hepatitis c - Asociación Española de Biopatología Médica

HEPATITIS C
CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A
DISTANCIA 2009-2010
TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO
Nº 4
I.S.S.N.- 1988-7469
Título: Taller del Laboratorio Clínico
Editor: Asociación Española de Biopatología Médica
Maquetación: AEBM
Fecha de Distribución: febrero de 2010
Hepatitis C
Marta
Barrionuevo González.- MIR Análisis Clínicos. Especialista en
Medicina Familiar y Comunitaria. Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Alcalá de Henares. A finales de los años 60 y principios de los 70, a raíz del descubrimiento de los
virus causales de las hepatitis A y B y de la aparición de métodos específicos para el
diagnóstico, se hizo evidente el hecho de que existía un tipo de hepatitis
postransfusionales que no podían ser explicadas ni por estos dos agentes ni por
ningún otro virus hepatotropo conocido hasta el momento. Por exclusión, este agente
fue denominado inicialmente virus de la hepatitis no-A no-B. La mayoría de estos
cuadros clínicos y algunos casos de hepatitis aguda estaban relacionados con un
virus que se clonó finalmente a finales de los años 80 y que se denominó VHC.
El espectro clínico de la enfermedad es muy variable y oscila entre una
infección aguda que suele pasar inadvertida hasta el desarrollo de una hepatopatía
crónica que con el transcurso de los años puede dar lugar a cirrosis y
hepatocarcinoma.
AGENTE CAUSAL Virus de la Hepatitis C.
Autor: JA Perkins
El VHC es un virus RNA monocatenario,
esférico, con un diámetro aproximado de
50-60 nm y que posee una cápside proteica
y una envoltura lipídica. Taxonómicamente
se engloba dentro de la familia Flaviviridae
(que incluye los géneros flavivirus y
pestivirus), considerándose hoy en día que
su diversidad es lo suficientemente amplia
como para ser considerado como un género
separado, los hepacivirus. El VHC no está
relacionado con ningún otro virus de la
hepatitis conocido, aunque la recientemente
descrita hepatitis G podría ser un pariente
lejano (filogenéticamente hablando).
331
GENOMA VIRAL: Consta de una sola molécula de RNA de polaridad positiva y aproximadamente 9.6 kb
de longitud. Su secuencia contiene un marco de lectura único región ORF (open
reading frame) de aproximadamente 9000 nucleótidos que codifica una gran
poliproteína de 3010 aminoácidos, flanqueado por dos regiones no traducibles en los
extremos 5´ y 3´ terminales UTR (untranslated regions).
1. Región 5´UTR Está formada por 341 nucleótidos que preceden al codón de inicio de la
poliproteína. Se trata de una región altamente conservada, con analogías superiores
al 98% en las cepas secuenciadas; no es extraño por tanto que se use como blanco
para la amplificación y múltiples ensayos diagnósticos y terapéuticos. Contiene
elementos esenciales para la replicación, probablemente como lugar de
reconocimiento de la replicasa viral, aunque su función principal radica en su
capacidad para permitir la unión de la subunidad 40s del ribosoma de la célula
huésped al RNA vírico en una estructura conocida como IRES (internal ribosoma
entry site), deteniendo la síntesis de proteínas del huésped mientras continúa
generando proteínas virales.
2.
Región 3´UTR Es un segmento de 30-60 nucleótidos cuyas funciones exactas se desconocen,
formada por unos 40 nucleótidos seguidos de una cola de uracilos (poly-U) y una
región muy conservada (presenta una homología del 98-100%).
3. Región ORF Comprende la mayor parte del genoma, aproximadamente 9000 nucleótidos
situados entre las regiones terminales no codificantes. Su traducción da lugar a una
gran poliproteína que posteriormente es dividida y origina
proteínas virales
estructurales y no estructurales.
El genoma de esta región ha sido dividido en dos bloques diferenciados:
- Genes estructurales: dan lugar a las proteínas de la núcleocápside (gen C) y de la
envoltura (genes E1 y E2).
- Genes no estructurales: situados a continuación de los anteriores. Codifican para
una serie de enzimas con acción helicasa, proteasa, RNA polimerasa dependiente de
RNA,… y se denominan NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B.
Entre las regiones E1 y E2 se encuentra la zona hipervariable (HVR1), que
muestra una gran variación genética y cuyas mutaciones parecen ser las
responsables de que el virus evite al sistema inmunitario y cause infecciones
persistentes y respuestas deficientes al tratamiento.
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Dentro de la región no estructural hay que destacar el papel de NS5A porque
contiene una zona conocida como ISDR (interferon sensitivity determining region). Se
ha observado que la acumulación de mutaciones en esta zona está relacionada con
una mejor respuesta a la terapia con interferón en pacientes infectados.
Representación esquemática del genoma viral. HETEROGENEIDAD VIRAL La incapacidad de la RNA polimerasa para corregir errores durante la
replicación, al igual que sucede en casi todos los virus RNA, da lugar a un gran
número de mutaciones. Muchas de ellas pueden dar lugar a cambios en nucleótidos
que resultan en un genoma no funcionante y en una replicación incompetente del
virus (mutantes letales). Sin embargo, en muchos casos y debido al pequeño tamaño
del genoma y a la gran tolerancia a la diversidad genética, la mutación persiste y se
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establecen en el mismo individuo mezclas complejas de virus con RNA no idénticos
aunque próximos entre sí.
El VHC nunca está presente in vivo como una población homóloga de
genomas RNA idénticos. Se denomina secuencia máster a la secuencia más
frecuentemente representada dentro de una población y secuencia promedio o
consenso a la que resulta de asignar a cada nucleótido su posición más frecuente.
La heterogeneidad viral permite al virus evitar los mecanismos del sistema
inmune y es extremadamente importante en la patogenia de la enfermedad, en la
respuesta al tratamiento y en el desarrollo de métodos diagnósticos y vacunas
convencionales.
Como consecuencia evolutiva de esta variabilidad, y a largo plazo, se han ido
estableciendo grupos virales genéticamente distintos. Estos grupos, dependiendo del
grado y diversidad de la variación se dividen en genotipos, subtipos, aislados y
cuasiespecies.
Variantes del VHC. Homología y nomenclatura. Categoría
Homología
Genotipo
65%
Subtipo
77-80%
Aislado
91-95%
Cuasiespecie
> 95-98%
Los genotipos presentan un grado de homología del 65%, se denominan con
un número arábigo y hasta el momento se han identificado 6 (1 al 6). Cuando el
grado de homología dentro del mismo genotipo se encuentra entre el 77-80% se
habla de subtipo (o subgenotipo). De éstos se conocen hasta el momento más de
100, que se nombran con una letra minúscula. Dentro del mismo subtipo, se
denomina aislado a aquel genoma cuyo grado de homología no supera el 91-95%.
Finalmente se habla de cuasiespecies cuando la homología del genoma es mayor del
95-98%. Las diferencias entre las familias de cuasiespecies sólo son evidentes
usualmente en cambios que ocurren en las regiones hipervariables.
La población que infecta a un individuo es una mezcla de cuasiespecies,
aunque se han descrito casos de infecciones mixtas, es decir, pacientes infectados
por más de un genotipo o subtipo. Teniendo en cuenta la tasa anual y global de
mutaciones descrita y la tasa de fijación de las mismas, se calcula que las variantes
existentes en la actualidad se originaron de un virus parental que apareció hace más
de 2000 años y que en un mismo hospedador, para que sucediera el cambio de un
subtipo a otro deberían pasar al menos 50-60 años. De momento no se ha
demostrado el cambio de genotipo o subtipo de VHC en un mismo paciente.
334
El genotipo infectante no influye en la historia natural de la enfermedad
aunque es un factor decisivo en la respuesta al tratamiento antiviral. Así, los
pacientes infectados por genotipos 1, 4 ó 5 tienen bajo índice de respuesta con
respecto a los infectados por genotipos 2 y 3 (que se consideran especialmente
prevalentes en usuarios de drogas por vía parenteral).
EPIDEMIOLOGÍA 1. Distribución geográfica La distribución de la enfermedad es universal y su prevalencia global es muy
variable. Se estima que en el mundo existen del orden de 170 millones de infectados.
En los países desarrollados la población portadora oscilaría entre 1-2% (0.5% en
donantes de sangre); aún así, el porcentaje variará dentro del propio país en función
de su grado de desarrollo y de las características de su sistema sanitario.
Los diferentes genotipos pueden encontrarse en cualquier lugar del mundo,
aunque hay diferencias claras en cuanto a su distribución geográfica, incluso entre
grupos de población de la misma zona. Así, los genotipos 1a, 1b, 2a, 2b, 2c y 3a
suponen el 90% de las infecciones por VHC en Norteamérica, Sudamérica, Europa,
antigua Unión Soviética, China, Japón, Nueva Zelanda y Australia. El genotipo 1b es
especialmente prevalente en este y sur de Europa, Japón y China y el genotipo 3 en
Bangladesh, India, Nepal y Pakistán. El 4 y varios de sus subtipos suelen encontrarse
en África del este y central, especialmente el subtipo 4a en Egipto. En Sudáfrica, el
genotipo 5 causa aproximadamente el 50% de las infecciones y el 6 suele
encontrarse en el sudeste asiático.
2. Distribución por edades Se considera que presenta dos picos: el de los mayores de 65 años, cuyo
contagio podría atribuirse a la recepción de transfusiones o uso de material
quirúrgico no estéril antes de la década de los 80; y otro entre los 30 y los 45 años,
cuya principal vía de contagio sería el consumo de drogas vía parenteral.
3. Transmisión La forma de transmisión más frecuente y eficiente sería la parenteral
percutánea con una eficiencia en la transmisión que lo situaría entre la del VHB y la
del VIH. La transfusión de sangre y hemoderivados contaminados explicarían la
mayor parte de las infecciones de más de 10-15 años de antigüedad, aunque en
nuestro medio se considera que esta vía no sería la responsable de más del 2% de
las infecciones actuales. El grueso de las infecciones se relacionaría con el consumo
de drogas vía parenteral, constituyendo este grupo de infectados un potencial
reservorio de VHC en la comunidad, aumentando la prevalencia de forma
proporcional a la duración del abuso de drogas; un porcentaje pequeño (2-4%) se
335
referiría a la transmisión por exposición ocupacional (pinchazo accidental en personal
sanitario) y a las llamadas rutas parenterales inaparentes, como serían los tatuajes,
los piercing y la acupuntura.
La transmisión no parenteral es claramente menos eficiente. Incluye la
transmisión sexual, el contagio perinatal y la transmisión familiar.
La transmisión sexual es excepcional en el seno de parejas estables, aunque se eleva
considerablemente en personas promiscuas o coinfectadas por el VIH. La mayoría de
los expertos no recomiendan modificación de las prácticas sexuales en relaciones
monógamas, excepto en el caso de ulceraciones genitales y durante la menstruación.
Aunque el riesgo de contagio es bajo, se recomienda realizar estudios serológicos de
anti-VHC a las parejas de pacientes infectados.
El contagio madre-hijo también es poco frecuente y se desconoce con
exactitud el mecanismo y el momento de la transmisión aunque el riesgo es mayor si
la madre está coinfectada por el VIH y tiene niveles de viremia elevados. En recién
nacidos de madres positivas para anti-VHC la transmisión ocurre aproximadamente
en un 2% de los casos, subiendo hasta el 4% si la madre tiene RNA viral positivo. La
coinfección materna por VIH eleva el riesgo de transmisión de un 2 a un 20%. La
posible transmisión por la leche materna está siendo objeto de estudio hoy en día y
no está aclarada todavía, aunque se sabe que el VHC está presente en el calostro. Se
recomienda explicar estos datos a la madre y que ella decida sobre dar lactancia o
no.
En cuanto a la transmisión familiar, se observa sobre todo cuando existe un tiempo
prolongado de convivencia, años, durante el cual se ha podido estar expuesto de
forma inadvertida o se han compartido objetos contaminados como cepillos de
dientes, maquinillas de afeitar,…etc.
Un porcentaje importante de casos (se cree que hasta un 40%) carece de factores
de riesgo evidentes. Son las llamadas infecciones esporádicas, que suelen darse
en sujetos de edad media o avanzada, que probablemente adquirieron la enfermedad
por transmisión percutánea inaparente. Esta forma de presentación constituye una
característica típica de la enfermedad.
HISTORIA NATURAL La historia natural de la enfermedad es difícil de establecer debido a que se trata de
una patología que cursa generalmente con un largo período asintomático y en la
mayor parte de los casos la identificación del momento exacto del inicio de la
enfermedad es imposible. Habría que tener en cuenta además otros factores, como
la existencia de etilismo crónico, coinfecciones virales y factores inmunológicos del
huésped.
336
Habitualmente, la hepatitis aguda por virus C es asintomática (hepatitis subclínica
anictérica) o bien cursa con síntomas clínicos inespecíficos que aparecen unas 7-8
semanas después del contagio y que son indistinguibles de otras infecciones
hepáticas agudas. Excepcionalmente estos cuadros agudos podrían evolucionar hacia
una hepatitis fulminante o una curación espontánea. Lo más frecuente, sin embargo,
es la evolución a cronicidad (70-80%). La presencia de RNA-VHC en suero es la
primera evidencia bioquímica de infección, siendo detectable por PCR entre unos
pocos días y las 8 semanas que siguen al contagio, lo cual depende sobre todo del
tamaño del inóculo.
En la mayor parte de los casos la enfermedad se diagnostica ya en su fase crónica.
Suele descubrirse en el seno de controles rutinarios en los cuales aparecen
alteraciones fluctuantes de los niveles de ALT y AST, una plaquetopenia casual,…etc
o incluso manifestaciones extrahepáticas secundarias al depósito de complejos
inmunes unidos a proteínas virales o al propio virus intacto; como glomerulonefritis,
vasculitis y manifestaciones reumatológicas asociadas a crioglobulinemia.
La progresión de hepatitis crónica a cirrosis suele ocurrir en un tercio de los
pacientes en el transcurso de los siguientes 30-40 años. Se han descrito algunos
factores que favorecerían la evolución a cronicidad y el acortamiento de este lapso de
tiempo, como inmunodeficiencia, sexo masculino, coinfección por VIH o VHB,
consumo de alcohol, tabaquismo,.. etc.
El 15% de los casos de cirrosis presentarán hepatocarcinoma; el riesgo de desarrollo
aumenta con los años desde la adquisición de la infección y siempre aparece en
individuos con cirrosis establecida, aunque no se ha podido demostrar un factor
oncogénico directo del virus.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO El diagnóstico de la infección por VHC se realiza inicialmente mediante una prueba de
screening, seguida de otra prueba suplementaria para confirmar la infección. Estas
pruebas deben ser aplicadas en función de la población estudiada y de la situación
diagnóstica.
1. Métodos de cribado Se utilizan tanto para población de bajo riesgo (por ejemplo donantes de sangre),
como para diagnóstico inicial en pacientes con factores de riesgo o en los que existen
ya alteraciones clínicas o analíticas que hagan sospechar una hepatopatía por virus C.
Desde principios de los años 90 se usa de forma rutinaria un EIA para detección de
IgG específica contra VHC. No es posible obtener proteínas virales nativas, de
manera que los antígenos usados son artificiales y se obtienen por síntesis química o
ingeniería genética. Estas pruebas han ido adquiriendo sensibilidad y especificidad
337
con el paso de los años, a medida que se han ido añadiendo antígenos nuevos y/o
modificando las proteínas ya existentes.
El EIA-1 usaba una sola proteína recombinante como antígeno y fue rápidamente
sustituido por otro de segunda generación al que se añadieron otras proteínas. El
EIA-3 es superior en especificidad y sensibilidad al EIA-2, con una detección más
precoz de la seroconversión en caso de hepatitis aguda (7-8 semanas) y con una tasa
menor de falsos positivos en las poblaciones de baja prevalencia. En pacientes
inmunocompetentes la sensibilidad del EIA es del 98-100%, mientras que en
inmunodeprimidos y dializados oscila entre un 50-90% dependiendo del grado de
inmunodeficiencia.
También se han desarrollado técnicas para detectar IgM anti-core VHC, pero no han
alcanzado las expectativas previstas, ya que el patrón de producción es demasiado
variable.
Existe además un test EIA para detección cualitativa del antígeno del core VHC en
suero o plasma que se cree podría ser útil para acortar el período ventana.
Actualmente por ley hay que hacer detección por PCR para evitar los periodos
ventana en el cribado de los donantes de sangre.
2. Métodos de confirmación Cuando un suero da un resultado positivo en una prueba de screening este resultado
debe ser confirmado. En muchas ocasiones, aunque no siempre, se usan técnicas de
inmunoblot, que son más específicas que el EIA, aunque menos sensibles. En este
tipo de pruebas se detectan de forma individual anticuerpos contra las distintas
proteínas virales.
La prueba de inmunoblot se considera positiva si el suero reacciona con dos o más
proteínas, negativa si no reacciona con ninguna e indeterminada si reacciona con una
sola. En individuos inmunocompetentes un valor indeterminado suele corresponder a
un estadío muy precoz de la infección. Casi el 100% de los pacientes con un sistema
inmunitario normofuncionante y exposición al VHC dan positivo a las pruebas de
screening y confirmación, durante el primer año postexposición. Por otro lado, los
pacientes dializados, VIH e inmunocomprometidos en general, dan un elevado
porcentaje de falsos negativos y suelen necesitar técnicas moleculares para
establecer un diagnóstico correcto.
3. Métodos moleculares La replicación del VHC en el interior de los hepatocitos produce como resultado la
muerte de dichas células y la liberación de las partículas víricas hijas. Una parte
importante de ellas pasa al torrente circulatorio convirtiéndose en potenciales dianas
para los métodos diagnósticos de laboratorio basados en la detección del genoma o
proteínas virales.
338
1.- Pruebas cualitativas: informan de la presencia o ausencia de RNA viral. Se
usan para confirmar infección activa por VHC en algunos pacientes seropositivos con
resultados dudosos, para diagnóstico de la infección muy precoz en el tiempo en
pacientes seronegativos con sospecha clínica y también en los pacientes
inmunodeprimidos.
Como el VHC circula a niveles relativamente bajos en la sangre, no son válidas las
técnicas de hibridación y el RNA viral debe amplificarse para su detección. La técnica
más usada es la amplificación por PCR del DNA complementario (DNAc) a un
fragmento del extremo 5´UTR, que es el mejor conservado, obtenido por
retrotranscripción. La especificidad y sensibilidad de esta técnica son bastante
elevadas (50-700 copias/ml).
Muchos laboratorios desarrollaron al principio su propia variante de la técnica,
aunque hoy en día se usan en la mayor parte de los sitios métodos comerciales
estandarizados y con distintos grados de automatización.
2.- Pruebas cuantitativas: sirven para determinar la carga viral del VHC. Estas
pruebas han sido estandarizadas usando tránscritos de RNA de distinta longitud,
secuencia y naturaleza; las unidades de medida no representan la misma cantidad de
RNA en muestras clínicas. Debido al auge que están adquiriendo estas técnicas se
hacía necesaria una normalización para poder intercambiar resultados, por ello la
OMS ha establecido un patrón internacional de referencia en UI/ml.
3.- Pruebas para determinación de genotipos: para conocer la variante de VHC
se pueden utilizar técnicas moleculares y técnicas serológicas. A efectos prácticos,
para determinar el genotipo se recurre a la amplificación del extremo 5´UTR (región
altamente conservada), para lo cual nos sirve ya el amplificado que hemos obtenido
para la determinación del RNA en el laboratorio de rutina. Se pueden usar otras
regiones del genoma, pero la extraordinaria variabilidad del mismo hace que la
amplificación y posterior secuenciación sean muy complejos, de manera que sólo se
usa en determinados laboratorios de investigación.
La mayor utilidad del genotipado es su utilización como marcador
epidemiológico y como marcador predictor de la respuesta al tratamiento.
339
Algoritmo utilizado para la confirmación diagnóstica de la hepatitis C TRATAMIENTO Los objetivos de un potencial tratamiento de esta enfermedad serían eliminar el
riesgo de contagio, erradicar la infección viral y evitar la progresión de la
enfermedad. En la actualidad los tratamientos existentes son limitados en cuanto a
su eficacia y poseen todavía bastantes efectos secundarios importantes, de manera
que estaría indicado en pacientes con criterios mínimos y siempre teniendo en cuenta
las características individuales de cada caso. Los criterios a considerar serían los
siguientes:
1.2.3.4.5.6.7.-
Capacidad del paciente de seguir el tratamiento y los controles.
Ausencia de contraindicaciones (embarazo, lactancia, epilepsia, y otros).
Ausencia de consumo de alcohol y drogas.
Enfermedad hepática no descompensada.
Niveles de ALT elevados, al menos los 6 meses anteriores al inicio.
Detección de RNA-VHC en suero.
Biopsia hepática con fibrosis.
Hasta hace pocos años el tratamiento se realizaba con interferón alfa, obteniéndose
unos resultados pobres y una tasa de respuesta mantenida variable del 18-20%. La
asociación interferón-ribavirina permitió aumentar la tasa de respuesta mantenida al
40-50%, ya que la ribavirina, aunque tiene una escasa actividad por sí misma,
potencia el efecto del interferón, reduciendo la replicación viral, la necrosis hepática,
la inflamación y la fibrosis. En la actualidad existe la posibilidad de asociar a la
ribavirina el interferón pegilado, cuya mejor solubilidad y retardo en la eliminación
permite obtener un grado de actividad de interferón más sostenido con menos dosis
340
semanales. Es posible que esta nueva asociación proporcione una mejor tasa de
respuesta para las infecciones por genotipo 1, pero no para las infecciones por
genotipos 2 y 3.
Más del 50% de los pacientes infectados no responden a las terapias antivíricas
actuales, de manera que se hace necesario continuar buscando nuevas alternativas
terapéuticas. Las dianas que se están ensayando incluyen distintas proteínas que
serían esenciales en el ciclo vital y la replicación del virus y el esfuerzo por estimular
la respuesta inmune mediante la activación de citocinas basándose en terapias
distintas al interferón. Conceptualmente podrían dividirse en:
Derivados de los tratamientos habituales: consiste en el desarrollo de formas
nuevas modificadas de los tratamientos habituales, que de momento se encuentran
en fase de prueba. Serían el albuferon, una forma de interferón alfa fusionado con
albúmina cuya vida media es mucho más larga; y derivados de la ribavirina, como la
levovirina o viramidina.
Potenciadores de la respuesta inmune: se están desarrollando varios
tratamientos que aumentarían la eficacia de los antivirales, como timosina,
interleukina 10, interleukina 11 y resiquimod; también se trabaja en el diseño de
vacunas tanto terapéuticas como preventivas, inmunoglobulinas experimentales y
transferencia de genes de receptores de células T.
Tratamientos enfocados al genoma del VHC: la caracterización del genoma viral
ha permitido el desarrollo de estrategias que se basan en interrumpir la replicación
del virus, fundamentalmente mediante inhibidores de las proteasas.
Tratamientos enfocados a la reducción de la fibrosis: interferón gamma,
vitamina E e inhibidores de caspasas.
Tratamientos que bloquearían la entrada del VHC en las células.
341
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CON LA COLABORACIÓN DE: