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LABORATORIOS BETERÁ
Obtención de la abrina y de la abrina aglutinina
Félix Ganem Báez,1 José A. Lagomasino Carrera
2
y Yamilet Álvarez Tejo
3
RESUMEN
En las semillas del Abrus precatorius se encuentran al menos 2 isolectinas, una tóxica con baja capacidad aglutinadora y otra, con
menor toxicidad, pero alta capacidad eritroaglutinadora denominadas abrina y abrina aglutinina respectivamente. El objetivo de
este trabajo consistió en la obtención de identificación de ambas especies moleculares, mediante la combinación de extracción
selectiva con purificación por medio de técnicas cromatográficas de intercambio iónico y de afinidad. La movilidad electroforética
de las proteínas se determinó sobre phasgel 8-25 % .Los resultados indicaron que más de 46 % de las lectinas presentes en el
extracto de Tris pertenecen a la abrina, mientras que en el de HAc, 2 % pertenece a la abrina aglutinina. La movilidad
electroforética de la abrina indicó la presencia de 2 compuestos de pesos moleculares cercanos a los 65 KD que se correspondieron
con las halotoxina abrina I y abrina II. La abrina aglutinina presentó una banda cercana a los135 KD.
Palabras clave: lectinas, abrina, cromatografía, purificación.
Las semillas del Abrus precatorius contienen
2 isolectinas una con baja toxicidad y fuerte
actividad eritroaglutinadora y otra muy tóxica
pero con poca aglutinación. Estas se conocen
como abrina y abrina aglutinina.1
La actividad citotóxica de la abrina se ha
venido utilizando en la elaboración de productos
terapéuticos contra tumores malignos y actúa
además como agente antimetástasis.1, 2
Los métodos de obtención de estas lectinas
plantean el uso combinado de varios tipos de
cromatografía, la más usada es la de intercambio
iónico, seguida de una columna de afinidad.4 Otro
método consiste en la extracción selectiva de
ambas isolectinas y se continúa con las
purificaciones cromatográficas señaladas
antes. 1, 4 .
El objetivo del presente trabajo es la
obtención y purificación de estas 2 isolectinas
mediante una modificación del método de Godal. 1
de Tris-HCl ( 50 mmol ) a pH 7,7 durante 24 h a
4 ºC. Se centrifuga a 3 000 rpm por 20 min a 4 ºC.
El sobrenadante se dializa 24 h con agitación suave,
se elimina el precipitado por centrifugación, se
toman 2 alícuotas de 100 µL para la determinación
de proteínas por el método Azul de Coomasie y
para el test de aglutinación, respectivamente.
Extracción de la abrina aglutinina
A 20 g de semillas se les realiza una
secuencia de pasos semejante a la anterior
extracción utilizando una solución de HAc 5 %.
El sobrenadante obtenido después de la
centrifugación se dializa 2 veces contra agua
destilada y contra Tris- HCl ( 10 mmol ) a pH 7,7.
El dializado se centrifuga bajo las condiciones
expuestas anteriormente. Se toman dos alícuotas
de 100 µL para determinar la concentración de
proteínas y realizar el test de aglutinación.
MÉTODOS
Purificación de los extractos de abrina
Extracción de la abrina
La muestra se pasa a través de una columna
(XK 50/30 ) de DEAE- Sepharosa preparada según
el fabricante, la matriz se lava y equilibra con
buffer Tris-HCL (10 µM). La muestra se eluye
Se maceran 20 g de semillas de Abrus
precatorius previamente trituradas con 150 mL
1
Doctor en Ciencias Técnicas.Licenciado en Química Investigador Auxiliar.
Maestro en Ciencias. Licenciado en Química.
3
Licenciada en Biología.
2
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con un gradiente salino a saltos con soluciones de
NaCL de diferentes concentraciones ( 0,1, 0,2, 0,3
y 0,4 M ). Se emplea un flujo de 5 mL/ min. La
elución se monitorea a 280 nm en un BIOPILOT
de Pharmacia, a las fracciones obtenidas se les
determinan concentración de proteínas y
aglutinación.
Purificación de los extractos de abrina aglutina
Se utilizan las mismas condiciones que la
purificación anterior, pero se eluye con un gradiente
salino continuo a partir de una solución de NaCL
2 mol. La elución de las proteínas se registró a
280 nm, se determinó la concentración de proteínas
y la aglutinación a las fracciones obtenidas.
Purificación mediante columna de afinidad
Las fracciones con aglutinación positiva se
purifican por cromatografia de afinidad en
columna XK-16 empaquetada con Sepharosa 4B
equilibrada con PBS a pH 7,3, la muestra se
introduce con flujo de 1 mL/min, se eluye con
galactosa (0,1 mol) en PBS y se monitorea a 280 nm
en un equipo FPLC. La fracción proteica eluida
con galactosa se dializa contra el buffer de
estabilización. La actividad aglutinadora de la abrina
se expresa en µg/mL y se determina mediante una
dilución seriada de una solución de abrina de 1 mg/mL.
Esta actividad es la menor concentración requerida
para aglutinar una suspensión a 2 % de eritrocitos
humanos con una hora de incubación a 25 ºC.5 La
evaluación electroforética se realiza en un equipo
Phast-System empleando Phastgeles con gradientes 8-25 % de poliacrilamida y patrones de
catalasa (60 KD), albúmina (67 KD) y ß-galactosidasa
(130 KD).
RESULTADOS
El comportamiento cromatográfico de los
diferentes extractos sobre las columnas de DEAESepharosa con diferentes sistemas de elución se
muestran en las figuras 1 y 2 . La presencia de 4
picos caracterizan a estos perfiles, en el primero
se encuentran las proteínas no retenidas
denominadas contaminantes, mientras que los
picos II, III y IV corresponden a las eluidas por el
gradiente salino, donde se encuentran tanto la abrina
como la abrina aglutinina como lo muestra el test
de aglutinación.
Las fracciones purificadas por la columna de
Sepharosa-4B muestran en la figura 3 un perfil
cromatográfico típico de una cromatografía de
afinidad; un primer pico compuesto por las
proteínas no retenidas y un segundo formado por
las proteínas que eluyen con la solución de
galactosa.
En la tabla 1 se muestra el comportamiento
cuantitativo de el proceso de purificación , el
rendimiento promedio de tres extracciones
realizadas alcanza 46 % para la abrina y 32 %
para la aglutinina .
La electroforesis de la abrina (fig. 4)
indica la presencia de 2 bandas, ambas
ligeramente por debajo de los 60 KD y una a la misma
altura de los 67 KD . La abrina aglutinina presenta una
sola banda a igual altura que la banda de 130 KD.
Tabla 1. Comportamiento del proceso de purificación de las isolectinas
Pasos del proceso
Extracto crudo
Extracto dializado
Purificación/
intercambio iónico
Purificación/ afinidad
Volumen total (mL) Concentración de proteínas (mg/mL) Cantidad de proteínas (mg)
Abrina Abrina/Aglutina Abrina Abrina/Aglutina
Abrina
Abrina/Aglu-tina
Abrina
200
210
200
215
5
3
2
1
1 000
630
400
215
580
920
835
320
0,77
0,5
0,2
0,4
446,6
460
167
128
Rendimiento %
Abrina/Aglutina.
100
100
46
32
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Fig.1. Perfil cromatográfico de la cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharosa del extracto de abrina.
Fig. 2. Perfil cromatográfico de la cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharosa del extracto de abrina aglutinina.
20
21
Fig. 3. Perfil cromatográfico de la cromatografía de afinidad en Sepharosa 4B de la fracción del pico II obtenida en la purificación del
extracto de abrina.
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1: B-Galactosidasa (130 KD).
2: Extracto de abrina aglutinina.
3: Extracto de abrina aglutinina.
Fig. 4. Movilidad electroforética de la abrina y de la abrina aglutinina.
1: Catalasa (60 KD).
2: Extracto de abrina.
3: Albúmina (67 KD).
23
DISCUSIÓN
La combinación adecuada de diferentes
sistemas cromatográficos, así como de extracción
permiten resolver satisfactoriamente complejas
mezclas de proteínas como es el caso que nos
ocupa con la separación de la abrina y de la abrina
aglutinina. El empleo de gradiente salino a salto
en la cromatografía de intercambio iónico sobre
DEAE-Sepharosa, permitió obtener una mejor
separación de los componentes de los extractos
que el gradiente continuo, como se muestra en los
cromatogramas de las figuras 1 y 2.
La utilización adecuada de la cromatografía
de afinidad permite obtener la separación de ambas
abrina con alta pureza, lo que se pone de manifiesto
al determinar el comportamiento electroforético de
ambas especies moleculares y la ausencia de otras
bandas acompañantes.
El contenido de abrina es más de 3 veces el
de la aglutinina lo cual es importante por su mayor
interés farmacológico.
SUMMARY
In the seeds of the Abrus precatorius they are 2
isolectins at least, a toxic one with low agglutinative
and other capacity, with smaller toxicity, but high
capacity eritroaglutinative denominated abrin and abrin
aglutinin respectively. The objective of this work
consisted on the obtaining of identification of both
molecular species, by means of the combination of
selective extraction with purification by means of
technical chromatography of ionic exchange and of
likeness. The mobility electroforetic of the proteins was
determined on phasgel 8-25% .This indicated that more
than 46 % of the present lectins in the extract of Tris
belong to the abrin, while in that of HAc, 2% belongs
to the abrin aglutinin. The mobility electroforetic of the
abrin indicated the presence of 2 made up of near
molecular weight to the 65 KD that belonged together
with the halotoxin abrin I and abrin II. The abrin aglutinin
presented a near band to 135 KD.
Key words: lectins, abrin, chromatography, purification.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Godal A. Abrin variants and inmunotoxins 1993. Patente
. WO/93 00362.
2. Tung T. Orally administrable anti-metastatic lectin
composition and method.1991. Patente No.5,053,386.
3. Sharon N, Lis H. Lectins Israel.Chapman and Hall Press.
1980.
4. Olnes S, Phil A. Molecular action of toxin and viruses.
Elsevier, Amsterdan 1982: 51-105.
5. Sigma Catalogo. Abrus precatorius aglutinin. 1995:1848.
Recibido: 2 de mayo del 2000.
Aprobado: 6 de junio del 2000.
Lic. Félix Gavem Báez. Edificio E-18 Apto 21 Zona 10, Alamar,
Habana del Este, Ciudad de La Habana.