
significativamente con el gen Cyp18a1 de D. melanogaster.
0,01
Figura 3.3.9. Clado CYP-2. Árbol Neighbor joining correspondiente al clado CYP-2 para los
genes CYP de D. melanogaster (Dm) y C. capitata (Cc). En el análisis filogenético se empleó, para
cada gen, un fragmento de 120-130 aminoácidos comprendido entre la región hélice Ι y el grupo
hemo. Los valores de los nodos indican el valor de bootstrap para un total de 1000 réplicas.
3.3.2. Expresión de los genes CYP.
Los niveles de expresión de 6 de los 37 genes CYP identificados en este trabajo se
analizaron mediante qPCR en machos y hembras de C. capitata. Los genes se seleccionaron por su
homología con otros genes CYP relacionados con resistencia a insecticidas en el orden Diptera. Los
genes CYP6D (I) like y CYP6D (III) like fueron analizados por pertenecer a la subfamilia CYP6D
asociada a resistencia a piretroides en Musca domestica (Liu y Scott, 1996; Kasai y Scott, 2000,
2001). El gen CYP6A (I) like fue seleccionado por su homología con CYP6A1 de M. domestica,
relacionado con resistencia a organofosforados y carbamatos (Feyereisen et al., 1989; Sabourault
et al., 2001), y con Cyp6a2 de D. melanogaster, implicado en resistencia a DDT y malatión (Waters
et al., 1992; Maitra et al., 2000). CYP6G like se analizó por ser similar a Cyp6g1, implicado en
resistencia a DDT en D. melanogaster (Daborn et al., 2001, 2002) y, por último, CYP12C (II) like
por ser el más próximo a Cyp12d1/2, también asociado a resistencia a DDT en D. melanogaster
(Le Goff et al., 2003). Además, aunque no ha sido relacionado con resistencia, se evaluó la
expresión génica de CYP4G1 like.
90
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
R2 = 0,997
b
dF/dT
10
5
0
a
60
65
70
75
80
85
90
95
deg.
c
Figura 3.3.10. Validación de los cebadores para PCR cuantitativa. Como ejemplo,
se muestran los parámetros que definieron la aptitud de la pareja de cebadores para el gen Ccp0.,
empleado como control interno en la qPCR. (a) Curva de fusión (melting curve) a 78ºC para el gen
Ccp0, representando la temperatura a la cual se produce la aparición del amplicón,
independientemente de la concentración de cDNA molde. (b) Recta patrón que define las
condiciones de linealidad de la amplificación a diferentes concentraciones de molde. (c) Curva de
cuantificación del fluoróforo a diferentes concentraciones de molde.
En la figura 3.3.10 se muestran, tomando como ejemplo el gen Ccp0, utilizado como
control interno, los elementos evaluados para seleccionar los cebadores óptimos para la
amplificación por qPCR de los diferentes genes. En el caso del gen CYP4G1 like se diseñaron dos
parejas de cebadores en dos regiones diferentes del gen para confirmar los niveles de expresión.
Los amplicones obtenidos para los seis genes CYP tenían entre 90-151 pb y los cebadores
mostraron unas eficiencias de amplificación comprendidas entre el 81% y el 110%. Los
coeficientes de determinación de las rectas patrón de amplificación de cada gen (R2) variaron entre
0,991 y 0,997 (Tabla 3.3.3). Las parejas de cebadores que amplificaban los genes CYP6D (I) like y
CYP6D (III) like se diseñaron para que flanqueasen una región intrónica. Mediante el empleo de
estas dos parejas de cebadores en una PCR sobre DNA genómico se corroboró la existencia de los
correspondientes intrones y, dado que en la qPCR sobre cDNA no se observó un amplicón doble,
se descartó que ocurriese una amplificación de DNA genómico en los ensayos de cuantificación de
la expresión de los genes CYP.
Los niveles de expresión del gen de referencia Ccp0 fueron similares a los niveles del gen
CYP6D (III) like, con unos valores de ciclo de inicio de la amplificación (Ct) de 25,82±0,33 y
25,98±0,35 respectivamente. Estos niveles de expresión se sitúan en una zona intermedia si
tenemos en cuenta la expresión estimada para el resto de genes CYP analizados (Fig. 3.3.11).
91
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Machos
10000
Expresión relativa
Hembras
*
1000
*
100
*
10
*
1
CYP12C (II)
like
CYP6D (I)
like
CYP4G1
like
CYP6A (I)
like
CYP6G
like
CYP6D (III)
like
Figura 3.3.11. Expresión de genes CYP en adultos de C. capitata. Análisis de los
niveles de expresión de los genes CYP12C (II) like, CYP6D (I) like, CYP4G1 like, CYP6A (I) like,
CYP6G like y CYP6D (III) like, analizados en machos y en hembras de C. capitata mediante qPCR.
Los valores de expresión génica relativa se muestran en escala logarítmica; están normalizados con
respecto a los valores de Ccp0 y relativizados con respecto a la expresión en hembras del gen
CYP6A (I) like. Las barras de los histogramas representan la desviación estándar de la media. El
asterisco indica que existen diferencias significativas en la expresión de un determinado gen, al
comparar entre sexos (t Student, p< 0,05).
El gen CYP6A (I) like, en hembras, fue el que menos se expresó, por lo que se empleó
como referencia para estimar los valores de expresión del resto de genes. Los niveles basales de
expresión de los adultos de la línea C de C. capitata para los seis genes CYP analizados mostraron
diferentes rangos de expresión, variando hasta en tres órdenes de magnitud. Por ejemplo, en las
hembras, el gen CYP6G like se expresó unas 5.000 veces más que CYP6A (I) like. La expresión en
algunos de los genes analizados varió en función del sexo, observándose una expresión
significativamente mayor en machos que en hembras en los genes CYP12C (II) like, CYP4G1 like y
CYP6A (I), mientras que el gen CYP6D (III) like se expresó más en hembras que en machos. La
mayor diferencia entre sexos se observó en CYP12C (II) like, gen en el que el nivel de expresión
fue tres veces superior en machos que en hembras. En los genes CYP6D (I) like y CYP6G like no se
observaron diferencias significativas en la expresión comparando ambos sexos (Fig. 3.3.11).
92
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
TCCAGGCTCTCTCCATACCA
CGACTTTGTCACCAGGCTTC
RP0
CGTGGACGTGGAAAGAAAAG
R12C1
FP0_2
GTAATGTGCGCGAAACTGG
CGAGAAATGGTAGTGGTGGA
R6G2_2
F12C1
CGTTTGCGTGAGGAGGTG
GGCAGACCGGGATATTTG
R6D5_2
F6G2_2
GGCGCAACGTGATATTAGAG
GTGTGCTCAGAATTGGGTATTT
R6D2_2
F6D5_2
TGAAGCCCAGTGATCCTCTT
F6D2_2
20
20
20
19
20
18
18
20
22
20
21
19
19
20
21
21
b
90
121
136
126
151
105
158
139
Amplicón (pb)
2
0,997
0,995
0,994
0,997
0,997
0,991
0,995
0,997
R
100
103
102
102
108
81
105
110
% Eficiencia
93
________________________________________________________________________________________________________________________
Ccp0
CYP12C (II) like
CYP6G like
CYP6D (III) like *
CYP6D (I) like *
CGTCAGTTGATTGTCGTGTTG
R6A1
GCGCAATCAAAGGTACTGG
R4G1b_2
ACGCTCTCTTTTGCGCTCT
TAAGGACGTGCAGGAAAAGG
F4G1b_2
F6A1
GGTACATACGCAAGGTCTCCA
R4G1
CYP6A (I) like
CATAAGGACGTGCAGGAAAAG
F4G1
3’)
CYP4G1 like
Secuencia (5’
Cebador
Gen
nombre del gen que amplifican. La secuencia nucleotídica se muestra en sentido 5’
3’. Se muestra el número de bases (b) y el amplicón originado
por la pareja de cebadores directo (F) y reverso (R) en pares de bases (pb). R2 indica el coeficiente de determinación de la recta patrón de
amplificación. Se muestra el porcentaje de eficiencia de la pareja de cebadores. (*) Estos genes contienen un intrón en la región amplificada por la
pareja de cebadores en el DNA genómico.
Tabla 3.3.3. Genes seleccionados para el estudio de expresión. Se indican los cebadores empleados en la qPCR ordenados según el
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
3.3.3. Inducción por fenobarbital.
Después de exponer adultos de C. capitata durante 72 horas a una dieta que contenía 1%
de fenobarbital, la mortalidad fue del 17%, y del 25% con 3% de fenobarbital. En los individuos
supervivientes se analizaron, mediante qPCR, los niveles de expresión en los genes CYP6D (I) like,
CYP6D (III) like, CYP6A (I) like, CYP6G like, CYP12C (II) like y CYP4G1 like, y se compararon con
los niveles de expresión de los individuos no tratados con fenobarbital (Fig 3.3.12).
La respuesta como inductor del xenobiótico fenobarbital fue desigual tanto al comparar su
efecto en los distintos genes estudiados como entre machos y hembras (Fig. 3.3.12). En el análisis
de la expresión de CYP6G like, el gen que presentó mayores tasas de expresión, no se detectó
inducción en ninguno de los dos sexos (Fig. 3.3.12.E). En el análisis de los niveles de expresión de
CYP4G1 like no se observaron diferencias significativas, tanto en machos como en hembras, al
comparar los valores de los insectos tratados con fenobarbital y los del control sin xenobiótico (Fig.
3.3.12.C). Sin embargo, en CYP6D (I) like, otro gen que mostró elevados niveles de expresión
respecto a CYP6A (I) like, sí se observó inducción significativa por la exposición a 1% y a 3% de
fenobarbital tanto en machos (1,8 y 2,2 veces, respectivamente), como en hembras (2,5 y 2,4
veces, respectivamente) en comparación con los controles sin xenobiótico (Fig. 3.3.12.B). Unos
valores similares de inducción (Fig. 3.3.12.F) se observaron en el otro gen de la subfamilia CYP6D,
CYP6D (III) like, en las dos concentraciones de fenobarbital ensayadas y en ambos sexos (1,7
veces en machos y 1,9-2,1 veces en hembras). En los genes CYP12C (II) like y CYP6A (I) like, que
mostraron los menores niveles de expresión basal, se observó inducción estadísticamente
significativa, pero únicamente en uno de los dos sexos y frente a una de las dos concentraciones
de fenobarbital (Fig. 3.3.12.A y D). Así, se observó inducción (1,8 veces) de CYP12C (II) like en
hembras expuestas a 1% de fenobarbital, pero no se detectó inducción en la exposición a 3%,
mientras que en CYP6A (I) like se observó un aumento significativo de la expresión en machos del
tratamiento de 3% de xenobiótico (1,8 veces).
94
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
7
1% FB
3% FB
6
5
4
*
3
2
1
8
7
6
3
Control
3% FB
5
4
3
8
7
1
0
Machos
Control
6
5
4
3
8
7
Hembras
Control
CYP6D (III) like
F
1% FB
3% FB
5
4
3
2
1
1
0
Hembras
3% FB
6
2
0
1% FB
*
1,8
Hembras
3% FB
Machos
D
3
0
1% FB
Control
4
2
CYP6G like
2,4
5
1
E
2,5
Hembras
CYP6A (I) like
6
2
7
1,8 2,2
Machos
6
8
3% FB
* *
4
0
1% FB
Machos
1% FB
*
*
5
Hembras
CYP4G1 like
C
7
Control
CYP6D (I) like
B
1
Expresión relativa
Expresión relativa
Machos
8
2
1,8
0
Expresión relativa
Control
CYP12C (II) like
A
Expresión relativa
8
Expresión relativa
Expresión relativa
______________________________________________________________________________________________________________________________________
* *
1,7 1,7
Machos
* *
1,9 2,1
Hembras
Figura 3.3.12. Efecto del fenobarbital en la expresión de los genes CYP en C.
capitata. Análisis de la influencia del xenobiótico fenobarbital (FB) en los niveles de expresión en
de CYP12C (II) like, CYP6D (I) like, CYP4G1 like, CYP6A (I) like, CYP6G like y CYP6D (III) like
mediante qPCR. Se compararon los tratamientos de 1% y 3% de FB, sumnistrado en la dieta, con
respecto a un control sin el xenobiótico. Los valores de expresión relativa están normalizados con
la expresión de CCp0 y relativizados, para cada gen, con respecto a la réplica biológica del control
sin FB que tenga el menor valor de expresión en cualquiera de los dos sexos. Las barras de los
histogramas representan la desviación estándar de la media. (*) Diferencias significativas entre los
niveles de expresión de un tratamiento de FB con respecto al control correspondiente de cada sexo
y para cada gen (test de Dunnett, p< 0,05). Se indica el valor de inducción, con respecto al control
de cada sexo, en aquellos tratamientos con diferencias significativas con respecto al control.
95
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
3.4. Discusión.
Las citocromo P450 engloban un elevado número de enzimas que participan en diversas
funciones metabólicas. Una de sus funciones es la detoxificación de xenobióticos y han sido
relacionadas con procesos de resistencia metabólica (Feyereisen, 2005). En este trabajo, partiendo
de DNA genómico y de cDNA, se ha evaluado la diversidad de genes CYP presentes en la mosca
mediterránea de la fruta C. capitata. El empleo de cebadores degenerados ha permitido la
amplificación por PCR de un fragmento que representa un tercio del tamaño total del gen CYP y
que está localizado en la región central, entre la hélice I y el grupo hemo. Tras el análisis de las
secuencias y su comparación con los genes de D. melanogaster hemos obtenido un total de 72
haplotipos de genes CYP entre los que hemos identificado, basándonos en criterios de similitud, al
menos, 37 genes diferentes. Al no existir solapamiento entre las secuencias que hemos obtenido y
las 13 secuencias parciales descritas por Danielson y colaboradores (Danielson et al., 1999), no se
han podido relacionar entre sí. Debido a que no se ha obtenido la secuencia completa de la región
codificante de los genes, no ha sido posible la asignación de un nombre completo a cada gen. A
los genes se les ha otorgado un nombre provisional en función de los porcentajes de similitud que
definen las familias (>40%) y subfamilias (50%), tomando como referencia el CYPoma de D.
melanogaster. La secuenciación del cDNA completo de todos los haplotipos que hemos descrito
permitirá asignar a cada gen un nombre adecuado siguiendo la nomenclatura actual (Nelson et al.,
1996).
97
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
El número de genes identificados en este trabajo mediante el proceso de amplificación por
PCR, clonación y selección de los diferentes haplotipos por RFLP es elevado si se compara con la
mayoría de trabajos en donde se ha evaluado la diversidad de genes CYP con metodologías
similares, como por ejemplo los 17 genes hallados en Anopheles albimanus (Scott et al., 1994), los
10 genes en D. melanogaster (Dunkov et al., 1996), o los 14 genes descritos en C. capitata
(Danielson et al., 1999). No obstante, recientemente se han obtenido resultados similares en
cuanto a la diversidad de genes en Frankliniella occidentalis (Cifuentes et al., 2012). El número de
secuencias parciales de genes CYP descritas en nuestro estudio es mayor al obtenido mediante
nuevas técnicas de secuenciación en la mariposa Zygaena filipendulae (Zagrobelny et al., 2009) y
similar al obtenido en la polilla Manduca sexta (Pauchet et al., 2010). Téngase en cuenta que, en
base a la secuenciación masiva del genoma completo de Bombyx mori, se ha estimado que esta
especie posee 85 genes CYP (Feyereisen, 2012), lo que sugiere que el número de genes CYP en
lepidópteros no es necesariamente mucho menor que en dípteros. Por ejemplo, en D.
melanogaster se han identificado 83 genes CYP que codifican proteínas P450 (Tijet et al., 2001).
Los cebadores degenerados, diseñados a partir de las secuencias proteicas de las familias
CYP4, CYP6, CYP9, CYP12, CYP18 y CYP28 de D. melanogaster, han amplificado genes
pertenecientes a todas las familias esperadas excepto a la familia CYP28, obteniéndose la misma
proporción de genes por familia que la existente en D. melanogaster (Tijet et al., 2001). Si ambas
especies tuviesen una cantidad similar de genes en las cinco familias estudiadas, los 37 genes
hallados con los cebadores degenerados en C. capitata representarían un 60% de la diversidad
para dichas familias. Además, si asumimos que el número total de genes CYP de C. capitata es
similar al de otros dípteros del suborden Brachycera (entre 76 y 91, según Feyereisen, 2011), los
genes identificados en este trabajo representarían entre el 41% y el 49% del total del CYPoma de
la mosca mediterránea de la fruta. Recientemente se ha analizado el transcriptoma de B. dorsalis
(Hsu et al., 2012a) y se ha estimado en 90 el número de genes CYP existente en esta especie de
tefrítido, muy próxima a C. capitata. La comparación del número de genes CYP de las familias
comunes a ambos estudios nos indica que la diversidad que detectada en C. capitata representa un
55% con respecto a la de B. dorsalis, asumiendo que ambas especies poseen el mismo número de
genes.
El árbol filogenético, resultado de la comparación de las secuencias aminoacídicas de D.
melanogaster con las secuencias de C. capitata, nos muestra que los nuevos genes encontrados se
incluyen en los cuatro grandes clados de genes CYP de insectos: CYP-2, CYP-3, CYP-4 y CYP
mitocondrial (Feyereisen, 2006). En el clado CYP-3 es donde hemos obtenido el mayor número de
genes y de haplotipos, localizados principalmente en la familia CYP6. Se han identificado un total
de 16 nuevos genes de la familia CYP6, lo que constituiría una amplia representación dentro de la
98
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
familia si comparamos esta diversidad con los 25 genes existentes en D. melanogaster (Tijet et al.,
2001). La disposición en el árbol filogenético de algunas de las secuencias obtenidas en C. capitata
en relación a las secuencias conocidas de D. melanogaster pone de manifiesto las limitaciones del
sistema adoptado para otorgar un nombre provisional a los genes CYP de C. capitata. Como se ha
dicho anteriormente, sólo las secuencias completas de las regiones codificantes permiten una
nomenclatura adecuada (Feyereisen, 2005). Así, en este trabajo se han observado contradicciones
entre las relaciones filogenéticas observadas en el árbol y el nombre asignado a cada gen de C.
capitata según el porcentaje de homología con las secuencias de D. melanogaster. El porcentaje
de similitud de CYP6G like no permitió su asignación a una subfamilia, pero en el árbol filogenético
se agrupó con la subfamilia CYP6A. Además, algunas secuencias de C. capitata a las que se les
había asignado una subfamilia por similitud, no se agruparon significativamente en el árbol con
miembros de dicha subfamilia de D. melanogaster (por ejemplo, CYP4D3 like se agrupó con la
familia CYP4AE). Finalmente, determinadas secuencias a las que se les asignó una subfamilia por
los criterios de similitud, no se agruparon significativamente en el árbol con ninguna subfamilia de
enzimas P450 de D. melanogaster (por ejemplo, CYP4D (I) like). Se debe tener en cuenta que
estas dos especies de dípteros no incluirán necesariamente en su CYPoma genes representantes
de las mismas subfamilias. En cualquier caso, las secuencias parciales de genes CYP identificadas
en este estudio facilitarán la obtención de las secuencias completas de los genes de C. capitata.
En la literatura científica no existen prácticamente datos sobre la expresión basal de los
genes CYP en insectos, ya que la mayoría de estudios se centran en la comparación, ya sea a
través de PCR cuantitativa o de microarrays, de los niveles de expresión de uno o varios genes
ante un determinado tratamiento con respecto a un control, para evaluar así el efecto de dicho
tratamiento. Los niveles transcripcionales basales de los seis genes analizados en C. capitata
presentaron un rango de variación de hasta tres órdenes de magnitud al relativizar su expresión
con respecto a la del gen CYP con menor valor de expresión (CYP6A (I) like), rango similar al
detectado en la expresión de varios genes CYP en las larvas del mosquito Aedes aegypti
(Poupardin et al., 2008; Riaz et al., 2009). En cuanto a la comparación de la expresión basal entre
sexos, en cuatro de los seis genes se observó una expresión diferencial dependiente del sexo de
hasta tres veces más, como se observa en el gen CYP12C (II) like, diferencias que podrían estar
ligadas a los distintos requerimientos metabólicos de cada sexo y que han sido descritas en
profundidad en D. melanogaster (Ranz et al., 2003; Arbeitman et al., 2004). Las diferencias de
expresión de los genes CYP entre sexos deberían ser consideradas cuando se estudie la expresión
de estos genes en relación a la resistencia a insecticidas, debiendo separar machos y hembras o
realizando grupos equilibrados de ambos sexos.
99
3. Bases para la detección precoz de la resistencia: diversidad de genes CYP
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Los trabajos realizados sobre la inducción de genes CYP por xenobióticos en insectos han
sido recientemente revisados por Feyereisen (2012). Una gran variedad de moléculas pueden
actuar como inductores de uno o más genes CYP en insectos pero, en base a los conocimientos ya
adquiridos en los estudios realizados en vertebrados, el fenobarbital es el inductor más empleado.
De hecho, el estudio sobre la inducción de genes CYP en D. melanogaster sugiere que una tercera
parte del CYPoma de este insecto es susceptible de ser inducido por xenobióticos, que existen
subconjuntos de inductores/inducidos, y que puede existir cierto grado de conservación sobre el
tipo de inducción por fenobarbital observada en D. melanogaster y en vertebrados (Giraudo et al.,
2010). En nuestro trabajo, se ha estudiado por primera vez la inducción de genes CYP por
xenobióticos en C. capitata. Aunque sólo se ha analizado la expresión de seis genes, se ha podido
observar que cuatro de ellos son inducidos a alguna de las concentraciones ensayadas o en alguno
de los dos sexos La inducción por fenobarbital en diferentes genes CYP en insectos varía en un
amplio rango según el gen analizado y dependiendo del sexo del individuo (Le Goff et al., 2006,
Willoughby et al., 2006; Sun et al., 2006; Zhou et al., 2010; Chung et al., 2011). La regulación de
los genes CYP que participan en los procesos fisiológicos es probablemente compleja y, en algunos
casos, puede haber expresión coordinada de distintos genes CYP pertenecientes a un mismo
cluster o que participan en una misma cascada metabólica (Feyereisen, 2012). Los valores de
inducción con respecto al control que hemos obtenido en cuatro de los seis genes estudiados son
bajos (1,7-2,5 veces), pero se encuentran en el intervalo de inducción encontrado en otras
especies de insectos en experimentos similares realizados en tejidos específicos (Zhou et al., 2010;
Chung et al., 2011), en estadios larvarios (Stevens et al., 2000; Li et al., 2002; Sun et al., 2006;
Willoughby et al., 2006) o, como en nuestro caso, en individuos adultos (Scott et al., 1996; Brown
et al., 2003; Sun et al., 2006; Willoughby et al., 2006; Le Goff et al., 2006). Según los casos
descritos hasta el momento, la resistencia a insecticidas mediada por P450 se produce por un
incremento de la actividad P450 como consecuencia de la duplicación de genes o de alteraciones
en la regulación de su expresión. Se han estimado unos valores de inducción por fenobarbital en
D. melanogaster de 15 veces en Cyp6a2 (Brun et al., 1996) y en M. domestica de 10 veces en su
ortólogo CYP6A1 (Cariño et al., 1994), genes implicados en resistencia a organofosforados,
carbamatos y DDT (revisado por Feyereisen, 2012).
Recientemente, nuestro grupo ha seleccionado en el laboratorio una línea de C. capitata
resistente al piretroide lambda-cialotrina cuyo mecanismo de resistencia, de acuerdo con los
resultados obtenidos con sinergistas, podría estar mediado por P450 (resultados no publicados). El
conocimiento de la diversidad de genes CYP será de utilidad para el estudio de este mecanismo de
resistencia, que podrá facilitar el desarrollo de un sistema bioquímico o molecular de detección
precoz de individuos resistentes.
100
Capítulo 4
DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LOS
GENES Ccace2 Y Ccae7 Y DESARROLLO DE
SISTEMAS DE DETECCIÓN PRECOZ DE ALELOS
DE RESISTENCIA
101
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
4.1. Introducción.
Los genes de Ceratitis capitata Ccace2 (ref. GenBank: FJ480223) y Ccae7 (ref. GenBank:
FJ489674) codifican respectivamente para la acetilcolinesterasa (AChE, EC 3.1.1.7) y para una
carboxilesterasa, la aliesterasa (AE7, EC 3.1.1.1). La función de la acetilcolinesterasa es la
regulación de los niveles de acetilcolina durante la sinapsis colinérgica (Fournier, 2005). Esta
enzima es la molécula diana de los insecticidas organofosforados y carbamatos, que actúan como
inhibidores. El bloqueo del centro activo de la enzima provoca la acumulación de acetilcolina en el
espacio sináptico, produciéndose la sobreexcitación nerviosa y la muerte del insecto (Aldridge,
1950). El mecanismo de resistencia en el que está involucrada habitualmente la AChE es la
modificación estructural de la molécula diana debido a mutaciones puntuales (Mutero et al., 1994;
Walsh et al., 2001). El cambio de un único aminoácido disminuye su susceptibilidad de ser inhibida
por el insecticida y puede reducir su actividad enzimática. Así ocurre con la mutación AChE G328A
que confiere resistencia al organofosforado malatión (Walsh et al., 2001; Menozzi et al., 2004;
Baek et al., 2005; Lee et al., 2007; Khajehali et al., 2009). Actualmente se han descrito nueve
mutaciones puntuales en la AChE (genes ace1 o ace2) asociadas a resistencia a insecticidas (Kono
y Tomita, 2006). Las carboxilesterasas son una gran familia de enzimas que, entre otras funciones,
se encargan de la detoxificación de xenobióticos (Oakeshott et al., 2005) y han sido implicadas en
la resistencia a malatión (Campbell et al., 1998b; Hemingway y Karunaratne, 1998). La resistencia
metabólica mediada por esterasas puede deberse a la sobreexpresión de las mismas, a
103
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
duplicaciones génicas, o a mutaciones puntuales que favorecen el incremento de su actividad
hidrolítica (Oakeshott et al., 2005). En los dípteros Musca domestica, Lucilia cuprina y L. sericata
se han identificado dos mutaciones asociadas a resistencia en el centro activo de la AE7: G137D,
que confiere resistencia a varios organofosforados, y W251S/L ligada con una resistencia específica
a malatión (Newcomb et al., 1997; Claudianos et al., 1999; Taskin y Kence, 2004; Hartley et al.,
2006).
Nuestro grupo ha determinado que en individuos de la línea W de C. capitata, resistente a
malatión, la actividad acetilcolinesterasa es menos susceptible de ser inhibida por malaoxón, forma
activa del malatión (Magaña et al., 2007). Además, hemos relacionado esta disminución en la
susceptibilidad frente a malatión con la mutación puntual AChE G328A (numeración según Torpedo
californica; Schumacher et al., 1986), situada en un aminoácido adyacente al glutámico de la tríada
catalítica (Magaña et al., 2008). Esta mutación puntual en la acetilcolinesterasa se ha relacionado
con la resistencia a insecticidas tanto en el gen ace2, en Drosophila melanogaster (Menozzi et al.,
2004) y en M. domestica (Walsh et al., 2001), como en ace1 en la araña roja Tetranychus urticae
(Khajehali et al., 2009). La resistencia a malatión en la línea W se debe además a un segundo
mecanismo de resistencia en el que estarían implicadas las carboxilesterasas, ya que la aplicación
de DEF, inhibidor de la actividad esterasa, reduce parcialmente la resistencia frente a malatión
(Magaña et al., 2007). El análisis de la secuencia del gen Ccae7 de la población resistente no
mostró las mutaciones asociadas a resistencia en otras especies de dípteros, sin embargo, se
encontraron ocho sustituciones no sinónimas (exones 2, 4 y 5), no presentes en una línea
susceptible de laboratorio, que no pudieron ser asociadas a resistencia (Magaña et al., 2008).
La caracterización de un determinado mecanismo de resistencia favorece la elaboración de
métodos de diagnóstico para la detección precoz de la resistencia en poblaciones de campo
(Hemingway et al., 2002). Para este diagnóstico precoz se emplean técnicas bioquímicas y
moleculares que permiten identificar los fenotipos y/o genotipos resistentes sin necesidad de
realizar bioensayos de susceptibilidad. Se han desarrollado diversas técnicas para la detección de
alelos de la acetilcolinesterasa que confieren resistencia a organofosforados en el pulgón Myzus
persicae (Cassanelli et al., 2005), en el lepidóptero Cydia pomonella (Cassanelli et al., 2006), en la
mosca Haematobia irritans (Foil et al., 2010), en cinco especies de mosquitos (Weill et al., 2004;
Alout et al., 2007; Ben Cheikh et al., 2009), en Bactrocera dorsalis (Hsu et al., 2006) y en la mosca
del olivo B. oleae (Hawkes et al., 2005; Margaritopoulos et al., 2008). En cuanto a las
carboxilesterasas, se han elaborado métodos de detección de alelos que confieren resistencia a
organofosforados en Culex pipiens (Berticat et al., 2000) y en H. irritans (Li et al., 2003). Uno de
los métodos más empleados para la identificación de los genotipos implicados en resistencia es el
sistema PCR-RFLP. En esta técnica se realiza una amplificación por PCR del gen implicado en
104
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
resistencia, seguida de una digestión del amplicón con una enzima de restricción, la cual distingue
entre el alelo silvestre y el mutado para, posteriormente, visualizar el perfil de restricción en un gel
de agarosa (Weill et al., 2004; Cassanelli et al., 2005, 2006; Hsu et al., 2006).
Las secuencias nucleotídicas de los genes Ccace2 y Ccae7 han sido obtenidas a partir de la
secuenciación del cDNA (Magaña et al., 2008). La amplificación por PCR de los exones completos a
partir de DNA genómico resulta complicada debido a la existencia de intrones de gran tamaño. La
estructura génica de la acetilcolinesterasa y de la aliesterasa están conservadas en dípteros, por lo
que cabe esperar que los intrones existentes en C. capitata sean de gran tamaño, al igual que
ocurre en D. melanogaster, donde existen varios intrones en ambos genes de entre dos y cinco
kilobases (McQuilton et al., 2012). Además, la mutación AChE G328A que confiere resistencia a
malatión en C. capitata
se localiza en la primera base del exón seis de la acetilcolinesterasa
(Magaña et al., 2008). Por lo tanto, para crear un método PCR-RFLP de detección de dicha
mutación, tomando DNA genómico como molde de la PCR, es necesario conocer la secuencia del
intrón 5, inmediatamente anterior al sitio puntual.
Mediante el conocimiento de la estructura de los genes Ccace2 y Ccae7 nos planteamos
amplificar y secuenciar aquellos exones susceptibles de estar implicados en resistencia a partir de
DNA genómico, para así explorar la presencia de nuevas mutaciones relacionadas con resistencia a
insecticidas en estas dos enzimas en poblaciones de C. capitata de diferentes regiones geográficas.
El diseño de un sistema PCR-RFLP para la detección de la mutación AChE G328A en C. capitata,
permitirá relacionar los niveles de susceptibilidad de las poblaciones de campo con la frecuencia
alélica de dicha mutación puntual y además, se podrá determinar su dispersión geográfica.
Además, el método de diagnóstico PCR-RFLP se podría implementar en los programas de
monitoreo por trampeo masivo que se realizan de manera rutinaria en los campos comerciales
para estimar los niveles poblacionales de la mosca mediterránea de la fruta, empleando para ello
los insectos capturados en las trampas.
105
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
4.2. Material y métodos
4.2.1. Obtención de intrones mediante GenomeWalkerTM.
Para determinar la estructura génica de Ccae7 y Ccace2 hemos empleado el Kit
GenomeWalkerTM (BD Biosciences-Clontech, California, EE.UU.), que permite identificar las
secuencias de los intrones adyacentes a un determinado exón mediante la amplificación por PCR
de librerías de DNA genómico digerido con diferentes enzimas de restricción (Fig. 4.2.1.).
107
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
DNA genómico
División en cuatro librerías
Digestión
Unión del adaptador (AP)
Amplificación del gen de interés en cada
librería con los cebadores del adaptador
(AP1 y AP2) y los específicos (CE1 y CE2)
CE2
CE1
AP
Intrón
AP1
AP2
Exón
Primera PCR: AP1-CE1
Segunda PCR: AP2-CE2
Visualización de los amplicones
en gel de agarosa
Figura 4.2.1. BD GenomeWalkerTM. Esquema del protocolo de elaboración de las librerías
de DNA, amplificación por PCR y localización de los cebadores empleados en la identificación de la
secuencia de los intrones de Ccae7 y Ccace2.
La posición de los exones e intrones en los genes Ccae7 y Ccace2 de C. capitata se predijo
en función de la estructura génica (Fig. 4.2.2.) de los genes homólogos de D. melanogaster Dmae7
y Dmace2 (ref. Genbank NP_524261 y NP_476953 respectivamente).
108
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
I5
I4
I3
I2
I1
Dmae7
I9
I7
I6
I5
I8
I2
I4
I1
I3
Dmace2
Figura 4.2.2. Estructura génica de Dmae7 y Dmace2. Esquema modificado de
McQuilton et al. (2012) que representa la estructura de los genes ae7 y ace2 y de D.
melanogaster, localizados en el cromosoma 3R. Se indica la posición y el número de intrones (I).
Los cebadores específicos para C. capitata
se diseñaron a partir de las secuencias de
cDNA de Ccae7 y de Ccace2 (ref. FJ489674 y EU130781 respectivamente). En las tablas 4.2.1 y
4.2.2 se indican las secuencias de los cebadores AP1 y AP2, suministrados en el Kit
GenomeWalkerTM, así como las de los cebadores específicos basados en las secuencias conocidas
de cDNA de C. capitata.
En este estudio se extrajo el DNA a partir de la cabeza de individuos adultos de la línea
susceptible de laboratorio C de C. capitata (descrita en el apartado 2.2.2) mediante las columnas
DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen, California, EE.UU.) y siguiendo las instrucciones del
fabricante. Una vez extraído, se midió la concentración de DNA total con un NanoDrop (Thermo
Scientific, Massachusetts, EE.UU.) y se mantuvo almacenado a -20ºC hasta su utilización. Se
dividió en cuatro alícuotas un volumen de 100 µl de DNA total a una concentración de 0,1 µg/µl.
Cada una de las alícuotas se digirió con una de las enzimas de restricción (Dra I, EcoR V, Pvu II y
Stu I) recomendadas en el kit BD GenomeWalkerTM, las cuales reconocen dianas de restricción que
coinciden con motivos típicos presentes en los intrones. Se obtuvieron así cuatro librerías de DNA
total con diferentes cortes de restricción.
109
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
E5
Ccace2
TM
RAChE_CcE5.1 (CE1)
RAChE_CcE5.2 (CE2)
FiAChE_CcE50 (CE1)
FAChE_327N (CE2)
RiAChE_CcE60 (CE1)
RAChE_327 (CE2)
FAChE_CcE6 (CE1)
FAChE_CcE6.2 (CE2)
RAChE_CcE5.1 (CE1)
RAChE_CcE5.2 (CE2)
FAChE_CcE7 (CE1)
FAChE_CCE7.2 (CE2)
I4 – 3’
I5 – 5’
I5 – 5’
I5 – 3’
I5 – 3’
I6 – 5’
I6 – 5’
I6 – 3’
I6 – 3’
I7 – 5’
I7 – 5’
AP2 GenomeWalker
TM
AP1 GenomeWalker
Cebador
I4 – 3’
Intrón (I)
3’)
GTTAGCTGAACGAGGAGCTTCTGT
GTTGGGTTGGTAACCCTGGCTT
CCATTGTTGCACTGAGATCG
TCATAGCCACGCATATCAGC
ACAAGCGGAACGCGAGGCCATCA
GGCAAAGTAACACAAGCGGAAC
AATTTCCAAATATTTATCACGCGG
CCGAAAAATGATGGCCTCGCGTTCCG
GTGGCTATGACATCTTGATGGGCA
CTCAAGCTGTAATGGCTTGCATGCGTG
CCATTGTTGCACTGAGATCG
TCATAGCCACGCATATCAGC
ACTATAGGGCACGCGTGGT
GTAATACGACTCACTATAGGGC
Secuencia (5’
24
22
20
20
23
22
24
26
24
27
20
20
19
22
b
110
________________________________________________________________________________________________________________________
E7
E6
Exón (E)
Gen
4.2.1). Se indica el exón tomado como referencia para el diseño, los intrones (I) y la región 5’ o 3’ del intrón que es amplificada por los cebadores. Se
muestra el nombre del cebador, la secuencia nucleotídica y el número de bases (b).
Tabla 4.2.1. Cebadores empleados en la amplificación mediante GenomeWalkerTM de los intrones de Ccace2. Listado de los
cebadores específicos (CE1 y CE2) diseñados para amplificar por PCR en combinación con los cebadores AP1 y AP2 del Kit GenomeWalkerTM (Ver Fig.
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
E2
Ccae7
Cebador
RAE7Ex2.1 (CE1)
RAE7Ex2.2 (CE2)
FAE7_CcEx4
FAE7_CcEx4.2
Intrón (I)
I1 – 3’ (CE1)
I1 – 3’ (CE2)
I4 – 5’ (CE1)
I4 – 5’ (CE2)
3’)
ATGAGAACAGCGTGGGGTAAT
GTAGAACCGTATGTGACACC
AGGTGGTTGGGCATAAGGTA
TTGAGGTGCTCTGAAGCGTA
Secuencia (5’
21
20
20
20
b
111
________________________________________________________________________________________________________________________
E4
Exón (E)
Gen
tomado como referencia para el diseño, los intrones (I) y la región 5’ o 3’ del intrón que es amplificada por los cebadores. Se muestra el nombre del
cebador, la secuencia nucleotídica y el número de bases (b).
Tabla 4.2.2. Cebadores empleados en la amplificación mediante GenomeWalkerTM de los intrones de Ccae7. Listado de los
cebadores específicos (CE1 y CE2) diseñados para amplificar con los cebadores AP1 y AP2 del Kit GenomeWalkerTM (Ver Fig. 4.2.1). Se indica el exón
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Una vez realizadas las digestiones del DNA, se unió un adaptador (AP) a los extremos de
los fragmentos obtenidos para, posteriormente, realizar una primera amplificación por PCR en un
termociclador Gene Amp® PCR System 2700 utilizando un cebador AP1, complementario al
adaptador, y un cebador específico (CE1) que se encuentra dentro de la secuencia conocida del
exón. Las condiciones de la primera PCR fueron 95ºC 1min; un ciclo de 94ºC 25 s, 72ºC 3 min,
repetido siete veces; seguido de otro ciclo de 94ºC 25 s, 67ºC 3min, repetido 32 veces; 67ºC 7
min y finalmente 4ºC 30 min. Tomando como molde el producto de la primera PCR diluida 1/50, se
realizó una reamplificación por PCR con un cebador AP2, complementario del AP1, y con un
segundo cebador específico (CE2), situado en la secuencia conocida de exón (Fig. 4.2.1). Las
condiciones de amplificación de la segunda PCR fueron las siguientes: 95ºC 1min; un ciclo de 94ºC
25s, 72ºC 3 min, repetido cinco veces; seguido de otro ciclo de 94ºC 25 s, 67ºC 3 min, repetido 20
veces; 67ºC 7 min para finalizar con 4ºC 30 min. Los productos de PCR se migraron
electroforéticamente para su separación por tamaño en un gel de agarosa al 1,5% en TAE 1X
modificado (Tris 10mM, EDTA 0,1mM pH 8.0) que contenía 1µg/50mL de gel de bromuro de etidio
(Sigma Chemical Co., Missouri, EE.UU.) y se visualizaron en un sistema de documentación de geles
Gel Doc XR (Bio-Rad Laboratories, California, EE.UU.).
Los amplicones obtenidos en las reamplificaciones por PCR de las cuatro librerías de DNA
digerido, susceptibles de contener secuencias de intrones, se purificaron o con el PCR Purification
Kit (QIAGEN CombH, Hilden, Alemania), o mediante la extracción de la banda correspondiente del
gel de agarosa y su posterior purificación en columnas Ultrafree-DA (Millipore, Massachusetts,
EE.UU.). Los productos de PCR purificados fueron clonados en el pGEM®-T Easy Vector System
(Promega Corporation, Wisconsin, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente,
para confirmar que el amplicón clonado incluía la secuencia del exón y la secuencia desconocida
del intrón adyacente, los productos de PCR fueron enviados a Secugen S.L. (Madrid) donde se
secuenciaron en un secuenciador automático ABI PRISM 377 (Applied Biosystems, California,
EE.UU.).
Las secuencias nucleotídicas definitivas de cada intrón se obtuvieron después de la
corrección manual de los cromatogramas con el programa Chromas V1.45 (Griffith University,
Queensland, Australia). La posición inicial y final de los intrones adyacentes a las regiones de exón
de los genes que codifican para la acetilcolinesterasa (AChE) y para la aliesterasa (AE7) de C.
capitata se determinaron por el alineamiento con las secuencias de cDNA.
112
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
4.2.2. Amplificación de los exones de Ccace2 y Ccae7.
A partir de las secuencias obtenidas para las regiones intrónicas que flanqueaban los
exones de los genes Ccace2 y Ccae7, se diseñaron cebadores específicos (Tabla 4.2.3) para
amplificar por PCR a partir de DNA genómico aquellos exones en los que se habían descrito
previamente mutaciones asociadas con la resistencia a insecticidas, tanto en genes ace como en
genes ae7. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 95ºC 10 min, 40 ciclos de 95ºC
30 s, 48-52ºC 30 s y 72ºC 45 s, seguidos de 72ºC 7 min y finalizando con un periodo de 30 min a
4ºC. Para comprobar el correcto funcionamiento de los cebadores diseñados, se realizó la
amplificación de los exones de Ccace2 y Ccae7 de individuos de la línea de laboratorio W-4Km
(descrita en el apartado 2.2.2), y de tres poblaciones de campo de Australia, Sudáfrica e Isla
Reunión (Tabla 4.2.4).
113
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
86
584
240
E4 (561)
E5 (164)
161
E7 (150)
E3 (151)
536
E6 (143)
364
234
E5 (204)
E2 (313)
585
E4 (537)
Ccae7
191
E3 (139)
Ccace2
Amplicón
Exón
Gen
114
TTTCCCTGCCTTAGGCGCTAAGA
GTTCCAGAAAATCGTGACAATGA
Rin5Ex5_AE7
ATGCCAGTAGTTCTCACCTTGC
Rin4Ex4_AE7
Fin4Ex5_AE7
AAACAGGCTTCCTTTCGCT
TGCTATCATCCCACACATACCC
RAE7_in3Ex3
FAE7_in3Ex4
CTTAAATCCTCACAGACTCTGCC
GGTACATAAATTTATATATATACTCAC
Rin2Ex2_AE7.1
FAE7_in2Ex3
CTCATACCTTTCTTCCGTTCTTAG
ACTTACATGTGTAAAGTAATA
Rin7Ex7_AChE
Fin1Ex2_AE7
TTCAGCACACAAGTTGGGT
TGCGCACAGTATGGCAACTCT
Rin6AChE
Fin6Ex7_AChE
TCAACATGTTTTTCATTTTCGTTCCAG
CACAGGAAGTACTCACCTTCATC
Rin5Ex5_AChE
FG328A_27
CATTTTCAGGAAAATCCTCAAGC
TTGCAAAATATGCACACCCACTTACCGCC
Rin4Ex4_AChE
Fin4Ex5_AChE
TCGTCTTCTAATATTCCCTACAGCACTCC
Fin3Ex4_AChE
TTAGCCTTTTTGTAGCTACTCACCTCACC
Rin3Ex3_AChE
3’)
GTATTCCCTTTTCGTGCGTTCACCTACAG
Secuencia (5’
Fin2Ex3_AChE
Cebador
23
23
22
19
22
23
27
24
21
19
21
27
23
23
29
29
29
29
b
tamaño del amplicón obtenido en pares de bases, el nombre del cebador, la secuencia nucleotídica y el número de bases del cebador (b).
Tabla 4.2.3. Cebadores empleados en la amplificación de los exones de Ccace2 y Ccae7. Una vez obtenida la secuencia de los
intrones flanqueantes de los exones de Ccace2 y Ccae7 se diseñaron los siguientes cebadores para amplificar en C. capitata, partiendo de DNA
genómico, los exones 3, 4, 5, 6 y 7 de Ccace2 y los exones 2, 3, 4 y 5 de Ccae7. Se indica el exón y su tamaño en pares de bases, entre paréntesis, el
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
4.2.3. Desarrollo de un método de detección de la mutación
AChE G328A.
Las secuencias obtenidas mediante el método GenomeWalkerTM permitieron el desarrollo
de un sistema de PCR-RFLP para la detección del alelo Ccace2R, que codifica para la mutación
AChE G328A en C. capitata, previamente asociada con resistencia a malatión (Magaña et al.,
2008). El sistema está basado en un método diseñado por Jacobson y Moskovits (1991) para la
detección de SNPs (single nucleotide polymorphisms) en oncogenes. Una vez conocida la secuencia
nucleotídica del extremo 3’ del intrón 5 del gen Ccace2, se diseñó un cebador basado en la
secuencia de dicho intrón. Este cebador directo FG328A_27 (Tabla 4.2.3) contiene una
modificación en la cuarta base de su extremo 3’ que crea un sitio de restricción en ausencia de la
mutación puntual AChE G328A, es decir, cuando está presente el alelo silvestre susceptible a
malatión (Ccace2S). La combinación de este cebador con el cebador reverso RiAChE_CcE60 (Tabla
4.2.1), situado en el exón 6 de Ccace2, permitió la amplificación por PCR de la región que contiene
la mutación AChE G328A, partiendo de DNA genómico (Fig. 4.2.3). Se emplearon individuos
adultos de las líneas de laboratorio C y W-4Km para la puesta a punto del método.
A
PCR
G328A
RiAChE_CcE60
FG328A_27
EXÓN 6 Ccace2
Intron 5
B
PCR-RFLP
172 pb
27 pb
145 pb
Bst NI
Figura 4.2.3. Diseño del método de detección de la mutación AChE G328A en C.
capitata. (A) Se muestra la localización de los dos cebadores empleados en la amplificación por
PCR de la mutación AChE G328A, partiendo de DNA genómico. (B) Esquema del sitio de corte de la
enzima Bst NI cuando el producto de PCR generado en la amplificación por PCR no posee la
mutación puntual AChE G328A.
115
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
La reacción de PCR se realizó en un termociclador GeneAmp® PCR System 2700 (Applied
Biosystem, Foster City, EE.UU.). El volumen final de cada reacción fue de 13 µl con los siguientes
componentes: 2 unidades de la enzima Amplitaq Gold® (Roche Molecular Systems, Inc., New
Jersey, EE.UU.), los cebadores a una concentración de 0,6 µM, MgCl2 2mM, dNTPs 0,2mM, buffer
II 1X, y aproximadamente 100 ng de DNA total. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes:
95ºC 10 min, seguidos de un ciclo de 95ºC 30s, 48ºC 30s, 72ºC 15s que se repitió cuarenta veces,
finalizando la reacción de PCR con 72ºC 7 min y 4ºC 30min. Para la visualización del amplicón, se
cargaron 3 µl del producto de PCR en un gel de agarosa al 2% (D-2 Agarose, Lab. Conda, Torrejon
de Ardoz, Madrid, España) en TAE 1X (Tris 40mM, EDTA 1mM pH 8.0). Posteriormente, se realizó
un RFLP con la enzima de restricción Bst NI (New England Biolabs, Massachusetts, EE.UU.). Así, a
los 10 µl de producto de PCR se le añadieron 2 µl de una disolución que contenía 2 unidades de la
enzima Bst NI, buffer NE-2 1X y BSA 100 µg/ml. El RFLP se realizó en el mismo termociclador
mediante una incubación durante 2 horas a 60ºC. Los productos del RFLP se migraron
electroforéticamente en un gel de agarosa al 3% donde se mezclaron en TAE 1X, en una
proporción 1:1, dos tipos de agarosa (D-2 Agarose y NuSieve® GTG® Agarose, Lonza, Maine,
EE.UU.). En la figura 4.2.4 se muestra el perfil de restricción teórico para este sistema de detección
teniendo en cuenta la secuencia conocida de cDNA de C. capitata.
PCR-RFLP
PCR
172 pb
145 pb
27 pb
(liberación del cebador)
SS
RS
RR
Genotipo Ccace2
Figura 4.2.4. Patrón PCR-RFLP esperado para Ccace2. Perfil de restricción teórico para
los tres genotipos posibles después de digerir el producto de PCR con la enzima de restricción Bst
NI, siendo S el alelo susceptible Ccace2S y R el resistente Ccace2R .
El método de detección del aleo Ccace2R, que confiere resistencia frente a malatión en C.
capitata, se empleó para analizar individuos provenientes de poblaciones extranjeras (Tabla 4.2.4)
y españolas (Tabla 4.2.5), examinando un total de 20 individuos para cada una de las poblaciones.
116
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Con el objeto de evaluar la complementariedad del método de detección del alelo Ccace2R
con los muestreos que se realizan para cuantificar la abundancia en campo de las poblaciones de
C. capitata, se analizaron individuos procedentes de trampas Moskisan® (Sansan Prodesing S.L.,
Burjassot, Valencia), situadas en una parcela de naranjos en la localidad de Sagunt (Valencia). Las
moscas se recogieron en trampas que permanecieron en el campo una semana. Los individuos
muertos encontrados en las trampas se conservaron en etanol al 95% hasta su posterior estudio
en el laboratorio. Sólo se analizaron individuos hembras para evitar la inclusión en el estudio de los
machos procedentes de la suelta de machos estériles que se pudieran haber efectuado en la
misma zona. El protocolo de extracción de DNA y el análisis por PCR-RFLP realizado fue el descrito
anteriormente en este apartado.
Tabla 4.2.4. Poblaciones extranjeras de C. capitata utilizadas en los estudios
moleculares de la resistencia a insecticidas. Se muestran los países y las poblaciones
analizadas en cada país, indicando su código de nomenclatura y la fecha de recolección de la
población. Además se indica si fueron empleadas en algún estudio previo.
País
Población
Código
Fecha
Estudio previo
Australia
Australia occidental
AUS
Oct, 2005
-
Brasil
Sao Paulo
BRA
Oct, 2004
Beroiz et al., 2012
Francia
Isla Reunión
REU
Nov, 2008
-
Grecia
Agrinio, Argos, Zacharo,
GRE
Dic, 2006
-
Lefkada, Dominio, Patras
Guatemala
Antigua Guatemala
GUA
Ago, 2008
-
Israel
Ma'agan Michael
ISR
Jun, 2004
Beroiz et al., 2012
Marruecos
Agadir
AGA
Dic, 2003
Beroiz et al., 2012
Portugal
Isla Madeira
MAD
Mar, 2004
Beroiz et al., 2012
Sudáfrica
Sudáfrica
SUD
Ene, 2006
-
Túnez
Béja, Tabarca
TUN
Dic, 2008
-
Turquía
Turquía
TUR
Dic, 2008
-
_________________________________________________________________________________________
117
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Tabla 4.2.5. Poblaciones españolas de C. capitata analizadas en los estudios
moleculares de resistencia a insecticidas. Se muestran, ordenadas alfabéticamente, las
localidades que dan nombre a las poblaciones, indicando la provincia (según ISO 3166-2 para
España), su código de nomenclatura, el fruto hospedador, la fecha de recolección de la fruta, y si
fueron empleadas en algún estudio previo.
CC.AA./Población
Provincia
Código
Hospedador
Fecha
Estudio previo
Algarrobo Costa
(MA)
MAY
Chirimoya
Dic, 2008
Capítulo 2
Almuñecar
(GR)
ALM
Níspero
Jun, 2007
Capítulo 2
Ayamonte
(H)
AYA
Mandarina
Sep, 2008
Capítulo 2
Andalucía
Gibraleón
(H)
GIB
Mandarina
Sep, 2008
Capítulo 2
Torre de Benagalbón
(MA)
MAG
Mango
Oct, 2003
Beroiz et al., 2012
(Z)
VIG
Melocotón
Sep, 2007
Capítulo 2
Alcanar
(T)
ALC
Mandarina
Oct, 2007
Capítulo 2
Amposta
(T)
AMP
Mandarina
Oct, 2003
Beroiz et al., 2012
Girona
(GI)
GER
Manzana
Oct, 2004
Beroiz et al., 2012
Tortosa
(T)
TOR
Mandarina
Oct, 2003
Beroiz et al., 2012
Alacant
(A)
ALI
Higo
Sep, 2004
Beroiz et al., 2012
Alcúdia
(V)
ALD
Melocotón
Jun, 2004
Magaña et al., 2007
Burriana
(CS)
BUR
Níspero
Jun, 2004
Magaña et al., 2007
Carlet
(V)
CAR
Melocotón
Jun, 2004
Magaña et al., 2007
Les Coves de Vinromà (CS)
COV
Pera
Jul, 2003
Beroiz et al., 2012
Moncada
(V)
MON
Melocotón
Jun, 2003
Beroiz et al., 2012
Orihuela
(A)
ORI
Cítricos
Nov, 2005
Magaña et al., 2007
Sagunt
(V)
SAG
Cítricos
Sep, 2008
Este capítulo
Aragón
Villalengua
Cataluña
C. Valenciana
Serra
(V)
SER
Cítricos
Oct, 2005
Magaña et al., 2007
Vila Joiosa
(A)
VIY
Naranja
May, 2007
Capítulo 2
Vila Real
(CS)
VIL
Caqui
Oct, 2005
Magaña et al., 2007
Xàbia
(A)
JAV
Naranja
Jun, 2007
Capítulo 2
Marratxí
(PM)
MAR
Naranja
Nov, 2007
Capítulo 2
Muro
(PM)
MUR
Cítricos
Nov, 2007
Capítulo 2
(TF)
VAG
Zapote
May, 2004
Beroiz et al., 2012
(LO)
ALB
Manzana
Oct, 2004
Magaña et al., 2007
I. Baleares
I. Canarias
Valle de Guerra
La Rioja
Albelda
___________________________________________________________________________________________________________________________________
118
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
4.3. Resultados.
4.3.1. Estructura del gen Ccace2.
Mediante el método GenomeWalkerTM se obtuvieron las secuencias intrónicas que
flanquean los exones 3, 4, 5, 6 y 7 del gen Ccace2 (ver anexo II), exones situados en su región
central (Fig. 4.3.1). La estructura intrón-exón fue análoga a la observada en Dmace2, su ortólogo
en D. melanogaster (Fig. 4.2.2) y tanto las posiciones físicas de los intrones dentro del gen como
su estructura típica de inicio/fin (GT/AG) fueron similares. El tamaño de las secuencias intrónicas
obtenidas varió entre los 133 pb y los 3.119 pb. Tanto la secuencia completa del intrón 3 (147 pb),
obtenida a partir de una librería de cDNA (Kit Marathon®, Clontech), como las secuencias parciales
del extremo 3’ del intrón 2 y del extremo 5’ del intrón 4 se obtuvieron previamente a éste (Tabla
4.3.1). Todos los fragmentos de intrón obtenidos tuvieron el tamaño suficiente como para diseñar
los cebadores que permitiesen la amplificación por PCR del exón adyacente correspondiente.
119
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
4.3.2. Estructura del gen Ccae7.
Se estudió la estructura génica de la región central del gen Ccae7 que codifica para la
aliesterasa (AE7) analizando, mediante GenomeWalkerTM, las secuencias intrónicas adyacentes a
cuatro de los seis exones que conforman el gen (E2, E3, E4, E5). En la figura 4.3.1 se muestra un
esquema de la estructura génica obtenida para Ccae7 de C. capitata, donde se observa la
localización de los intrones y de los cebadores diseñados sobre ellos para posteriormente amplificar
los exones adyacentes mediante PCR.
La
secuenciación
GenomeWalker
TM
de
los
productos
de
PCR
obtenidos
mediante
el
protocolo
(ver anexo II) mostró que el esquema intrón-exón, analizando la secuencia
nucleotídica del gen Ccae7 (Fig. 4.3.1), coincidía con la descrita para Dmae7, su ortólogo en D.
melanogaster (Fig. 4.2.2), así como la posición física de los intrones y su estructura típica de
inicio/fin (GT/AG). El tamaño de las secuencias intrónicas de Ccae7 varió entre los 71 pb y los 347
pb (Tabla 4.3.1), lográndose la secuencia completa de los intrones 2, 3 y 4. La secuencia de los
intrones 2 y 3 se obtuvo previamente a partir de una librería de cDNA (Kit Marathon®, Clontech).
La secuencia del intrón 4 se obtuvo de manera indirecta, al ser un intrón de pequeño tamaño (71
pb) incluido en la amplificación del cebador directo FAE7_CcEx4.2 y el cebador AP2 del
GenomeWalkerTM. Las secuencias de los intrones 1 y 5 fueron parciales, pero con un tamaño
suficiente como para diseñar cebadores que permitiesen la amplificación por PCR del exón
adyacente correspondiente.
G328A
Ccace2 (DNA genómico)
I2
I3
E3
I4
I5
E4
E5
I6
E6
I7
E7
Ccae7 (DNA genómico)
I1
I2
E2
I3
E3
I4
E4
I5
E5
Figura 4.3.1. Estructura génica de Ccae7 y Ccace2. Esquema de los exones
amplificados por PCR a partir de la secuencias de los intrones adyacentes (trazo grueso del
segmento del intrón) obtenidas mediante el GenomeWalkerTM. Las flechas indican la posición de los
cebadores diseñados para amplificar por PCR la secuencia completa del exón correspondiente. En
el gen Ccace2 se indica la posición de la mutación puntual AChE G328A, que confiere resistencia a
malatión.
120
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Tabla 4.3.1. Secuencias nucleotídicas de los intrones de Ccae7 y Ccace2. Se
indica el tamaño en pares de bases (pb) de las secuencias parciales de cada uno de los intrones,
entre paréntesis. Además se muestra el tamaño total de la secuencia de intrón conseguida.
Gen
Intrón
Tipo de secuencia y tamaño (pb)
Ccae7
I1
Parcial, desde el extremo 3’ (107)
I2
Completa
347
I3
Completa
82
I4
Completa
71
I5
Parcial, desde el extremo 5’ (192)
> 192
I2
Parcial, desde el extremo 3’ (133)
> 133
I3
Completa
I4
Parcial, desde el extremo 5’ (2.436)
Ccace2
Total (pb)
> 107
147
> 3.119
Parcial, desde el extremo 3’ (683)
I5
Parcial, desde el extremo 5’ (874)
> 1.178
Parcial, desde el extremo 3’ (304)
I6
Parcial, desde el extremo 5’ (960)
> 2.227
Parcial, desde el extremo 3’ (1.267)
I7
Parcial, desde el extremo 5’ (453)
> 453
____________________________________________________________________________________________________
4.3.3. Amplificación de Ccae7 y Ccace2 en individuos de
distintas regiones geográficas.
Las secuencias nucleotídicas de los intrones obtenidas para los genes Ccae7 y Ccace2 nos
permitieron diseñar cebadores específicos para amplificar por PCR, a partir de DNA genómico, cada
uno de los exones adyacentes correspondientes (Tabla 4.2.3). Se obtuvieron productos de PCR
para todas las parejas de cebadores diseñadas, amplificando los exones 2, 3, 4 y 5 de Ccae7 y los
exones 3, 4, 5, 6, 7 de Ccace2. En la figura 4.3.2 se muestra, como ejemplo del correcto
funcionamiento del sistema de amplificación por PCR, el análisis realizado en insectos procedentes
121
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
de una línea de laboratorio (Línea W-4Km) y de tres diferentes regiones geográficas: Sudáfrica
(SUD), Australia (AUS) e Isla Reunión (REU). Así, se confirmó experimentalmente que las parejas
de cebadores diseñadas amplificaban correctamente los exones independientemente del origen de
los individuos analizados.
Ccae7
E2
E3
M
E4
E5
584 pb
364 pb
240 pb
186 pb
Ccace2
E3
E4
E5
E6
M
E7
585 pb
536 pb
234 pb
161 pb
191 pb
Figura 4.3.2. Amplificación de Ccae7 y Ccace2 en individuos de distintas
regiones geográficas. Las fotografías muestran la amplificación por PCR de los exones de
Ccae7 y Ccace2, a partir de DNA genómico, de cuatro individuos de distintas regiones geográficas,
migrados en geles de agarosa 1,5% en TAE 1X. Para cada uno de los exones (E), de izquierda a
derecha, se analizó un individuo de la población australiana (AUS), sudafricana (SUD), de Isla
Reunión (REU) y de la línea de laboratorio W-4Km. Se empleó como referencia un marcador
molecular en escalera de 100 pb (M).
4.3.4. Método de detección del alelo Ccace2R portador de la
mutación AChE G328A.
Al alelo del gen Ccace2, que codifica para la mutación AChE G328A, y confiere resistencia
al malatión en C. capitata (Magaña et al., 2008), lo denominaremos Ccace2R, y al alelo silvestre,
que muestra susceptibilidad frente a malatión lo llamaremos Ccace2S. A partir de la secuencia del
extremo 3’ del intrón 5 de Ccace2, obtenido en el apartado 4.3.2, se comprobó que dicho intrón se
situaba entre la primera y la segunda base del codón portador de la mutación AChE G328A, tal y
como se predecía de la estructura génica de Dmace2 (McQuilton et al., 2012). El sitio puntual de la
mutación AChE G328A se correspondió con la segunda posición del triplete, por lo que dicha base
122
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
ocuparía la primera posición del exón 6. Debido a que en la secuencia del intrón adyacente al sitio
de la mutación puntual (últimas bases del extremo 3’ del intrón 5) no existía un sitio de restricción
adecuado para detectar el alelo mutado mediante un sistema convencional de PCR-RFLP, fue
necesario diseñar un cebador que crease dicho sitio de restricción. El cebador en sentido directo se
diseñó con una modificación en su extremo 3’, dirigida a crear una diana de restricción para la
enzima Bst NI dependiente de la ausencia de la mutación AChE G328A. Es decir, se cortaría aquel
producto de PCR que correspondiese al alelo silvestre Ccace2S. Este cebador, denominado
FG328A_27 (Tabla 4.2.2), en combinación con el cebador reverso RiAChE_CcE60 (Tabla 4.1.)
amplificó, a partir de DNA genómico, un fragmento de 172 pb que, al ser expuesto a la enzima Bst
NI, permitió detectar la presencia/ausencia del alelo Ccace2R al migrar el RFLP en un gel de
agarosa. Así, se obtuvieron tres perfiles de restricción distintos que nos permitieron diferenciar,
dependiendo de si existía la mutación AChE G328A y si ésta se encontraba en homocigosis o
heterocigosis, los tres posibles genotipos del gen Ccace2: 1) individuos con genotipo silvestre, el
producto de PCR de 172 pb fue digerido por Bst NI y se visualizó una sola banda de 145 pb, ya
que el fragmento de 27 pb no se visualizó con nitidez en el gel de agarosa debido a su pequeño
tamaño; 2) individuos homocigotos para la mutación AChE G328A, la enzima Bst NI no digirió el
producto de PCR y se visualizó una sola banda de 172 bp; 3) individuos heterocigotos, se
visualizaron las dos bandas anteriormente descritas de 172 pb y 145 pb correspondientes al alelo
silvestre y al de resistencia (Fig. 4.3.3).
Ccace2S
Ccace2S
Ccace2R
Ccace2S
M
Ccace2R
Ccace2R
172 pb
145 pb
Figura 4.3.3. Método PCR-RFLP para la detección del alelo Ccace2R. Los productos
del RFLP correspondientes a los tres posibles genotipos para Ccace2 se migraron en un gel de
agarosa al 3% en TAE 1X. Se empleó un marcador molecular en escalera de 100 pb (M).
123
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Este método de detección de la mutación puntual AChE G328A resultó ser rápido, ya que
en un día se pudieron analizar hasta cuarenta insectos, desde la extracción de DNA genómico de la
cabeza hasta la interpretación del perfil de restricción para identificar el genotipo del individuo para
Ccace2. Además, el análisis PCR-RFLP se realizó a partir de DNA extraído tanto de insectos adultos
completos, como de larvas y de pupas, obteniendo en todos los casos resultados satisfactorios.
4.3.5. Distribución geográfica del alelo Ccace2R.
Mediante el método de detección PCR-RFLP explicado anteriormente se determinó la
frecuencia del alelo Ccace2R en poblaciones de varias áreas geográficas. Se analizaron 27
poblaciones españolas y 11 poblaciones extranjeras de los cinco continentes. La figura 4.3.4.a
muestra un ejemplo representativo de los análisis de PCR-RFLP realizados para determinar la
distribución del alelo Ccace2R en las diferentes poblaciones, mostrando los perfiles de restricción de
varios individuos de las poblaciones de Torre de Benagalbón (Málaga), Tortosa (Tarragona), Les
Coves de Vinromà (Castellón) y Moncada (Valencia). Además, para evaluar la posible aplicación del
método de detección de la mutación AChE G328A en insectos procedentes de trampas, se incluyó
en este estudio la población Sagunt (Valencia), donde se analizaron moscas recogidas en una
trampa Moskisan® que podían llevar muertas en la trampa hasta siete días (ver apartado 4.2.3). El
análisis de la población de Sagunt (Valencia) se muestra en el figura 4.3.4.b. En ambas imágenes
se identifica el genotipo de cada uno de los individuos analizados mediante el método PCR-RFLP
para la detección del alelo Ccace2R, que codifica para la mutación AChE G328A y que confiere
resistencia frente a malatión en la mosca mediterránea de la fruta C. capitata.
124
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
(a)
MAG
M
TOR
COV
MON
S-S S-S S-S S-S S-S S-S R-S R-S R-R R-S S-S R-R R-S R-S R-R S-S R-R R-S S-S R-S S-S S-S R-S
M
200 pb
100 pb
(b)
R-S
R-S R-R
S-S
R-R
S-S
S-S
S-S
M
172 pb
145 pb
Figura 4.3.4. Análisis por PCR-RFLP del alelo Ccace2R en poblaciones de campo
de C. capitata. Los productos de PCR-RFLP se migraron en un gel de agarosa al 3% en TAE 1X.
Se empleó un marcador molecular en escalera de 100 pb (M). Para facilitar la compresión del
esquema, Ccace2S se abrevia como “S” y Ccace2R como “R”. (a) Ejemplo de varios individuos de
las poblaciones de Torre de Benagalbón, Málaga (MAG); Tortosa, Tarragona (TOR); Les Coves de
Vinromà, Castellón (COV) y Moncada, Valencia (MON). (b) Individuos recolectados en trampas en
la población de Sagunt, Valencia (SAG).
125
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
El análisis de las 27 poblaciones españolas mediante el método PCR-RFLP para la detección
de la mutación AChE G328A mostró que el alelo Ccace2R, que confiere resistencia a malatión, se
encontró en al menos un individuo de todas las poblaciones analizadas (Tabla 4.3.2 y Fig. 4.3.5),
con las únicas excepciones de Torre de Benagalbón (Málaga) y Marratxí (Mallorca), lo que supone
que el alelo Ccace2R estuvo presente en el 93% de las poblaciones analizadas.
Albelda (04)
Villalengua (07)
Girona (04)
Tortosa (03)
Amposta (03)
Alcanar (07)
Les Coves de Vinromà (03)
Vila Real (05)
Burriana (04)
Muro (07)
Marratxí (07)
Alcúdia (04)
Sagunt (08)
Gibraleón
(08)
Serra (05)
Moncada (03)
Ayamonte
(08)
Carlet (04)
Xàbia (07)
Vila Joiosa (07)
Torre de
Benagalbón (03)
Algarrobo
Costa (08)
Almuñécar
(07)
Orihuela
(05)
Alacant
(04)
Valle de Guerra (04)
Figura 4.3.5. Distribución geográfica del alelo Ccace2R en España. Localización de
las poblaciones españolas analizadas. El sector negro de cada círculo representa el porcentaje de
individuos que poseen el alelo Ccace2R. Entre paréntesis, a continuación del nombre de cada
población, se indica el año de recogida.
En las poblaciones de Gibraleón (Huelva), Almuñécar (Granada), Algarrobo Costa (Málaga)
y Villalengua (Zaragoza) se registraron las menores frecuencias del alelo de resistencia, donde el
número de individuos que portaban el alelo Ccace2R no superó el 10% (Tabla 4.3.2). Las
poblaciones que exhibieron un mayor porcentaje de individuos con el alelo Ccace2R fueron Les
Coves de Vinromà (90%) en Castellón y Amposta (85%) en Tarragona, seguidas de Valle de
Guerra (80%) en Tenerife (Tabla 4.3.2). En estas cuatro poblaciones, la proporción del alelo
Ccace2R con respecto a Ccace2S fue mayor o igual al 50%. Además, en 16 de las 25 poblaciones en
las que se detectó el alelo Ccace2R el porcentaje de dicho alelo fue mayor o igual al 20% (Fig.
4.3.6).
126
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
C. Valenciana
Cataluña
Aragón
Andalucía
CC.AA.
AYA
GIB
MAG
Ayamonte
Gibraleón
Torre de Benagalbón
ALD
BUR
CAR
COV
Burriana
Carlet
Les Coves de Vinromà
TOR
Tortosa
Alcùdia
GER
Girona
ALI
AMP
Amposta
Alacant
ALC
Alcanar
VIG
ALM
Villalengua
MAY
Almuñécar
CÓD.
Algarrobo Costa
Población
10
80
55
58
74
25
35
15
60
92
0
95
90
95
95
Ccace2
S
Ccace2
S
127
70
20
35
42
22
55
50
70
40
8
0
5
10
5
5
R
Ccace2
S
Ccace2
20
0
10
0
4
20
15
15
0
0
0
0
0
0
0
R
Ccace2
R
Ccace2
___________________________________________________________________________________________________________
Genotipo (%)
Tabla 4.3.2. Presencia del alelo Ccace2R en poblaciones españolas de C. capitata.
55
10
28
21
15
48
40
50
20
4
0
3
5
3
3
% alelo
R
Ccace2
90
20
45
42
26
75
65
85
40
8
0
5
10
5
5
% individuos con
R
alelo Ccace2
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
VIL
JAV
Vila Real
Xàbia
Albelda
Valle de Guerra
ALB
VAG
MUR
VIY
Vila Joiosa
Muro
SER
Serra
MAR
SAG
Sagunt
Marratxí
MON
ORI
Orihuela
CÓD.
Moncada
Población
56
20
80
0
40
35
90
40
45
55
30
Ccace2
S
Ccace2
50
44
45
20
0
40
60
10
55
45
40
R
Ccace2
S
Ccace2
0
35
0
0
20
5
0
5
10
5
20
R
Ccace2
R
Ccace2
22
58
10
0
40
35
5
33
33
25
45
% alelo
R
Ccace2
44
80
20
0
60
65
10
60
55
45
70
% individuos con
R
alelo Ccace2
128
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
La Rioja
I. Canarias
I. Baleares
C. Valenciana
CC.AA.
S
___________________________________________________________________________________________________________
Genotipo (%)
Tabla 4.3.2. Presencia del alelo Ccace2R en poblaciones españolas de C. capitata. (Continuación).
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Cast elló
Valle de Guerr a
Les Coves de Vinromà
Ampost a
Tort osa
Moncada
Xàbia
Gir ona
Vila Real
Serr a
Sagunt
Bur riana
Ccace2
Ccace2
Orihuela
Albelda
S
R
Alcùdia
Alcanar
Alacant
Mur o
Carlet
Vila Joiosa
Ayamont e
Villalengua
Gibraleón
Almuñecar
´
Algar r obo Cost a
Torr e de Benagalbón
Mar rat xí
0%
20%
40%
60%
80%
100%
a le lo s
Figura 4.3.6. Porcentaje de alelos Ccace2S y Ccace2R en las poblaciones
españolas de C. capitata analizadas.
En cuanto a las poblaciones extranjeras analizadas, no se detectó el alelo Ccace2R, que
contiene la mutación AChE G328A que confiere resistencia a malatión en C. capitata, en ninguno
de los individuos analizados (Fig. 4.3.7).
129
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Túnez (08)
Grecia (08)
Turquía (08)
Marruecos (03)
Isla de Madeira (04)
Israel (04)
Isla Reunión (08)
Guatemala (08)
Brasil (04)
Australia (05)
Sudáfrica (06)
Figura 4.3.7. Distribución geográfica del alelo Ccace2R en las poblaciones no
españolas. Situación de las poblaciones recogidas en once países de cinco continentes. El color
blanco del círculo indica que la totalidad de los individuos analizados no portaban el alelo Ccace2R.
b) Entre paréntesis, a continuación del nombre de cada población, se muestra el año de recogida.
4.3.6. Frecuencia genotípica de Ccace2 en las líneas de
laboratorio resistentes a malatión.
Con el objetivo de estudiar la evolución temporal del alelo Ccace2R en una población sujeta
a una presión de selección se analizaron con el método PCR-RFLP descrito previamente (apartado
4.3.4) individuos adultos, recogidos antes del tratamiento con insecticida, de las líneas de
laboratorio resistentes a malatión: W (F2 y F10), W-4Km (F37) y W-10Km (F52). En la generación
F2 de la línea W la frecuencia de individuos heterocigotos fue del 56%, un 6% eran homocigotos
silvestres y un 38% homocigotos para la mutación AChE G328A. Estas frecuencias serían
representativas de las existentes en la población Castelló de la que proceden (Magaña et al.,
2007), ya que las moscas no fueron tratadas con malatión en la primera generación que se
mantuvo en el laboratorio. En la generación F10, donde la concentración de selección fue de 2.000
ppm de malatión (Tabla 2.3.3), el porcentaje de heterocigotos se incrementó hasta el 70%,
disminuyendo a la mitad el porcentaje de homocigotos para Ccace2R. Los análisis realizados en la
generación F37 de la línea W-4Km, donde la selección se realizaba con 4.000 ppm de malatión,
130
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
mostraron que la mayoría de los individuos eran heterocigotos (96%) y no se detectaron
individuos homocigotos silvestres. Finalmente, en el análisis de la generación F52 de la línea W10Km, tratada con 10.000 ppm de malatión, se observó que la totalidad de los individuos
analizados eran heterocigotos para el gen Ccace2 (Fig. 4.3.8).
Ccace2S-Ccace2S
Ccace2R-Ccace2S
56%
70%
F2
F10
_________________________
W
96%
F37
100%
Ccace2R-Ccace2R
F52
___________
___________
W-4Km
W-10Km
Figura 4.3.8. Frecuencia genotípica de Ccace2 en las líneas de laboratorio
resistentes a malatión seleccionadas a partir de la población W. Proporción de
homocigotos para el alelo silvestre Ccace2S, heterocigotos y homocigotos para el alelo resistente
Ccace2R para el gen Ccace2 en las generaciones F2 y F10 de la línea W, F37 de la línea de
laboratorio W-4Km y F52 de la línea W-10Km. Se analizaron un mínimo de 20 individuos en cada
una de las generaciones.
131
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
4.4. Discusión.
El análisis de la estructura génica de la acetilcolinesterasa y de la aliesterasa de C. capitata
ha confirmado que la disposición de intrones y exones estudiados de los genes Ccace2 y Ccae7 es
idéntica a la que presentan los genes ortólogos en D. melanogaster (McQuilton et al., 2012). En
cuanto al tamaño de los intrones, se ha observado que en ambas especies de dípteros el gen ae7
presenta algunos intrones de pequeño tamaño. Sin embargo, los intrones del gen Ccace2
presentaron, en general, un tamaño mayor, en correspondencia con lo descrito en el gen Dmace2
de D. melanogaster (McQuilton et al., 2012). Debido al gran tamaño de algunos de estos intrones
no se ha obtenido la secuencia completa de todos ellos, pero sí una secuencia con un tamaño
adecuado para el diseño, en C. capitata, de cebadores específicos para amplificar por PCR los
exones de ace2 y ae7 relacionados con resistencia en otros insectos, partiendo de DNA genómico.
El análisis de las mutaciones en los genes Ccace2 y Ccae7, previo a este trabajo, se realizó
mediante la amplificación por PCR del cDNA, por lo que era necesario purificar el RNA (Magaña et
al., 2008). La extracción de RNA sólo se puede realizar a partir de individuos vivos y/o conservados
a -80ºC, factor que limitaba el análisis a los individuos disponibles en el laboratorio o a los que
eran recogidos en campo y criopreservados hasta su estudio. Los cebadores diseñados en este
trabajo permiten la amplificación y secuenciación de los exones a partir de DNA genómico, que es
menos sensible a la degradación que el RNA, no siendo necesario criopreservar los individuos antes
133
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
de su análisis. Esta técnica permite incluso analizar, con resultados satisfactorios, individuos
procedentes de trampas de captura que podían llevar muertos en la trampa una semana antes de
su recogida.
Los cebadores empleados para amplificar los exones de los genes Ccace2 y Ccae7 fueron
diseñados a partir de secuencias intrónicas adyacentes a los exones. Además, algunos de los
cebadores incluyeron parte de la secuencia del exón. Los cebadores fueron diseñados con la
intención de que fueran útiles para poder amplificar distintos alelos de estos genes, pudiendo así
detectar mutaciones en las regiones codificantes del gen. La eficacia de los cebadores para
amplificar los exones de los genes Ccace2 y Ccae7 en poblaciones de diferentes regiones
geográficas (España, Sudáfrica, Australia o Isla Reunión) confirma el elevado grado de
conservación existente en las regiones escogidas para el diseño de los cebadores.
La mutación puntual AChE G328A ha sido asociada con la aparición de resistencia al
organofosforado malatión en poblaciones españolas de la mosca mediterránea de la fruta (Magaña
et al., 2007, 2008). El diseño de un método de diagnóstico para identificar aquellos individuos
portadores de la mutación aumentaría el conocimiento sobre la distribución y dispersión de la
resistencia y ayudaría a diseñar la estrategia adecuada para su manejo. Nuestro objetivo fue poner
a punto un método sencillo para la detección de la mutación AChE G328A. El método de
diagnóstico seleccionado fue mediante PCR-RFLP, método empleado para la detección de alelos de
resistencia a insecticidas en otros insectos (Weill et al., 2004; Cassanelli et al., 2005, 2006; Hawkes
et al., 2005; Hsu et al., 2006). Sin embargo, la mutación puntual no generaba o modificaba un
sitio de restricción que diferenciase el alelo silvestre del mutado, por lo que no se pudo realizar una
PCR-RFLP convencional. En la detección de marcadores tumorales definidos por SNPs (del inglés
single-nucleotide polymorphism) se emplea asiduamente una técnica descrita en 1989 por
Haliassos y colaboradores en la que se modifica deliberadamente la secuencia de uno de los
cebadores empleados en la PCR para crear un sitio de restricción que permita la identificación de
los diferentes alelos. Esta técnica, denominada PIRA-PCR (del inglés primer-introduced restriction
analysis PCR) (Jacobson y Moskovits, 1991), ha sido empleada recientemente en la detección de
alelos que confieren resistencia a insecticidas en B. oleae, Anopheles gambiae y A. culicifacies
(Margaritopoulos et al., 2008; Janeira et al., 2008; Singh et al., 2009, 2010). Basándonos en la
secuencia conocida del exón 6 de la AChE (Magaña et al., 2008) y en la secuencia del intrón 5 del
gen que codifica para la acetilcolinesterasa que obtuvimos en este estudio, diseñamos una pareja
de cebadores que nos permite amplificar por PCR la región del gen Ccace2 que contiene la
mutación AChE G328A, realizando en uno de los cebadores la correspondiente modificación para
crear artificialmente un sitio de restricción. Así, este sistema PCR-RFLP nos permite detectar la
presencia del alelo mutado Ccace2R sin la necesidad de realizar bioensayos, tanto en insectos
134
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
adultos, como en larvas o pupas. Además, este método molecular nos permite detectar el alelo de
resistencia aun cuando se encuentre a baja frecuencia en la población, hecho que no lograríamos
mediante la realización de bioensayos de susceptibilidad. Se logró amplificar por PCR la región que
contiene la mutación puntual AChE G328A en todas las poblaciones analizadas (españolas y de
once países de cinco continentes), por lo que se valida el método de detección para la especie,
independientemente de la posible variabilidad alélica dependiente de la región geográfica.
Hasta la fecha sólo se han descrito poblaciones de C. capitata resistentes a malatión en
España, posiblemente debido al elevado número de tratamientos con malatión aplicados frente a
esta plaga en los campos españoles durante varios años (Magaña et al., 2007). Mediante el
método PCR-RFLP desarrollado hemos confirmado la presencia del alelo Ccace2R en prácticamente
la totalidad de las poblaciones españolas analizadas y su ausencia en las once poblaciones de C.
capitata recogidas en otros países. La elevada frecuencia de individuos que portaron el alelo
Ccace2R en determinadas poblaciones podría estar relacionada con el uso del malatión, ya que se
observa que las mayores frecuencias del alelo mutado se encuentran en la Comunidad Valenciana
y Cataluña, regiones que tradicionalmente han sufrido las mayores intensidades de tratamiento con
malatión para intentar disminuir los daños ocasionados por C. capitata en los cítricos y otros
frutales. El grado de expansión del alelo Ccace2R se muestra con la detección de individuos
heterocigotos para la mutación AChE G328A en el análisis de la población recogida en la finca
experimental del CSIC de La Mayora, situada en el municipio de Algarrobo-Costa (Málaga), a pesar
de que en esta finca no se aplican insecticidas dirigidos frente a la mosca mediterránea de la fruta.
Además, el alelo resistente se ha encontrado en poblaciones de las Islas Canarias y Baleares. El
resultado positivo obtenido en el análisis de los individuos procedentes de las trampas del
municipio de Sagunt (Valencia) demuestra que es posible la implementación del sistema de
detección PCR-RFLP en el sistema de monitoreo para el seguimiento de la abundancia de la plaga.
No obstante, a la hora de analizar con el método PCR-RFLP individuos recogidos en trampas
situadas en zonas donde se realizan sueltas masivas de machos estériles, sería conveniente
analizar exclusivamente hembras. La implementación del sistema de detección del alelo de
resistencia en el monitoreo de poblaciones permitirá conocer la frecuencia genotípica del alelo
Ccace2R en una determinada zona a lo largo de un periodo de tiempo y estudiar cómo varía dicha
frecuencia después de la aplicación de un insecticida, observando si ha sido eficaz el método de
control aplicado a esta plaga. Si se retomase la utilización del malatión o de otro organofosforado
para el control de C. capitata en España, sería conveniente realizar un seguimiento de la frecuencia
del alelo de resistencia Ccace2R en las poblaciones de campo.
Es importante destacar que, en algunas de las poblaciones de C. capitata que hemos
analizado, la frecuencia del alelo Ccace2R ha llegado a ser superior al 50%, valor que se considera
135
4. Determinación de la estructura de los genes ccace2 y ccae7 y desarrollo de sistemas de detección precoz de alelos de resistencia
______________________________________________________________________________________________________________________________________
elevado y que es habitual en las mutaciones relacionadas con la resistencia a piretroides en el
canal de sodio en mosquitos (Reimer et al., 2005; Santolamazza et al., 2008; Sarkar et al., 2009;
Kawada et al., 2011; Antonio-Nkondjio et al., 2011) y en la mutación A296S del receptor GABA en
poblaciones de Anopheles funestus (Wondji et al., 2011). En relación a los alelos de la
acetilcolinesterasa que confieren resistencia a insecticidas, únicamente se han descrito frecuencias
superiores al 50% en poblaciones de A. gambiae en Burkina Faso (Dabiré et al., 2009) y de B.
oleae en Grecia (Margaritopoulos et al., 2008). En otros estudios donde se ha estimado la
frecuencia de los alelos de resistencia en genes ace se han encontrado frecuencias más bajas,
como por ejemplo en H. irritans (Li et al., 2003), en varias especies del género Anopheles y Culex
(Reimer et al., 2005; Djogbénou et al., 2008; Santolamazza et al., 2008; Sarkar et al., 2009; Alou
et al., 2010; Verhaeghen et al., 2010; Kawada et al., 2011; Antonio-Nkondjio et al., 2011; Wondji
et al., 2011) y en poblaciones de B. oleae (Nardi et al., 2006).
Aunque el uso de malatión se prohibió desde el final de la campaña de 2008, actualmente
se ha incorporado de nuevo al anexo I de la Directiva Europea 91/414/ECC, permitiendo su empleo
en la Unión Europea pero, hasta el momento, no ha sido aprobado en España su uso específico
frente a C. capitata. El hecho de que la frecuencia del alelo Ccace2R sea tan elevada y que la
distribución geográfica de dicho alelo sea muy amplia, localizado en multitud de regiones de la
Península Ibérica, en las Islas Baleares y Canarias, desaconseja el empleo de cualquier tipo de
insecticida organofosforado o carbamato para el control químico de la mosca mediterránea de la
fruta en España si no va acompañado de un manejo de la resistencia adecuado.
De acuerdo con nuestro método de detección PCR-RFLP, la línea W-10Km está formada
únicamente por individuos heterocigotos para la mutación AChE G328A. De igual modo, durante el
proceso de selección de la línea W-4Km, se observó una disminución de los homocigotos para el
alelo de resistencia y un incremento del porcentaje de individuos heterocigotos (96% en la
generación F37). Lo esperable en una línea seleccionada es que los homocigotos susceptibles a la
selección tiendan a desaparecer, incrementándose así la proporción del alelo de resistencia con
respecto al susceptible. Además, según lo establecido por la herencia mendeliana clásica, la
existencia de una población formada únicamente por individuos heterocigotos para un determinado
gen con dos alelos es difícilmente explicable. Estas cuestiones, así como el estudio de la línea
altamente resistente a malatión W-10Km se discutirán en el siguiente capítulo de esta tesis.
136
Capítulo 5
NUEVO MECANISMO DE RESISTENCIA A
MALATIÓN EN Ceratitis capitata
137
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
5.1. Introducción.
La acetilcolinesterasa (AChE) es una enzima implicada en la sinapsis colinérgica durante la
transmisión del impulso nervioso (Fournier, 2005). Los insecticidas organofosforados y carbamatos
inhiben esta enzima mediante el bloqueo de su centro activo, por lo que cualquier modificación
estructural en la AChE que impida o dificulte la unión de los insecticidas a dicho centro activo
favorecerá la aparición de resistencia. Estas modificaciones en la AChE se producen debido a
mutaciones puntuales en el gen ace que codifica la AChE. Las mutaciones puntuales, situadas en el
centro activo de la enzima o en sus proximidades, crean impedimentos estéricos que dificultan la
entrada del insecticida en el centro activo de la AChE (Mutero et al., 1994; Walsh et al., 2001;
Oakeshott et al., 2005).
En Ceratitis capitata se ha relacionado la mutación puntual AChE G328A con la resistencia
al organofosforado malatión (Magaña et al., 2008). En el capítulo anterior hemos descrito un
sistema PCR-RFLP para la detección del alelo de resistencia Ccace2R que porta esta mutación.
Además, el análisis realizado en varias poblaciones de campo mediante un método PCR-RFLP
mostró que la distribución geográfica del alelo Ccace2R es amplia en todo el territorio español, sin
embargo, este alelo de resistencia no se detectó en otros países.
139
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
El análisis de la frecuencia del alelo Ccace2R en las líneas de laboratorio resistentes a
malatión W-4Km y W-10Km (seleccionadas con 4.000 ppm y 10.000 ppm de malatión,
respectivamente) mostró que se había producido un incremento en la frecuencia del alelo Ccace2R
con respecto al alelo silvestre Ccace2s a lo largo del proceso de selección. Además, conforme se
sucedieron las generaciones en las líneas resistentes a malatión, se observó un desequilibrio a
favor de los individuos heterocigotos para estos dos alelos. Así, según el método PCR-RFLP, el
análisis de los individuos de la línea W-10Km, realizado antes del tratamiento con malatión, mostró
que la totalidad de los individuos a partir de la generación F52 eran heterocigotos. Estos resultados
contradicen la segregación mendeliana esperada para un gen con dos alelos cuando se producen
apareamientos al azar en ausencia de selección (Griffiths et al., 2008), ya que en la descendencia
del
cruzamiento
de
individuos
heterocigotos
sería
esperable
observar
tanto
individuos
heterocigotos como individuos homocigotos para ambos alelos.
A principios de los años noventa se describieron los primeros casos en los que se
relacionaban las duplicaciones génicas con resistencia a insecticidas en varias especies de insectos
(Devonshire y Field, 1991). En las dos últimas décadas se ha incrementado el número de casos de
artrópodos en los que las duplicaciones producen un incremento en la síntesis de enzimas
relacionadas con la resistencia metabólica y con la resistencia mediada por modificaciones en la
molécula diana, sin embargo el número de estudios no supera la decena (Bass y Field, 2011).
Recientemente, en mosquitos, se han descrito varios casos de duplicaciones del gen que codifica la
acetilcolinesterasa (ace1, nomenclatura según Weill et al., 2002) relacionadas con resistencia a
organofosforados en Culex pipiens (Bourguet et al., 1996a, 1996b; Labbé et al., 2007a; Alout et
al., 2009; Ben Cheikh et al., 2009) y en Anopheles gambiae (Djogbénou et al., 2009).
Concretamente, en C. pipiens (Labbé et al., 2007a, 2007b) se han descrito dos eventos de
duplicación independientes en diferentes poblaciones del mosquito y que originan la presencia de
dos alelos del gen ace1, el mutado y el silvestre, en un mismo cromosoma. Esta duplicación génica
provocaría una heterocigosis permanente (Ccace2RS) (Labbé et al., 2007a). Hay que tener en
cuenta que la adquisición de la resistencia provocada por una mutación puntual en la AChE
conlleva un coste biológico asociado, ya que dicho gen codifica una AChE menos susceptible de ser
inhibida por el insecticida pero, al mismo tiempo, es menos eficiente a la hora de hidrolizar la
acetilcolina, sustrato indispensable para la transmisión del impulso nervioso. Se ha sugerido que en
los individuos que portan la duplicación anteriormente descrita se reduciría el coste biológico,
normalmente asociado a la presencia del alelo de resistencia, ya que el aumento del número de
copias del gen compensaría la menor eficiencia de la enzima mutada (Labbé et al., 2007a).
En este capítulo analizaremos la posible existencia de una duplicación del gen que codifica
la acetilcolinesterasa en C. capitata, similar a la encontrada anteriormente en el mosquito C.
140
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
pipiens (Labbé et al., 2007a). Esta duplicación, que porta en el mismo cromosoma el alelo silvestre
y el alelo de resistencia, representaría un nuevo mecanismo de resistencia a malatión en C.
capitata.
141
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
5.2. Material y métodos.
5.2.1. Líneas de laboratorio y cruzamientos.
En este estudio se emplearon individuos de la línea de laboratorio resistente a malatión W10Km y de la línea susceptible C (descritas en el apartado 2.2.2). Además, en los experimentos en
los que se indica, se utilizaron insectos de una isolínea (proveniente de una sola pareja), obtenida
a partir de la línea W-4Km, constituida por individuos homocigotos para el alelo Ccace2R y
denominada de aquí en adelante isolínea R/R.
En el experimento realizado para demostrar la existencia de una duplicación del gen
Ccace2 que provoca heterocigosis permanente (Labbé et al., 2007a), se analizó la descendencia
del cruzamiento de la línea susceptible C con la línea resistente a malatión W-10Km. En el interior
de unas cajas similares a las empleadas en los bioensayos de susceptibilidad a insecticidas (Fig.
2.2.3) se aislaron un macho y una hembra de ambas líneas. La puesta se recogió en un recipiente
inferior que contenía agua (Fig. 5.2.1) y posteriormente se prosiguió con el protocolo de cría
descrito en el apartado 2.2.1.1. Inicialmente se emplearon un total de veinte parejas, diez para
cada dirección del cruzamiento. Sólo algunas hembras iniciaron la puesta y, de éstas, solo algunas
pusieron huevos fértiles. Se seleccionaron para el experimento aquellas tres parejas en cada
143
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
dirección del cruzamiento con más de quince pupas en su descendencia, seis parejas en total. Los
doce individuos parentales que formaban las parejas seleccionadas se genotiparon mediante el
sistema de PCR-RFLP descrito en el capítulo anterior (apartado 4.2.3) para comprobar que los
cruces se habían realizado conforme a lo esperado; es decir, que los individuos de la línea C
presentaban un perfil de restricción homocigoto para el alelo silvestre y que los individuos de W10Km eran heterocigotos. Con el objeto de determinar si los dos alelos segregaban según la
herencia mendeliana clásica se genotiparon, además de los parentales, un total de ochenta
individuos de la descendencia. De cada una de las seis parejas se seleccionaron al azar entre diez
y quince individuos, lo que representaba entre un 40% y un 100% de la descendencia de cada
pareja.
a
b
c
Figura 5.2.1. Cajas para los cruzamientos. (a) Sistema de cajas empleado para la
obtención de isolíneas y de cruzamientos dirigidos. (b) Los huevos se recogieron en el recipiente
inferior, que contenía agua. (c) Detalle de los huevos depositados por la hembra a través de la
rejilla
Además, se realizaron otros cruzamientos entre las líneas de laboratorio W-10Km, C y la
isolínea R/R pero, en estos casos, la mezcla de líneas se llevó a cabo introduciendo en dos jaulas
de cría 25 machos de una línea con 25 hembras de la otra en ambas direcciones de cruzamiento.
La puesta de las dos jaulas se recogió y se mantuvo según el protocolo de cría en laboratorio
descrito en el apartado 2.2.1.1.
144
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
5.2.2. Evaluación del número de copias del gen Ccace2.
Con el objeto de identificar la presencia de una duplicación del gen que codifica la
acetilcolinesterasa en la línea resistente W-10Km se evaluó el número de copias de Ccace2,
mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), tomando como molde DNA genómico. Se
utilizaron como genes de referencia para la qPCR el gen que codifica la superóxidodismutasa (sod,
ref. Genbank L35494) y el gen de la proteína ribosomal P0 (Ccpo, ref. GenBank Y18444).
La qPCR se realizó en un termociclador Rotor Gene 6000 Corbett Life Science (Qiagen,
Foster City, California, EE.UU.) tomando como molde 1 ng de DNA genómico. La reacción de PCR
contenía 7,5 µl de Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green qPCR MasterMix (Agilent Technologies,
California, EE.UU.), 1,25 µl de cada cebador 3,6 µM, para un volumen total de reacción de 15 µl. El
ciclo de amplificación para todos los genes fue el siguiente: inicialmente 95ºC durante 10 min para
desnaturalizar el DNA y a continuación se realizó cuarenta veces el ciclo 95ºC 20s, 58ºC 20s y
72ºC 20s. Las características de los cebadores empleados y su eficiencia se muestran en las tablas
5.2.1 y 5.2.2.
Tabla 5.2.1. Cebadores empleados en la determinación del número de copias
de Ccace2 y en la estimación de su expresión. Se muestra el nombre del cebador, su
tamaño en bases (b) y su secuencia nucleotídica. El tamaño del amplicón originado en la qPCR por
la pareja de cebadores directo (F) y reverso (R), se indica en pares de bases (pb).
Gen
Cebador
b
Secuencia (5’
Ccace2
FAChE4qPCR
20
GAAATCCGCAAAACACCACA
RAChE4qPCR
18
CGGTCATAAAGCCACCAC
FP0_2
20
TCCAGGCTCTCTCCATACCA
RP0
20
CGACTTTGTCACCAGGCTTC
FSOD
20
TCCCGTAGTGAAGGGTAATG
RSOD
19
CGGTGTCAAGCCAGTCAAA
Ccp0
Sod
3’)
Amplicón (pb)
69
90
88
_______________________________________________________________________________________
Inicialmente se comparó el número de copias de Ccace2 presente en los individuos de la
línea susceptible C con los de la línea resistente a malatión W-10km, analizando seis individuos de
cada una de ellas. En experimentos posteriores, siguiendo el mismo procedimiento, se analizaron
entre cuatro y seis individuos de los cuatro posibles genotipos restantes para Ccace2, obtenidos de
los descendientes del cruce de las líneas de laboratorio W-10Km, C y de la isolínea R/R. Finalmente
145
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
se estudiaron varios individuos de dos poblaciones de campo analizadas mediante el método PCRRFLP en el capítulo anterior (Tabla 4.3.2): Orihuela (Alicante) y Alcanar (Tarragona).
Tabla 5.2.2. Eficiencia de los cebadores empleados en la determinación del
número de copias de Ccace2 y en la estimación de su expresión. Se indica el
coeficiente de determinación de la recta patrón de amplificación (R2) y el porcentaje de eficiencia
de la pareja de cebadores, según el molde empleado en la qPCR.
2
Gen
Molde
R
Ccace2
DNA
0,999
113
cDNA
0,996
117
DNA
0,995
116
cDNA
0,999
101
DNA
0,998
113
Ccp0
Sod
Eficiencia (%)
El número de copias en el genoma de cada gen se calculó siguiendo el método de ∆Ct
(Pfaffl, 2001), realizando la media aritmética de la cantidad de copias estimada para los individuos
de cada línea. La cantidad de copias obtenida para el gen Ccace2 se normalizó con respecto a la
cantidad de copias del gen Ccp0 y del gen sod. Con el programa SPSS v17.0 se realizó un test de
la t de Student o un ANOVA, según corresponda, para comparar la cantidad de copias del gen
Ccace2 presentes en los diferentes grupos de insectos.
5.2.3. Cuantificación de la expresión de Ccace2.
Con el objetivo de cuantificar la expresión del gen Ccace2 en la línea resistente a malatión
W-10Km y en la línea susceptible C, se evaluaron los niveles de expresión de Ccace2 mediante
qPCR, tomando como referencia la expresión del gen Ccp0, que codifica la proteína ribosomal P0.
En cada línea se analizaron un total de treinta individuos adultos, de entre tres y cinco días de
edad, divididos en cinco grupos de seis insectos, conteniendo cada uno de los grupos tres machos
y tres hembras de cada línea. El análisis de expresión se realizó a partir del tórax y del abdomen,
mientras que las cabezas fueron almacenadas a -80ºC para su utilización en los ensayos de
actividad enzimática (ver más adelante). El RNA total (RNAT) de cada grupo de individuos se
146
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
extrajo mediante TRIzol® Reagent (Life Technologies, Van Allen Way, Carlsbad, California, EE.UU.)
siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración del RNAT se midió con un NanoDrop
(Thermo Scientific, Massachusetts, EE.UU.). La primera cadena de cDNA se sintetizó a partir de 1
µg de RNAT utilizando iScript cDNA Syntesis Kit (Bio-Rad Laboratories, California, EE.UU.) siguiendo
las instrucciones del fabricante. La reacción de amplificación a tiempo real se realizó en un
termociclador con detector continuo de fluorescencia Rotor Gene 6000 Corbett Life Science
(Qiagen, Foster City, California, EE.UU.) con los cebadores descritos en la tabla 5.2.1. La mezcla de
la reacción de PCR (15 µl) contenía 7,5 µl de Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green qPCR MasterMix
(Agilent Technologies, California, EE.UU.), 1,25 µl de cada cebador 3,6 µM y aproximadamente 8
ng de cDNA. El ciclo de amplificación fue el siguiente: inicialmente 95ºC durante 10 min para
desnaturalizar el cDNA y a continuación se realizó cuarenta veces el ciclo 95ºC 20 s, 58ºC 20s y
72ºC 20s. La expresión de ambos genes se estimó siguiendo el método de ∆Ct (Pfaffl, 2001),
normalizando la expresión de Ccace2 con la expresión del gen Ccp0. El valor final de la expresión
de Ccace2 en cada línea se calculó realizando la media aritmética de las expresiones obtenidas en
los cinco grupos de individuos. Finalmente se realizó un test t de Student con el programa SPSS
v17.0 para comparar la expresión del gen Ccace2 en las líneas de laboratorio C y W-10Km.
5.2.4. Análisis de la actividad AChE y su inhibición por
malaoxón.
Se estimó la actividad AChE en la línea resistente a malatión W-10Km y en la línea
susceptible C empleando para ello las cabezas de los individuos en los que previamente se había
analizado la expresión del gen Ccace2. Cada uno de los cinco grupos de seis cabezas (tres de
machos y tres de hembras) se disgregaron en 900 µl de una disolución de homogeneización
(tampón fosfato Na 0,1M pH 7, 1% Tritón X-100 v/v). La suspensión proteica se centrifugó a 4ºC
durante 10 min a 20.000 g en una centrífuga Universal 32 R (Hettich, Massachusetts, EE.UU.). El
homogeneizado empleado en los ensayos enzimáticos se correspondió con la fase superior
sobrenadante después de la centrifugación. La cantidad total de proteína en el homogeneizado se
calculó según el método de Bradford (1976), utilizando como proteína estándar albúmina de suero
bovino (Sigma Chemical Co., Missouri, EE.UU.). Las diluciones seriadas del estándar se prepararon
en el mismo tipo de disolución en la que las muestras fueron homogeneizadas (Friednauer y
Berlet, 1989). La actividad AChE se evaluó por el método espectrofotométrico descrito por Ellman
et al. (1961). Se realizaron tres réplicas experimentales de cada medida de absorbancia de los
147
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
homogeneizados y se compararon con los pocillos sin muestra (blancos). Los 100 µl de mezcla de
reacción en tampón fosfato pH 7 contenían 5 µl de homogeneizado, ATChI 2mM (acetiltiocolina
yodada, Sigma Chemical Co., Missouri, EE.UU.) y DTNB 1 mM (5,5 ditio-bis-(ácido 2nitrobenzoico)), Sigma Chemical Co., Missouri, EE.UU.). El incremento de absorbancia se midió a
30ºC durante 5 minutos a una longitud de onda de 412 nm. La actividad AChE medida en
mOD/min se convirtió a nanomoles de acetilcolina hidrolizada por minuto y por miligramo de
proteína empleando el coeficiente de extinción de producto de Ellman (ε412= 1,36·104 M-1 cm-1)
(Ellman, 1959).
En los ensayos de inhibición de la actividad AChE se emplearon los mismos
homogeneizados de cabeza de las líneas de laboratorio C y W-10Km que en la medición de la
propia actividad enzimática. El agente inhibidor de la actividad AChE empleado fue el malaoxón
Pestanal® al 94% (Ref. 36142, Riedel de Haën, Seelze, Alemania), diluido en etanol absoluto
(Merck, Darmstadt, Alemania). Los homogeneizados de cabezas de ambas líneas se incubaron en
las siguientes concentraciones de malaoxón: 3·10-5 M, 1·10-5 M, 3·10-6 M, 1·10-6 M, 3·10-7 M.
Además, en el análisis del homogeneizado de la línea W-10Km se evaluó una concentración
adicional de inhibidor de 1·10-4 M. Se analizó la variación de la actividad AChE en cada una de las
concentraciones a los 10, 20, 30, 40 y 50 segundos, deteniendo la reacción mediante la adición de
sustrato (ATChI) en exceso. Se realizaron tres réplicas experimentales de cada una de las
concentraciones de malaoxón evaluadas y se midió la actividad AChE tal y como se describe en el
párrafo anterior. La constante de inhibición (Ki) para los homogeneizados de las dos líneas de
laboratorio analizadas se calculó siguiendo la metodología propuesta por Main (1964).
5.2.5. Caracterización de los perfiles RFLP.
El método PCR-RFLP con la enzima Bst NI para la detección de la mutación AChE G328A
(apartado 4.2.3) se empleó en el presente capítulo para genotipar tanto los individuos parentales
como la descendencia de los diferentes cruzamientos realizados (ver apartado 5.2.1). Además, se
realizó una caracterización de los patrones de restricción obtenidos mediante el sistema de
documentación de geles Gel Doc XR (Bio-Rad Laboratories, California, EE.UU.) y con el programa
Quantity One® v4.6.5 (Bio-Rad Laboratories, California, EE.UU.). Este programa analiza las
imágenes de los geles y cuantifica la intensidad de las dos bandas, asignándole a cada una de ellas
un porcentaje de intensidad en tanto por uno. Esta caracterización del perfil de restricción se
realizó con el objetivo de, teniendo en cuenta la posible existencia de la duplicación, asociar un
148
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
determinado patrón RFLP con un determinado genotipo. Se analizaron individuos de las líneas de
laboratorio C y W-10Km, e insectos de tres poblaciones de campo recogidas en los municipios de
Les Coves de Vinromà (Castellón), Amposta y Tortosa (Tarragona) (Tabla 4.2.5).
5.2.6.
Análisis
de
la
mutación
AChE
G328A
mediante
secuenciación.
Con la finalidad de asociar un patrón de secuenciación a cada uno de los genotipos
posibles para Ccace2, asumiendo la existencia de la duplicación cromosómica, se analizaron los
cromatogramas de aquellos individuos portadores de la duplicación tanto en homocigosis
(Ccace2RS/RS) como en heterocigosis (Ccace2RS/R, Ccace2RS/S). Además, se estudiaron individuos de
la línea susceptible C (Ccace2S/S) y la F1 del cruce de la línea C con la isolínea R/R, cuyo genotipo
esperado sería Ccace2R/S.
En primer lugar, se realizó la amplificación por PCR del fragmento de DNA que contiene el
sitio puntual en el que se localiza la mutación AChE G328A. El amplicón se obtuvo empleando los
cebadores FG328A_27 y RiAChE_CcE60, tal y como se describe en el apartado 4.2.3. En segundo
lugar, los productos de PCR fueron enviados a Secugen S. L. (Madrid) donde se analizaron en un
secuenciador automático ABI PRISM 377 (Applied Biosystems, California, EE.UU.), utilizando el
cebador reverso RiAChE_CcE60 en la reacción de secuenciación. Los cromatogramas se
visualizaron con el programa Chromas 1.45 (Griffith University, Queensland, Australia).
5.2.7. Método PCR-RFLP para la detección de la duplicación
Ccace2RS.
En el capítulo anterior se describió el diseño de un método PCR-RFLP para la detección de
la mutación que confiere resistencia a malatión en C. capitata mediante el corte con la enzima Bst
NI de la secuencia correspondiente al alelo silvestre (apartado 4.2.3). Además, en el análisis de los
perfiles de restricción de determinados individuos heterocigotos para la mutación AChE G328A se
observó que existían distintas intensidades en las bandas originas en el RFLP (ejemplo, calles 1 y 2
149
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
de la figura 4.3.4.B), hecho que podría estar relacionado con la presencia de la duplicación. Con el
fin de diseñar un sistema de detección de la duplicación, se incorporó una segunda reacción al
método PCR-RFLP (apartado 4.2.3) que detectaba, en este caso, el alelo que confiere resistencia a
malatión. Para ello, se diseñó un nuevo cebador directo FG328A_27TseI (5’-TCA ACA TGT TTT TCA
TTT TCG TTG CAG-3’), localizado en la misma posición que el cebador FG328A_27 descrito en el
apartado 4.2.3. Este cebador posee una modificación en su extremo 3’ que produce una diana de
restricción para la enzima Ape KI (New England Biolabs, Massachusetts, EE.UU.) en el producto
amplificado cuando existe la mutación AChE G328A. El resultado teórico esperado del RFLP se
muestra en el esquema de la figura 5.2.2.
Ape KI
Bst NI
PCR-RFLP
PCR
PCR-RFLP
PCR
172 pb
145 pb
SS
RS
RR
Fenotipo Ccace2
27 pb
(liberación del
SS
RS
RR
cebador)
Fenotipo Ccace2
Figura 5.2.2. Representación esquemática del método PCR-RFLP para la
detección de la duplicación génica de Ccace2 en C. capitata. (Izquierda) Perfil de
restricción esperado en la nueva reacción de restricción con la enzima Ape KI que produce la
liberación del cebador en presencia del alelo R (Ccace2R). (Derecha) Recordatorio del corte
producido por la enzima Bst NI (apartado 4.2.3).
La reacción de PCR se realizó en un termociclador Gene Amp® PCR System 2700 (Applied
Biosystem, Foster City, EE.UU.) con 2 unidades de la enzima polimerasa Amplitaq Gold® (Roche
Molecular Systems, Inc., New Jersey, EE.UU.) a partir de un molde de 30 ng de DNA, empleando
los cebadores FG328A_27TseI y RiAChEE_CcE60 en un volumen final de 10 µl de reacción. El ciclo
de la reacción de PCR fue el siguiente: 95ºC 10 min, seguidos de un ciclo de 95ºC 30s, 48ºC 30s,
72ºC 15s que se repitió cuarenta veces, finalizando con un periodo de 72ºC durante 7 min. Una
vez concluida la reacción, al producto de PCR se añadió una mezcla de restricción de 2 µl que
contenía 0,05 unidades de la enzima de restricción Ape KI con el buffer NE3 recomendado por el
150
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
fabricante. La mezcla de producto de PCR y enzima de restricción se incubó durante 2 horas a
75ºC en el mismo termociclador empleado para la PCR. La migración electroforética del producto
de restricción se realizó en un gel de agarosa al 3% en TAE 1X (Tris 40mM, EDTA 1mM pH 8.0). La
composición del gel fue de 50% agarosa D-2 (Lab. Conda, Torrejón de Ardoz, Madrid, España) y
50% de NuSieve® GTG® Agarose (Lonza, Maine, EE.UU).
La comparación de los perfiles de PCR-RFLP obtenidos utilizando, bien los cebadores
FG328A_27 / RiAChEE_CcE60 en combinación con la enzima Ape KI (corta en ausencia de la
mutación, descrito en apartado 4.2.3), bien los cebadores FG328A_27TseI / RiAChEE_CcE60 en
combinación con la enzima Bst NI (corta en presencia de la mutación, descrito en este apartado),
nos permitirá identificar la duplicación cuando se encuentre en uno de los dos cromosomas de un
individuo.
5.2.8. Estimación del tiempo de desarrollo, porcentaje de
emergencia y supervivencia de los adultos pertenecientes a
las líneas C y W-10Km.
En jaulas de cría independientes se depositaron pupas de la línea C (susceptible) y W10Km (resistente a malatión). Transcurridos 5-7 días desde la emergencia del primer adulto, previa
eliminación de los huevos puestos con anterioridad, se recogieron de ambas jaulas los huevos
depositados por las hembras durante 24 horas. Las puestas se sembraron en dieta y se
mantuvieron en las condiciones de cría descritas en el apartado 2.2.1.1. Se consideró como tiempo
cero experimental el momento en el que se realizó la siembra de los huevos. Se observó
diariamente el estadio de desarrollo (larva, pupa o adulto) de los individuos de cada línea desde el
momento de la puesta hasta la emergencia de los adultos y se calculó el día en el que el 100% de
las larvas habían pupado. Para analizar el porcentaje de emergencia y el día de emergencia, del
total de pupas obtenidas para cada línea, se seleccionaron al azar cien (entre los individuos que
puparon en un intervalo de 4 días) y se anotó diariamente el número de adultos que emergieron
en cada línea. Además, se analizó la supervivencia de los adultos emergidos a partir de esas cien
pupas, anotando diariamente durante un periodo de quince días el número de insectos vivos de
cada una de las líneas de laboratorio. Se realizaron tres réplicas experimentales no simultáneas de
cada uno de los experimentos.
151
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
5.3. Resultados.
En el capítulo anterior se observó que, según el perfil de restricción obtenido mediante el
método PCR-FLP (ver apartado 4.3.6), la línea de laboratorio resistente a malatión W-10Km estaba
formada únicamente por individuos heterocigotos para la mutación AChE G328A. Una posible
explicación para este resultado sería la existencia de una duplicación génica en homocigosis
(Ccace2RS/RS) en los individuos de esta línea W-10Km, que provocaría la presencia del alelo
silvestre (Ccace2S) y del mutado (Ccace2R) en las dos copias de un mismo cromosoma. A
continuación se muestran los resultados de las diferentes aproximaciones realizadas en este
capítulo para corroborar la existencia de esta duplicación tanto en líneas seleccionadas en el
laboratorio como en poblaciones de campo de C. capitata.
5.3.1. Cruzamientos y descendencia de las líneas C y W-10Km.
Para corroborar la hipótesis de la duplicación del gen Ccace2 se realizaron cruzamientos
entre individuos de la línea resistente a malatión W-10Km con individuos de la línea susceptible C.
Se genotiparon, mediante el sistema PCR-RFLP descrito en el capítulo anterior (apartado 4.2.3),
153
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
tanto los parentales como la descendencia de un total de 6 parejas, 3 parejas por dirección de
cruzamiento. Según lo esperado, los seis parentales de la línea resistente W-10Km presentaron un
perfil heterocigoto para la mutación AChE G328A (doble banda), mientras que los insectos
parentales de la línea C mostraron un perfil asociado a la presencia del alelo silvestre en
homocigosis. Los ochenta insectos analizados de la F1 de los cruzamientos de ambas líneas
presentaron un perfil de restricción correspondiente a individuos heterocigotos para la mutación
AChE G328A (Fig. 5.3.1). La ausencia de descendientes homocigotos para el alelo silvestre, tal
como cabría esperar según la herencia mendeliana y en ausencia de selección, es compatible con
la hipótesis de la duplicación génica. Así, los individuos de la F1 portarían en un cromosoma la
duplicación génica (Ccace2RS) proveniente del parental W-10Km (homocigoto estructural para la
duplicación) y, en el otro cromosoma, portarían el alelo silvestre proveniente de la línea C, con lo
que su genotipo sería Ccace2RS/S.
Resultado esperado
(herencia mendeliana)
Resultado observado
línea C
línea W-10Km
línea C
línea W-10Km
SS
RS
SS
RS
X
P:
50%
SS
X
50%
RS
100% RS
F1:
Figura 5.3.1. Resultado esperado y observado en el cruzamiento de las líneas C
y W-10Km. Perfiles de restricción esperados y observados en el análisis de la mutación AChE
G328A mediante el método PCR-RFLP para la detección del alelo CCace2R en los individuos
parentales (P) de la línea C y de la línea W-10Km, y en su descendencia (F1).
154
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
5.3.2. Determinación del número de copias del gen Ccace2.
Con el objetivo de determinar si existía una duplicación del gen Ccace2 en los individuos
de la línea W-10Km se estimó el número de copias de este gen mediante qPCR sobre DNA
genómico. El resultado se comparó con el análisis realizado en los individuos de la línea susceptible
de laboratorio C, utilizando los genes Ccp0 y sod como genes de referencia. En la figura 5.3.2 se
observa como los individuos de la línea W-10Km presentaron en su genoma doble número de
copias del gen Ccace2 respecto a los individuos de la línea C. Este resultado apoya la hipótesis de
la existencia de una duplicación del gen que codifica la acetilcolinesterasa en C. capitata.
Nº relativo de copias de Ccace2
2,5
b
Ccp0
b
sod
2
1,5
a
a
1
0,5
0
C
W-10Km
Figura 5.3.2. Cuantificación del número de copias del gen Ccace2 en dos líneas
de laboratorio de C. capitata. Se muestra la cantidad relativa del gen Ccace2 en la línea
susceptible C y la línea resistente al malatión W-10Km tomando DNA genómico como molde de la
qPCR, con respecto al número de copias de los genes Ccp0 y sod. Las distintas letras muestran
diferencias significativas según un ANOVA con test post hoc de Tukey (p<0,05). Las barras de
error representan la desviación estándar de la media.
No se observaron diferencias significativas en el análisis del número de copias de Ccace2
en las líneas C y W-10Km en función del gen de referencia empleado (Figura 5.3.2.), por lo que en
las siguientes estimaciones del número de copias de Ccace2 únicamente se empleó como
referencia el gen Ccp0.
155
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
5.3.3. Cuantificación de la expresión de Ccace2.
Para evaluar la funcionalidad de la duplicación del gen Ccace2 detectada en el genoma de
los individuos de la línea W-10Km se estudió la expresión de Ccace2 mediante qPCR. Se analizaron
cinco grupos de seis individuos de las líneas C y W-10Km, formado cada grupo por tres machos y
tres hembras. La extracción de RNA se realizó a partir del tórax y el abdomen, empleando la
cabeza para estimar la actividad AChE (ver apartado siguiente). Como se puede observar en la
figura 5.3.3, la expresión relativa de Ccace2 fue el doble en la línea W-10Km, en comparación con
la de la línea susceptible C.
3
Expresión relativa de Ccace2
b
2,5
2
1,5
a
1
0,5
0
C
W-10Km
Figura 5.3.3. Cuantificación de la expresión de Ccace2 en las líneas de
laboratorio C y W-10Km. Las distintas letras muestran diferencias significativas según el test
t de Student (p<0,05). Las barras de error representan el error estándar de la media.
5.3.4. Actividad AChE e inhibición por malaoxón.
Una vez comprobado que la duplicación detectada en la línea W-10Km estaba acompañada
de una mayor expresión de Ccace2 en esta línea resistente a malatión en comparación con la línea
susceptible C, nos planteamos si este incremento en la expresión se vería reflejado en un aumento
en la actividad enzimática. Con el objeto de comparar la actividad enzimática AChE y su inhibición
por malaoxón en las líneas C y W-10Km, se analizaron los homogeneizados de las cabezas de los
156
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
grupos de insectos empleados en el estudio de la expresión de Ccace2. La actividad específica
AChE en los grupos de insectos de la línea susceptible C varió entre 0,36 y 0,42 µmol·min-1·mg
prot-1. Sin embargo, en los grupos de insectos de la línea W-10Km, la actividad específica AChE
varió entre 0,45 y 0,55 µmol·min-1·mg prot.-1 (Tabla 5.3.1), siendo ésta un 30% mayor (p<0,001)
que la actividad AChE estimada en los individuos de la línea susceptible C, línea que no portaban la
mutación AChE G328A en el gen Ccace2.
Tabla 5.3.1. Actividad AChE e inhibición por malaoxón en las líneas de
laboratorio C y W-10Km. Se muestran los valores medios de actividad AChE y de la
constante de inhibición (Ki) con su error estándar de la media (EE). Se indican las diferencias
significativas con respecto a la línea susceptible C al realizar el test t de Student (* p<0,05, **
p<0,001).
Actividad AChE ± EE
Ki ± EE
-1
(M-1·min-1)
-1
(µmol·min ·mg prot )
Línea C (Ccace2S/S)
0,38 ± 0,01
2,09·106 ± 2,1·105
Línea W-10Km (Ccace2RS/RS)
0,49 ± 0,01 **
1,36·106 ± 1,4·105 *
La inhibición de la actividad enzimática AChE mediada por malaoxón se estimó mediante el
cálculo de la constante de inhibición (Ki) en los mismos grupos de individuos. Cuanto mayor sea el
valor de la Ki mayor será la afinidad del inhibidor por la enzima inhibida. Como se puede observar
en la tabla 5.3.1, la Ki media calculada para los individuos de la línea susceptible C fue de 2,09·106
M-1·min-1, mientras que la Ki media de los individuos de la línea resistente W-10Km fue
significativamente menor: 1,36·106 M-1·min-1 (p<0,05). Estos resultados demuestran que la línea
W-10Km mantiene la insensibilidad frente al malaoxón sin que se vea reducida la actividad AChE,
lo que indica que la duplicación observada al analizar el número de copias de Ccace2 no está
originada por un pseudogen.
157
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
5.3.5. Caracterización del perfil RFLP de los individuos con
fenotipo heterocigoto para la mutación AChE G328A.
En el capítulo anterior se diseñó un sistema PCR-RFLP que reconocía la presencia del alelo
de resistencia Ccace2R, identificando aquellos individuos homocigotos y heterocigotos para la
mutación AChE G328A. En el análisis de la F52 de la línea W-10Km mediante este sistema se
observó que la totalidad de los individuos poseían el mismo perfil RFLP, consistente en una banda
superior más intensa que la inferior, fenotipo RFLP asociado a los individuos heterocigotos para la
mutación AChE G328A (Fig. 5.3.1). Además, en el análisis de las poblaciones de campo se
observaron hasta tres perfiles RFLP heterocigotos distintos en función de la intensidad relativa de
las dos bandas originadas (Fig. 5.3.4).
A
B
B
C
C
B
172 pb
145 pb
Figura 5.3.4. Perfiles RFLP asociados a los individuos heterocigotos para AChE
G328A. Se pueden observar las diferentes intensidades de las bandas (A, B, C) existentes en el
patrón de restricción obtenido con la enzima Bst NI.
En primer lugar, con el fin de asociar un perfil RFLP con la enzima Bst NI a cada uno de los
cuatro genotipos que poseen el alelo de resistencia (Ccace2R/S, Ccace2RS/RS, Ccace2RS/S, Ccace2RS/R),
elaboramos un modelo teórico de lo que ocurriría durante la PCR y el RFLP para cada uno de los
cuatro genotipos. Así, en el amplicón obtenido tras la PCR habría tres posibles tipos de moléculas
(Fig. 5.3.5):
1) moléculas de DNA con complementariedad perfecta y correspondientes al alelo Ccace2S, que
serían cortadas por la enzima Bst NI.
2) moléculas de DNA con complementariedad perfecta y correspondientes al alelo Ccace2R, que no
serían cortadas por la enzima Bst NI.
3) moléculas heterodúplex, que no serían cortadas por Bst NI debido a que en el sitio de corte
existiría un fallo en la complementariedad de bases.
158
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Bst NI
DIANA:
5’-ttccagGCACTTA-3’ cadena S
3’-aaggtcCGTGAAT-5’ cadena S
5’-ttccagCCACTTA-3’ cadena R
3’-aaggtcGGTGAAT-5’ cadena R
N
O
5’-ttccagGCACTTA-3’ cadena S
3’-aaggtcGGTGAAT-5’ cadena R
5’-ttccagCCACTTA-3’ cadena R
3’-aaggtcCGTGAAT-5’ cadena S
C
O
R
T
E
Figura 5.3.5. Modelo teórico de PCR-RFLP para los individuos portadores del
alelo de resistencia Ccace2R. Se muestran las cuatro combinaciones de DNA de doble
cadena que se generarían tras la PCR en los individuos con genotipo Ccace2R/S, Ccace2RS/RS,
Ccace2RS/R o Ccace2RS/S. Las cadenas S poseen el alelo silvestre (Ccace2S) y las R el de resistencia
(Ccace2R). En amarillo se indica el sitio de la mutación puntual AChE G328A. Los triángulos negros
muestran el punto de corte de la enzima Bst NI. Sólo serán cortadas aquellas moléculas de DNA
con dos puntos de corte.
Al realizar el RFLP del amplicón con la enzima Bst NI, sólo aquellas moléculas de DNA con
la doble cadena S serían cortadas por la enzima, mientas que tanto los heterodúplex (cadena Rcadena S y viceversa), como las moléculas de DNA formadas por dos cadenas R permanecerían
intactas. Por otro lado, la posible existencia de la duplicación génica, que provoca la presencia de
los alelos Ccace2S y Ccace2R en un mismo cromosoma, daría lugar a un cambio en la proporción de
los alelos, lo que repercutiría en la intensidad de las dos bandas originadas después del RFLP.
En segundo lugar, teniendo en cuenta el razonamiento anterior y la relación existente
entre los alelos silvestre y de resistencia, estimamos la proporción de las dos bandas del RFLP
mediante un cuadro de Punnett (Fig. 5.3.6). Según nuestra estimación, el RFLP teórico de los
individuos con genotipo Ccace2RS/R generaría una banda superior de 0,89 y una banda inferior de
0,11. Los individuos Ccace2RS/S mostrarían una banda superior de 0,55 y una inferior de 0,45. En el
caso de los genotipos Ccace2R/S y Ccace2RS/RS la cantidad de alelos es proporcional, con lo que no
se podrían diferenciar mediante este método los individuos con estos genotipos, mostrando ambos
una banda superior de 0,75 y una inferior de 0,25 (Fig. 5.3.6).
159
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
RS/RS ó R/S
RS/R
Genotipo:
Alelos
Alelos
RR(2/3)
(2/3)
SS(1/3)
(1/3)
PCR-RFLP
teórico:
RR(2/3)
(2/3)
0,45
0,45
0,22
0,22
SS(1/3)
(1/3)
0,22
0,22
0,11
0,11
Alelos
Alelos
RR(1/2)
(1/2)
SS (1/2)
(1/2)
RR(1/2)
SS (1/2)
(1/2)
(1/2)
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25 0,25
0,25
RS/S
Alelos
Alelos
R
R (1/3)
(1/3)
SS (2/3)
(2/3)
R
(2/3)
R (1/3)
SS (2/3)
(1/3)
0,11
0,22
0,11
0,22
0,22
0,22 0,45
0,45
Figura 5.3.6. Caracterización matemática de los perfiles de restricción
heterocigotos para la mutación AChE G328A con Bst NI. En los genotipos, S
representa el alelo Ccace2S, R es el alelo Ccace2R y RS representa la duplicación Ccace2RS. En el
PCR-RFLP teórico se muestran, en tanto por uno, la proporción de cadenas que teóricamente se
producirían durante la PCR en función de la cantidad inicial de los alelos, señalada entre
paréntesis. En cada caso, sólo se cortarían con la enzima Bst NI las moléculas de doble cadena SS, resaltadas en gris en las tablas.
Tomando como referencia los perfiles RFLP teóricos para los diferentes genotipos
estimados en la figura 5.3.6, realizamos la cuantificación de las bandas de los perfiles RFLP de los
individuos heterocigotos para la mutación AChE G328A con la enzima Bst NI en la línea de
laboratorio resistente a malatión W-10Km (n=30) y en tres poblaciones recogidas en campo:
Amposta (n=12), Les Coves de Vinromà (n=14) y Tortosa (n=11). Las intensidades de las bandas
superior e inferior del perfil RFLP de cada individuo se representaron, en tanto por uno, en unos
ejes de coordenadas en los que además se mostraron los valores teóricos estimados para cada
1,0
SUP
SUP
genotipo (Fig. 5.3.7).
W-10Km
1,0
0,9
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
0,6
0,0
0,5
῀
0,0
0,0
0,5
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
AMP
῀
0,0
0,1
0,2
0,3
Figura 5.3.7. Cuantificación
de
los
perfiles RFLP
heterocigotos para AChE
G328A. Se representa en
0,4
1,0
COV
1,0
TOR
0,9
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
0,6
0,0
0,5
῀
0,0
0,0
0,5
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,5
INF
SUP
SUP
INF
῀
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
INF
INF
160
ordenadas la intensidad de la
banda superior (SUP) y en
abscisas la de la banda inferior
(INF), en tanto por uno. Cada
punto negro representa un
individuo. El punto azul indica el
valor teórico de un genotipo
Ccace2RS/R, el punto rojo de un
genotipo Ccace2RS/RS o Ccace2R/S,
y el punto verde de un genotipo
Ccace2RS/S. Se analizó la línea W10Km y las poblaciones de
Amposta (AMP), Les Coves de
Vinromà (COV) y Tortosa (TOR).
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
En el análisis de las intensidades de las bandas del perfil RFLP observamos que todos los
individuos de la línea W-10Km, homocigotos estructurales para la duplicación (genotipo
Ccace2RS/RS), se situaron próximos al punto de color rojo que indica ese genotipo teórico. Por otro
lado, en las poblaciones de Amposta (AMP) y Tortosa (TOR), los individuos se separaron en tres
grupos: un grupo central próximo al punto rojo, de distribución similar a la observada en W-10Km
y cuyo genotipo no se podría definir mediante el RFLP (podría ser Ccace2RS/RS o Ccace2R/S), un
segundo grupo, próximo al punto azul, que tendría genotipo Ccace2RS/R y por último, un grupo
próximo al punto verde que tendría genotipo Ccace2RS/S. Sin embargo, en la población recogida en
Les Coves de Vinromà (COV) el agrupamiento no fue tan evidente, por lo que a algunos individuos
no se les pudo asignar un genotipo (Tabla 5.3.2).
Tabla 5.3.2. Asignación de genotipos para Ccace2 en función de la
caracterización de los perfiles RFLP. Se indica el número de individuos de cada genotipo
en las diferentes poblaciones. (nd) Indica que no se pudo determinar el genotipo.
Genotipo
W-10Km
Amposta
Les Coves de Vinromà
Tortosa
RS/R
0
2
4
2
R/S ó RS/RS
30
6
4
5
RS/S
0
4
3
4
nd
0
0
3
0
TOTAL
30
12
14
11
5.3.6. Confirmación del genotipo asociado al perfil RFLP
mediante cruzamientos y PCR cuantitativa.
Con el objetivo de comprobar que la asociación genotipo-perfil descrita anteriormente era
correcta en todos los posibles genotipos de Ccace2, se estimó el número de copias del gen
mediante qPCR y se realizó un genotipado mediante el sistema PCR-RFLP con la enzima Bst NI en
las siguientes líneas y cruzamientos:
· Línea susceptible C (genotipo Ccace2S/S).
· Línea W-10Km, resistente a malatión y formada por individuos homocigotos estructurales para la
duplicación (genotipo Ccace2RS/RS).
· Isolínea R/R (genotipo Ccace2R/R).
· F1 del cruce de la línea W-10Km con la línea C: genotipo Ccace2RS/S.
· F1 del cruce de la línea W-10Km con la isolínea R/R: genotipo Ccace2RS/R.
· F1 del cruce de la isolínea R/R con la línea C: genotipo Ccace2R/S.
161
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
En la figura 5.3.8 se muestra el perfil RFLP para la enzima Bst NI obtenido en los
individuos parentales y en la F1 de los cruzamientos descritos previamente, y la correspondencia
entre los patrones de restricción y el genotipo. En las líneas parentales se observó el perfil RFLP
esperado según su genotipo conocido: i) la línea W-10Km mostró la doble banda asociada con la
presencia de la mutación AChE G328A en heterocigosis, resultado de la duplicación; ii) en la línea
C se observó el corte total de la banda superior, apareciendo únicamente la inferior, iii) en la
isolínea R/R, al estar constituida por individuos homocigotos para el alelo de resistencia, no se
produjo el corte del producto de PCR por la enzima Bst NI.
Teniendo en cuenta la caracterización teórica de los perfiles RFLP realizada anteriormente
(Fig. 5.3.6), en el análisis de la F1 del cruzamiento de la línea W-10Km con la isolínea R/R se
observó un perfil RFLP en el que la banda superior era mucho más intensa que la inferior, relación
que es compatible con la estimada para este genotipo Ccace2RS/R (89:11). En el caso de la F1 del
cruce de la línea W-10Km con la línea C, se observó que la diferencia de intensidades entre ambas
bandas era menor, siendo ligeramente más intensa la superior, siendo esto compatible con la
intensidad estimada para los individuos con genotipo Ccace2RS/S (55:45). En el análisis de los
individuos que poseen la misma proporción de alelo silvestre y de resistencia (genotipos
Ccace2RS/RS y Ccace2R/S) se obtuvo un perfil RFLP en el que la banda superior era de mayor
intensidad que la inferior y la relación entre sus intensidades era intermedia a las de los dos casos
descritos anteriormente, por lo que coincidiría con una proporción 75:25 (Fig. 5.3.8).
Línea
W-10Km
Isolínea
R/R
Línea
W-10Km
X
RS/RS
Isolínea
R/R
RS/RS
Línea
C
RS/RS
R/R
RS/RS
X
S/S
R/S
Línea
C
Línea
W-10Km
X
X
R/R
RS/R
Línea
W-10Km
RS/RS
S/S
RS/S
Figura 5.3.8. Correspondencia entre los patrones RFLP y los genotipos para la
mutación AChE G328A y para la mutación estructural. En la asignación de los
genotipos, S representa el alelo Ccace2S, R es el alelo Ccace2R y RS representa la duplicación
génicaCcace2RS, resultado de la mutación cromosómica.
162
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
El número relativo de copias observado mediante qPCR se muestra en la figura 5.3.9. Los
individuos de la isolínea R/R, de la línea C y los individuos resultado del cruce de éstas, con
genotipo Ccace2R/S, mostraron el mismo número relativo de copias del gen Ccace2. Los individuos
de la línea W-10Km, homocigotos estructurales para la duplicación génica (Ccace2RS/RS),
presentaron el doble número de copias del gen Ccace2 con respecto a los individuos de la línea C.
Por otro lado, los individuos de la F1 resultado del cruce de la línea W-10Km con la línea C o la
isolínea
R/R,
heterocigotos
estructurales
para
la
duplicación
(Ccace2RS/S
o
Ccace2RS/,
respectivamente), presentaron 1,5 veces más copias del gen Ccace2 que los individuos silvestres.
2,5
a
Nº relativo copias Ccace2
2,0
b
b
1,5
c
c
c
R/S
R/R
S/S
1,0
0,5
0,0
RS/RS
RS/R
RS/S
Genotipos
Figura 5.3.9. Cuantificación del número de copias del gen Ccace2 en diferentes
genotipos. Se muestra la cantidad relativa del gen Ccace2 con respecto a Ccp0 en los seis
genotipos posibles teniendo en cuenta la presencia de la duplicación Ccace2RS (RS). S representa el
alelo Ccace2S y R es el alelo Ccace2R. Las distintas letras sobre las barras indican diferencias
significativas según un ANOVA con test post hoc de Tukey (p<0,05). Las barras de error
representan el error estándar de la media.
5.3.7. Análisis de los patrones de secuenciación de la
mutación AChE G328A.
Analizamos los patrones de secuenciación de aquellos genotipos que originaban un perfil
RFLP heterocigoto para AChE G328A con la enzima Bst NI (Ccace2R/S, Ccace2RS/RS, Ccace2RS/S,
Ccace2RS/R) y los comparamos con los patrones de los individuos con genotipo silvestre (Ccace2S/S)
pertenecientes a la línea susceptible C. La secuenciación directa con el cebador RiAChE_CcE60 del
163
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
producto de PCR resultante de la amplificación del exón 6 de la acetilcolinesterasa mostró
diferentes patrones de secuenciación en función del genotipo (Fig. 5.3.10).
Fenotipos heterocigotos
Fenotipo silvestre
(línea C)
Genotipo
RFLP (Bst I)
Cromatograma
0,00
Ccace2S/S
1,00
Ccace2R/S
0,77
Ccace2RS/RS
0,23
0,56
Ccace2RS/S
0,44
0,93
Ccace2RS/R
0,07
Figura 5.3.10. Patrones de secuenciación para la mutación AChE G328A. Se
muestran los perfiles RFLP y los cromatogramas correspondientes a los cuatro genotipos
heterocigotos posibles para la mutación AChE G328A y a un individuo de genotipo silvestre de la
línea susceptible C, empleado como referencia. En los perfiles de restricción se indica el
porcentaje, en tanto por uno, de cada una de las bandas generadas con la enzima Bst NI. El
recuadro del cromatograma señala el sitio puntual de la mutación AChE G328A.
164
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
En los cromatogramas de los cuatro perfiles heterocigotos para la mutación AChE G328A
se observó una doble lectura correspondiente a las bases citosina (C) y guanina (G) en la posición
de la mutación puntual AChE G328A, mientras que los individuos con genotipo silvestre de la línea
C mostraron un único pico correspondiente a la guanina. La guanina se corresponde con el alelo
silvestre Ccace2S y la citosina con el alelo mutado Ccace2R que confiere resistencia a malatión.
Tomando como referencia la proporción de ambos picos en el cromatograma de los
individuos con genotipo Ccace2R/S y Ccace2RS/RS, que poseen idéntica proporción de alelos,
observamos que la relación entre los picos varió en función del alelo predominante. Así, los
individuos con genotipo Ccace2RS/R, que tienen mayor proporción de alelo Ccace2R, mostraron un
pico de citosina mucho mayor que el de guanina. Por el contrario, los individuos con genotipo
Ccace2RS/S mostraron mayor cantidad de pico de guanina que de citosina al comparar su
cromatograma con el de los individuos Ccace2R/S y Ccace2RS/RS (Fig. 5.3.10).
5.3.8. Detección de la duplicación Ccace2RS mediante un
sistema de doble PCR-RFLP.
En el apartado 5.3.5 se explicó que el sistema de PCR-RFLP con la enzima Bst NI, descrito
en el capítulo 4 y empleado para determinar la presencia del alelo de resistencia Ccace2R, también
podía ser utilizado para la detección de la duplicación. Sin embargo, la caracterización de los
perfiles RFLP de la enzima Bst NI puede ser confusa en ocasiones, debido a la dificultad para
distinguir las proporciones relativas de las intensidades de las bandas del perfil de restricción en un
gel de agarosa.
Con el objetivo de detectar la duplicación Ccace2RS de una manera más precisa se
desarrolló un método de doble PCR-RFLP que consistió en combinar el sistema de la enzima Bst NI
con un segundo PCR-RFLP. En el nuevo sistema PCR-RFLP se utilizó un cebador (FG328A_27TseI)
que creaba un sitio de restricción para la enzima Ape KI en presencia del alelo de resistencia
Ccace2R. Del mismo modo que para la enzima Bst NI (Fig. 5.3.6), se estimaron las proporciones de
las bandas de los perfiles de restricción para Ape KI (Tabla 5.3.3) y se observó que la proporción
existente entre las dos bandas originadas en el RFLP difería en ambas enzimas únicamente en la
estimación de los individuos heterocigotos estructurales para la duplicación (CCace2RS/S y
CCace2RS/R).
165
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Tabla 5.3.3. Proporción de las bandas estimada para el sistema de doble PCRRFLP. Se indica el porcentaje de intensidad de cada una de las dos bandas (superior SUP, inferior
INF) que conforman el perfil de restricción para las enzimas Bst NI y Ape KI. En los genotipos, S
representa el alelo Ccace2S, R es el alelo Ccace2R y RS representa la duplicación Ccace2RS.
Bst NI
Ape KI
(% bandas)
(% bandas)
Genotipo
SUP
INF
SUP
INF
RS/RS ó R/S
75
25
75
25
RS/R
89
11
55
45
RS/S
55
45
89
11
La relación entre el doble perfil PCR-RFLP y los posibles genotipos de Ccace2 (ver apartado
5.3.6) se muestra en la figura 5.3.11. Mediante el sistema de doble PCR-RFLP se obtuvieron dobles
perfiles de restricción característicos para los genotipos homocigotos (Ccace2S/S y Ccace2R/R) y para
los individuos heterocigotos estructurales para la duplicación (Ccace2RS/S y Ccace2RS/R). Los
individuos con genotipos Ccace2R/S y Ccace2RS/RS, donde las proporciones de los alelos Ccace2R y
Ccace2S son idénticas, no lograron ser diferenciados porque en ambos sistemas PCR-RFLP se
produjo el mismo perfil, sin embargo, sí fueron identificados mediante qPCR (Fig. 5.3.9).
RS/RS
1
RS/R
2
1
RS/S
2
1
R/S
2
1
R/R
2
1
S/S
2
1
2
172 pb
145 pb
Figura 5.3.11. Sistema de doble PCR-RFLP para la detección de la mutación
AChE G328A y de la duplicación Ccace2RS. En los genotipos, S representa el alelo
Ccace2S, R es el alelo Ccace2R y RS representa la duplicación Ccace2RS. Se indican los patrones
RFLP para las enzimas Bst NI (1) y Ape KI (2) en un gel de agarosa al 3%.
166
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
5.3.9. Detección de la duplicación Ccace2RS en poblaciones de
campo.
Con el objetivo de estimar la frecuencia de individuos portadores de la duplicación
Ccace2RS, mediante el sistema del doble PCR-RFLP, se analizaron de nuevo las 25 poblaciones
españolas (recogidas entre los años 2003 y 2008) en la que se habían encontrado individuos
heterocigotos para la mutación AChE G328A (apartado 4.3.5). Este nuevo sistema nos permitió
confirmar los individuos homocigotos para los alelos Ccace2R y Ccace2S, e identificar aquellos
heterocigotos estructurales para la duplicación (Ccace2RS/S, Ccace2RS/R).
Los resultados del análisis de PCR-RFLP se muestran en la tabla 5.3.4. La duplicación
RS
Ccace2
se detectó mediante el método del doble PCR-RFLP en 18 de las 25 poblaciones
españolas de C. capitata que habían presentado la mutación AChE G328A. La distribución
geográfica de la duplicación, aunque se concentró en la cuenca mediterránea, fue amplia en todo
el territorio español, ya que se observó tanto en las Islas Baleares como en Canarias (Tabla 5.3.4).
El porcentaje de individuos portadores de la duplicación varió entre el 5%, detectado en Carlet y
Burriana, y el 35% observado en Les Coves de Vinromà. No obstante, hay que tener en cuenta
que estos valores representan la frecuencia genotípica mínima, ya que los individuos homocigotos
estructurales para la duplicación (genotipo Ccace2RS/RS) no pueden ser distinguidos de los
heterocigotos Ccace2R/S con el método del doble PCR-RFLP.
Tabla 5.3.4. Frecuencias genotípicas de Ccace2 en poblaciones españolas de C.
capitata. Se indica la frecuencia genotípica estimada mediante el sistema de doble PCR-RFLP. En
los genotipos, S representa el alelo Ccace2S, R es el alelo Ccace2R y RS representa la duplicación
Ccace2RS.
__________________________________________________________________________________________________________________
Frecuencia genotípica para Ccace2
________________________________________________________________
C. Autónoma
Población
RS/R
RS/S
R/R
S/S
RS/RS ó R/S
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Andalucía
Algarrobo-Costa
Almuñecar
Ayamonte
Gibraleón
-
-
-
0,95
0,95
0,90
0,95
0,05
0,05
0,10
0,05
Villalengua
-
0,08
-
0,92
-
0,11
0,10
0,10
0,22
0,20
0,20
0,17
0,15
0,20
0,60
0,17
0,35
0,25
0,30
0,33
0,30
0,25
Aragón
Cataluña
Alcanar
Amposta
Girona
Tortosa
167
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Tabla 5.3.4. Frecuencias genotípicas de Ccace2 en poblaciones españolas de C.
capitata. (Continuación).
__________________________________________________________________________________________________________________
Frecuencia genotípica para Ccace2
________________________________________________________________
C. Autónoma
Población
RS/R
RS/S
R/R
S/S
RS/RS ó R/S
______________________________________________________________________________________________________________________________________
C. Valenciana
Alacant
Alcùdia
Burriana
Carlet
Les Coves de Vinromà
Moncada
Orihuela
Sagunt
Serra
Vila Joiosa
Vila Real
Xàbia
0,20
0,05
0,05
-
0,17
0,05
0,05
0,15
0,21
0,11
0,25
0,10
0,11
0,30
0,04
0,10
0,20
0,21
0,05
0,11
0,05
0,05
0,20
0,74
0,58
0,55
0,80
0,10
0,32
0,55
0,50
0,40
0,90
0,37
0,40
0,22
0,25
0,30
0,15
0,35
0,21
0,40
0,28
0,25
0,47
0,10
Muro
-
0,10
-
0,80
0,10
Valle de Guerra
-
0,05
0,20
0,35
0,40
Albelda
-
-
-
0,56
0,44
I. Baleares
I. Canarias
La Rioja
______________________________________________________________________________________________________________________________________
En aquellos individuos en los que no fue posible determinar el genotipo con el sistema de
doble PCR-RFLP (Ccace2RS/RS y Ccace2R/S), se cuantificó el número de copias del gen Ccace2
mediante qPCR (ver apartado 5.3.2). Se analizaron un total de 13 individuos pertenecientes a dos
poblaciones de campo recogidas en Alcanar (ALC, n=6) y Orihuela (ORI, n=7). Además, se
analizaron 6 individuos de genotipo silvestre de la población ORI y, como control, se analizó uno
Nº relativo copias Ccace2
de la línea C de laboratorio (Fig. 5.3.12).
2,5
Doble RFLP
(Bst NI y Ape KI)
2
Ccace2RS/RS
ó Ccace2R/S
1,5
1
0,5
Ccace2S/S
Control
ORI13
ORI12
ORI11
ORI9
ORI10
ORI8
ORI7
ORI6
ORI5
ORI4
ORI3
ORI2
ORI1
ALC6
ALC5
ALC4
ALC3
ALC2
ALC1
0
Figura 5.3.12. Cuantificación mediante qPCR del número de copias de Ccace2
en individuos de campo. Se muestra la cantidad relativa del gen Ccace2 con respecto a Ccp0
en las poblaciones de Alcanar (ALC) y Orihuela (ORI). Además, como control, se evaluó el número
de copias en un individuo de la línea de laboratorio C.
168
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
De los trece individuos con genotipo indefinido (Ccace2R/S o Ccace2RS/RS), doce presentaron
un número de copias de Ccace2 similar al del control, con lo que se les asignó el genotipo
Ccace2R/S. Un individuo de la población de Alcanar presentó doble número de copias y se identificó
como homocigoto estructural para la duplicación (genotipo Ccace2RS/RS). Con estos datos se
calcularon las frecuencias alélicas de la población de Alcanar y se observó que los alelos Ccace2S,
Ccace2R, y la duplicación Ccace2RS se encontraron en unos porcentajes de 77,5%, 12,5% y 10%,
respectivamente. Del mismo modo, en la población de Orihuela, la frecuencia estimada para
Ccace2S y Ccace2R fue del 75% y 25%, respectivamente, con lo que no se detectó la duplicación
en esta población.
5.3.10. Comparación del desarrollo, porcentaje de emergencia
y supervivencia de adultos en las líneas C y W-10Km.
Se estimaron algunos parámetros indicadores de la posible existencia de un coste biológico
asociado a la duplicación Ccace2RS comparando en las líneas de laboratorio C y W-10Km: i) los
tiempos de desarrollo, ii) el porcentaje de emergencia y iii) la supervivencia de los adultos.
Tomando como tiempo cero del experimento el momento en el que las puestas de huevos fueron
recogidas, no se detectaron diferencias entre ambas líneas en cuanto al desarrollo larvario, ya que
el día en el que el 100% de las larvas habían pupado fue de 19,6±0,3 días en W-10Km y de
20,0±0,0 días en la línea C. Tampoco se encontraron diferencias en el día de emergencia de los
adultos de la línea W-10Km (28,7±0,8 días) con respecto a la línea susceptible C (29,1±0,2 días).
En cuanto al porcentaje de emergencia, aunque el valor fue mayor en la línea C (94±0,8%) que en
W-10Km (91±1,2%), las diferencias entre las líneas no fueron significativas. El análisis de la
supervivencia, realizado en ambas líneas durante un periodo de quince días después de la
emergencia de los adultos, nos indicó que a partir del séptimo día existieron diferencias
significativas en la viabilidad de los adultos (Fig. 5.3.13), siendo mayor la mortalidad en los
individuos de la línea W-10Km. Estas diferencias se incrementaron en el tiempo. Así, en el día
decimoquinto, último día del experimento, la mortalidad acumulada fue 3,4 veces mayor en la línea
resistente a malatión W-10Km que en la línea susceptible C.
169
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
100%
Supervivencia
*
90%
*
W-10Km
*
*
C
* *
*
W-10Km
80%
*
*
70%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
días
Figura 5.3.13. Supervivencia de los adultos de las líneas C y W-10Km después
de la emergencia. Se muestra el porcentaje de individuos vivos a lo largo de quince días. Las
barras de error representan el error estándar de la media. Los asteriscos indican diferencias
significativas con respecto a la línea C (t de Student, p<0,05).
170
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
5.4. Discusión.
El nuevo mecanismo de resistencia a malatión descrito en C. capitata en este capítulo
consiste en una mutación cromosómica que produce una duplicación del gen Ccace2 que codifica
la acetilcolinesterasa (AChE). Esta duplicación génica provoca la coexistencia de los alelos silvestre
Ccace2S y resistente Ccace2R en un mismo cromosoma, y es similar a la encontrada anteriormente
en C. pipiens (Bourguet et al., 1996b). La primera evidencia de la existencia de esta duplicación se
observó al genotipar la línea W-10Km mediante el sistema PCR-RFLP con la enzima Bst NI,
observándose que la totalidad de los individuos presentaban un perfil de restricción
correspondiente a individuos heterocigotos para la mutación AChE G328A (apartado 4.3.6). Según
la segregación mendeliana de un gen con dos alelos en ausencia de selección, el cruce entre
individuos heterocigotos para dicho gen debe dar lugar tanto a individuos heterocigotos como a
individuos homocigotos para los dos alelos del gen (Griffiths et al., 2008). En el análisis, con el
mismo método, de la generación filial (F1) de las dos direcciones del cruzamiento entre la línea W10Km y la línea susceptible C (formada por homocigotos para Ccace2S) se demostró que toda la
descendencia presentaba un perfil de restricción asociado a individuos heterocigotos (apartado
5.3.1). Este hecho es compatible con que en la línea W-10Km se haya producido una duplicación
en tándem del gen Ccace2 que favorezca que dos copias del gen (una mutada y otra no mutada)
se transmitan ligadas, generándose así una heterocigosis permanente (Labbé et al., 2007a). Si las
dos copias del gen no estuvieran ligadas habríamos identificado en la F1, al menos, individuos
171
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
homocigotos para el alelo Ccace2S, en una proporción aproximada del 50%. La ausencia de
descendientes homocigotos para el alelo silvestre indica que estos individuos de la F1 serían
heterocigotos estructurales. Así, estos individuos portarían en un cromosoma una duplicación
génica (Ccace2RS) y, en el otro cromosoma, portarían el alelo silvestre proveniente de la línea C,
con lo que su genotipo sería Ccace2RS/S.
La cuantificación mediante qPCR del número de copias del gen Ccace2 en ambas líneas
parentales (C y W-10Km) y en la F1 corroboró la existencia de la duplicación (apartado 5.3.2).
Además, la existencia de la duplicación y su segregación se comprobó analizando, mediante qPCR,
las líneas W-10Km y C, y la isolínea R/R, y la F1 resultado del cruzamiento entre ellas, obteniendo
así los seis genotipos posibles para CCace2: Ccace2RS/RS, Ccace2S/S, Ccace2R/R, Ccace2RS/R,
Ccace2RS/S y Ccace2R/S. En los seis casos, el número de copias del gen Ccace2 esperado para cada
genotipo coincidió con el estimado mediante qPCR (ver figura 5.3.9). Finalmente, se ha
demostrado que la duplicación detectada en el RFLP y en la qPCR no es un pseudogen y es
funcional, ya que tanto los niveles de expresión de Ccace2 (apartado 5.3.3) como la actividad
AChE fueron superiores en la línea W-10Km que en la línea C. (apartado 5.3.4).
En ácaros e insectos se han relacionado con resistencia varias amplificaciones y
duplicaciones de genes que codifican enzimas de detoxificación (Oakeshott et al., 2005), sin
embargo, el número de casos de duplicaciones génicas relacionadas con la resistencia a
insecticidas mediada por modificación de la molécula diana es escaso (revisado por Bass y Field,
2011). En el pulgón Myzus persicae se ha relacionado con resistencia frente a ciclodienos una
duplicación del gen que codifica la subunidad gamma del receptor del ácido aminobutírico (GABA)
(Anthony et al., 1998); y tanto en el ácaro Tetranychus urticae como en el pulgón Aphis gossypii
se ha asociado a resistencia a organofosforados la amplificación del gen ace1 (Kwon et al., 2010;
Shang et al., 2012). De hecho, se ha sugerido que los eventos de duplicación o amplificación en
artrópodos pueden ser más comunes de lo que los datos reflejan, pudiendo existir zonas del
genoma más propensas a albergar duplicaciones (Bass y Field, 2011). No obstante, la duplicación
encontrada en C. capitata, que da lugar a una heterocigosis permanente, se ha encontrado
únicamente en el gen ace1 de mosquitos (Bourguet et al., 1996b; Djogbénou et al., 2009),
habiéndose además demostrado la existencia de duplicaciones independientes en distintas zonas
geográficas (Labbé et al., 2007a).
Los distintos escenarios que pueden provocar la duplicación que genera heterocigosis
permanente y que permiten la permanencia de ambos genes ligados en la población han sido
discutidos anteriormente (Haldane, 1954; Spofford 1969; Otto y Yong, 2002; Labbé et al., 2007a).
En los análisis realizados en las poblaciones de campo de C. capitata no hemos detectado
172
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
individuos con genotipo silvestre que tuviesen doble número de copias del gen Ccace2, hecho que
indicaría que el evento de la duplicación génica es previo a la mutación AChE G328A, no obstante,
habría que comprobar esta hipótesis analizando un mayor número de individuos. Así, en el
contexto de nuestros resultados, no es posible determinar si ha podido ocurrir en primer lugar la
duplicación y a continuación la mutación en una de las dos copias del gen, o si una mutación ha
estado seguida de una recombinación no homóloga que originaría la duplicación en tándem.
Se ha demostrado que la mutación puntual encontrada en el alelo Ccace2R provoca una
disminución de la inhibición por malaoxón, la molécula activa del malatión, pero también una
disminución de la actividad AChE (Magaña et al., 2008) que podría estar asociada a un coste
biológico. En C. pipiens (Bourguet et al., 1996b) se ha sugerido que la disminución de actividad en
la AChE alterada puede provocar un exceso de acetilcolina en el espacio sináptico que podría
acarrear un coste biológico asociado al alelo de resistencia. En este trabajo hemos comprobado
que los individuos de C. capitata portadores de la duplicación poseen al mismo tiempo una afinidad
baja por el insecticida y una mayor actividad AChE, con toda probabilidad producida por el
aumento de la expresión que acompaña al incremento en el número de copias del gen. Además, el
hecho de que la duplicación se haya fijado en la línea W-10Km parece indicar que la duplicación
Ccace2RS confiere a los individuos que la portan una doble ventaja con respecto a los individuos
que poseen el alelo de resistencia Ccace2R: por un lado, la presencia del alelo Ccace2R conferiría
resistencia al malatión y, por otro lado, el aumento del número de copias del alelo silvestre
reduciría el coste biológico producido por la menor eficiencia catalítica de la enzima mutada, hecho
que ha sido observado en C. pipiens (Raymond et al., 2001). No obstante, la compensación no
resulta suficiente para eliminar totalmente el coste biológico en C. capitata en ausencia de
selección. Así, hemos observado que en individuos portadores de la duplicación en homocigosis se
produce una disminución en la supervivencia de los adultos a partir del séptimo día tras la
emergencia (apartado 5.3.10). Es esperable que el coste biológico observado en individuos
portadores de la duplicación sea menor que el observado en individuos portadores del alelo
resistente sin duplicación, pero esta hipótesis deberá ser verificada en posteriores estudios
mediante el análisis del coste biológico asociado a la mutación AChE G328A en los individuos
homocigotos para el alelo mutado (Ccace2R/R).
El conocimiento de los mecanismos asociados a resistencia y de los genes implicados
permite desarrollar métodos de detección precoz, basados en técnicas de bioquímica o de biología
molecular, que pueden ser útiles para el seguimiento y el manejo de la resistencia (Vontas et al.
2011). En el capítulo anterior describimos un método PCR-RFLP con la enzima de restricción Bst NI
que identificaba la presencia de la mutación AChE G328A en los individuos en los que no se había
producido el corte del amplicón, ya que la enzima reconocía el alelo silvestre Ccace2S (apartado
173
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
4.2.3). Este método tiene la ventaja de poder ser aplicado sobre individuos muertos provenientes
de trampas de monitoreo convencionales (ver figura 4.3.4.B), siendo posible la identificación de
resistencia aún cuando el porcentaje de individuos resistentes sea bajo. Un objetivo que nos
planteamos en este capítulo fue la detección de dicha duplicación de un modo simple y rápido.
Para ello, inicialmente, estudiamos los patrones de secuenciación de los individuos heterocigotos
para la mutación. El análisis de los cromatogramas no sólo reveló una doble lectura en el sitio de la
mutación puntual AChE G328A, fenómeno similar al observado para una mutación en el receptor
GABA de Anopheles funestus (Wondji et al., 2011), sino que la intensidad de los dos picos que
mostraban la heterocigosis estaba relacionada con la cantidad de alelos (apartado 5.3.7). Así, se
observaron patrones característicos para los genotipos Ccace2R/S/Ccace2RS/RS, Ccace2RS/R y
Ccace2RS/S y, aunque detectamos la duplicación cuando estaba presente en uno de los dos
cromosomas, las diferencias no eran tan evidentes como para emplear este método para el
diagnóstico de la presencia de la duplicación. Posteriormente, analizamos los perfiles de
restricción, obtenidos con la enzima Bst NI, de los individuos heterocigotos para la mutación AChE
G328A y comprobamos que, si se atendía a la intensidad de las dos bandas generadas por la
enzima de restricción, se podían observar distintos patrones de PCR-RFLP. Sin embargo, la
visualización de las diferencias de intensidad entre bandas puede no ser clara en algunos casos.
Finalmente, diseñamos un sistema de doble PCR-RFLP (apartado 5.3.8) que nos permitió identificar
con mayor precisión los genotipos para el gen CCace2, a excepción de aquellos individuos en los
que la proporción entre los dos alelos (mutado y no mutado) no está descompensada (genotipos
Ccace2R/S y Ccace2RS/RS), en el primer caso por la ausencia de la duplicación y en el segundo por la
presencia de la duplicación en las dos copias del cromosomas Hemos demostrado que la distinción
entre estos dos genotipos es posible mediante el análisis del número relativo de copias del gen
Ccace2 por qPCR. Además, mediante el sistema de doble PCR-RFLP, hemos asociado doble perfil
de restricción a los individuos heterocigotos estructurales para la duplicación (Ccace2RS/S y
Ccace2RS/R), hecho que nos permite detectar la duplicación sin emplear qPCR.
El análisis de poblaciones españolas con el método del doble RFLP demostró que la
duplicación Ccace2RS, fijada en la línea resistente de laboratorio W-10Km, se encuentra
ampliamente distribuida por todo el territorio español, encontrándose en 18 de las 25 poblaciones
analizadas, incluyendo las Islas Canarias y Baleares (apartado 5.3.9). Esta elevada dispersión de la
duplicación concuerda con lo observado en C. pipiens (Ben Cheikh et al., 2009; Alout et al., 2009,
2011) y en A. gambiae (Djogbénou et al., 2009), ya que cuando se detecta la duplicación de ace1
en una región, se observa en la mayoría de las poblaciones y de los individuos. Además, en
determinadas poblaciones de la cuenca mediterránea, la frecuencia de la duplicación era
moderadamente alta entre los años 2003 y 2008, siendo igual o superior al 20% en Amposta,
Girona y Tortosa (Cataluña); y en Les Coves de Vinromà, Moncada, Serra y Xàbia (C. Valenciana).
174
5. Nuevo mecanismo de resistencia a malatión en Ceratitis capitata
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Como el método del doble PCR-RFLP no permite la distinción entre los genotipos Ccace2R/S y
Ccace2RS/RS, solo ha sido posible realizar las estimaciones absolutas de frecuencia de cada uno de
los alelos y de la duplicación en aquellas poblaciones analizadas mediante qPCR: Alcanar
(Cataluña) y Orihuela (C. Valenciana).
El malatión ha estado excluido temporalmente del registro de productos fitosanitarios de la
Unión Europea durante los años 2009 y 2010 pero, recientemente, ha sido incorporado al registro
y se permite su aplicación en los cultivos de especies ornamentales y de fresas, por lo que no se
puede descartar que en las próximas campañas se apruebe de nuevo su uso en España para el
tratamiento de las poblaciones de C. capitata, quizás mediante el empleo de una nueva
formulación. En cualquier caso, el malatión se sigue utilizando para el control de C. capitata en
multitud de países fuera de la Unión Europea. La amplia dispersión del alelo Ccace2R que hemos
encontrado en las poblaciones españolas y la presencia de la duplicación, que provoca la
heterocigosis permanente, podría suponer un grave problema si se utilizase de nuevo el malatión u
otro organofosforado para el control de esta plaga. Además, la resistencia a malatión está asociada
a resistencia cruzada frente a otros insecticidas utilizados actualmente para el control de C.
capitata, como el caso de lambda-cialotrina, por lo que los tratamientos con malatión en campo
podría favorecer la resistencia frente a otros insecticidas. Es por tanto muy importante obtener
estimaciones precisas de las frecuencias de cada uno de los alelos y de la duplicación en distintas
zonas geográficas, que permitan realizar un seguimiento de su progreso en el tiempo.
Actualmente, se están recogiendo individuos en algunas de las localidades analizadas durante el
periodo 2003-2008 con el objetivo de estimar la evolución en el tiempo de la frecuencia de los
alelos de Ccace2 así como de la duplicación descrita en este capítulo. La detección precoz de la
resistencia, unida al uso racional de los insecticidas y a la integración de distintos sistemas de
control, permitirá la sostenibilidad del uso de insecticidas para el control de C. capitata y
contribuirá a reducir los graves daños económicos que esta especie causa en la agricultura.
175
CONCLUSIONES
177
Conclusiones
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Conclusiones.
A partir de los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral se extraen las siguientes
conclusiones:
1. Los bioensayos realizados con una dosis discriminante sugieren la existencia de individuos
resistentes a malatión en poblaciones de campo de C. capitata recogidas en Cataluña, Comunidad
Valenciana, Andalucía, Islas Baleares y Aragón.
2. La susceptibilidad de las poblaciones españolas de C. capitata frente a espinosad fue elevada en
general y similar a la de la línea susceptible C, aunque en una población recogida en Xàbia
(Alicante) se observó una susceptibilidad aproximadamente dos veces menor.
3. Mediante selección en laboratorio se han obtenido las líneas W-4Km y W-10Km, 178 y 400 veces
más resistentes a malatión que la línea susceptible C, respectivamente. Además, por primera vez
en C. capitata, se ha seleccionado una línea 500 veces más resistente a espinosad (Xàbia-W-100s)
que la línea susceptible C.
4. En la línea W-4Km se ha detectado resistencia cruzada moderada (entre 4 y 16 veces) a varios
organofosforados, a carbaril, a lambda-cialotrina y a lufenurón, sin embargo, la resistencia cruzada
a espinosad fue baja (1,5 veces).
5. El análisis de la diversidad de genes CYP en C. capitata ha permitido la identificación de, al
menos, 37 genes que codifican enzimas P450 pertenecientes a cinco familias.
6. La expresión de 6 genes CYP, con homología a genes asociados con resistencia a insecticidas en
otras especies, fue dependiente del sexo y presentó variaciones basales de hasta tres órdenes de
magnitud entre diferentes genes. Hemos observado inducción de la expresión por fenobarbital en
cuatro de ellos.
179
Conclusiones
______________________________________________________________________________________________________________________________________
7. Se ha puesto a punto un sistema que permite amplificar por PCR y secuenciar, partiendo de
DNA genómico, los exones de los genes Ccace2 y Ccae7 donde se han encontrado mutaciones
relacionadas con resistencia a insecticidas en otras especies.
8. Se ha diseñado un sistema PCR-RFLP que permite la detección del alelo Ccace2R que confiere
resistencia a malatión en C. capitata. Este alelo está ampliamente distribuido por todo el territorio
español (en 25 de las 27 poblaciones analizadas), aunque no ha sido detectado en poblaciones
procedentes de once países y de cinco continentes.
9. Se ha identificado un nuevo mecanismo de resistencia a malatión en C. capitata consistente en
una duplicación del gen Ccace2 que da lugar a la existencia de los alelos Ccace2S y Ccace2R en un
mismo cromosoma. Las dos copias del gen, al estar ligadas, originan una heterocigosis
permanente.
10. Mediante la combinación de un sistema de doble PCR-RFLP y PCR cuantitativa, se ha detectado
la duplicación Ccace2RS en la mayoría de poblaciones españolas de C. capitata analizadas,
oscilando su frecuencia entre el 5% y el 35%.
11. Los dos genes que conforman la duplicación son funcionales, ya que en los individuos que
portan la duplicación aumenta la expresión del gen Ccace2 y la actividad acetilcolinesterasa,
manteniéndose al mismo tiempo la baja sensibilidad al malaoxón, forma activa del malatión.
12. Se ha observado un coste biológico asociado a la duplicación génica que se manifiesta en una
disminución de la supervivencia de los adultos de la línea W-10Km.
13. Los conocimientos adquiridos en esta Tesis serán de utilidad para el seguimiento y manejo de
la resistencia y, por tanto, podrán contribuir a la sostenibilidad del uso de insecticidas para el
control de C. capitata.
180
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213
ANEXOS
215
ANEXO I
Protocolo para la elaboración de la dieta para las larvas de C. capitata.
Componentes:
®
· 100 g salvado de trigo Santiveri
· 300 g azúcar molido
®
· 145,2 g levadura de cerveza Santiveri
®
· 11,2 g Nipagin (metil p-hidroxibenzoato) Sigma
®
· 11,2 g Nipasol (N-propil-p-hidroxibenzoato) Sigma
· 2.400 ml Agua destilada
· 10 g ácido benzoico (Ref: 12349 Sigma-Aldrich Inc.)
Elaboración:
1. Se disuelven los 10 g de ácido benzoico en 1.500 ml de agua destilada calentando la
mezcla en agitación a 75-80ºC en un matraz durante aproximadamente media hora,
tapando el matraz con papel de aluminio.
2. En una bandeja se mezclan el salvado de trigo, el azúcar, la levadura y los productos
®
®
antibacterianos Nipagin y Nipasol .
3. Antes de añadir la disolución de ácido benzoico a la bandeja, se añaden 900 ml de agua
destilada al matraz y se deja enfriar unos 15 minutos.
4. Finalmente se añaden los 2400 ml de la disolución de ácido benzoico a la mezcla
existente en la bandeja y se homogeniza.
5. La dieta se repartirá en varios recipientes, anotando la fecha, para su congelación a -20ºC
y posterior uso.
217
ANEXO II. SECUENCIAS INTRÓNICAS DE Ccace2 y Ccae7
Secuencias nucleotídicas de los intrones de los genes Ccae7 y Ccace2. Todas las
secuencias nucleotídicas se muestran en sentido 5’ 3’ indicando su tamaño en pares de bases
(pb). Para el mejor entendimiento de la nomenclatura de los intrones y su localización en la
estructura génica, véase la Figura IV.3.1. El símbolo […] indica que la secuencia intrónica está
incompleta en ese extremo. Subrayadas las bases típicas que identifican el principio y el fin de los
intrones (GT/AG).
>Intrón 2 Ccace2. Secuencia parcial que incluye el extremo 3’ (133 pb)
[…]ATTGAAAAAAGCTTTTAATTTCCAATAAGCGAAATAGTTATACAACACATAGCTTTTGTACTTGCATACATACGTATACATACATATTA
TATAACTAAATTAATGTATTCCCTTTTCGTGCGTTCACCTACAG
>Intrón 3 Ccace2. Secuencia completa (147 pb)
GTGAGTAGCTACAAAAAGGCTAAAGTATCTAATGTCTGCATTCAAACATACAAACGCAAATACACCCAAAATTCTATACTCGTACAAAGCA
ACTCATTCATTGCTCTTACTCTCATATTTTCTTTCGTCTTCTAATATTCCCTACAG
>Intrón 4 Ccace2. Secuencia parcial que incluye el extremo 5’ (2.436 pb)
GTAAGTGGGTGTGCATATTTTGCAAAAAATTTAAATTGAATTCAGCTTTTTTTTGGAACAACTAGCTTTTATACGTTTTGGAGATGTGTTG
TGTTCATGTGTATTTGAATACAAAAACAAGAATTGGTCAGATTTTAATGAAATGACTCACAAAGGATTTTTCTGCGCAGGAAATGAGAAAA
TGGGGATTGTTACTTATTCGAGTTTGAGTCATTGGTATTCTGAAACGTTCCGTTCAGTAGACTTGTACGAAGTTTCAGCTAAATTCTGTTC
CATTATTATATCTTAAATGCATTCAGAGAGCCCTCTTGGAGTTCGGGGAGTCAACTCCACAGTAAAGAAATTGAGGTGGTGCGTGAAGTCT
ACTCCTCCTTTTATCTTATCAATTTGCTAGGTGGAGCACCTATTGAAGATGCGGGGTATTACAAGAGGAACTATTAAGTCTAATAACTCTT
GAAAAAGTGTTAGTGTGACGGAGAAAGCTTCGTGGAATTCTTATCACCAGCATTCCTTGTGATGGCAAATATCTAAGCCTGGCATAGTATG
GATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGGATGGGAACTTTCTAACTTATGTACGTAATTCCCCCAAGAAGTTGTTAAAAATTTCACAA
CTATTCTTGTCTAGTGATTTTCCGGAAGTTTTTTATTTTTTTTATTAACTCGGTTTTCTCGCTTTTTTTTTAAGGGAAAGAAAATTCAGAA
TTCATTCGAAAGAGAATTCAAGGCCTAAATTTAAGTTGGATTGCTCTCATGGAATTTGGACTTTACCATTCACCACAGGAAAAATTCTATC
AGTGTGATATCCCACGATCCTGGTAGACGATCGGCCAGTCGAAAAACGAAAACGTGAAATGTTCTCTCAATAAACTCATTGATCGATGTGT
GTGAAGTGGCGATTGTTGAAGCCAAATTTTGCCGAGATCACGAGCTTCTATTTCAGGCATCAATTAGTCGTTCATCCTGCCGCGATAACGA
TCGCCATGACGGTTACGTACTCATATCTTAACAAAATTTGGCTCGAGAAGGTCGAACCTTCTTAGAACTTCTCAAGTGTGCATAGAACAAG
GCGATTTCACATGGAAAGATCGAGCGACCTCAATTCTCGCATAAACTATATTTTGTATACTTTTAATGAAAGATCTCGAAGTAAAATGCGC
CAAGAAGATCCATATGTTCGTGCAAGTTGATGCGAACGGCGCCAAATCGTTTTCGTGTACATACTGAGCTACGGCCGCTATCTGAGCCGTT
TGATACCAAGCGACGTTTTAGACATTGTGATTCCGTGTGATTTCTTCAGTTTAATGCAGGAGAAATAATGAGAGCTGCAGAGCTAAATTGA
GGAGATACAGTCTTGATATGACAATATTGGCCTCAACAACCGCGCCCTGAGTTCTGCCTCCCCCAGTCTTGACAAAGCAACGAAGTGAATA
GGTCTGCCAGTGAACGAGGAGAAGTATTTCCTGTCATCAAACCAACAATATTCAAATGTTTCTTCTTTGCTTACGTCGAAAGGAAATTCTC
TTATATTGAATGACATTATGTAAAAGAACACAAATAAATCTTTGTTATCCGTGCGAAAGGAAAAATATTTGTTTGCAGTTGAGAAAATTAT
AACAAATCTTGCCATCTTGACCGATAGAAAATTACTTTCGCACCGGACTCCTGCAAGTTTTTTTTTCCATAAATCTAGAGATCTGCAAATA
CTTAAGCCAGTTTGGGATCACTTATAAAATCGTTTCATTTTACTTGGAGTATAAGGTTTCAGCTTTCTGTTTAAAAAGACTTAAGAAATGG
AATAAGTACGTCTTCCAGTCGTTTGTTAGTCTGGATTATTCGTTAATAATTAACACAATGCAAACCAACATTGAAGAAATAATAACATTCC
TCAATCAGATTTTTTTTTAACTCCCTATTTAATAGACACTTCCTCACATGGCTTCTTTTAAGGTTGATCCACCATCTCTAGTGTTCATGGT
TGAGGTATCAACGGCTTGTTTTGCCCACAAATTGAAGATTTAATTACAGAAAAGTATTTTTATAAAATCCCCTAAAGATTTCTCCACAAAC
GTAATGACACACATTTCGATCACTGAAACAATTTCCCCGGGACGAAGACCTGATAATCAATCTCTATTTAGTTATAAAAAGACACTAATAG
CATATTTCCACCGTACGTTAAATGCATTTAAATATTGCATTTCAATGCGTGATTTCCCATGTGTTTGTTGTTGTGAATTTTAGTGAATTAA
CTCATTTTCGGTATTTTAGCAGAAAATGTTATGTTAACAGTCGTTGCAGTCACTACTAATGTAATCATTTCGGAAGTTTCGGCATATTTTT
TGCCAGAGTCGTGTATTTTCGGGTTTTATGAGGGGAGAAACTTTTATTTTTCATGGTGAAATTTTTTCAG[…]
>Intrón 4 Ccace2. Secuencia parcial que incluye el extremo 3’ (683 pb)
[…]TTTTTTCAGCTGATTTCACTAAACAAATAATTTGAGAGTATTTGTTCCCAATGTGAAAATAGAAACATGCATAAAAGCATTTCGTTTCA
ATAGSGAAGGCCCGTGTAGAAAAAATGTGCACTTGCAAATCATAAGATTGCATAAATAGCCAAATAAAATTAATGCGGTTCCTTGAATTTA
TGATTTCAAAAGTTGTGACAAATATTGCAAACTGCTTGACATTTCATTCTCTTAACAGAGACATTAAATGCATTTAAATGCTCGGTGGAAA
TAGGCTATAGGACTTAAAATTGTGCTCTTAAATGTGCTAACTACAGCAAGTTTGAAAAACATATGGTAGCTACAAAACTTCACATTAGAAA
AAAAGTAAAAAATATTTTTCTTATTGCCAATGCATATTTAATACAAAACCCAAAATAATTTTTTTTAGTTGTGTTGGGGTGGAATTCACAA
AGTTATTTAGTCTTTTATTTGTATCATTATTTTACAATAATATTGAGAATAATATTTAGGGTACCTGACTTTTATGAGCACCGATTTTAAA
ATCAATACGATATTGATTTGCTTCAGTTTTGATCATCAGGGCCTTGGTTTAAGTATTTTTTTACACTAAATTTTTTTTTTTATACTTAAAA
ACGTATTTTGGTTTGTTTTCACTTACCTTTTTCCCTTTCCATTTTCAG
>Intrón 5 Ccace2. Secuencia parcial que incluye el extremo 5’ (874 pb)
GTGAGTACTTCCTGTGATGAAATATAAAATTTATAATTTTTTGAACAAAGTTAAGGAATGAGACAAAATTTGTGCTCAATGAGAAGTGTCA
GTAAAAATTAGTCAGTAAAAATTAGTCAGTAAAAATTAGTCAGTAAAAATTAGTCACTAAACAAATTGAGAAAGTATAACGTCTTGCTCTT
TTAAAAAGGAAACTAAATACTGTTTCACACAAAAATAAAAAAATAAATAAAAATTGTGTTACATTACATAATCTTTAATAATATGGAAAAT
ATACAGCGTAAAAGCGAACTACCTTTTAATCCAAAATAAGTTTCCAACATTAACGAAAAAAATGCACCTAATAAAGTCATCAACTTCTGGC
TCACATTTCCGCGCCATAAGCGCGCGCTCAGCACACAAAAATAATCACAATGAAGTTGGTGTTGTTGAAAATTGTTGTCGCTACCACTAAG
TGGACTCACAAACTCTCTGGCACATAAACATTTTTATATATCAAAGAAATGTGTGTGAACAAATATAGAAGCGTGCAAACGCCTTTCTAAA
GTGGCAACAGTCAACCATCTGCCGCATGCACTTCATACTTCTGCATCTTTCCaCTACAGCACGACGCGACACAGTTGCCAATTGCAACTGT
GCTAAGTTGCAACAAACAATACAAATTTTTCTTCTTTTTTTTttGTTGATGTCCCATTTTCCAAAATTACTTTGCCTCGGCGTTTCATTGG
219
CAACGAAATGATGTTACAAAGGGTGTGTAGCGCGTATGTATGTAGGCGACAAAGTGAGACTGGCTGTAAAGTAGTGAAGAAAAGTAGGATG
CTCTGTAACGAGTTTTACTCTGACGTCAGAGTtGAACCAGAAAAATGCGGCTCAC[…]
>Intrón 5 Ccace2. Secuencia parcial que incluye el extremo 3’ (304 pb)
[…]TTTTTTTTAAATCACTTTTTATATGAAGGAAGTCCCCAGTTTCCTATTTAATGGTTGGGCAACGAAAATTTTTCTTTTAAAACTTGCTG
TAACAACAAGAACAATAGmCATTTCTTTCCCTGGATGGTTGGCACAATAACACGAATAGACGAGAAGCAATATTGCCGGCTGAAGACTCAT
CATTTTCGCCGTTAGTTTTCACAACAGATTTGAACACATTTATTTATGTTGGTATTTTTTTCTATTTTAGAAATATTTTTAAGTCAATGAA
TTGATTTCAACATGTTTTTCATTTTCGTTTCAG
>Intrón 6 Ccace2. Secuencia parcial que incluye el extremo 5’ (960 pb)
GTAAGTAAATTGCTTTAATTTATGTATTTAAGTATGTATTGCAAAAAAAGTCATAACATAAAGACAAAAGTTATTCGCGAATGGTGTATAC
ATATATGTTTGTATTAAATGTTTGGTTTTCAATAAGGCAATCCTTTTTTCGGAGTTGTTTACTTTAACAGCTCTTCATTAATTTATGTCCA
GTTAAGTTAGGCATTTCCAGAGTGAACAGACTTATACCGGAACAACGTTTGAAAATCGTCCAAATTTATTGCCAAAATTATTGTTCGGTTC
GCGCGACGCATCGCAGTGCAACCATTTATTCATTTCAAATCACGTTTGCTCTAGTGGATAATTTGCATCGTCAGAGTTGCCATACTGTGCG
CACCGAAGACATTGCTGCTGTGGAGCAGACAATAGGAGCTGGCCCAGCTCCAAAAATTTCATGGAAAATTTTACGGAAGGATAGACTCATG
CATTAATTTTTCGTACCTGAGTTGGAAGATGTTGATGTGGACGACCTTTCGTTACAACAAGAGACCACTATAAGCTTACAGACAATGAATC
AATCAATTTATTGAAGGAAACTTTTTATGCGCTCCTTATATTGCGTCGTGCTCCCATGGCGTGGCTTTAAAGTTCTTACGATTTATTACTA
CTGCGGGGTTTTTACGGGGTTATGCGAAGTCGTTTTTCTACGCGCGGAAAGCCTACTTTTGTAATAAAGTTGTTTTTCTGGCAACAACAAT
AAGTTACATACATTTTGTTTTCCTTGAAAACCACATGTATACGATATTTGTTATCACCTATGTAAtATAATATGAAAAGATTTGTCCTGAA
TGACTGACACATCAATCCATAGCCTAAATATTTGCTCGTAGAAAAATTAAACTTGGAAATTGACCTGTGACCGAATTGATGGCTTGGTTTT
GTTTATTATGTGAAACATATGAGTATATGAGCCaAGAGTAGTTTCTCTCT[…]
>Intrón 6 Ccace2. Secuencia parcial que incluye el extremo 3’ (1.267 pb)
[…]AAATTATTCTACAAAAATTTTTTTTAATTATAACTTATTAGATATTTTTTGATCAACATTCAAAGAAACTATAATTAATGCCAAAAATT
AAAAAAAAAATTCAAATTTCGCATATTGCTCAAGTAAATGGTAATCCATTATTTTTGCAAAAGTTGGCTTTAGTGATATGTATCCCGCGTT
CTAATTGGGTTTTCCAATAAGAGATGTTATTTTGAATGAAAAATGGAACGATTCACACTTCAACAACGCAATGAAATAATTAAAATTCAAT
AAAAAAATTTCATCGAAAAATTATATTGACTAACGAGGCCCAGTTACACCTTGATAGCTACATCTATAAGCGCAACTGTCTGACTAACCTT
TCAAATTTTTACGTAGTTTATGGTCCAGCAGGGTCATTTGACCTTTATTTTTCGGAAATGAATGGATTGCGCTATCGATAGATGATTAATG
ATTTTTTTACGAGCGAAGCAAAGTTTACTTTCAACATGATAATGCTACGTGTTTATTTGAATATTAAAATAACACATTTATTGGAAAACCC
TGTACGAGTATAAGTTCGATTGGACTACGCTGGGTGGCATTAAAAAGTTGAGATTTGGTTCTAAAAAAGACAAAGGGAGAAGTGTTGGTCG
CATATCTAAGGAGGTGGGGAGGCAAATGGTCGAAAATTCAATAAAATGATGAAAATCGTCGAATCATTGCACAAAAAGCTTGATCTGTGGA
TGCCACATAAATTAACGAAAATATTCTGATGTACCGAATCATTTCGGAAGCAAATTTTGGACGGAAGTGCAGCAAGAAGCATTGCAAGAGC
TACCAATGCATCCAGAAAAAGTAACAGGTTGGTGCGGACTGATGGCATCTTTGGACCGTACTTCTTCAAAGACGACGCGAATCGTAACGTA
ACTGTGAATGGTGAGTGCCACCTTGAGATGATATCATACTTTTTCGATTGGCCCCTAGATCGTGTGACGCAACGTATTTAGACTATTTTTG
TGGGGCTCTGTTAAGTCTAATCTTTCTAATCTCCAACATAATGTTTTTTACTTGAATTAAATTAAAATTAGTAGTACAAGATTTACTAACT
TGATACAAGTTTTTTTTGCAGGGCTTAAATTCTCCCAGTACATTAAAATTTCTTAAGATTTTGGTCAACCTTTTACGTTATAACATTATTT
ATAACATATGTATATATTATAATATAAACTATCGGACCTTCATCTTAAGCCATAATTAATAAAAATAATATGATTTATTATTTCAG
>Intrón 7 Ccace2. Secuencia parcial que incluye el extremo 5’ (453 pb)
GTAAGTATTGGTAATAAAAAAAACAATAACAATGATAAACTAAAAAAAGTACTCTGCCACGCATCAGCGAGTTTCAAAATATTTTTAAATT
AAAAATATGATGATTTTTTTAATTTTTATAAACCCACGACTTGTTACGACTTGCAAAATACAAAAGTCCGTGAACATAAAGAAGAAATACA
ATATCGCAAGTCTAAGCAAAGAAGGCTCGAACAATAACAAATTTAGTTAAAAGGGTAATCGCTGAATCTAAGGAGTTCAATGGCTCATTTT
GAAATATGGCTCAGTTGTATAGTGTCCACACCATCAATGGTTTAGGGCTAAATTGGAATCTATGCAGAAACAATTCCTACTACTCGCGTAA
GAAATTTAAACTGGGATACGAATGAGAGTCTCCGTCCTCACAAAAGTTTTTTGGCGCTCATTAAAATGCCAACAATACAATACTAAATT[…]
_________
>Intrón 1 Ccae7. Secuencia parcial que incluye el extremo 3’ (107 pb)
[…]AAATAAACGCTTCATAGCAACAATTGTTAGGCAATGGAAAAAAATTTATTTTTTTTAAGGACAAGCACAATCTAAATATCTAACTCATA
CCTTTCTTCCGTTCTTAG
>Intrón 2 Ccae7. Secuencia completa (347 pb)
GTGAGTATATATATAAATTTATGTACCAAAACAGTGAAACGTTGCATCGTTAAACGAAGGAGAAAAATCTCAAATTTCTACTATTAGTTCT
CATAAAAAGAATAAAGAATATATCGGCTTATGAATTTTTAAAGAATAATTGTTTAGATTATAAAAATTACCTATAGATCCTGTTCTAAAAT
TTCGCTTTGCAGTTTATAGTATAACATACCTTTGTATGTGTTCATTACTTATTTCTTAATATAATAATACTTTGCTCAATCAGTCCGAAAC
TTGCCCGCAGCCTTGTTACTTTATATCTTTTTCTTTTACTGTTTGATATTCAAAAATAACTTAAATCCTCACAG
>Intrón 3 Ccae7. Secuencia completa (82 pb)
GTATGTGTGGGATGATAGCATATTTTACAGGCAATAATATTTCGTACGAGTATATTATTATTTTACATACAAATATAAACAG
>Intrón 4 Ccae7. Secuencia completa (71 pb)
GTGAGAACTACTGGCATTGCCACATACATTTTTGAATCATTATAATAAATTTATAATTTTCCCTGCCTTAG
>Intrón 5 Ccae7. Secuencia parcial que incluye el extremo 5’ (192 pb)
GTGAGTATCGCAAAAATAATTATAAAAATGAAAATTAATTCATTGTCACGATTTTCTGGAACTTAATTAAATAAATAATAATAATTGAAAA
TCATATTTTTATATGTATTTGCGTATGAATAATATCAAATATCACGCTTCTAGATGAGCTTTTGGCGGCTTCTTTACCAAAAACCTCTTAA
AGGGGGATTT[…]
220
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1.1. Principales especies de artrópodos ordenadas según el número de casos de resistencia.
13
Tabla 2.2.1. Lugares de muestreo de C. capitata.
42
Tabla 2.2.2. Listado de insecticidas empleados en los bioensayos de susceptibilidad.
46
Tabla 2.3.1. Análisis de la susceptibilidad a malatión y espinosad en poblaciones de campo de
C. capitata.
51
Tabla 2.3.2. Selección de resistencia a malatión en líneas de laboratorio de C. capitata:
Establecimiento de W-4Km.
53
Tabla 2.3.3. Selección de resistencia a malatión en líneas de laboratorio de C. capitata:
Establecimiento de la línea W-10Km.
54
Tabla 2.3.4. Susceptibilidad de C. capitata frente a diferentes insecticidas.
56
Tabla 2.3.5. Selección de resistencia a espinosad en laboratorio: Establecimiento de la línea
Xàbia-W-100s.
58
Tabla 3.2.1. Cebadores empleados en el estudio de diversidad de genes CYP.
73
Tabla 3.3.1. Combinaciones de cebadores degenerados para P450s.
80
Tabla 3.3.2. Diversidad de genes CYP en C. capitata.
83
Tabla 3.3.3. Genes seleccionados para el estudio de expresión.
90
Tabla 4.2.1. Cebadores empleados en la amplificación mediante GenomeWalkerTM de los intrones de
Ccace2.
110
Tabla 4.2.2. Cebadores empleados en la amplificación mediante GenomeWalkerTM de los intrones de
Ccae7.
111
Tabla 4.2.3. Cebadores empleados en la amplificación de los exones de Ccace2 y Ccae7.
114
Tabla 4.2.4. Poblaciones extranjeras de C. capitata utilizadas en los estudios moleculares de la
resistencia a insecticidas.
117
Tabla 4.2.5. Poblaciones españolas de C. capitata analizadas en los estudios moleculares de
resistencia a insecticidas.
118
Tabla 4.3.1. Secuencias nucleotídicas de los intrones de Ccae7 y Ccace2.
R
Tabla 4.3.2. Presencia del alelo Ccace2 en poblaciones españolas de C. capitata.
121
127
Tabla 5.2.1. Cebadores empleados en la determinación del número de copias de Ccace2 y en la
estimación de su expresión.
145
Tabla 5.2.2. Eficiencia de los cebadores empleados en la determinación del número de copias de
Ccace2 y en la estimación de su expresión.
146
221
Pág.
Tabla 5.3.1. Actividad AChE e inhibición por malaoxón en las líneas de laboratorio C y W-10Km.
157
Tabla 5.3.2. Asignación de genotipos para Ccace2 en función de la caracterización de los perfiles
RFLP.
161
Tabla 5.3.3. Proporción de las bandas estimada para el sistema de doble PCR-RFLP.
166
Tabla 5.3.4. Frecuencias genotípicas de Ccace2 en poblaciones españolas de C. capitata.
167
222
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1.1. Detalle del ovipositor de las hembras y de las quetas de los machos de C. capitata.
4
Figura 1.2. Distribución de la mosca mediterránea de la fruta.
5
Figura 1.3. Principales países productores de cítricos.
6
Figura 1.4. Principales exportadores de cítricos a nivel mundial.
7
Figura 1.5. Evolución de la resistencia a pesticidas.
12
Figura 1.6. Distribución de las especies de insectos en los que se han identificado casos de resistencia.
13
Figura 1.7. Nomenclatura de un gen CYP.
18
Figura 2.2.1. Jaula de cría para adultos.
36
Figura 2.2.2. Cría de larvas.
37
Figura 2.2.3. Líneas de laboratorio.
39
Figura 2.2.4. Caja de bioensayo.
43
Figura 2.2.5. Insecticidas.
44
Figura 3.2.1. Estructura de un cDNA que codifica una P450.
74
Figura 3.2.2. Clonación y comprobación del inserto.
75
Figura 3.2.3. Estructura química del fenobarbital.
77
Figura 3.3.1. Amplificación por PCR de genes CYP.
79
Figura 3.3.2. Análisis RFLP de los clones.
81
Figura 3.3.3. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas obtenidas a partir de los genes CYP de C.
capitata.
81
Figura 3.3.4. Distribución de los genes CYP en las cinco familias estudiadas.
82
Figura 3.3.5. Disposición de los genes CYP de C. capitata.
86
Figura 3.3.6. Clado CYP-4.
87
Figura 3.3.7. Clado Mitocondrial.
88
Figura 3.3.8. Clado CYP-3.
89
Figura 3.3.9. Clado CYP-2.
90
Figura 3.3.10. Validación de los cebadores para PCR cuantitativa.
91
Figura 3.3.11. Expresión de genes CYP en adultos de C. capitata.
92
Figura 3.3.12. Efecto del fenobarbital en la expresión de los genes CYP en C. capitata.
95
Figura 4.2.1. BD GenomeWalkerTM.
108
Figura 4.2.2. Estructura génica de Dmae7 y Dmace2.
109
Figura 4.2.3. Diseño del método de detección de la mutación AChE G328A en C. capitata.
115
Figura 4.2.4. Patrón PCR-RFLP esperado para Ccace2.
116
223
Pág.
Figura 4.3.1. Estructura génica de Ccae7 y Ccace2.
120
Figura 4.3.2. Amplificación de Ccae7 y Ccace2 en individuos de distintas regiones geográficas.
R
Figura 4.3.3. Método PCR-RFLP para la detección del alelo Ccace2 .
R
Figura 4.3.4. Análisis por PCR-RFLP del alelo Ccace2 en poblaciones de campo de C. capitata.
R
Figura 4.3.5. Distribución geográfica del alelo Ccace2 en España.
122
123
125
126
Figura 4.3.6. Porcentaje de alelos Ccace2S y Ccace2R en las poblaciones españolas de C. capitata
analizadas.
129
R
Figura 4.3.7. Distribución geográfica del alelo Ccace2 en las poblaciones no españolas.
130
Figura 4.3.8. Frecuencia genotípica de Ccace2 en las líneas de laboratorio resistentes a malatión
seleccionadas a partir de la población W.
131
Figura 5.2.1. Cajas para los cruzamientos.
144
Figura 5.2.2. Representación esquemática del método PCR-RFLP para la detección de la duplicación
génica de Ccace2 en C. capitata.
150
Figura 5.3.1. Resultado esperado y observado en el cruzamiento de las líneas C y W-10Km.
154
Figura 5.3.2. Cuantificación del número de copias del gen Ccace2 en dos líneas de laboratorio de
C. capitata.
155
Figura 5.3.3. Cuantificación de la expresión de Ccace2 en las líneas de laboratorio C y W-10Km.
156
Figura 5.3.4. Perfiles RFLP asociados a los individuos heterocigotos para AChE G328A.
158
Figura 5.3.5. Modelo teórico de PCR-RFLP para los individuos portadores del alelo de resistencia
Ccace2R.
159
Figura 5.3.6. Caracterización matemática de los perfiles de restricción heterocigotos para la mutación
AChE G328A con Bst NI.
160
Figura 5.3.7. Cuantificación de los perfiles RFLP heterocigotos para AChE G328A.
160
Figura 5.3.8. Correspondencia entre los patrones RFLP y los genotipos para la mutación AChE G328A y
para la mutación estructural.
162
Figura 5.3.9. Cuantificación del número de copias del gen Ccace2 en diferentes genotipos.
163
Figura 5.3.10. Patrones de secuenciación para la mutación AChE G328A.
164
Figura 5.3.11. Sistema de doble PCR-RFLP para la detección de la mutación AChE G328A y de la
duplicación Ccace2RS.
166
Figura 5.3.12. Cuantificación mediante qPCR del número de copias de Ccace2 en individuos de campo.
168
Figura 5.3.13. Supervivencia de los adultos de las líneas C y W-10Km después de la emergencia.
170
224