Genética reversa para el estudio funcional de genes implicados en... metabolismo del nitrógeno en pino marítimo

Genética reversa para el estudio funcional de genes implicados en el
metabolismo del nitrógeno en pino marítimo
M. Cano1, I. Mendoza-Poudereux1, M. Morcillo1, J. Segura1, E. Sales2 e I. Arrillaga1
1
Departamento de Biología Vegetal, ERI BiotecMed, Facultad de Farmacia, Universitat de
València. Av. Vicent Andrés Estellés s/n 46100 Burjasot, Valencia
2
Departamento de Ciencias Agrarias y del Medio Natural, Universidad de Zaragoza, Escuela
Politécnica Superior. Ctra. Cuarte s/n 22071 Huesca
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Pinus pinaster Ait. es una conífera que presenta un amplio rango de distribución y una
elevada plasticidad fenotípica que le permite crecer en ambientes muy variables. Por ello, se ha
utilizado como especie modelo para estudios de adaptación a diferentes estreses bióticos y
abióticos. A partir del transcriptoma obtenido en el proyecto SUSTAINPINE
(www.scbi.uma.es/sustainpine) de plantas y tejidos bajo distintas condiciones de estrés se han
aislado un elevado número de secuencias génicas que excede al número de genes con función
biológica conocida. El objetivo de la genética reversa es caracterizar funcionalmente estos genes
candidatos mediante la producción de individuos en las que su actividad haya sido alterada. En
este trabajo se presentan los resultados preliminares de la caracterización molecular y bioquímica
de líneas embriogénicas de pino marítimo obtenidas mediante la sobreexpresion o el
silenciamiento de 2 genes candidatos a regular el metabolismo del nitrógeno: la arginasa
(ARS20) y la ornitina-delta-aminotransferasa (dOAT). La primera cataliza la hidrólisis de
arginina y la segunda, la conversión de ornitina en un intermediario de la síntesis de glutamato
en la mitocondria.
Mediante co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens se obtuvieron las líneas transgénicas
para ARS20 y dOAT (sobreexpresión e RNAi interferente). La expresión de los transgenes,
determinada mediante RT-PCR permitió caracterizar al menos 3 líneas sobreexpresoras y
silenciadas para cada gen. El número de copias insertadas de los genes de interés se realizó
mediante PCR cuantitativa. Esta técnica presenta ventajas frente al Southern Blot tradicional, ya
que requiere menor cantidad de ADN es más rápida y evita el uso de sondas radiactivas. El perfil
del contenido en aminoácidos libres se realizó mediante HPLC.
Trabajo subvencionado por el MINECO, la UE (AGL2013-47400-C4-4-R), la Generalitat
Valenciana (PROMETEOII/2014/052) y por la Universitat de València (Ayuda a la
investigación concedida a María Cano).