Proyecto Fin de Carrera

ÍNDICE DE CONTENIDOS
ÌNDICE DE CONTENIDOS.
ÌNDICE DE CONTENIDOS. ____________________________________________ 1
I. capítulo 1___________________________________________________________ 7
I-1. EQUILIBRIO DE FASES EN SISTEMAS DE UN COMPONENTE _____ 7
1.1. Regla de las fases _______________________________________________ 7
1.2. Ecuación de Clapeyron __________________________________________ 9
1.3. Metaestabilidad _______________________________________________ 11
I-2. DISOLUCIONES _______________________________________________ 12
2.1. Magnitudes molares parciales ____________________________________ 12
2.2. Magnitudes de mezcla __________________________________________ 15
I-3. DISOLUCIONES IDEALES______________________________________ 19
3.1. Potencial químico______________________________________________ 20
3.2. Presión de vapor. La ley de Raoult ________________________________ 21
I-4. DISOLUCIONES DILUIDAS IDEALES ___________________________ 23
I-5. DISOLUCIONES NO IDEALES __________________________________ 26
5.1. Actividades y coeficientes de actividad _____________________________ 26
5.2. Estados normales de disoluciones no ideales_________________________ 27
5.3. Determinación de actividades y coeficientes de actividad_______________ 29
5.4. Coeficientes de actividad de solutos no volátiles______________________ 30
5.5. Coeficientes de actividad en las escalas de molalidad y concentración molar 31
I-6. DISOLUCIONES DE ELECTROLITOS ___________________________
6.1. Potencial químico del disolvente __________________________________
6.2. Potencial químico del electrolito __________________________________
6.2.1 Sin asociación iónica: _______________________________________
6.2.2 Con asociación iónica: _______________________________________
33
34
35
36
37
I-7. TEORÍA DE DEBYE-HUCKEL __________________________________ 38
I-8. PROPIEDADES COLIGATIVAS _________________________________ 43
8.1. Disminución de la presión de vapor________________________________ 43
8.2. Descenso del punto de congelación ________________________________ 45
II. capítulo 2 _________________________________________________________ 50
II-1. DEFINICIÓN DE ÓSMOSIS. LAS MEMBRANAS SEMIPERMEABLES
__________________________________________________________________ 50
1.1. La ósmosis. La presión osmótica __________________________________ 50
1.2. Causa de la semipermeabilidad ___________________________________ 52
1.2.1 Teoría del cribado. __________________________________________ 52
1.2.2 Teoría de la solubilidad superficial o adsorción. ___________________ 52
1.2.3 Teoría de la presión de vapor. _________________________________ 54
II-2. MECANISMOS DE LA PRESIÓN OSMÓTICA ____________________
2.1. Ley de la presión osmótica para disoluciones ideales.__________________
2.2. El coeficiente osmótico _________________________________________
2.3. Teorías sobre el origen de las presiones osmóticas ____________________
55
55
58
60
1
ÍNDICE DE CONTENIDOS
2.3.1 Teoría del bombardeo de las moléculas de soluto. _________________
2.3.2 Teoría del bombardeo de las moléculas de disolvente. ______________
2.3.3 Teoría de la presión de vapor. _________________________________
2.4. Mecanismo de equilibrio osmótico. El potencial químico. ______________
60
49
50
51
II-3. LA PRESIÓN OSMÓTICA Y LA PRESIÓN DE VAPOR ____________ 52
II-4. UNIDADES DE MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA EN SISTEMAS
BIOLÓGICOS_____________________________________________________ 55
III. capítulo 3 ________________________________________________________ 57
III-1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS _______________________________ 57
III-2. NECESIDAD DE MODELOS MATEMÁTICOS ___________________ 58
III-3. OBSERVACIONES EXPERIMENTALES ________________________ 60
III-4. MUERTE CELULAR. HIPÓTESIS DE LOS DOS FACTORES ______ 63
IV. Capítulo 4 ________________________________________________________ 66
IV-1. INTRODUCCIÓN_____________________________________________ 66
IV-2. APLICABILIDAD DEL MODELO ______________________________ 67
2.1. Caso de células aisladas _________________________________________ 67
2.2. Caso de células en tejidos _______________________________________ 67
IV-3. HIPÓTESIS SIMPLIFICATORIAS DEL MODELO IDEAL_________ 70
IV-4. LAS VARIABLES Y PARÁMETROS DEL MODELO. _____________ 74
IV-5. EL COEFICIENTE DE PERMEABILIDAD O LA CONDUCTIVIDAD
HIDRÁULICA DE LA MEMBRANA CELULAR _______________________ 77
5.1. Introducción __________________________________________________ 77
5.2. Ley de la permeabilidad de la membrana celular______________________ 78
5.3. Determinación experimental de los parámetros del modelo de permeabilidad81
5.3.1 Método de las dos etapas (two – step) ___________________________ 82
5.3.2 Método de la calorimetría de escaneo diferencial (Differential scanning
calorimetry. DSC) _______________________________________________ 85
IV-6. MODELO TEÓRICO IDEAL ___________________________________ 87
6.1. Introducción __________________________________________________ 87
6.2. El modelo teórico ideal para un perfil de enfriamiento arbitrario _________ 88
6.3. La curva de equilibrio. El subenfriamiento __________________________ 94
6.3.1 Interpretación física _________________________________________ 94
6.3.2 La ecuación de la Curva de Equilibrio___________________________ 95
6.4. Particularización de las ecuaciones del modelo _______________________ 97
6.4.1 Introducción _______________________________________________ 97
6.4.2 Ley de enfriamiento lineal ____________________________________ 98
6.4.3 Ley de enfriamiento cuadrática ________________________________ 99
6.4.4 Ley de enfriamiento exponencial ______________________________ 101
6.5. Modelo de deshidratación para un perfil de enfriamiento nulo __________ 103
6.5.1 Introducción ______________________________________________ 103
6.5.2 Planteamiento de las ecuaciones ______________________________ 104
IV-7. RESOLUCIÓN NUMÉRICA DE LAS ECUACIONES DEL MODELO
IDEAL __________________________________________________________ 105
7.1. Introducción _________________________________________________ 105
2
ÍNDICE DE CONTENIDOS
7.2. Los perfiles de enfriamiento_____________________________________ 106
7.3. Curvas de Deshidratación para Espermatozoides de Ratón_____________ 110
7.3.1 Datos Físicos _____________________________________________ 110
7.3.2 Programación en MALTAB de las ecuaciones diferenciales ________ 112
7.3.3 Representación grafica de la deshidratacion _____________________ 118
7.3.3.1 Programación en MATLAB de la integración de la ecuación
diferencial de la deshidratación celular____________________________ 118
7.3.3.2 Representación gráfica de la deshidratación. _________________ 121
7.3.3.3 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre la deshidratación ___ 126
7.3.3.4 Deshidratación para perfiles de enfriamiento no lineales ________ 131
7.3.4 Representación gráfica del subenfriamiento _____________________ 134
7.3.4.1 Programación en MATLAB del subenfriamiento______________ 134
7.3.4.2 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el subenfriamiento _ 136
7.3.4.3 El subenfriamiento para perfiles de enfriamiento no lineales_____ 141
7.3.5 Representación Gráfica del Flujo Osmótico _____________________ 143
7.3.5.1 Programa en MATLAB del flujo osmótico __________________ 143
7.3.5.2 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el caudal de flujo
osmótico ___________________________________________________ 145
7.3.5.3 Curvas de flujo osmótico para perfiles de enfriamiento no lineales 150
7.3.6 Representación Gráfica a Temperatura Constante_________________ 151
7.3.6.1 Introducción __________________________________________ 151
7.3.6.2 Programación en MATLAB de la deshidratación a temperatura
constante.___________________________________________________ 153
7.3.6.3 Resolución numérica y representación gráfica de la deshidratación a
temperatura constante _________________________________________ 156
7.3.6.4 Aplicación de la etapa de deshidratación a temperatura constante para
la optimización de protocolos de enfriamiento ______________________ 158
7.4. Análisis teórico del efecto de los parámetros físicos de las células sobre la
deshidratación ___________________________________________________ 169
7.4.1 Introducción ______________________________________________ 169
7.4.2 El óvulo de ratón no fertilizado _______________________________ 170
7.4.2.1 Parámetros físicos ______________________________________ 170
7.4.2.2 Comparativa de la deshidratación celular ____________________ 171
7.4.3 Parámetros físicos de las células que afectan al proceso de deshidratación
_____________________________________________________________ 175
7.4.3.1 La permeabilidad de la membrana celular ___________________ 175
7.4.3.2 Ratio Área membrana / Volumen celular____________________ 177
IV-8. MODELO TEÓRICO NO IDEAL ______________________________
8.1. Revisión de las hipótesis simplificatorias __________________________
8.2. El Modelo Teórico NO Ideal para un perfil de enfriamiento arbitrario____
8.3. La curva de Equilibrio no ideal __________________________________
8.4. Particularización de las ecuaciones del modelo no ideal _______________
8.4.1 Introducción ______________________________________________
8.4.2 Ley de enfriamiento lineal ___________________________________
8.4.3 Ley de enfriamiento cuadrática _______________________________
8.4.4 Ley de enfriamiento exponencial ______________________________
8.5. Modelo de deshidratación a temperatura constante ___________________
8.6. Obtención de las leyes ideales a partir de las no ideales _______________
8.6.1 Introducción ______________________________________________
8.6.2 Determinación de la condición de idealidad _____________________
180
180
181
190
192
192
193
194
195
196
197
197
198
3
ÍNDICE DE CONTENIDOS
8.6.3 Sustitución de la condición de idealidad en la ecuación del modelo no ideal
_____________________________________________________________ 199
8.6.4 Comparación de las ecuaciones del modelo ideal, con la condición de
idealidad, con las ecuaciones del modelo ideal________________________ 200
IV-9. RESOLUCIÓN NUMÉRICA DE LAS ECUACIONES DEL MODELO
NO IDEAL _______________________________________________________ 202
9.1. Introducción _________________________________________________ 202
9.2. Curvas de deshidratación para espermatozoides de ratón ______________ 203
9.2.1 Datos Físicos _____________________________________________ 203
9.2.2 Programación en MATLAB de las ecuaciones diferenciales ________ 204
9.2.3 Representación gráfica de la deshidratación _____________________ 206
9.2.3.1 Programación en MATLAB de la integración de la ecuación
diferencial de la deshidratación celular____________________________ 206
9.2.3.2 Representación gráfica de la deshidratación __________________ 208
V. capítulo 5 ________________________________________________________ 213
V-1. INTRODUCCIÓN ____________________________________________ 213
V-2. PROTOCOLO DE ADICIÓN DE AGENTES CRIOPROTECTORES_ 215
2.1. Introducción _________________________________________________ 215
2.2. Modelo matemático ___________________________________________ 216
2.2.1 Deshidratación inicial por la presencia de crioprotectores en el medio
extracelular.___________________________________________________ 216
2.2.2 Rehidratación progresiva de la célula debido a la entrada de crioprotectores
permeables____________________________________________________ 217
2.3. Resolución numérica para óvulos de ratón no fertilizados _____________ 219
2.3.1 Datos numéricos___________________________________________ 219
2.3.2 Adición de crioprotectores en una sola etapa_____________________ 220
2.3.3 Adición de crioprotectores en varias etapas______________________ 224
V-3. EFECTOS COLIGATIVOS DE LOS CRIOPROTECTORES
PERMEABLES ___________________________________________________ 228
3.1. Introducción _________________________________________________ 228
3.2. Modelo matemático ___________________________________________ 229
3.3. Análisis del efecto de la presencia de crioprotectores permeables en el medio
intracelular______________________________________________________ 232
3.3.1 Estudio de las curvas de deshidratación_________________________ 232
3.3.2 Estudio de las curvas de deshidratación a temperatura constante _____ 235
3.3.3 Estudio de las curvas de subenfriamiento _______________________ 239
3.3.4 Estudio de las curvas de flujo osmótico_________________________ 241
3.3.5 Estudio de las curvas de concentración de cloruro sódico___________ 243
VI. capítulo 6 _______________________________________________________ 246
VI-1. INTRODUCCIÓN____________________________________________ 246
VI-2. ANÁLISIS DEL LÍMITE DE SOLUBILIDAD SIN PRESENCIA DE
CRIOPROTECTORES ____________________________________________
2.1. Diagramas de Fases. Los Sistemas Eutécticos Simples________________
2.1.1 Interpretación del Diagrama de Fases __________________________
2.1.1.1 Curva de solubilidad ____________________________________
2.1.2 Análisis de grados de libertad ________________________________
2.1.3 Ejemplo _________________________________________________
248
248
248
249
251
256
4
ÍNDICE DE CONTENIDOS
2.2. Efecto de la solubilidad en el proceso de deshidratación_______________ 258
2.2.1 Primera Etapa de Deshidratación______________________________ 258
2.2.2 Segunda Etapa de Deshidratación _____________________________ 259
2.2.2.1 Caso 1: La solución líquida saturada extracelular desaparece después
de alcanzar el equilibrio con el medio intracelular ___________________ 261
2.2.2.2 Caso 2: La solución líquida saturada extracelular desaparece
instantáneamente _____________________________________________ 266
2.3. Modelos teóricos de deshidratación con disoluciones saturadas _________ 272
2.3.1 Modelo de deshidratación celular con el medio extracelular con
composición constante __________________________________________ 272
2.3.1.1 Hipótesis de la Capa Líquida Saturada ______________________ 272
2.3.1.2 Modelo matemático de la deshidratación ____________________ 273
VI-3. ANÁLISIS DEL LÍMITE DE SOLUBILIDAD CON PRESENCIA DE
CRIOPROTECTORES PERMEABLES ______________________________ 275
3.1. Diagramas ternarios ___________________________________________ 275
3.1.1 interpretación del diagrama de fases ternario tridimensional ________ 275
3.1.2 Diagrama de fases bidimensional _____________________________ 280
3.1.2.1 Interpretación del diagrama_______________________________ 280
3.1.2.2 Propiedades de los diagramas bidimensionales _______________ 282
3.1.2.2.1 Coordenadas de un punto del interior del diagrama ________ 282
3.1.2.2.2 Isoplectas _________________________________________ 285
3.1.2.3 Ejemplo ______________________________________________ 286
3.1.3 Diagrama de fases bidimensonal del sistema ternario agua-ClNa-glicerol
_____________________________________________________________ 289
3.1.4 Simplificación de la representación bidimensional de un sistema ternario
_____________________________________________________________ 292
3.2. Efecto de la solubilidad en el proceso de deshidratación_______________ 296
3.2.1 Primera etapa de deshidratación_______________________________ 296
3.2.2 Segunda etapa de deshidratación ______________________________ 298
3.2.3 Tercera etapa de deshidratación_______________________________ 300
3.2.4 Cuarta etapa de deshidratación________________________________ 302
3.2.4.1 La solución líquida saturada extracelular desaparece después de
alcanzar el equilibrio con el medio intracelular _____________________ 303
3.2.4.2 La solución líquida saturada extracelular desaparece instantáneamente
___________________________________________________________ 308
3.3. Modelos teóricos de deshidratación con disoluciones saturadas _________ 314
3.3.1 Modelo de deshidratación con medio intracelular saturado en cloruro
sódico _______________________________________________________ 314
3.3.2 Curva de descenso crioscópico ideal cuando la solución intracelular está
saturada en cloruro sódico________________________________________ 316
3.3.3 Modelo de deshidratación con la solución intracelular saturada en cloruro
sódico, con el medio extracelular saturado en cloruro sódico y crioprotector 317
VII. anexo programas ________________________________________________ 319
VII-1. PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 4. LA DESHIDRATACIÓN
CELULAR _______________________________________________________ 319
VII-2. PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 5. LOS CRIOPROTECTORES ___ 370
VII-3. PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 6. EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD 387
VIII. bibliografía ____________________________________________________ 431
5
ÍNDICE DE CONTENIDOS
6
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
I. CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
I-1. EQUILIBRIO DE FASES EN SISTEMAS DE UN COMPONENTE
1.1. REGLA DE LAS FASES
Se define el número de grados de libertad L de un sistema en equilibrio,
como el número de variables intensivas independientes necesarias para
especificar su estado intensivo, es decir, su estado termodinámico a excepción
del tamaño de sus fases.
Vamos a establecer el estado intensivo de un sistema termodinámico
mediante las variables intensivas temperatura, presión, y las fracciones
molares de todas las especies químicas en cada una de las fases. Hemos
supuesto que en todas las fases tengo la misma temperatura y presión.
Para determinar el número de grados de libertad del sistema supondremos
que no hay reacciones químicas, y que todas las especies químicas están en
todas las fases.
• Número de variables intensivas: sea C el número de especies
químicas presentes en cada una de las fases, y sea F el número de
fases del sistema. El número de variables que habría que especificar
para establecer el estado termodinámico del sistema sería:
o C·F variables correspondientes a las fracciones molares.
o 1 correspondiente a la temperatura.
o 1 correspondiente a la presión.
o En total C·F+2
• Número de ecuaciones: no todas las variables intensivas
anteriores son independientes.
c
o F ecuaciones asociadas a la igualdad
∑x
i =1
i
= 1 en cada
fase, donde xi es la fracción molar del componente i.
o F-1 ecuaciones asociadas a µ iα = µ iβ = µ iδ = L para cada
especie química, donde µτi son los potenciales químicos de los
componentes i en cada una de las fases τ del sistema. Para todas
las especies químicas tendremos C·(F-1).
o En total F+C·(F-1)
El número de grados de libertad del sistema será L=F·C+2-F-C·(F-1)=CF+2.
7
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
El número de grados de libertad si no consideramos la hipótesis de que
existan todas las especies químicas en todas las fases es L=C-F+2, es decir,
igual que antes. La razón es que la especie i que se encuentra ausente de una
fase δ reduce el número de variables en uno, pues su fracción molar será cero
en dicha fase, es decir, ya no es una variable pues conocemos su valor.
También se reduce el número de ecuaciones en uno puesto que en el equilibrio
el potencial químico de dicha especie en la fase δ no tiene porque igualarse
con el resto de los potenciales químicos.
El número de grados de libertad si no consideramos la hipótesis de que no
existan reacciones químicas es L=C-F+2-r donde r es el número de ecuaciones
independientes y que introducen una condición de equilibrio químico de la
forma:
c
∑ν
i =1
i
⋅ µ i = 0 Ec. 1
donde νi son los coeficientes estequiométricos de las especies químicas
presentes en la reacción.
Relaciones debidas a condiciones estequiométricas o de electroneutralidad
reducen en a el número de grados de libertad L=C-F+2-r-a, donde por tanto a
es el número de ecuaciones adicionales asociadas a relaciones de
estequiometría u otro tipo de propiedad.
8
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
1.2. ECUACIÓN DE CLAPEYRON
Esta ecuación nos permitirá calcular la pendiente de una curva de equilibrio
entre dos fases en el diagrama Temperatura-Presión en un sistema de un
componente.
Consideremos un sistema compuesto por dos fases α y β que se
encuentran inicialmente en equilibrio termodinámico (estado 1). Mediante un
proceso infinitesimal modificamos la temperatura y la presión de manera que el
sistema en el estado final se encuentre de nuevo en equilibrio termodinámico
(estado 2):
En el equilibrio de fases se cumple µ α = µ β .
Como los potenciales químicos son por definición las energías libres de
Gibbs molares en sistemas de un solo componente, podemos escribir la
igualdad anterior de la forma:
G mα = G mβ Ec. 2
El sistema en el estado 1 cumplirá:
G mα ,1 = Gmβ ,1 Ec. 3
El sistema en el estado 2 cumplirá:
G mα , 2 = Gmβ , 2
⇒ G mε ,1 + dG mα = G mβ ,1 + dG mβ Ec. 4
Sustituyendo Ec.3 en Ec.4 tenemos:
dG mα = dG mβ Ec. 5
Teniendo en cuenta la expresión de la energía libre de Gibbs molar:
dG m = − S m ⋅ dT + Vm ⋅ dp Ec. 6
9
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
donde Sm es la entropía molar y Vm es el volumen molar, la igualdad de las
variaciones infinitesimales de energía libre de Gibbs molar parcial queda :
− S mα ⋅ dT + V mα ⋅ dp = − S mβ ⋅ dT + V mβ ⋅ dp Ec. 7
Reordenando, tenemos:
∆S
dp ∆S m
n = ∆H Ec. 8
=
=
dT ∆Vm ∆V
T ⋅ ∆V
n
donde hemos tenido en cuenta que la variación de entropía se produce en un
cambio de fase reversible y a presión constante.
• Equilibrio líquido-vapor y sólido-vapor: en estas condiciones se
cumple que Vm,gas<<Vm,liq , Vm,solido y por tanto podemos aproximar la
variación de volumen molar por el volumen molar del gas. Si suponemos
que el gas tiene comportamiento ideal entonces la ecuación de
Clapeyron queda :
∆H m
∆H m
dp
=
= p⋅
R ⋅T
dT
R ⋅T 2
T⋅
p
⇒
d ln p ∆H m
=
Ec. 9
dT
R ⋅T 2
En el caso de equilibrio Líquido-Vapor ∆Hm es el calor latente de
vaporización molar. En el caso de equilibrio Sólido-Vapor ∆Hm es el
calor latente de sublimación molar.
• Equilibrio Sólido-Líquido: la hipótesis simplificatoria anterior
(Vm,gas<<Vm,liq , Vm,solido ),no tiene aquí validez. Sin embargo,
aprovechando la elevada inclinación de la curva de fusión del diagrama
Temperatura-Presión podemos afirmar que a menos que la presión
cambie en una cantidad considerable, la variación de la temperatura de
fusión durante el proceso de cambio de fase será pequeña.
2
∫ dp =
1
T2
∆H m, fus
∫ T ⋅ ∆V
T1
m , fus
dT
⇒
p 2 − p1 ≈
∆H m, fus (T1 )
∆Vm , fus (T1 )
⋅ ln
T2
Ec. 10
T1
10
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
1.3. METAESTABILIDAD
Se dice que una fase α es metaestable con respecto a una fase β a unas
temperaturas y presiones dadas, si µα > µβ , es decir la fase β es la más estable
y si además la velocidad de conversión de α a β es lo suficientemente lenta
como para permitir que la fase α exista durante un periodo de tiempo grande en
relación a los tiempos de experimentación.
Ejemplo son los líquidos subenfriados por debajo de sus puntos de
congelación, hasta el punto de que podemos tener agua líquida a –40ºC.
11
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
I-2. DISOLUCIONES
Una disolución es una mezcla homogénea, es decir, un sistema monofásico
con más de un componente.
La composición de una disolución se puede especificar de diferentes
maneras. Un resumen de ellas se detalla a continuación:
• Fracción molar xi : cociente entre los moles de la sustancia i y los
moles totales de la disolución.
• Concentración molar ci : cociente entre los moles de la sustancia i
y el volumen total de la disolución. Cuando lo expresamos en moles por
litro de disolución se denomina molaridad.
• Molalidad mi : cociente entre los moles de sustancia i y la masa de
disolvente expresada en kilogramos.
A continuación vamos a introducir un concepto termodinámico fundamental
para el tratamiento matemático de las disoluciones, la magnitud molar parcial.
2.1. MAGNITUDES MOLARES PARCIALES
Comencemos considerando n1, n2, ..., nr moles de sustancia 1,2,...r a
temperatura T, y a presión p.
Los volúmenes molares de las sustancias puras serán Vm*,1 , Vm*, 2 , K,Vm*,r .
El volumen total de sustancias sin mezclar será:
V * = n1 ⋅ Vm*,1 + n 2 ⋅ Vm*, 2 + L + nr ⋅ Vm*,r Ec. 11
Pues bien, experimentalmente se comprueba que cuando mezclamos las
sustancias 1,2,...,r para formar una disolución, el volumen de la disolución
resultante V, no coincide con la suma de los volúmenes de las sustancias puras
mezcladas V*.
Esta propiedad que hemos descrito para el volumen de la disolución la
cumple cualquier propiedad extensiva de la disolución, como la energía interna,
la entalpía, la entropía, la energía libre de Gibbs, etc.
Nuestro interés se centra en encontrar funciones de la forma Y=Y(T,p,n1,
n2, ...,nr) siendo Y una propiedad extensiva cualquiera de la disolución.
Vamos a realizar los desarrollos para el volumen de la disolución, siendo las
ecuaciones análogas para el resto de propiedades extensivas.
Supongamos que existe una función de la forma V=V(T,p,n1,n2,...,nr). Una
variación infinitesimal del volumen la podremos expresar de la forma:
12
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
dV =
∂V
∂T
dT +
p , ni
∂V
∂p
∂V
j =1 ∂n j
r
dp + ∑
T , ni
dn j
Ec. 12
T , p , n j ≠ ni
Definimos el volumen molar parcial de la sustancia j en la disolución
como la variación que experimenta el volumen de la disolución al variar en una
unidad el número de moles de la sustancia j, manteniendo constante la
temperatura, la presión, y el número de moles del resto de sustancias
presentes en la disolución:
Vj =
∂V
∂n j
Ec. 13
T , p , n j ≠ ni
El volumen molar parcial de la sustancia j es una magnitud intensiva por ser
cociente de dos infinitésimos de propiedades extensivas. Por lo tanto, en
general, una magnitud molar parcial de la sustancia j no dependerá de las
cantidades de sustancias presentes en la disolución, sino de la proporción que
exista entre ellas:
V j = V j (T , p, x1 , x 2 ,K, x r ) Ec. 14
siendo xi
disolución.
las fracciones molares de las sustancias presentes en la
Se puede demostrar muy fácilmente que el volumen molar parcial de una
sustancia pura es igual a su volumen molar:
V j* = n j ⋅ Vm*, j
V j* =
∂V j*
∂n j
=
T , p , n j ≠ ni
∂ (n j ⋅ Vm*, j )
∂n j
= Vm*, j
Ec. 15
T , p , n j ≠ ni
Sin embargo, el volumen molar parcial de un componente j en una
disolución, no es necesariamente igual al volumen molar de j puro.
Al ser el volumen de la disolución V una magnitud extensiva, es
proporcional al número total de moles presentes en la disolución n para una
temperatura, presión, y composición dada:
V = n ⋅ f (T , p, x1 , x 2 ,K , x r ) ⇒ dV = f (T , p, x1 , x 2 ,K , x r ) ⋅ dn Ec. 16
Al ser la temperatura y la presión constantes, la variación del volumen de la
disolución será:
r
r
j =1
j =1
dV = ∑ V j ⋅ dn j = ∑ x j ⋅ V j ⋅ dn Ec. 17
13
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
Combinando ambas ecuaciones obtenemos la función f :
r
 r
 r
f = ∑ x j ⋅ V j ⇒ V = n ⋅  ∑ x j ⋅ V j  = ∑ n j ⋅ V j T,p cte Ec. 18
j =1
 j =1
 j =1
Hemos llegado a la ecuación que estábamos buscando, que nos permite
relacionar el volumen de la disolución, con las cantidades de sustancia que
forman parte de la disolución, siendo el factor de proporcionalidad los
volúmenes molares parciales de cada una de las sustancias presentes, y no,
los volúmenes molares de las sustancias puras como habíamos intentado
establecer al principio.
Para el resto de magnitudes extensivas llegamos a ecuaciones similares:
r
U = ∑ n j ⋅U j
j =1
r
H = ∑nj ⋅ H j
j =1
r
S = ∑nj ⋅ S j
j =1
r
G = ∑nj ⋅Gj
j =1
;U j =
∂U
∂n j
;Hj =
∂H
∂n j
∂S
; Sj =
∂n j
; Gj =
T , p , n j ≠ ni
∂G
∂n j
T , p , n j ≠ ni
Ec. 19
T , p , n j ≠ ni
= µj
T , p , n j ≠ ni
En la última igualdad vemos que la energía libre de Gibbs molar parcial
coincide con la definición que hicimos anteriormente del potencial químico.
Todas las ecuaciones desarrolladas son válidas en procesos a temperatura
y presión constante.
Estas últimas expresiones sugieren interpretar el producto n j ⋅ Y j , donde Y j
es la magnitud molar parcial del componente j de una propiedad extensiva
cualquiera de la disolución, como la contribución del componente j de la
disolución a la propiedad extensiva Y. Sin embargo esta interpretación es
demasiado simplista puesto que debido a las fuerzas intermoleculares Y j es
una propiedad de la disolución en conjunto y no una propiedad exclusiva del
componente j.
Las magnitudes molares parciales Y j dan la velocidad de cambio de la
magnitud extensiva Y en la disolución con respecto al número de moles de la
especie j, en un proceso a temperatura y presión constante.
La interpretación física que podemos dar de una magnitud molar parcial es
la de la variación de la magnitud extensiva de la disolución cuando se añade un
14
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
mol de sustancia j a una disolución de volumen infinito y con composición
x1,x2,...,xr manteniendo la temperatura y la presión constantes.
La mayoría de las relaciones termodinámicas existentes entre propiedades
extensivas las cumplen las magnitudes molares parciales. A modo de ejemplo
vemos lo que ocurre con la energía libre de Gibbs molar parcial:
G = H −T ⋅S ⇒
∂G
∂n j
=
T , p , n j ≠ ni
∂H
∂n j
−T ⋅
T , p , n j ≠ ni
∂S
∂n j
⇒ Gj = µ j = H j −T ⋅ S j
T , p , n j ≠ ni
Ec. 20
A partir de la última igualdad entre magnitudes molares parciales podemos
concluir que se verifican las siguientes igualdades:
∂µ j
∂T
= −S j
∂µ j
;
∂p
p ,n j
= V j Ec. 21
T ,n j
Los potenciales químicos constituyen las propiedades clave de la
termodinámica química. Los potenciales químicos determinan el equilibrio
químico y el equilibrio de fases. Más aún, a partir de los potenciales químicos
se pueden calcular todas las demás propiedades molares parciales y
propiedades termodinámicas de la disolución.
2.2. MAGNITUDES DE MEZCLA
El cambio de magnitud extensiva Y producido en el proceso de mezclar los
componentes puros para formar la disolución a temperatura y presión
constante viene dado por la magnitud de mezcla , que representamos como
∆Ymez que definimos como ∆Ymez=Y-Y*, donde Y es el valor de la magnitud
extensiva en la disolución y Y* es la propiedad extensiva de los componentes
puros sin mezclar.
La magnitud de mezcla más importante es la que afecta a la energía libre de
Gibbs:
r
r
r
j =1
j =1
j =1
(
)
∆Gmez = G − G * = ∑ n j ⋅ µ j − ∑ n j ⋅ G m* , j = ∑ n j ⋅ µ j − µ *j Ec. 22
De la misma forma que se puede obtener S j y V j como derivadas parciales
de µj , también se pueden calcular ∆Smez y ∆Vmez como derivadas parciales de
∆Gmez, de ahí su especial importancia:
∂∆G mez
∂T
= −∆S mez
p,n j
;
∂∆Gmez
∂p
= ∆Vmez Ec. 23
T ,n j
15
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
La determinación experimental de ∆Gmez se lleva a cabo a partir de medidas
de presión de vapor. Por ejemplo en el caso de una disolución de dos
componentes A y B se miden las presiones parciales pA y pB en el vapor que se
encuentra en equilibrio con la disolución y se miden las presiones de vapor p*A
y p*B de A puro y B puro, y siguiendo el siguiente camino isotérmico hipotético
obtengo ∆Gmez:
Vamos a ir calculando cada uno de los incrementos de energía libre de
Gibbs cuya suma será igual a ∆Gmez:
p*A
∆G1 = ∆G1, A + ∆G1, B = ∫ n AV
pB*
*
mA,l
p
*
⋅ dp + ∫ n BVmB
,l ⋅ dp Ec. 24
p
• ∆G2 = 0 por ser un cambio de fase reversible.
∆G3 = ∆G3, A + ∆G3, B =
pA
∫n V
A
p *A
pB
*
mA, g
*
⋅ dp + ∫ n BVmB
, g ⋅ dp Ec. 25
p B*
• ∆G 4 = ∆Gmez gas ideal .Suponemos comportamiento de gas ideal:
o Potencial químico de un gas ideal puro: la variación del
potencial químico con la presión la obtenemos a partir de la
ecuación de Gibbs dG=-S·dT+V·dp. En una sustancia pura se
cumple G/n=Gm=µ. Así la variación infinitesimal del potencial
químico la podremos escribir como dµ=-Sm·dT+Vm·dp siendo Sm ,
Vm magnitudes molares.
La variación del potencial químico de un gas ideal en un proceso a
temperatura constante será :
dµ =
p
R ⋅T
dp ⇒ µ (T , p 2 ) − µ (T , p1 ) = RT ⋅ ln 2 Ec. 26
p
p1
16
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
Sea p1 la presión normal p 0 = 1 atm .
Entonces µ (T , p1 ) = µ 0 (T ) el potencial químico normal del gas.
Con esta referencia del potencial químico normal a una
temperatura dada, el potencial químico de un gas ideal a una
temperatura T y a una presión p lo podemos expresar como:
µ (T , p ) = µ 0 (T ) + RT ⋅ ln
p
Ec. 27
p0
o Potencial químico de una mezcla de gases ideales: una
mezcla de gases es ideal si cumple:
§ La ecuación de estado p·V=ntot·R·T siendo ntot el
número total de moles del gas.
§ Si la mezcla se encuentra separada del gas puro i por
una membrana rígida, diatérmica, y permeable sólo al
componente i entonces en el equilibrio la presión parcial
pi=xi ·p del gas i en la mezcla es igual a la presión del
sistema constituido por el gas i puro.
Vamos a definir el estado normal del componente i de una
mezcla de gases ideales a la temperatura T como el gas ideal i
puro a la temperatura T y a la presión p0 =1 atm.
Supongamos que tenemos un recipiente dividido en dos partes
por una membrana permeable solamente al componente i . En
una mitad del recipiente tenemos una mezcla de gases ideales, y
en la otra mitad gas i puro a la misma temperatura:
La condición de equilibrio con una membrana permeable sólo
al componente i es la igualdad de potenciales químicos :
17
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
µ i (T , p, x1 , x 2 ,K , x r ) = µ i* (T , p i* ) = µ i* (T , pi ) Ec. 28
La última igualdad se debe a la segunda condición que deben
cumplir las mezclas de gases ideales.
Por lo tanto el potencial químico del componente i en una
mezcla de gases ideales a la temperatura T y a la presión P es
igual al potencial químico del gas puro i a la temperatura T y a la
presión pi :
µ i (T , P, x1 , x 2 , K, x r ) = µ i0 (T ) + RT ⋅ ln
pi
Ec. 29
p0
Teniendo en cuenta esta última expresión, se puede
comprobar muy fácilmente que ∆G4 es cero.
• ∆G5 = 0 por ser un cambio de fase reversible.
∆G 6 =
P
P
p A + pB
p A + pB
∫ V ⋅ dp = ∫ n
P
A
⋅ VmA,l dp +
∫n
B
⋅ VmB,l dp Ec. 30
p A + pB
Despreciando las integrales que involucran a los volúmenes molares y a los
volúmenes molares parciales de los líquidos frente a las integrales de los
volúmenes molares de los gases, y teniendo en cuenta el comportamiento ideal
de los gases llegamos a la siguiente expresión aproximada para ∆Gmez:
∆G mez = n A ⋅ R ⋅ T ⋅ ln
pA
p
+ n B ⋅ R ⋅ T ⋅ ln B*
*
pA
pB
Ec. 31
18
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
I-3. DISOLUCIONES IDEALES
Desde el punto de vista microscópicos se define una disolución ideal como
aquella en la cual las moléculas de las distintas especies son tan semejantes
unas a otras que las moléculas de uno de los componentes pueden sustituir a
las moléculas de otro componente de la disolución sin que se produzca una
variación en la estructura espacial de la disolución o de la energía de las
interacciones intermoleculares presentes en la disolución.
Este modelo sirve de referencia a la hora de discutir el comportamiento de
las disoluciones reales.
Sin embargo dado que la termodinámica obvia la estructura molecular de la
materia esta definición de disolución ideal que hemos dado no tiene sentido
dentro de ella.
Así conviene definir alternativamente a la disolución ideal como aquella que
cumple la siguiente relación:
r
∆G mez = R ⋅ T ⋅ ∑ n j ⋅ ln x j Ec. 32
j =1
Vamos a llegar a esta conclusión mediante la mecánica estadística. Vamos
a partir de la definición molecular de disolución ideal para deducir la definición
termodinámica.
Partimos de un recipiente que contiene dos tipos de moléculas C y B
separadas por una pared (estado 1). A continuación retiramos la pared
llegándose a una situación final de mezcla homogénea (estado 2).
Como las moléculas C y B no tienen diferencias en cuanto a interacciones
intermoleculares, tamaños, y forma (definición molecular de la disolución ideal),
las moléculas no tienen ninguna preferencia hacia ninguna localización
particular, por lo que se encontrarán distribuidas de forma aleatoria, al igual que
ocurre cuando se mezclan dos gases ideales. Por lo tanto la probabilidad de
estados en una mezcla de gases ideales es la misma que en una disolución
ideal, hasta el punto que una mezcla de gases ideales es una disolución ideal.
Podemos aplicar la mecánica estadística para calcular la entropía en gases
ideales a nuestro caso de disoluciones ideales:
∆Gmez = ∆H mez − T ⋅ ∆S mez
∆H mez = ∆U mez + p ⋅ ∆Vmez = 0
Ec. 33
pues ∆Umez y ∆Vmez son cero por la definición molecular de la disolución ideal.
19
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
∆S mez = k ⋅ ln
p2
Ec. 34
p1
Tanto para una mezcla de gases ideales como para una disolución ideal, la
probabilidad de que una molécula cualquiera se encuentre en la parte izquierda
de la mezcla es igual a V*B / V donde V*B es el volumen de B antes de la mezcla
y V es el volumen de la mezcla. Por lo tanto la probabilidad del estado inicial
será:
V * 
p1 =  B 
V 
NB
V * 
⋅  C 
V 
NC
V * 
=  B 
V 
nB ⋅ N A
V * 
⋅  C 
V 
nC ⋅ N A
Ec. 35
La probabilidad del estado final es uno pues es el estado de equilibrio, es
decir:
p2 = 1. Ec. 36
Por lo tanto la entropía de mezcla se obtiene sustituyendo las ecuaciones
Ec.35 y Ec.36, en la ecuación Ec34:
∆S mez
R
=
⋅ ln
NA
  V *  nB
 B 
  V 

nC
r
  V *  nB
 VC*  
B





= − R ln  + ln   = − R ⋅ ∑ n j ⋅ ln x j
  V 
j =1
 V  
1
V * 
⋅  C 
V 
nC




NA
Ec. 37
Sustituyendo Ec.36 en Ec.33 obtenemos la definición termodinámica de las
disoluciones ideales.
3.1. POTENCIAL QUÍMICO
Vamos a obtener la expresión del potencial químico de un componente
cuando este se encuentra formando parte de una disolución ideal. Para ello
emplearemos la definición termodinámica de disolución ideal, que hemos
obtenido anteriormente:
r
(
)
r
(
∆G mez = G − G * = ∑ n j ⋅ G j − Gm* , j = ∑ n j ⋅ µ j − µ *j
j =1
j =1
)
Ec. 38
r
∆G mez = RT ⋅ ∑ n j ⋅ ln x j
j =1
Igualando ambas expresiones llegamos a la expresión del potencial químico
buscado:
µ j (T , p, x j ) = µ *j (T , p ) + RT ⋅ ln x j
Ec. 39
20
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
Se define el estado estándar de cada especie química j en una disolución
líquida ideal como el líquido j puro a la temperatura y presión de la disolución:
µ 0j = µ *j (T , p ) Ec. 40
Por lo tanto la expresión del potencial químico en función del estado
estándar será:
µ j (T , p, x j ) = µ 0j + RT ⋅ ln x j Ec. 41
3.2. PRESIÓN DE VAPOR. LA LEY DE RAOULT
La presión P del sistema de la figura es igual a la presión de vapor cuando
la disolución está en equilibrio con su vapor. La presión de vapor P es la suma
de las presiones parciales de los gases:
P = ∑ pj
;
p j = x j,g ⋅ P
j
La condición de equilibrio de fases entre una disolución ideal y su vapor es
la igualdad de potenciales químicos: µj,l = µj,g.
Para una mezcla de gases ideales, el potencial químico de un componente
será:
µ j , g = µ 0j , g (T ) + RT ln
pi
Ec. 42
p0
Para una disolución ideal, el potencial químico de un componente será,
según la ecuación Ec.39:
µ j ,l = µ *j ,l (T , P) + RT ln x j Ec. 43
21
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
Si consideramos el componente j puro en equilibrio con su vapor se
cumplirá otra igualdad de potenciales químicos:
µ (T , p ) = µ
*
j ,l
*
j
*
j,g
(T , p ) = µ
*
j
0
j,g
(T ) + RT ln
p *j
p0
Ec. 44
Podemos sustituir la expresión de µ*j,l (T,p*j) donde aparece µ*j,l (T,P) en la
ecuación Ec43 , puesto que los potenciales químicos de los compuestos en la
disolución son poco sensibles a las variaciones de presión. Esta sustitución
será tanto mejor cuanto más próximos sean los valores de las presiones de
vapor de cada uno de los componentes a la presión total del sistema.
µ
0
j,g
(T ) + RT ln
p *j
p
0
+ RT ln x j = µ 0j , g (T ) + RT ln
pj
p0
Ec. 45
Despejando llegamos a la Ley de Raoult para disoluciones ideales:
p j = x j ,l ⋅ p *j
⇒ x j , g ⋅ P = x j ,l ⋅ p *j
Ec. 46
donde P es la presión de vapor de la disolución, pj es la presión parcial del
componente j en la disolución, y p*j es la presión de vapor del componente j
puro.
22
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
I-4. DISOLUCIONES DILUIDAS IDEALES
Como en el apartado anterior comenzaremos con una definición molecular
de este tipo de sistemas, y a continuación plantearemos una definición
termodinámica alternativa.
En una disolución diluida ideal las moléculas de soluto prácticamente sólo
interaccionan con moléculas de disolvente, dada la elevadísima dilución de los
solutos. La teoría que vamos a desarrollar sólo es válida para disoluciones de
no electrolitos. En disoluciones de electrolitos las intensas fuerzas entre iones
dan lugar a interacciones entre moléculas de soluto considerables, por lo que el
modelo de disolución diluida no es válido en disoluciones de electrolitos,
incluso a muy altas diluciones.
A diferencia de las disoluciones ideales, donde todas las especies químicas
tenían la misma “categoría”, cumpliendo las mismas ecuaciones (sólo
obtuvimos una ecuación para el potencial químico), en las disoluciones diluidas
ideales se diferencian dos tipos de sustancias, los solutos y los disolventes,
que verificarán ecuaciones diferentes. Utilizaremos la letra A para referirnos al
disolvente, y la letra i para referirnos a cualquiera de los solutos.
Por los mismos razonamientos que en el caso de las disoluciones ideales
necesitamos una definición termodinámica alternativa de una disolución diluida
ideal.
Para ello vamos a plantear un experimento. Partimos de una disolución
diluida ideal, a la que vamos a añadir una cierta cantidad de disolvente, para
obtener una nueva disolución diluida ideal. Este proceso se conoce como
dilución.
23
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
Primeramente vamos a obtener una expresión para la energía libre de
mezcla ∆Gmez del proceso de dilución anteriormente descrito, a partir de
conceptos termodinámicos. A continuación obtendremos la misma variable a
partir de la mecánica estadística. Al comparar ambas expresiones llegaremos a
las ecuaciones de los potenciales químicos en las disoluciones diluidas ideales.
Vamos a obtener ∆Gmez a partir de la termodinámica; relacionaremos de
esta manera ∆Gmez con los potenciales químicos de cada uno de los
componentes de la mezcla. Por definición la energía libre de Gibbs de mezcla
se define como sigue:
∆G mez = G2 − (G1 + G *A ) Ec. 47
Las expresiones de las energías libres de Gibbs anteriores son:
G1 = ni ⋅ µ i ,1 + n A,1 ⋅ µ A,1
G *A = (n A, 2 − n A,1 ) ⋅ µ *A
Ec. 48
G 2 = n i ⋅ µ i , 2 + n A, 2 ⋅ µ A , 2
Sustituyendo valores obtenemos:
(
)
(
∆Gmez = ni ⋅ (µ i , 2 − µ i ,1 ) + n A, 2 ⋅ µ A, 2 − µ *A − n A,1 ⋅ µ A,1 − µ *A
)
Ec. 49
A continuación vamos a obtener ∆Gmez a partir de la mecánica estadística ;
relacionaremos de esta manera ∆Gmez con la composición de la mezcla, para
ser más exactos con las fracciones molares de los solutos y el disolvente.
Se puede demostrar muy fácilmente que la energía libre de Gibbs de
mezcla del proceso de dilución es igual a la energía libre de Gibbs de mezcla
del proceso de formación de la disolución diluida ideal 2 menos la energía libre
de Gibbs de mezcla del proceso de formación de la disolución diluida ideal 1:
∆Gmez (T , P, ni , n A , ∆n A ) = ∆Gmez (T , P, ni , n A, 2 ) − ∆Gmez (T , P, ni , n A,1 ) Ec. 50
24
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.
25
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
I-5. DISOLUCIONES NO IDEALES
Los potenciales químicos en sistemas no ideales normalmente son
expresados en términos de actividades y coeficientes de actividad, por lo que
nuestro primer objetivo será definir estas magnitudes y ver cómo se miden.
5.1. ACTIVIDADES Y COEFICIENTES DE ACTIVIDAD
Para una disolución ideal o diluida ideal de no electrolitos, el potencial
químico de cada componente es:
µ
id
i
= µ + RT ln xi
0
i
⇒
 µ iid − µ i0
xi = exp
 RT



Ec. 51
donde µ0i es el potencial químico en el estado normal adecuadamente definido.
Una disolución no ideal se define como aquella que no es ni ideal ni diluida
ideal. Elegimos expresar los potenciales químicos no ideales µi de cada
componente de una forma que recuerde lo más posible a los potenciales
químicos ideales:
o El potencial químico del estado normal µ0i de cada componente
se elegirá de forma que se corresponda con el estado normal usado en
una disolución ideal o diluida ideal.
o Definimos la actividad ai de la sustancia i en cualquier disolución,
ideal o no, de no electrolitos como:
 µ − µ i0
a i = exp i
 RT

 Ec. 52

De esta manera obtenemos una expresión para el potencial químico
de cualquier disolución, que se parece mucho a las de las disoluciones
ideales:
µ i = µ i0 + RT ln a i Ec. 53
Teniendo en cuenta que el estado normal de una disolución ideal o diluida
ideal coincide con el de una disolución no ideal, la diferencia entre el potencial
químico de una disolución ideal y el potencial químico de una disolución no
ideal será:
µ i − µ iid = RT ⋅ ln
ai
Ec. 54
xi
26
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
El cociente ai / xi se define como el coeficiente de actividad, y lo denotamos
por γi . Este coeficiente es una medida de la discrepancia con respecto al
comportamiento ideal.
El potencial químico de una disolución no ideal expresado en función del
coeficiente de actividad queda:
µ i = µ i0 + RT ⋅ ln (γ i ⋅ xi ) Ec. 55
Tanto la actividad como el coeficiente de actividad son función de la
temperatura, la presión, y la composición de la disolución:
a i = a i (T , P, x1 , x 2 ,K)
γ i = γ i (T , P, x1 , x 2 ,K) Ec. 56
Al igual que el potencial químico, la actividad ai da la tendencia de escape
del componente i de la disolución.
5.2. ESTADOS NORMALES DE DISOLUCIONES NO IDEALES
Existen dos tipos diferentes de convenios de estado normal.
a) Convenio Ι : se usa para disoluciones donde las fracciones
molares de todos los componentes pueden variar en un amplio intervalo.
Es el estado normal que emplearemos cuando queramos comparar
nuestra disolución con una disolución ideal. El Convenio Ι considera
todos los componentes de la disolución a un mismo nivel, sin destacar a
ninguno de ellos como disolvente.
El estado normal de cada componente i como líquido puro a la
temperatura y presión de la disolución:
µ I0,i = µ i* (T , P) Ec. 57
Con la definición dada del estado normal vamos a interpretar el
coeficiente de actividad:
µ i = µ I0,i + RT ln γ I ,i xi = µ i* (T , P ) + RT ln γ I ,i xi Ec. 58
Si xi tiende a uno, entonces la disolución será prácticamente
componente i puro y se cumplirá que µi → µ*i . Teniendo esto en cuenta
en la expresión del potencial químico tenemos:
µ i* = µ i* + RT ln γ I ,i ⋅ 1 ⇒ γ I ,i → 1
si
xi → 1 Ec. 59
El coeficiente de actividad de la especie i tiende a uno, conforme la
composición de la disolución tiende al componente i puro.
27
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
Como el estado normal del Convenio Ι es el mismo que el estado
normal de la disolución ideal tendremos:
µ iid = µ I0,i + RT ln xi
µ i = µ I0,i + RT ln γ I ,i xi
Ec. 60
Vemos que para una disolución ideal γΙ,i es igual a uno. Por lo
tanto para disoluciones no ideales las desviaciones de los
coeficientes de actividad γΙ,i con respecto a la unidad miden el
alejamiento del comportamiento de la disolución con respecto al
comportamiento de la disolución ideal.
b) Convenio ΙΙ : se usa cuando se quiere tratar a uno de los
componentes de la disolución, el disolvente A, de una forma diferente a
los otros componentes, los solutos i. Es el estado normal que
emplearemos cuando queramos comparar nuestra disolución con una
disolución diluida ideal.
a. Disolvente: el estado normal del disolvente se toma como
líquido puro a la presión y temperatura de la disolución:
µ II0 , A = µ *A (T , P) Ec. 61
Con la definición dada del estado normal vamos a comprobar
que cuando la disolución tiende a disolvente puro el coeficiente de
actividad del disolvente tiende a la unidad:
µ A = µ II0 , A + RT ln γ II , A x A = µ *A (T , P) + RT ln γ II , A x A Ec. 62
Si xA tiende a uno, entonces la disolución será prácticamente
disolvente A puro y se cumplirá que µA → µ*A . Teniendo esto en
cuenta en la expresión del potencial químico tenemos:
µ *A = µ *A + RT ln γ II , A ⋅ 1 ⇒ γ II , A → 1
si
x A → 1 Ec. 63
b. Soluto :aquí vamos a seguir el camino inverso. Vamos a
imponer la relación entre γΙΙ,i y xi , y a continuación deducimos
cual es el estado normal compatible con dicha relación.
El estado normal para cada soluto será aquel que verifique :
γ II ,i → 1 cuando
x A → 1 Ec. 64
Ahora de lo que se trata es de determinar cual es el estado
normal de los solutos compatible con la relación anterior.
En el estado normal µi = µ0ΙΙ,i y por lo tanto sustituyendo en la
expresión del potencial químico del soluto :
28
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
µ II0 ,i = µ II0 ,i + RT ln γ II ,i xi
⇒ γ II ,i xi = 1 Ec. 65
Por la definición dada del estado normal de los solutos, el
coeficiente de actividad del soluto será la unidad, γΙΙ,i =1 en el
límite de dilución infinita, es decir cuando xA →1.
En el límite de dilución infinita, se cumple la ecuación del
potencial químico del soluto en una disolución diluida ideal.
Con todo esto podemos afirmar que el estado normal del
soluto es un estado ficticio donde se cumple la ecuación de
solución diluida ideal (γΙΙ,i =1) cuando la fracción molar de soluto es
xi=1. Vemos que en este estado ficticio se cumple
simultáneamente γΙΙ,i =1 y xi=1 por lo que se cumple γΙΙ,i ·xi =1.
Este estado ficticio se corresponde al soluto i puro, en el cual
cada molécula de soluto i experimenta las mismas fuerzas
intermoleculares que experimentaría en una disolución diluida
ideal.
Los estados normales según el Convenio ΙΙ para disolventes y solutos
son los mismos que los usados para disoluciones diluidas ideales. Por lo
tanto en una disolución diluida ideal se cumple que γΙΙ,A =1 y γΙΙ,i =1. Por
lo tanto las desviaciones de γΙΙ,A y γΙΙ,i con respecto a la unidad,
miden el alejamiento del comportamiento de la disolución con
respecto al comportamiento de disolución diluida ideal.
5.3. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDADES Y COEFICIENTES DE ACTIVIDAD
Ambos parámetros normalmente se calculan a partir de medidas de
presiones de vapor durante el equilibrio de fases; el potencial químico de la
disolución será igual al potencial químico de la fase vapor; el potencial químico
de la disolución depende del coeficiente de actividad γi y el potencial químico
de la fase vapor, supuesto una mezcla de gases ideales, depende de las
presiones de vapor de cada componente pi ; midiendo pi determino γi .
a) Convenio Ι: La ley de Raoult para disoluciones no ideales.
Cuando tenemos una disolución en equilibrio con su vapor se cumple
la igualdad de potenciales químicos:
µ i ,l (T , P) = µ i , g (T , P)
µ i ,l (T , P) = µ I0,i (T , P) + RT ln γ I ,i xi = µ i* (T , P) + RT ln γ I ,i xi Ec. 66
µ i , g (T , P ) = µ i0 + RT ln
pi
p0
Planteando el mismo equilibrio para el componente i puro tenemos:
29
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
µ i*,l (T , pi* ) = µ i0 + RT ln
pi*
Ec. 67
p0
Puesto que el potencial químico de los líquidos es poco sensible a la
presión podemos sustituir µ*i (T,P) por la expresión de µ*i,l (T,p*i ) .
Operando llegamos a la Ley de Raoult para disoluciones no ideales:
pi = γ I ,i ⋅ xi ⋅ p i*
⇒ xi , g ⋅ P = γ I ,i ⋅ xi ,l ⋅ pi* Ec. 68
b) Convenio ΙΙ: La ley de Henry en disoluciones no ideales.
Siguiendo los mismos razonamientos que nos llevaron a la ley de
Henry para el caso de disoluciones diluidas ideales, y teniendo en
cuenta ahora que el potencial químico de los solutos en la disolución es
µ i ,l (T , P) = µ II0 ,i (T , P ) + RT ln γ II ,i xi Ec. 69
llegamos a la siguiente formulación de la Ley de Henry para el caso
de disoluciones ideales:
pi = K i (T , P) ⋅ γ II ,i ⋅ xi
⇒ xi , g ⋅ P = K i (T , P) ⋅ γ II ,i ⋅ xi ,l Ec. 70
El disolvente verifica la ley de Raoult : x A, g ⋅ P = γ II , A ⋅ x A,l ⋅ p *A
5.4. COEFICIENTES DE ACTIVIDAD DE SOLUTOS NO VOLÁTILES
Para una disolución de un sólido en un disolvente líquido, la presión parcial
de vapor del soluto sobre la disolución es en general demasiado pequeña como
para poder ser medida. Lo único que es accesibles la presión parcial del
disolvente pA , que nos permitirá calcular el coeficiente de actividad γA en
función de la composición de la disolución.
La ecuación de Gibbs-Duhem nos va a permitir expresar el coeficiente de
actividad del soluto en función del coeficiente de actividad del disolvente. La
ecuación de Gibbs-Duhem en procesos a temperatura y presión constante es:
r
∑n
j =1
j
⋅ dµ j = 0 Ec. 71
siendo r el número de componentes de la disolución. Aplicándolo al caso
particular de una disolución formada por un soluto y un disolvente tenemos:
x A ⋅ dµ A + x B ⋅ dµ B = 0 ⇒
(
)
(
)
x A ⋅ d µ A0 + RT ln γ A x A + x B ⋅ d µ B0 + RT ln γ B x B = 0
Ec. 72
30
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
Operando llegamos a :
d ln γ B = −
xA
⋅ d ln γ A Ec. 73
xB
Integrando:
2
xA
d ln γ A Ec. 74
1
−
x
A
1
ln γ II , B 2 − ln γ II , B1 = − ∫
Si consideramos al estado 1 como disolvente puro, entonces γΙΙ,B1 =1 y la
integral queda:
ln γ II , B =
xA
xA
d ln γ II , A Ec. 75
x
1
−
A
x A =1
∫
5.5. COEFICIENTES DE ACTIVIDAD EN LAS ESCALAS DE MOLALIDAD Y CONCENTRACIÓN
MOLAR
Para disoluciones de sólidos o gases en líquidos, los potenciales químicos
de los solutos suelen expresarse en molalidades mi :
mi =
ni
xi
=
⇒ xi = mi ⋅ x A ⋅ M A Ec. 76
nA ⋅ M A xA ⋅ M A
donde ni , nA son los moles de soluto y disolvente respectivamente, y MA el
peso molecular del disolvente. Sustituyendo la relación entre fracción molar y
molalidad en el potencial químico de un soluto:

m0 
µ i = µ II0 ,i + RT ln γ II ,i ⋅ mi ⋅ x A ⋅ M A ⋅ 0 
m 

Ec. 77
mi 

0
0
µ i = µ II ,i + RT ln M A ⋅ m + RT ln x A ⋅ γ II ,i ⋅ 0 
m 

(
)
donde m0 =1 mol / Kg se introduce para mantener las ecuaciones
dimensionalmente correctas puesto que sólo podemos tomar el logaritmo de
una cantidad adimensional.
Definimos el potencial químico del estado normal en la escala de
molalidades como:
(
µ m0 ,i = µ II0 ,i + RT ln M A ⋅ m 0
)
Ec. 78
Definimos el coeficiente de actividad en la escala de molalidades como:
31
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
γ m,i = x A ⋅ γ II ,i Ec. 79
Nótese que con esta definición γm,i →1 si xA→1.
Con estas definiciones el potencial químico del soluto queda:
m 

µ i = µ m0 ,i + RT ln γ m ,i ⋅ 0i  Ec. 80
m 

Por los mismos razonamientos que en el Convenio ΙΙ el estado normal del
soluto es un estado ficticio donde se cumple la ecuación de solución diluida
ideal, γm,i =1 cuando la molalidad del soluto es la unidad, mi =1.
Para el disolvente se emplea la escala de fracciones molares, que ya hemos
visto anteriormente.
Puesto que los estados normales según el Convenio ΙΙ en la escala de
molalidades para solutos, y el Convenio ΙΙ a secas para el disolvente son los
mismos que los usados para disoluciones diluidas ideales, las desviaciones de
γm,i
y
γΙΙ,A
con respecto a la unidad miden las discrepancias del
comportamiento de la disolución con respecto al comportamiento de la
disolución diluida ideal.
Los potenciales químicos de los solutos también suelen expresarse en
función de las concentraciones molares. Siguiendo los mismos pasos que para
las molalidades llegamos a las siguientes ecuaciones:
c 

µ i = µ c0,i + RT ln γ c ,i ⋅ 0i 
c 

µ c0,i = µ II0 ,i + RT ln Vm*, A ⋅ c 0
(
γ c ,i =
xi
Vm*, A ⋅ ci
)
Ec. 81
⋅ γ II ,i
c 0 = 1 mol / dm 3
Se cumple por la definición de γc,i
que γc,i →1
cuando xA→1.
32
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
A.I)
DISOLUCIONES DE ELECTROLITOS
Un electrolito es una sustancia que produce iones en disolución, lo cual se
pone de manifiesto por el hecho de que la disolución presenta conductividad
eléctrica. Para un disolvente dado, un electrolito se clasifica en fuerte y débil,
según que la disolución a concentraciones moderadas sea un buen o un mal
conductor de la electricidad.
Un cristal de NaCl, CuSO4 , o MgS está formado por iones positivos y
negativos. Cuando un cristal iónico se disuelve en un disolvente polar, los iones
se separan del cristal y quedan solvatados en la disolución. El término
solvatado indica que en la disolución cada ión está rodeado por una envoltura
formada por varias moléculas de disolvente, unidas al ión por fuerzas
electrostáticas. Cuando el disolvente es agua, la solvatación recibe el nombre
de hidratación.
Debido a las fuertes interacciones de largo alcance existentes entre los
iones en la disolución, el uso de coeficientes de actividad al tratar disoluciones
de electrolitos es esencial, incluso para disoluciones muy diluidas. Los iones
positivos y negativos se producen juntos en disolución con lo que hemos de
estudiarlos conjuntamente para determinar sus actividades. Por tanto es
necesario un desarrollo especial de los coeficientes de actividad de los
electrolitos.
Por simplicidad consideraremos una disolución compuesta por un disolvente
A que no es un electrolito, como por ejemplo agua, con un electrolito que da
lugar a dos clases de iones en disolución.
Sea el electrolito i de fórmula Mν+Xν- que al disolverse sigue el siguiente
proceso:
M ν + X ν − ( s) ⇒ ν + M z + ( dis ) + ν − X z − ( dis ) Ec. 82
donde (dis) denota especies en disolución.
A menudo se considera que sales como CuSO4 existen en disolución
acuosa sólo en forma de iones. Esto es inexacto pues salvo para iones donde
ν+=ν-=1, como por ejemplo ClNa, existe una asociación considerable entre
iones de carga opuesta formando lo que se ha dado en llamar par iónico.
El equilibrio de formación de un par iónico en disolución es:
M z + (dis ) + X z − (dis ) ⇔ MX z+ + z− Ec. 83
A continuación plantearemos las ecuaciones de los potenciales químicos de
los solutos y del disolvente en una disolución de electrolitos. Consideremos una
disolución formada por ni moles de un electrolito fuerte i de fórmula Mν+Xν- y nA
moles de disolvente A. Las especies presentes en disolución serán:
33
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
§ nA moles de moléculas de A, con potencial químico µA.
§ n+ moles de iones de Mz+, con potencial químico µ+.
§ n- moles de iones de Xz-, con potencial químico µ-.
§ nPI moles de pares iónicos MX z+ + z− ,con potencial químico
µPI.
a.i.1
POTENCIAL QUÍMICO DEL DISOLVENTE
El potencial químico del disolvente puede expresarse en la escala de
fracciones molares:
µ A = µ *A (T , P ) + RT ln γ xA x A = µ *A (T , P ) + RT ln a A Ec. 84
donde γxA es el coeficiente de actividad en la escala de fracciones molares.
Esta expresión del potencial químico es la misma que la empleada en
disoluciones de no electrolitos no ideales. Por lo tanto la ley de Raoult para
disoluciones no ideales es de aplicación para el disolvente en una disolución de
no electrolito:
p A = a A ⋅ p *A Ec. 85
donde pA es la presión de vapor del disolvente en la disolución, y p*A es la
presión de vapor del disolvente puro. Para llegar a esta ecuación supusimos
que el vapor tenía comportamiento de gas ideal. Cuando el electrolito es no
volátil, pA es aproximadamente la presión de vapor de la disolución.
Al trabajar con disoluciones de electrolitos, el potencial químico del
disolvente también suele expresarse en función del coeficiente osmótico
práctico φ del disolvente.
La definición de φ para una disolución de un electrolito fuerte es:
φ =−
ln a A
µ A − µ *A
Ec. 86
=
M A ⋅ ν ⋅ mi R ⋅ T ⋅ M A ⋅ ν ⋅ mi
Con esta definición, la expresión del potencial químico del disolvente queda:
µ A = µ *A − φ ⋅ R ⋅ T ⋅ M A ⋅ν ⋅ mi Ec. 87
donde ν=ν++ν- , mi es la molalidad estequiométrica del electrolito y MA es la
masa molar del disolvente.
34
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
La razón para usar φ en lugar del coeficiente de actividad del disolvente es
que en disoluciones diluidas de electrolitos, el coeficiente de actividad del
disolvente puede ser muy próximo a la unidad, a pesar de que el coeficiente de
actividad del soluto se desvíe sustancialmente de uno, y el comportamiento de
la disolución diste mucho del comportamiento de disolución diluida ideal.
a.i.2
POTENCIAL QUÍMICO DEL ELECTROLITO
Puesto que en una disolución de electrolitos no podemos variar fácilmente
el número de moles del ión positivo, mientras se mantiene constante el número
de moles del ión negativo, la determinación experimental del potencial químico
de los iones es prácticamente imposible:
µ+ =
∂G
∂n+
µ− =
T , P , n A , n−
∂G
∂n−
Ec. 88
T , P , n A , n+
Por ello no hablaremos del potencial químico del ión positivo y del ión
negativo, sino del potencial químico del electrolito como un todo:
µi =
∂G
∂ni
Ec. 89
T , P ,n A
El siguiente paso será relacionar el potencial químico del electrolito µi con
el de los iones µ+ y µ -.
Para ello plantearemos la ecuación de Gibbs para una disolución de un
electrolito:
dG = − SdT + Vdp + µ A dn A + µ + dn+ + µ − dn− + µ PI dnPI Ec. 90
Teniendo en cuenta que cuando se forman pares iónicos tanto el número de
moles de cationes como el de aniones se reducen en nPI se cumplirá:
n + = ν + ⋅ ni − n PI
n − = ν − ⋅ ni − n PI Ec. 91
La condición de equilibrio para la reacción de formación de pares iónicos es:
∑ν
i
⋅ µ i = 0 ⇒ µ PI = µ + + µ − Ec. 92
Aplicando estas relaciones a la ecuación de Gibbs obtenemos:
dG = − SdT + Vdp + µ A dn A + (ν + µ + + ν − µ − )dni Ec. 93
Teniendo en cuenta la definición de µi , la ecuación anterior nos proporciona
la relación buscada:
35
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
µ i = ν + ⋅ µ + + ν − ⋅ µ − Ec. 94
Estos potenciales químicos se expresan normalmente en la escala de
molalidades:
m 

µ + = µ +0 + R ⋅ T ln γ + ⋅ +0 
m 

m 

µ − = µ −0 + R ⋅ T ln γ − ⋅ −0  Ec. 95
m 

Sustituyendo:
ν+
ν−

 m−  
ν+
ν −  m+ 
µ i = ν + ⋅ µ + ν − ⋅ µ + RT ln (γ + ) ⋅ (γ − ) ⋅  0  ⋅  0   Ec. 96
 m   m  

0
+
0
−
Definimos el coeficiente de actividad iónico medio en la escala de
molalidades γ± del electrolito Mν+Xν- como :
(γ ± )ν
= (γ + ) + ⋅ (γ − )
+ +ν −
ν
ν−
Ec. 97
Definimos el potencial químico del estado normal del electrolito como:
µ i0 = ν + ⋅ µ +0 + ν − ⋅ µ −0 Ec. 98
Con estas definiciones el potencial químico del electrolito queda:
ν+
ν−

 m−  
ν  m+ 
µ i = µ + RT ln (γ ± ) ⋅  0  ⋅  0   Ec. 99
 m   m  

0
i
donde ν = ν + + ν − .
La relación entre las molalidades iónicas m+ y m- y la molalidad del
electrolito mi , dependerá de la existencia o no de asociación iónica:
a.i.2.1 SIN ASOCIACIÓN IÓNICA:
En este caso las molalidades iónicas son:
m + = ν + ⋅ mi
m− = ν − ⋅ mi Ec. 100
Definimos ν± como :
(ν ± )ν = (ν + )ν ⋅ (ν − )ν
+
−
Ec. 101
Con esta definición y teniendo en cuenta la relación entre molalidades
iónicas y la molalidad del electrolito, el potencial químico del electrolito queda:
36
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
m 

µ i = µ i0 + ν ⋅ R ⋅ T ⋅ lnν ± ⋅ γ ± ⋅ 0i  Ec. 102
m 

a.i.2.2 CON ASOCIACIÓN IÓNICA:
Este caso no se va a dar en el desarrollo posterior de nuestro proyecto y por
ello sólo mostraré las ecuaciones.
El potencial químico del electrolito cuando se produce asociación iónica es:
m 

µ i = µ i0 + ν ⋅ R ⋅ T ⋅ lnν ± ⋅ γ i ⋅ 0i 
m 

γi =α
ν+
ν−

ν
⋅ 1 − (1 − α ) ⋅ +
ν−

ν−



ν
Ec. 103
⋅γ ±
donde α es la fracción de iones Mz+ que no se asocia con los iones Xz- para
formar pares iónicos.
A partir de esta expresión del potencial químico podemos obtener el
potencial químico del electrolito sin asociación iónica, tomado α unidad.
Sustituyendo µi por µ0i vemos que el estado normal del electrolito i como
un todo tiene que cumplir la siguiente igualdad:
ν ± ⋅γ i ⋅
mi
= 1 Ec. 104
m0
El estado normal del electrolito i se toma como el estado ficticio donde se
verifica simultáneamente:
γi =1
ν± ⋅
Ec. 105
mi
1 mol
= 1 ⇒ mi =
0
Kg
ν±
m
La actividad ai del electrolito como un todo se define de tal modo que se
satisfaga :
µ i = µ i0 + RT ln a i Ec. 106
Por lo tanto para un electrolito fuerte la expresión de la actividad es:
m 

a i = ν ± ⋅ γ i ⋅ 0i  Ec. 107
m 

37
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
I-6. TEORÍA DE DEBYE-HUCKEL
En 1923 Debye y Huckel desarrollaron un modelo muy simplificado de una
disolución de electrolitos y mediante la mecánica estadística dedujeron
expresiones teóricas para los coeficientes de actividad iónicos en la escala de
molalidades γ+ y γ- .
Debido a la carga de los iones, éstos están sujetos a fuerzas culombianas,
es decir, fuerzas de atracción y repulsión. Estas fuerzas interiónicas de
atracción y repulsión son las que hacen que la distribución de iones no sea
completamente al azar, sino que es de esperar que alrededor de un ion positivo
sea más probable encontrar iones negativos. En realidad si no fuera por el
movimiento térmico de las partículas de soluto y disolvente se obtendría una
configuración perfectamente ordenada similar a la de un cristal iónico. Esto
quiere decir que hay un equilibrio dinámico entre dos causas opuestas: una el
movimiento térmico que tiende a desordenar los iones y otra la atracción
culombiana que tiende a ordenarlos; como consecuencia cada ion está
rodeado de una atmósfera de iones de signo opuesto que en un promedio se
puede considerar de simetría esférica y en la que la carga está uniformemente
distribuida.
La idea esencial de la teoría de Debye-Huckel es suponer que todas las
desviaciones de la idealidad de una disolución son debidas a las interacciones
eléctricas de los iones.
En su modelo los iones se consideran esferas rígidas de diámetro a
cargadas uniformemente. La diferencia de tamaño entre los iones positivos y
negativos se desprecia y a se interpreta como el diámetro iónico medio. El
disolvente A se considera un medio sin estructura con una constante dieléctrica
εr,A .
El potencial químico de un ion de carga i (+ o -) viene dado por la ecuación:
µ i = µ i* + RT ln mi + RT ln γ i
Ec. 108
que se puede representar por
µ i = µ i (ideal ) + µ i (eléctrico) Ec. 109
siendo
µ i (ideal ) = µ i* + RT ln mi
µ i (eléctrico) = RT ln γ i
Ec. 110
donde RTlnγi es la energía libre de Gibbs adicional por mol, debida a la
interacción de las cargas de los iones.
38
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
El potencial químico por ion será:
µ i (eléctrico)
= kT ln γ i Ec. 111
NA
donde NA es el número de Avogadro y k es la constante de Boltzmann.
El objetivo de la teoría es poder calcular esta energía adicional que surge
debido a las interacciones de los iones.
Con el propósito de hacer más claro el desarrollo de la teoría, ésta será
dividida en varias etapas.
1) Ecuación de Poisson.
Supongamos un ion positivo en el origen de coordenadas. El
potencial eléctrico ψ en un punto situado a una distancia r del ion central
viene dado por la ecuación de Poisson:
∇ 2ψ = −
4π
⋅ ρ Ec. 112
εA
donde εA es la constante dieléctrica del disolvente y ρ es la densidad de
carga (carga por unidad de volumen).
Puesto que la distribución de carga alrededor de un ion central tiene
simetría esférica es conveniente usar coordenadas esféricas:
1 d  2 dψ
r
r 2 dr  dr
4π

⋅ ρ Ec. 113
=−
εA

Para poder integrar esta ecuación necesitamos expresar ρ
función de ψ.
en
2) Ecuación de Poisson-Boltzmann.
Si zi es la valencia del ion i, y e es la carga del protón entonces zi ·e
será la carga eléctrica del ion. Como el potencial eléctrico ψ en un punto
se define como el trabajo necesario para llevar la unidad de carga desde
el infinito a dicho punto, zi ·e·ψ será la energía necesaria para colocar
dicho ion en el punto en que el potencial es ψ.
Por otro lado, la expresión de la densidad de carga ρ será:
ρ = z + ⋅ e ⋅ n + + z − ⋅ e ⋅ n − = ∑ z i ⋅ e ⋅ ni
Ec. 114
siendo ni el número de iones i por unidad de volumen.
39
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
Una de las suposiciones más importantes en la teoría de DebyeHuckel es la que se refiere a la distribución de iones en la disolución que
viene dada por la ley de distribución de Maxwell-Boltzmann, es decir:
ni = ni0 ⋅ e
−
z i ⋅e⋅ψ
kT
Ec. 115
donde n0i
es el número de iones por unidad de volumen, con
energía eléctrica igual a cero.
La forma exponencial de esta ley de distribución es un inconveniente
para resolver la ecuación de Poisson. Por ello introducimos la
aproximación de que zi ·e·ψ <<kT para poder linealizarla, desarrollando
en serie:
 z ⋅ e ⋅ψ

ρ = ∑ z i ⋅ e ⋅ ni0 ⋅ 1 − i
+ L Ec. 116
kT


Esto quiere decir que la energía potencial interiónica es mucho menor
que la energía térmica, o que los iones están raramente juntos lo que
restringe el tratamiento a disoluciones muy diluidas.
Teniendo en cuenta que
∑z
i
⋅ ni0 = 0 Ec. 117
y puesto que
ni0 =
ci ⋅ N A
Ec. 118
1000
donde n0i es el número de iones por centímetro cúbico, ci el número de
iones por litro y que en disoluciones diluidas ci=mi ·ρA donde mi es la
molalidad del ion y ρA es la densidad del disolvente, llegamos a :
∑n
0
i
⋅ z i2 =
2ρ A N A 1
⋅ ∑ mi ⋅ z i2 Ec. 119
1000 2
Definimos la magnitud fuerza iónica en la escala de molalidades como:
Im =
1
mi ⋅ z i2 Ec. 120
∑
2
Por lo tanto la expresión de la densidad de carga queda:
ρ=−
e 2 ⋅ψ 2 ρ A N A
⋅
I m Ec. 121
kT
1000
40
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
Sustituyendo en la ecuación de Poisson obtenemos:
1 d  2 dψ  8π ⋅ e 2 N A ρ A I m
⋅ψ Ec. 122
r
=
1000 ⋅ ε A kT
r 2 dr  dr 
Si definimos la magnitud κ como
κ2 =
8π ⋅ e 2 N A ρ A I m
Ec. 123
1000 ⋅ ε A kT
entonces obtenemos
1 d  2 dψ 
2
r
 = κ ⋅ψ Ec. 124
r 2 dr  dr 
que es la ecuación de Poisson-Boltzmann.
La solución es de la forma:
ψ = A⋅
e −κ ⋅ r
e κ ⋅r
+ B⋅
r
r
Ec. 125
donde A y B son constantes de integración.
3) Proceso de carga de un ión.
Como dijimos en un principio la esencia de la teoría de Debye-Huckel
es suponer que las desviaciones del comportamiento ideal son debidas a
la carga de los iones y el objeto de la teoría era poder calcular el
µi(eléctrico) de un ión para poderlo relacionar con el coeficiente de
actividad del mismo.
Supongamos que todos los iones de la disolución están cargados,
excepto el ión central. Sea a la distancia más pequeña a la que pueden
acercarse los iones. Si ψa es el potencial eléctrico en la superficie de la
esfera, el trabajo necesario para cargar ese ión central será:
q
Wi = ∫ψ a ⋅ dq Ec. 126
0
Puesto que el proceso es a temperatura y presión constante, este
trabajo eléctrico se ha de relacionar con la variación de energía libre de
Gibbs del proceso.
41
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
El resultado final que Debye y Huckel obtuvieron fue:
1
ln γ + = −
z +2 ⋅ A ⋅ I m 2
1
1 + B ⋅ a ⋅ I m2
1
ln γ − = −
z −2 ⋅ A ⋅ I m 2
1
1 + B ⋅ a ⋅ I m2
A = (2πN A ρ A )
1
2


e2

⋅
 4πε ε kT 
0
,
r
A


 2N A ρ A 

B = e ⋅ 

 ε 0 ε r , A kT 
1
I m = ∑ mi ⋅ z i2
2
1
3
2
Ec. 127
2
donde a es el diámetro iónico medio, NA es el número de Avogadro, k es la
constante de Boltzmann, e es la carga del protón, ε0 es la permitividad del
vacío, εr,A es la constante dieléctrica relativa del disolvente, ρA es la densidad
del disolvente, e Im es la fuerza iónica en la escala de molalidades.
Aunque la teoría de Debye-Huckel nos da el potencial químico para cada
ión, no los podemos medir experimentalmente. Por lo tanto expresamos el
resultado obtenido en la teoría en términos del coeficiente de actividad iónico
medio:
1
ln γ ± = − z + ⋅ z − ⋅
A ⋅ I m2
1
1 + B ⋅ a ⋅ I m2
Ec. 128
Esta ecuación es razonablemente exacta en disoluciones acuosas donde la
fuerza iónica Im sea menor que 0.1 moles/ Kg.
A una fuerza iónica dada, la teoría funciona mejor cuanto menor es el valor
de z+ ·|z-| ,es decir, que la teoría da resultados más fiables para electrolitos 1:1
(ClNa) que para los 2:2.
42
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
I-7. PROPIEDADES COLIGATIVAS
Cuando se añade un soluto a un disolvente A puro, la fracción molar de A,
xA disminuye. Teniendo en cuenta que se cumple la relación :
∂µ A
∂x A
>0
Ec. 129
T , p , xi ≠ A
una disminución de xA debe traer consigo una disminución del potencial
químico de A. Por lo tanto la adición a temperatura y presión constante de un
soluto reduce el potencial químico del disolvente µA por debajo del valor
correspondiente al soluto puro µ*A.
Esta variación del potencial químico del disolvente modifica la presión de
vapor, el punto de ebullición normal, el punto de congelación normal, y da lugar
al fenómeno de la presión osmótica.
Estas cuatro propiedades son las propiedades coligativas. La principal
característica de estas propiedades es que dependen fundamentalmente del
número de moléculas presentes en disolución y no de su naturaleza.
De las cuatro propiedades coligativas sólo desarrollaremos en este capítulo
dos de ellas, la disminución de la presión de vapor, y el descenso del punto de
congelación. El aumento del punto de ebullición no lo describimos por carecer
de interés en el estudio de este proyecto. Por el contrario el fenómeno de la
presión osmótica lo desarrollaremos en el siguiente capítulo por su especial
interés en los desarrollos posteriores del proyecto.
7.1. DISMINUCIÓN DE LA PRESIÓN DE VAPOR
Puesto que el potencial químico µA es una medida de la tendencia a
escapar de la disolución, por lo que la disminución del potencial químico del
disolvente originada por la adición de soluto hace que la presión parcial de
vapor pA del disolvente en la disolución sea menor que la presión de vapor p*A
del disolvente puro.
Para cuantificar esta reducción supondremos que la disolución está formada
por un soluto no volátil y un disolvente volátil, de manera que la contribución del
soluto a la presión de vapor de la disolución es despreciable. De esta manera
la presión de vapor de la disolución P es debida únicamente a la presencia del
disolvente A.
Esta condición se cumple para casi todos los solutos sólidos. Para
simplificar supondremos que las presiones son lo suficientemente bajas como
para considerar hipótesis de gas ideal.
La ley de Raoult para disoluciones no ideales es :
P = p A = γ A ⋅ x A ⋅ p *A Ec. 130
43
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
La reducción de la presión de vapor es por definición ∆P=P- p*A.
Sustituyendo en la ley de Raoult obtenemos:
∆P = (γ A ⋅ x A − 1) ⋅ p *A
∆P = (γ A ⋅ (1 − ∑ x B ) − 1) ⋅ p *A
Ec. 131
siendo xB las fracciones molares de los solutos presentes en la disolución.
Vemos que ∆P es independiente de la naturaleza de los solutos.
44
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
7.2. DESCENSO DEL PUNTO DE CONGELACIÓN
En el punto de congelación normal T*f del disolvente puro, las fases sólidas
A(s) y líquida A(l) se encuentran en equilibrio y sus potenciales químicos son
iguales:
µ *A( s ) = µ *A(l ) Ec. 132
Por debajo de T*f el sólido puro A es más estable que el líquido puro A,
cumpliéndose la desigualdad:
µ *A( s ) < µ *A(l ) Ec. 133
puesto que la fase pura más estable es aquélla con el valor más bajo del
potencial químico.
La adición de soluto al disolvente líquido puro a temperatura y presión
constante, siempre reduce µA y por tanto se cumplirá la desigualdad :
µ A( dis ) < µ *A(l ) Ec. 134
tal como puede apreciarse en la figura adjunta:
Esto hace que la intersección de las curvas de A(dis) con A(s) aparezca a
una temperatura menor que en el caso de la intersección de A(l) con A(s).
Por tanto el punto de congelación de la disolución Tf es menor que el punto
de congelación del disolvente puro A, T*f .
A continuación vamos a calcular la expresión de partida que nos permitirá
calcular en base a ciertas hipótesis simplificatorias el descenso del punto de
congelación de un disolvente A debido a un soluto B. Supondremos que
45
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
únicamente la sustancia A pura se congela en la disolución cuando ésta se
enfría hasta su punto de congelación.
La condición de equilibrio en el punto de congelación normal, es decir a 1
atm de presión, es aquella en la que los potenciales químicos del sólido A puro
y de A en la disolución deben de ser iguales:
µ *A( s ) (T f , P ) = µ A( dis ) (T f , P)
µ *A( s ) (T f , P ) = µ *A(l ) (T f , P ) + R ⋅ T f ⋅ ln a A
Ec. 135
El potencial químico de una sustancia pura es igual a la energía libre de
Gibbs molar G*m , por lo que podemos escribir:
ln a A =
Gm* , A( s ) (T f , P ) − Gm* , A(l ) (T f , P )
R ⋅Tf
=
∆Gm* , fus , A (T f , P )
R ⋅Tf
Ec. 136
Teniendo en cuenta que la variación de la energía libre de Gibbs molar con
la temperatura a presión constante es igual a la entropía molar cambiada de
signo, al derivar la ecuación anterior con respecto a la temperatura a presión
constante obtenemos:
∂ ln a A
∂T f
=
∆S m* , fus , A (T f , P)
R ⋅Tf
P
+
∆G m* , fus , A (T f , P)
R ⋅ T f2
∆Gm* , fus , A (T f , P ) = ∆H m* , fus , A (T f , P) − T f ⋅ ∆S m* , fus , A (T f , P )
∂ ln a A
∂T f
=
∆H m* , fus , A (T f , P)
R ⋅ T f2
P
d ln a A =
Ec. 137
∆H m* , fus , A (T f )
R ⋅ T f2
dT f
Integrando entre los estados 1 y 2 se llega a:
ln
a A, 2
a A,1
2
=∫
1
∆H m* , fus , A (T f )
R ⋅Tf
dT f Ec. 138
Si consideramos al estado 1 como la sustancia A pura, entonces Tf,1 será el
punto de congelación de A puro T*f y aA,1=1 quedando la ecuación anterior:
46
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
Tf
∆H m* , fus , A (T )
Tf
R ⋅T
ln γ A x A = ∫ *
dT Ec. 139
Para mostrar gráficamente la reducción del descenso del punto de
congelación, vamos a aplicar la ecuación anterior a una disolución diluida ideal.
Supondremos que la entalpía de fusión no dependerá de la temperatura.
La ecuación que describirá el descenso del punto de congelación en este
caso particular será:
∆H m* , fus , A
∆H m* , fus , A  1
1 
∆T

ln x A = −
⋅
⋅
− * =−


R
R
T f ⋅ T f*
 Tf Tf 
Ec. 140
donde ?T=T*f - Tf , es el descenso crioscópico.
La representación gráfica de la ecuación anterior para el caso del agua es:
DESCENSO CRIOSCÓPICO DEL AGUA
5
0
Temperatura/(ºC)
-5
-10
-15
-20
-25
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
Fracción molar de soluto
0.16
0.18
0.2
47
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS
Es usual emplear una ecuación de descenso crioscópico aun más
simplificada. Para disoluciones diluidas Tf y T*f no son muy diferentes y por
tanto se puede reemplazar Tf ·T*f por Tf*2.
Al ser la solución diluida, xA será muy próximo a la unidad, y por lo tanto
ln xA˜ -xA.
Así la ecuación de descenso crioscópico queda:
xA =
∆H m , fus , A ∆T
⋅ *2 Ec. 141
R
Tf
Como consecuencia de que estamos considerando una disolución diluida,
podemos escribir:
xA =
moles soluto
moles soluto
≈
Ec. 142
moles soluto + moles disolvente moles disolvente
wB
xA =
wA
MB
Ec. 143
MA
donde wA y wB son las masas de disolvente y soluto respectivamente, y MA y
MB son los pesos moleculares de disolvente y soluto respectivamente.
Aplicando la simplificación anterior a la ecuación de descenso crioscópico
obtenemos:
∆T =
R ⋅ T f*2
∆H m , fus , A
⋅
R ⋅ T f*2
wB ⋅ M A
1000 ⋅ wB
=
⋅
= K f ⋅ m Ec. 144
w A ⋅ M B 1000 ⋅ ∆H m , fus , A M A M B ⋅ w A
donde Kf es la constante de descenso molal o constante crioscópica, una
constante para cada disolvente, ya que dependerá de su punto de fusión y de
su calor latente de fusión. La magnitud m es la molalidad de la disolución.
Para el caso particular del agua, la expresión de la ecuación del descenso
crioscópico queda:
∆T = 1.86 ⋅ m
Ec. 145
48
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
49
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
II. CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
II-1. DEFINICIÓN DE ÓSMOSIS. LAS MEMBRANAS SEMIPERMEABLES
1.1. LA ÓSMOSIS. LA PRESIÓN OSMÓTICA
El hecho de que la presencia de soluto modifica las propiedades del agua
ha sido descrito anteriormente cuando hemos visto las propiedades coligativas.
Conviene decir que que a partir de ahora nos vamos a referir siempre a
soluciones acuosas.
Cuando una solución como por ejemplo de sacarosa en agua, es puesta en
contacto con agua pura a través de una membrana adecuada, sucede un flujo
espontáneo de agua, del lado del recipiente que contiene agua pura hacia el
lado que contiene la disolución acuosa de sacarosa.
La propiedad que describe el flujo espontáneo de agua bajo las condiciones
dadas anteriormente se denomina ósmosis.
La propiedad esencial de las membranas que las hace adecuadas para que
se manifieste la ósmosis es que permiten el paso libre de agua pero no de las
sustancias disueltas. Este tipo de membranas se denominan semipermeables.
Se define la presión osmótica como el exceso de presión que se debe
aplicar a una disolución para impedir el paso a ella de disolvente puro cuando
la disolución y el disolvente puro se encuentran separados por una membrana
semipermeable perfecta.
La presión osmótica no es una propiedad tangible de las disoluciones, como
lo puede ser su presión de vapor o su temperatura. Es una propiedad que sólo
podemos considerar cuando la disolución se encuentra separada del disolvente
puro por una membrana semipermeable.
Hemos también que decir que las membranas semipermeables perfectas
son sólo una abstracción teórica. Así en el caso de membranas biológicas se
permite el paso de ciertas sustancias disueltas. Un comportamiento más
próximo a las membranas semipermeables perfectas son las membranas
artificiales y en concreto la más selectiva es la de ferrocianuro cálcico
(Cu2Fe(CN)6).
50
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
Por último hay que decir que siempre que la membrana sea completamente
semipermeable, la presión osmótica desarrollada será independiente de la
naturaleza de dicha membrana.
La presión osmótica es única para una disolución dada a una temperatura
definida.
Por lo tanto en experimentos de laboratorio la presión osmótica que
alcancemos dependerá de la naturaleza de la naturaleza de la membrana
utilizada en las medidas.
51
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
1.2. CAUSA DE LA SEMIPERMEABILIDAD
Los mecanismos que permiten a una membrana actuar selectivamente
sobre el disolvente y los solutos disueltos, desde el punto de vista del
transporte de materia, permitiendo únicamente el paso de disolvente no son del
todo conocidos.
Es por ello que existen varias teorías que tratan de explicar el fenómeno, no
alcanzando ninguna de ellas a explicar completamente todos los fenómenos
asociados a la semipermeabilidad.
Hasta la fecha, las teorías más importantes que se han formulado son tres:
1.2.1 TEORÍA DEL CRIBADO.
Esta teoría explica la selectividad de las membranas en función de la
relación de tamaños entre los poros de la membrana y las moléculas que tratan
de atravesarlos.
Así moléculas mayores que el tamaño de poro, no pasarán mientras que
moléculas pequeñas no tendrán ningún problema en atravesar la membrana.
Sin embargo esta teoría por si sola no puede explicar todos los fenómenos
de semipermeabilidad pues se ha establecido que hay membranas que son
capaces de impedir el paso de las moléculas de soluto a pesar de que el
diámetro de los poros de la membrana es mucho mayor que el diámetro de las
moléculas de soluto.
1.2.2 TEORÍA DE LA SOLUBILIDAD SUPERFICIAL O ADSORCIÓN.
Como introducción previa para ilustrar el mecanismo de selectividad basado
en esta teoría vamos a plantear el experimento siguiente.
Se colocan en un cilindro cloroformo, agua y éter en el orden dado, de
manera que formen tres capas. Siendo el éter soluble en agua en un grado
apreciable, podrá pasar a través de esta hasta la capa clorofórmica; pero el
cloroformo debido a su insolubilidad en agua, no podrá alcanzar la capa etérea.
El agua funciona así como una membrana semipermeable, permitiendo el paso
de éter, pero no el de cloroformo, debido a que el éter es soluble en ella
mientras el cloroformo no lo es.
Otro experimento que combina la idea anterior con la presencia física de
una membrana que se interpone es el siguiente.
Se llena con éter y benceno un tubo ancho A cuyo extremo inferior va
cerrado con una membrana semipermeable que se ha tenido previamente
52
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
sumergida en agua. Se cierra con un corcho que lleva un tubo de vidrio, y se
coloca en un vaso B que contiene éter húmedo. Se observa que el nivel de
líquido en el tubo de vidrio asciende gradualmente. La membrana se comporta
aparentemente de una forma semipermeable, dejando pasar al éter que es
soluble en el agua contenida en los poros de la membrana, de B a A; pero el
benceno que es insoluble en agua, no podrá pasar en la dirección opuesta.
Según los experimentos descritos parece que la semipermeabilidad, en
conexión con la ósmosis, se puede explicar suponiendo que el disolvente es
soluble en la membrana mientras que el soluto es insoluble.
En los últimos años se ha desarrollado la idea de que el factor que
determina la semipermeabilidad es la solubilidad superficial o adsorción. En
apoyo de esta idea, por ejemplo se ha encontrado que las membranas de
ferrocianuro de cobre toman agua con preferencia a la sacarosa en una
disolución acuosa de esta sustancia. O sea el agua es adsorbida
preferentemente y la sacarosa muestra lo que se denomina adsorción negativa.
En general se supone, a la luz de esta teoría, que una membrana es
permeable a las moléculas que adsorbe positivamente, como por ejemplo el
agua; pero es impermeable a aquellas que son adsorbidas negativamente,
como por ejemplo la sacarosa.
De nuevo encontramos que esta teoría no es capaz por si sola de explicar
todos los fenómenos de semipermeabilidad. Así se ha comprobado que el
ferrocianuro de cobre y otras membranas inorgánicas están formadas por una
red de partículas cristalinas con un diámetro medio de 1.5 · 10-6 metros. Las
dimensiones de los poros en la membrana serán probablemente del mismo
orden y en consecuencia demasiado grandes para que la membrana actúe
simplemente como cedazo molecular.
53
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
No obstante hay alguna relación entre semipermeabilidad y tamaño de los
poros, como se hace evidente por el hecho de que una membrana de
ferrocianuro de cobre no puede impedir completamente el paso de las
moléculas de soluto de bajo peso molecular, a menos que con anterioridad se
rellenen los poros de la membrana parcialmente con una sustancia inerte como
silicato magnésico. Esto explica el hecho que casi todas las medidas
satisfactorias de presión osmótica hayan sido efectuadas con azúcares, cuyas
moléculas son relativamente grandes.
El tamaño de poro por tanto interviene en la propiedad de
semipermeabilidad, pero como factor secundario; los poros de la membrana
deben ser suficientemente pequeños para quedar bajo la influencia completa
de las fuerzas superficiales que son las responsables de la adsorción.
Una combinación de las teorías de la adsorción superficial y del cedazo
molecular puede explicar satisfactoriamente la propiedad de semipermeabilidad
en mucha de las membranas analizadas. Esta combinación de las teorías
explicaría la semipermeabilidad de la siguiente manera. Si las partículas que
constituyen la membrana se recubren con moléculas adsorbidas del disolvente
se establecerá, a pesar de la red de pequeños cristales, una continuidad que
permitirá el movimiento fácil del disolvente a través de la membrana.
Por otro lado las moléculas de soluto son incapaces de penetrar en la red
compleja, especialmente porque la adsorción preferente de las moléculas de
disolvente sobre la superficie hacen que los poros sean efectivamente de
diámetro menor.
1.2.3 TEORÍA DE LA PRESIÓN DE VAPOR.
Como paso previo y a modo de introducción describiremos un fenómeno
físico que servirá de punto de partida al planteamiento de esta teoría que trata
de explicar la causa de la selectividad de las membranas.
La superficie de una disolución formada por un soluto completamente no
volátil en un disolvente volátil, es una membrana semipermeable perfecta, ya
que permite el paso libre de moléculas de disolvente del líquido al vapor, pero
no las de soluto.
Sobre la base de este fenómeno se ha propuesto una teoría de la ósmosis
que implica la idea del paso de vapor a través de capilares. Se considera que el
material semipermeable está formado por un gran número de finos capilares no
humedecidos por el disolvente líquido o la disolución, pero a cuyo través
pueden pasar moléculas de vapor. Cuando a un lado se coloca disolvente puro
y disolución en el otro, tiene lugar una destilación a través de los capilares
desde la región de mayor presión de vapor (disolvente) a la de menor
(disolución), resultando de aquí la ósmosis.
54
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
II-2. MECANISMOS DE LA PRESIÓN OSMÓTICA
2.1. LEY DE LA PRESIÓN OSMÓTICA PARA DISOLUCIONES IDEALES.
Vamos a demostrar a continuación cómo las presiones osmóticas verifican
una ley similar a la de los gases ideales y que se cumplirá exclusivamente para
disoluciones diluidas ideales.
Dividiremos el desarrollo en tres etapas:
§ Etapa 1:Efecto de la presión osmótica sobre el potencial
químico de la disolución.
Como ya se ha demostrado en el capítulo 1 de Fundamentos
Termodinámicos, la variación del potencial químico de un
componente genérico i en una disolución con la presión, es igual al
volumen molar parcial de dicho componente en la disolución.
∂µ i
∂p
= Vi
Ec. 146
T ,n
Así el incremento de potencial químico de un disolvente A en una
disolución provocado por la aplicación de una sobrepresión igual a la
presión osmótica π, se obtendrá por integración de la ecuación
anterior.
∆µ A =
p0 +π
∫V
A
⋅ dp = π ⋅ V A Ec. 147
p0
La aproximación de que el volumen molar parcial del disolvente es
constante con la presión es bastante buena, debido a que los
líquidos son prácticamente incompresibles.
§ Etapa 2: Efecto de la adición de soluto sobre el potencial
químico de la disolución.
El descenso del potencial químico del disolvente por la adición de
soluto puede ser calculado a partir del incremento de entropía que
acompaña al proceso de mezcla.
A partir de consideraciones estadísticas ya descritas en el capítulo
1 de Fundamentos Termodinámicos llegamos a una expresión de la
forma:

n + nB
n + nB
∆S = R ⋅  n A ⋅ ln A
+ n B ⋅ ln A
nA
nB


 Ec. 148

55
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
donde nA es el número de moles de disolvente y nB es el de
soluto.
La variación de entropía molar parcial del disolvente se obtiene
derivando la ecuación anterior por el número de moles de disolvente
manteniendo constante el número de moles de soluto.
∆S A =
∂∆S
∂n A
= − R ⋅ ln
nB
nA
Ec. 149
n A + nB
La variación del potencial químico del disolvente en el proceso de
mezcla se puede escribir como:
∆µ A = ∆H A − T ⋅ ∆S A Ec. 150
Consideramos la hipótesis simplificatoria de que la variación de
entalpía molar parcial es nula. Esto implica que no se producirán ni
cambios de temperatura ni de volumen en la disolución durante el
proceso de mezcla.
Por lo tanto la variación del potencial químico será:
∆µ A = R ⋅ T ⋅ ln
nA
n A + nB
Ec. 151
§ Etapa 3: Obtención de la ley de las presiones osmóticas.
En el equilibrio osmótico que se establece entre la disolución y el
disolvente puro a través de la membrana semipermeable, el
incremento del potencial químico del disolvente en la disolución
debido a la sobrepresión ejercida sobre la disolución es
contrarrestado por el descenso del potencial químico del disolvente
en la disolución por la adición del soluto al disolvente para la
formación de la disolución inicial de partida.
∆µA (debido a la presión) + ∆µA (debido al soluto) = 0
Sustituyendo las ecuaciones que obtuvimos en las etapas 1 y 2,
en la expresión anterior, obtenemos:
π ⋅ V A + R ⋅ T ⋅ ln
nA
= 0 Ec. 152
nA + B
Si la disolución está muy diluida, entonces podemos hacer la
siguiente aproximación:
56
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
ln
nA
n
≈ − B Ec. 153
n A + nB
nA
La ecuación de balance de potencial químico finalmente queda:
π ⋅VA = R ⋅ T ⋅
nB
⇒ π ⋅ V = n B ⋅ R ⋅ T Ec. 154
nA
Esta ecuación es conocida como la ecuación de van’t Hoff.
La determinación termodinámica de esta ley, nos permite ver lo
limitado de su aplicación, por las numerosas simplificaciones que
hemos tenido que efectuar. Esta ley sólo es aplicable, estrictamente
hablando, a disoluciones diluidas ideales.
La ecuación
fundamentales:
de
van’t
Hoff
llega
a
dos
conclusiones
o La presión osmótica correspondiente a una disolución dada
es directamente proporcional a la concentración de soluto en la
disolución.
o La presión osmótica de una disolución es directamente
proporcional a la temperatura absoluta.
La ecuación de van’t Hoff implica que la presión osmótica de una
disolución diluida es igual a la presión que ejercería el mismo número
de moléculas de soluto si se encontrasen en estado gaseoso
ocupando un volumen igual al de la disolución.
57
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
2.2. EL COEFICIENTE OSMÓTICO
La ecuación de van’t Hoff, que nos permite relacionar la presión osmótica de
una disolución con la concentración de soluto, sólo es aplicable al caso de
disoluciones diluidas ideales.
Para poder utilizar esta ecuación en todo tipo de disoluciones, se introduce
un factor de corrección empírico, denominado coeficiente osmótico, y que
designamos por la letra φ.
La ecuación de van’t Hoff modificada resulta entonces
π ⋅ VA = φ ⋅ R ⋅ T ⋅ nB
π = φ ⋅ R ⋅ T ⋅ mB
Ec. 155
Existen tablas de coeficientes osmóticos para distintos tipos de solutos y
disolventes.
Puesto que la concentración molar, en moles por litro es virtualmente la
molalidad, moles de soluto por kilogramo de disolvente, para el caso de
disoluciones acuosas no muy concentradas, φ es el llamado coeficiente
osmótico molal.
Hay que indicar que el uso del coeficiente osmótico introduce las
correcciones necesarias para tener en cuenta las interacciones entre las
moléculas de soluto, y las interacciones entre las moléculas de soluto con las
de disolvente, en el caso de un único tipo de soluto disuelto, en un disolvente
específico.
Así la mayoría de los coeficientes osmóticos, están referidos a disoluciones
acuosas.
Por lo tanto, es importante no olvidar que cuando más de un tipo de soluto
está presente en una disolución, las interacciones que podrían ocurrir entre las
moléculas de las distintas especies de soluto, no son tenidas en cuenta por los
coeficientes osmóticos tabulados.
Así predicciones de la presión osmótica de disoluciones que tienen disueltos
varios tipos de soluto, basadas en el coeficiente osmótico, son sólo
aproximadas. Esto es especialmente aplicable a disoluciones que contienen
sales y proteínas juntas.
Existen tres tipos principales de solutos en las disoluciones intracelulares
que tienen sus correspondientes coeficientes osmóticos asociados:
o No electrolitos, como la glucosa. En concentraciones
fisiológicas, es decir, en concentraciones usuales en las células,
el coeficiente osmótico excede ligeramente la unidad.
58
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
o Electrolitos, como el ClNa. En concentraciones fisiológicas,
el valor del coeficiente osmótico está ligeramente por debajo de la
unidad. Así por ejemplo, para una concentración 0.15 M de ClNa,
el valor de φ es igual a 0.93.
o Macromoléculas, como las proteínas. El valor de φ para este
tipo de solutos excede con mucho la unidad. Así para la
hemoglobina en una concentración de 33.5 gramos / 100 mililitros,
φ vale 2.57.
59
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
2.3. TEORÍAS SOBRE EL ORIGEN DE LAS PRESIONES OSMÓTICAS
Se han formulado varias teorías que tratan de predecir el valor de la presión
osmótica. Las más importantes son tres:
2.3.1 TEORÍA DEL BOMBARDEO DE LAS MOLÉCULAS DE SOLUTO.
La interpretación que hicimos de la ecuación de van’t Hoff, asumía que la
presión osmótica de una disolución diluida era igual a la presión que ejercería
el mismo número de moléculas de soluto, si se encontrasen en estado
gaseoso, ocupando un volumen igual al de la disolución.
Esta semejanza entre el comportamiento de los gases y de las disoluciones
nos lleva a pensar que la presión gaseosa y la presión osmótica tienen el
mismo origen fundamental. En el primer caso se debe a los impactos de las
moléculas del gas sobre las paredes de la vasija en que están contenidas, y en
el último a los impactos de las moléculas de la sustancia disuelta sobre la
membrana semipermeable.
Mediante un experimento que a continuación vamos a describir se mostró
en el año 1894, esta analogía entre gases y disoluciones, que apoyaba la idea
del bombardeo de moléculas de soluto como origen de la presión osmótica.
El experimento se basa en la capacidad del paladio caliente
(aproximadamente a 300ºC ) de dejar pasar a su través hidrógeno con
facilidad, pero no nitrógeno; así el paladio actúa como membrana
semipermeable para una disolución de nitrógeno y hidrógeno.
El dispositivo del experimento consta de una ampolla de paladio que
contiene en su interior una mezcla de hidrógeno y nitrógeno. Las presiones
parciales de los gases en la mezcla son conocidas.
La ampolla se coloca dentro de una vasija, a cuyo través se hace pasar una
corriente de hidrógeno a presión atmosférica.
60
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
Al calentar la ampolla pasará hidrógeno a su interior y cuando se alcanza el
equilibrio, la presión en el interior de la ampolla será superior a la atmosférica
en una cantidad igual a la presión parcial del nitrógeno.
Generalizando los resultados de este experimento para el caso de
disoluciones, haciendo uso de la analogía entre disoluciones y mezclas de
gases, podemos ver cómo la disolución contenida en una vasija
semipermeable, rodeada por disolvente puro, estará en equilibrio con él,
cuando la sobrepresión en el interior de la vasija sea igual a la presión
osmótica, que podemos identificar con la presión parcial de la sustancia para la
cual la membrana no es permeable, o sea el soluto.
El caso, es sin embargo que en una mezcla de gases se obedece la ley de
Dalton de las presiones parciales, por lo menos aproximadamente, así que la
presión de exceso debe de ser igual a la del nitrógeno; pero no se deduce
necesariamente que se aplique el mismo argumento a la presión osmótica,
excepto quizás a dilución infinita.
No hay duda de la semejanza entre la ecuación de van’t Hoff para una
disolución diluida ideal, y la ecuación característica para un gas ideal, pero esta
identidad no suministra información en lo que concierne al mecanismo de la
presión osmótica.
La conclusión alcanzada es que únicamente a dilución infinita puede la
presión osmótica ser igual a la presión de bombardeo de las moléculas de
soluto.
61
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
2.3.2 TEORÍA DEL BOMBARDEO DE LAS MOLÉCULAS DE DISOLVENTE.
Consideramos el experimento descrito acerca del nitrógeno y hidrógeno: se
observa que el hidrógeno entra en la ampolla de paladio hasta que se igualan
las presiones interior y exterior. Cuando se pregunta por qué entra el hidrógeno
en la ampolla, la respuesta es que se debe a que tiene una presión parcial
menor en el interior que en el exterior y no meramente porque el nitrógeno de
la ampolla esté ejerciendo una presión. Exactamente de la misma forma se
puede decir que las moléculas del disolvente entran en la disolución a través de
una membrana semipermeable debido a que su presión parcial, o su
equivalente, es menor en la disolución que en el disolvente puro.
Cuando se planteo la teoría del bombardeo de las moléculas de soluto se
supuso que los impactos de las moléculas de disolvente se podían despreciar,
por ser iguales a ambos lados de la membrana, pero esto no es cierto en modo
alguno.
Se puede ver fácilmente que habrá más moléculas de disolvente por unidad
de volumen o por unidad de superficie de membrana en el disolvente que en la
disolución; por consiguiente, los impactos sobre ambos lados de la membrana
no serán los mismos.
En efecto, parece más lógico considerar que la presión osmótica se debe a
la diferencia entre las presiones de bombardeo de las moléculas del disolvente
en el disolvente puro y en la disolución, más bien que al bombardeo por las
moléculas de soluto.
De esta manera se atribuyó una presión térmica a las moléculas del
disolvente, y sería igual a la presión que ejercerían las moléculas de disolvente
por bombardeo en el interior del líquido.
Se supone que la presión térmica tiene un valor menor en la disolución que
en el disolvente, debido a un menor número de moléculas que hay en un
volumen dado. Así cuando dos líquidos están separados por una membrana
semipermeable, la diferencia en presión térmica producirá una corriente de
disolvente desde la región de presión mayor a la de menor, es decir, tiene lugar
la ósmosis.
2.3.3 TEORÍA DE LA PRESIÓN DE VAPOR.
Como se ha visto, con relación al estudio de las propiedades coligativas en
el capítulo 1 de Fundamentos Termodinámicos, cuando aplicamos una presión
exterior, se puede aumentar la presión de un líquido; por consiguiente
aumentando la presión sobre una disolución se puede elevar su presión de
vapor hasta que sea igual a la del disolvente puro.
62
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
La disolución estará entonces en equilibrio con el disolvente y será por
tanto, termodinámicamente necesario que la presión que se ejerza sobre la
disolución sea igual a la presión osmótica.
Análogamente la disminución de la presión sobre el disolvente, reducirá su
presión de vapor, siendo la presión osmótica igual a la cantidad en que debe
disminuir la presión sobre el disolvente para que éste, esté en equilibrio de
vapor con la disolución.
Los tres puntos de vista principales relativos al origen de la presión
osmótica, bombardeo de moléculas de soluto, bombardeo de moléculas de
disolvente, y presión de vapor, pueden no ser independientes, pues es
probable que sea el movimiento de las moléculas de soluto la causa de que la
presión térmica y la presión de vapor sean menores en la disolución que en el
disolvente.
63
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
2.4. MECANISMO DE EQUILIBRIO OSMÓTICO. EL POTENCIAL QUÍMICO.
Por alguna razón relacionada con la presencia de las moléculas de soluto,
el potencial químico de una molécula de disolvente es menor en una disolución
que en el líquido puro; es decir la transferencia de disolvente desde el
disolvente puro a la disolución produce una disminución del potencial químico.
Por tanto cuando se junten el disolvente y la disolución, tenderá siempre a
producirse una transferencia de esta clase, y el proceso continuará hasta que
se alcance el equilibrio.
Si se colocan dos líquidos, uno junto a otro en un espacio cerrado,
conectados a través de una membrana semipermeable, la diferencia de
potencial químico se manifestará por una destilación del disolvente a la
disolución. Si se utilizan dos disoluciones de concentración diferente el proceso
continuará hasta que ambas tengan el mismo potencial químico. Análogamente
cuando el disolvente y la disolución están separados por una membrana
semipermeable pasará disolvente a la disolución hasta que se alcance un
equilibrio por la formación de una sobrepresión.
Se deduce por tanto que el establecimiento de una presión osmótica es el
resultado inevitable de la introducción de una membrana semipermeable entre
un disolvente y una disolución como consecuencia de la diferencia de los
potenciales químicos entre las moléculas del disolvente.
La presión de vapor de la disolución, una vez alcanzado el equilibrio bajo la
influencia de la presión osmótica, deberá ser entonces igual, por exigencia
termodinámica, al valor normal del disolvente puro.
64
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
II-3. LA PRESIÓN OSMÓTICA Y LA PRESIÓN DE VAPOR
De todo lo dicho anteriormente resulta evidente que debe haber una
relación entre la presión osmótica de una disolución y el descenso de la presión
de vapor.
Supongamos un disolvente y una disolución a temperatura constante, que
se encuentran separados por una membrana semipermeable en un dispositivo
como el indicado en el esquema adjunto.
El dispositivo consta de dos émbolos con los que podemos controlar la
presión ejercida tanto sobre la disolución como sobre el disolvente puro.
Sean F1 y F2 las fuerzas ejercidas sobre los émbolos del disolvente y de la
disolución respectivamente, para que se dé el equilibrio termodinámico a través
de la membrana semipermeable; en estas condiciones no se observará flujo del
disolvente hacia la disolución; hay equilibrio osmótico.
Como resultado de las fuerzas ejercidas, el disolvente puro y la disolución
estarán sometidos a unas presiones P1 y P2 respectivamente. Como por
definición la presión osmótica es la sobrepresión ejercida sobre el lado de la
disolución para que exista equilibrio termodinámico, entonces P2−P1 es la
presión osmótica π del sistema.
Estas presiones no son las presiones de vapor, es decir, presiones que
verifican el equilibrio entre la fase líquida y la fase vapor; sólo son las presiones
justamente necesarias para verificar el equilibrio entre el disolvente puro y la
disolución a través de la membrana semipermeable.
Por lo tanto se cumplirán las siguientes relaciones:
65
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
µ *A,l (T , P1 ) = µ A,l (T , P2 ) = µ A,l (T , P1 ) + ∫ V A,l ⋅ dp
P2
P1
µ *A,l (T , P1 ) ≠ µ *A, g (T , P1 )
Ec. 156
µ A,l (T , P2 ) ≠ µ A, g (T , P2 )
donde µ*A.l es el potencial químico del disolvente puro en estado líquido, a
una temperatura y presión dadas; µ*A.g es el potencial químico del disolvente
puro en estado vapor; µA,l es el potencial químico del disolvente en la disolución
líquida; µA,g es el potencial químico de la disolución gaseosa y VA,l es el
volumen molar parcial del disolvente en estado líquido.
Las presiones de vapor del disolvente puro y de la disolución cumplirán las
siguientes relaciones:
µ *A,l (T , Pv* ) = µ *A, g (T , Pv* )
µ A,l (T , Pv ) = µ A, g (T , Pv )
Ec. 157
donde P*v y Pv son las presiones de vapor del disolvente puro y de la
disolución respectivamente a una temperatura determinada.
La variación del potencial químico de una sustancia i con la presión, a
temperatura constante es igual al volumen molar parcial de la sustancia.
∂µ i
∂p
= Vi Ec. 158
T
Puesto que para los líquidos, el valor del volumen molar parcial es
relativamente pequeño podemos despreciar el efecto de la presión en el
potencial químico, cuando las variaciones de presión son moderadas.
Si aplicamos la simplificación anterior, podemos escribir las siguientes
aproximaciones:
µ *A,l (T , P1 ) ≈ µ *A,l (T , Pv* ) = µ *A, g (T , Pv* )
µ A,l (T , P1 ) ≈ µ A,l (T , Pv ) = µ A, g (T , Pv )
Ec. 159
Suponiendo comportamiento de gas ideal, los potenciales químicos de la
fase vapor podemos escribirlos como:
Pv*
P 0 Ec. 160
P
µ A, g (T , Pv ) = µ A0 (T ) + R ⋅ T ⋅ ln v0
P
µ *A, g (T , Pv* ) = µ A0 (T ) + R ⋅ T ⋅ ln
66
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
Aplicando a la igualdad de potencial químico entre el disolvente puro y la
disolución en equilibrio osmótico, las simplificaciones descritas hasta ahora,
tenemos:
µ *A,l (T , P1 ) = µ A,l (T , P2 ) = µ A,l (T , P1 ) + ∫ V A,l ⋅ dp
P2
P1
µ A0 (T ) + R ⋅ T ⋅ ln
P2
Pv*
P
= µ A0 (T ) + R ⋅ T ⋅ ln v0 + ∫ V A,l ⋅ dp
0
P1
P
P
Ec. 161
Operando resulta:
R ⋅ T ⋅ ln
P2
Pv*
= ∫ V A,l ⋅ dp Ec. 162
P1
Pv
Si aplicamos la propiedad de que los líquidos son prácticamente
incompresibles, entonces podemos considerar que el volumen molar parcial del
disolvente es constante en el intervalo de presiones de P1 a P2.
Por lo tanto podemos escribir:
R ⋅ T ⋅ ln
Pv*
= VA,l ⋅ ( P2 − P1 ) = VA,l ⋅ π
Pv
R ⋅T
P*
π=
⋅ ln v
VA, l
Pv
Ec. 163
donde como ya hemos dicho antes P*v es la presión de vapor del disolvente
puro y Pv es la presión de vapor de la disolución, ambas a la temperatura del
sistema.
67
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
II-4. UNIDADES DE MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA EN SISTEMAS
BIOLÓGICOS
Las unidades naturales de la presión osmótica son los milímetros de
mercurio o bien las atmósferas.
Sin embargo la presión osmótica para una solución dada, tal como la hemos
definido varía con la temperatura.
Teniendo en cuenta que los estados de equilibrio entre dos soluciones a
través de la membrana semipermeable, es siempre a una única temperatura,
es muy conveniente usar unas unidades de la presión osmótica que sean
relativamente independientes de la temperatura.
Dicha unidad es el osmol, o como más frecuentemente se usa el
miliosmol.
Desgraciadamente, sin embargo hay cierta confusión en el uso del término
miliosmol. Éste ha sido con frecuencia definido simplemente en términos de
concentraciones de solutos presentes, bajo la suposición de que la
concentración es proporcional a la presión osmótica, como muestra la ecuación
de van’t Hoff para disoluciones diluidas ideales.
Sin embargo, este uso del concepto miliosmol sólo es válido para el caso de
disoluciones diluidas ideales, es decir, sólo se podría emplear como unidad de
la presión osmótica cuando la disolución en contacto con el disolvente puro, a
través de la membrana semipermeable, fuera una disolución diluida ideal.
Para que el término miliosmol pueda ser empleado correctamente como
medida de la presión osmótica, debe incluir el coeficiente osmótico, además de
la concentración de soluto.
Así los miliosmoles serán obtenidos como el producto de la concentración
milimolal, con el coeficiente osmótico molal.
Pr esión osmótica (osmoles) = φ ⋅ m B =
π
Ec. 164
R ⋅T
Vemos como el efecto de la temperatura sobre la presión osmótica se
contrarresta con la temperatura que aparece en el denominador, de forma que
la expresión completa no depende tanto con la temperatura.
Con esta definición, un osmol es la presión osmótica de una disolución ideal
con una concentración de soluto 1M.
Esta unidad expresa la presión osmótica de una disolución de manera
bastante buena, pero no de forma exacta, por dos motivos:
o El coeficiente osmótico varía muy ligeramente con la
temperatura.
68
CAPÍTULO 2
LA ÓSMOSIS
o En soluciones multicomponentes las interacciones entre los
distintos tipos de soluto, no se tenían en cuenta en el coeficiente
osmótico y por tanto provocan una pérdida de exactitud en la
relación presión osmótica, concentración de soluto.
69
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
70
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
III. CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIOPRESERVACIÓN
III-1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS
Los primeros estudios de investigación sobre la biología a bajas
temperaturas fueron llevados a cabo por Sir Robert Boyle en 1693. Sin
embargo no se produjeron avances significativos hacia el desarrollo de
protocolos de criopreservación, que tuviesen moderado éxito, hasta mediados
del siglo veinte. Fue entonces cuando se produjeron dos importantes
acontecimientos:
Ø La aplicación en 1949 del glicerol, una sustancia química cuyas
propiedades anticongelantes eran de sobra conocidas en automovilismo,
al campo de la criopreservación de muestras biológicas. Se vio que al
añadir esta sustancia a una muestra sometida a un proceso de
criopreservación, mejoraba espectacularmente la tasa de supervivencia.
En general las sustancias químicas capaces de mejorar la supervivencia
de las células al proceso de criopreservación se denominan agentes
crioprotectores o CPA (cryoprotective agent).
Ø La aplicación en 1963 de modelos matemáticos, para predecir el
comportamiento de las células durante el proceso de criopreservación.
Peter Mazur fue el primero en desarrollar modelos de este tipo.
71
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
III-2. NECESIDAD DE MODELOS MATEMÁTICOS
Los procesos de criopreservación provocan cambios significativos en las
condiciones térmicas, químicas y físicas de los tejidos, con el consiguiente
riesgo de daños biológicos irreversibles.
Los cambios térmicos son debidos a la transferencia de calor impuesta por
las condiciones de contorno del método de enfriamiento y calentamiento, pero
también pueden ser debidos a el calor latente de fusión del hielo formado en
los tejidos.
Las condiciones químicas del medio celular pueden ser modificadas antes
del proceso de congelación por la adición de los agentes crioprotectores y
durante el proceso de enfriamiento por la formación de hielo en el medio
extracelular. El crecimiento de los cristales de hielo retira agua líquida de la
solución extracelular, que aun permanece en estado líquido aumentando de
esta manera la concentración de solutos en el medio.
La presencia de hielo extracelular además modifica las condiciones físicas
en el tejido, provocando alteraciones en su estructura. Este hielo reduce el
espacio disponible que tienen las células en el tejido, originando fuerzas
mecánicas de compresión.
Para minimizar los daños en los tejidos originados por los procesos de
criopreservación, los procedimientos para modificar las condiciones químicas y
térmicas del sistema deben ser optimizados.
Las manipulaciones químicas están normalmente limitadas a la introducción
de uno o varios agentes crioprotectores en el tejido antes de comenzar a enfriar
la muestra, y a su eliminación tras calentar un tejido hasta la temperatura
ambiente.
El tipo de agente crioprotector a emplear y la manera en la que va a ser
introducido en el tejido, deben minimizar los daños que puedan causar al tejido.
Los protocolos para añadir y posteriormente eliminar los agentes
crioprotectores, constan básicamente de una o varias etapas, donde
sumergimos el tejido en un baño de crioprotector, de una composición
determinada, durante un determinado periodo de tiempo, a una determinada
temperatura. Vemos que para cada etapa del protocolo es necesario
especificar tres parámetros:
Ø Composición del baño.
Ø Temperatura del baño.
Ø Duración del baño.
Los métodos para manipular las condiciones térmicas se describen en
términos de perfiles de temperatura frente al tiempo, T(t), que van a ser
impuestos en los contornos del tejido. El control que podamos tener de las
condiciones térmicas dentro del tejido son muy limitadas.
72
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
Los perfiles de temperatura pueden ser lineales o no lineales. Los
protocolos de enfriamiento que se emplean hoy día, consisten en varias etapas
de enfriamiento lineal, cada una de una duración determinada. Por lo tanto para
tener definida cada etapa del protocolo de enfriamiento necesitamos especificar
dos parámetros:
Ø La velocidad de enfriamiento.
Ø La duración de la etapa.
Consideremos el desarrollo de un protocolo de criopreservación. Si tenemos
n etapas en el protocolo de manipulación química y m etapas en el protocolo
de manipulación térmica, habrá p = 3·n + 2·m parámetros que nos permitirán
optimizar el protocolo de criopreservación.
Considerando que incluso en el caso más simple, de una única etapa para
añadir crioprotectores, una única etapa para eliminarlos (n=2), una única etapa
de enfriamiento y una única etapa de calentamiento (m=2), el número de
experimentos requeridos para un optimización del protocolo resultan
prohibitivos.
Por lo tanto, la obtención de protocolos de criopreservacvión que den
buenos resultados, van a requerir el uso de modelos teóricos, y métodos de
optimización asistidos por ordenador.
En este Proyecto Fin de Carrera, nos vamos a ceñir a modelos teóricos
aplicables a células aisladas. El estudio del comportamiento de células aisladas
durante el enfriamiento y posterior calentamiento, proporciona un punto de
partida para el análisis de los daños en tejidos durante la criopreservación.
Si bien los daños originados en los tejidos durante la criopreservación,
pueden tener múltiples causas, la minimización del daño a nivel de células
debe ser la principal meta en el diseño de protocolos de enfriamiento y
calentamiento, así como de los protocolos para añadir y eliminar los agentes
crioprotectores.
73
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
III-3. OBSERVACIONES EXPERIMENTALES
La repuesta de las células a los procesos de enfriamiento, pueden ser
observados mediante el uso de criomicroscopios. Estos consisten en un
microscopio convencional al que se le ha acoplado un equipo de enfriamiento
criogénico. Además disponen de un sistema de control automático para regular
la temperatura de la muestra e imponer así el perfil de temperatura deseado.
La respuesta de las células al enfriamiento, depende del método de
enfriamiento. En particular la velocidad de enfriamiento es el parámetro crítico
que determina los resultados del protocolo de criopreservación.
A continuación vamos a describir los procesos básicos que han sido
observados, cuando se induce hielo en el medio extracelular, en función del
perfil de enfriamiento aplicado.
El comienzo del proceso de formación de hielo es de naturaleza aleatoria.
Así aunque la temperatura de un sistema sea inferior a la de cambio de fase,
no tiene por qué formarse hielo. Cuanto mayor sea la diferencia entre la
temperatura a la que comienza a formarse hielo y la temperatura de cambio de
fase, mayor será la velocidad de crecimiento de los cristales de hielo. En el
peor de los casos, puede ocurrir que la temperatura a la que comienza a
formarse hielo sea tan baja, que la velocidad de crecimiento de los cristales
resulta explosiva. En estas condiciones los cristales de hielo actúan como
lanzas que atraviesan las células, destruyéndolas por completo.
Para evitar este problema, se induce la formación de hielo extracelular, para
garantizar que cuando la temperatura del sistema sea la de cambio de fase,
tengamos hielo. Existen numerosas maneras de inducir la formación de hielo.
En el caso de muestras de células aisladas se toca la muestra con una aguja
fría, a una temperatura inferior a la de cambio de fase.
La formación de hielo extracelular, origina una diferencia de potencial
químico entre la disolución intracelular y extracelular, que rompe el equilibrio
isotónico natural de la célula. Por equilibrio isotónico entendemos el equilibrio
de potencial químico que se establece entre la célula y el entorno que la rodea,
en el órgano o tejido del que forma parte, dentro de un organismo vivo.
La formación de hielo extracelular rompe el equilibrio isotónico por una
única razón: el agua que forma parte del hielo no contiene los solutos que tenía
disuelta cuando formaba parte de la disolución acuosa del medio extracelular.
Por lo tanto, cuando comienza a formarse hielo fuera de las células,
simultáneamente se está produciendo un aumento de la concentración de los
solutos disueltos en el medio extracelular.
Como se describió anteriormente en el CAPÍTULO 1 de FUNDAMENTOS
TERMODINÁMICOS, un aumento de la concentración de los solutos provoca una
disminución del potencial químico del disolvente. Mientras tanto, en el interior
de las células no se ha producido cambio alguno, permaneciendo el potencial
químico inalterado, frente al del disolvente del medio extracelular, que ha
74
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
disminuido. Debido a la naturaleza semipermeable de la membrana celular,
este desequilibrio del potencial químico origina una sobrepresión del lado de la
disolución que tiene una concentración de solutos menor, que desencadena un
flujo de disolvente puro desde la región menos concentrada hacia la región de
mayor concentración. Esta sobrepresión como se vio en el CAPÍTULO 2 de
ÓSMOSIS se puede interpretar como la diferencia de presiones osmóticas que
tienen las dos disoluciones.
Vemos por tanto que la formación de hielo extracelular, tiene como
consecuencia la evacuación de agua desde el medio intracelular hacia el medio
extracelular, en un proceso que llamaremos Deshidratación Celular.
Paradójicamente la formación de hielo extracelular, en principio podría evitar
que se formase hielo dentro de la célula, ya que al aumentar la concentración
de solutos en la región intracelular, la temperatura de cambio de fase
disminuye, como se vio en el apartado de Propiedades Coligativas del Capítulo
1, al explicar el descenso crioscópico. Por lo tanto podemos tener una solución
intracelular líquida a temperaturas muy inferiores a los cero grados centígrados,
que es aproximadamente la temperatura de cambio de fase del medio
intracelular original, cuando existía equilibrio isotónico natural.
En el párrafo anterior hemos empleado la expresión”podría evitar que se
formase hielo” . la razón está en que hay dos factores que determinan la
formación de hielo dentro de las células:
Ø Factor termodinámico: es el descenso crioscópico descrito
anteriormente, que permite tener una disolución acuosa en estado
líquido a temperaturas inferiores a los cero grados centígrados.
Ø Factor cinético: la membrana celular tiene una permeabilidad finita al
paso del agua, que determina la velocidad a la que puede ser
evacuada y el tiempo característico del la deshidratación celular.
Así si la velocidad de enfriamiento es lo suficientemente pequeña como
para permitir, que la solución intracelular como para permitir, que la solución
intracelular esté en equilibrio con el medio exterior, gracias al mecanismo de la
ósmosis, la célula se deshidratará conforme disminuimos la temperatura del
sistema. Esto se traduce en una reducción apreciable del volumen celular.
Podemos apreciarlo en el par de fotografías que se muestran a
continuación, donde hepatocitos (células del hígado) de ratón, se han enfriado
a –10ºC/min.
75
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
Esta misma fotografía pero retocada para resaltar el contorno de las células
se muestra a continuación.
En la fotografía A se muestran las células antes del proceso de
enfriamiento, mientras que en la B, ya ha concluido. Vemos como el tamaño de
las células en la fotografía B es significativamente menor que el de las células
de la fotografía A.
Por otra parte si la velocidad de enfriamiento es demasiado rápida,
podemos alcanzar muy bajas temperaturas sin que la concentración de solutos
dentro de la célula se haya modificado significativamente.
La velocidad con la que la célula es capaz de evacuar agua es muy
pequeña comparada con la velocidad con la que disminuye la temperatura. Al
microscopio las células enfriadas de esta manera, no han modificado su
tamaño, al no haberse producido una deshidratación apreciable, siendo la
probabilidad de formar hielo muy alta.
En los criomicroscopios de luz visible, la formación de hielo intracelular
aparece como un oscurecimiento del interior de las células, debido a la
dispersión de la luz llevada a cabo por los cristales de hielo.
76
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
Este oscurecimiento podemos apreciarlo claramente en el par de fotografías
que se muestran a continuación, donde hepatocitos de ratón se han enfriado a
–400ºC/min .
Esta misma fotografía pero retocada digitalmente para apreciar mejor los
contornos de las células se muestra seguidamente.
Se observa como las células no han modificado su tamaño, siendo el único
cambio apreciable el oscurecimiento anteriormente descrito, que delata la
presencia de hielo dentro de la célula.
Como resumen el factor cinético establece una relación entre la velocidad
de enfriamiento y la formación de hielo. Con bajas velocidades de enfriamiento,
la probabilidad de formar hielo es muy baja, incluso a temperaturas muy
inferiores a los cero grados centígrados, mientras que a altas velocidades de
enfriamiento, la probabilidad de formar hielo es muy alta, incluso a
temperaturas próximas a los cero grados centígrados.
77
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
III-4. MUERTE CELULAR. HIPÓTESIS DE LOS DOS FACTORES
Observaciones experimentales muestran que cuando enfriamos muestras a
altas velocidades, la supervivencia de las células al proceso de
criopreservación disminuye conforme aumentamos la velocidad de
enfriamiento.
Se sabe que las velocidades de enfriamiento para las cuales el 50% de las
células sobreviven, coincide aproximadamente con las velocidades para las
cuales el 50% de las células sufren la formación de hielo intracelular. Esta
evidencia empírica establece una relación directa entre la formación de hielo
dentro de las células y la supervivencia de las células al proceso de
criopreservación.
Otras observaciones, muestran que cuando enfriamos muestras a muy
bajas velocidades, la supervivencia de las células al proceso de
criopreservación disminuye conforme disminuimos la velocidad de enfriamiento.
Basándonos en las evidencias experimentales descritas anteriormente, son
dos las maneras en las que la velocidad de enfriamiento afecta a la tasa de
supervivencia celular. Para tratar de explicar este doble comportamiento de la
supervivencia frente a las velocidades de enfriamiento, se ha propuesto una
teoría denominada Hipótesis de los Dos Factores. En ella se proponen dos
mecanismos distintos como causa de los daños en las células, durante el
protocolo de criopreservación.
Uno de los mecanismos es la formación de hielo intracelular. Es dominante
a altas velocidades de enfriamiento. La manera en la que este hielo daña a la
célula, no es del todo conocido, pero se piensa que es debido a una disfunción
de origen mecánico de las propiedades de la membrana celular y de otras
estructuras celulares suspendidas en su interior, como pueden ser orgánulos
celulares o grandes macromoléculas de proteínas. Lo que si se sabe es que
cuanto mayor sea la cantidad de hielo formado dentro de la célula, menor es
la esperanza de que la célula sobreviva. Debido a la relación vista
anteriormente entre la velocidad de enfriamiento y la formación de hielo dentro
de la célula, podemos afirmar que cuanto mayor sea la velocidad de
enfriamiento, menor es la esperanza de que las células sobrevivan.
Podríamos pensar, llegados a este punto que un buen protocolo de
criopreservación sería aquel en el que la velocidad de enfriamiento fuera tan
lenta que apenas formásemos hielo. Sin embargo existe otro mecanismo que
provoca daños celulares y que precisamente actúa cuando las velocidades de
enfriamiento son muy reducidas, lo que hace inviable este protocolo que
acabamos de proponer.
Este mecanismo, activo a bajas velocidades de enfriamiento, está
relacionado con la deformación mecánica de la célula, debida a la reducción de
tamaño originada por el proceso de deshidratación tan intenso, y a la
prolongada exposición de la célula a elevadas concentraciones de electrolitos y
78
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
agentes crioprotectores. Este mecanismo se conoce como “Efecto de
Solución”.
Como se muestra en la figura adjunta, que tiene un valor exclusivamente
cualitativo, existe una velocidad de enfriamiento óptima, para la cual los dos
mecanismos de daño celular se compensan, alcanzándose un máximo en la
probabilidad de supervivencia de las células a la criopreservación.
El valor óptimo de otros posibles parámetros, como puede ser la duración
de una etapa de enfriamiento, en un protocolo con varias etapas a distintas
velocidades de enfriamiento, pueden ser también obtenidos en términos de
alcanzar un máximo en la supervivencia, compensando el efecto de la
formación de hielo, con el efecto de solución.
79
CAPÍTULO 3
INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN
A pesar de que se ha comprobado la validez universal de la hipótesis de los
Dos Factores en todas las células estudiadas, el protocolo de criopreservación
que optimiza la supervivencia no es universal, es decir, cada tipo de célula
requiere su propio protocolo optimizado.
Esto se debe a que las propiedades biofísicas de las células, como pueden
ser la permeabilidad de la membrana, o la actividad catalítica que se tiene
dentro de la célula para iniciar la formación de hielo intracelular, afectan al
proceso de deshidratación y a la probabilidad de formación de hielo dentro de
la célula.
En este proyecto buscamos obtener unas ecuaciones que se puedan aplicar
a cualquier tipo de célula y nos permita obtener un protocolo de
criopreservación personalizado.
80
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
81
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV. CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV-1. INTRODUCCIÓN
En este capítulo vamos a estudiar cómo es el proceso de deshidratación
celular mediante un modelo matemático ideal, conforme vamos reduciendo la
temperatura del sistema por debajo de los cero grados centígrados.
Comenzaremos indicando en qué casos es posible aplicarlo. A continuación
mostraremos sus limitaciones, así como las variables y parámetros más
significativos, destacando entre todos ellos la permeabilidad de la membrana
celular.
El desarrollo del modelo teórico ideal irá acompañado por su resolución
numérica en ordenador, a través del software matemático MATLAB, mostrando
los resultados gráficamente.
Con el objetivo de cuantificar el error que tiene el modelo ideal,
plantearemos un modelo no ideal.
82
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV-2. APLICABILIDAD DEL MODELO
El modelo de transporte de agua a través de la membrana celular, me va a
permitir analizar el proceso de deshidratación celular durante el protocolo de
enfriamiento.
Este modelo es aplicable en dos casos, células aisladas y tejidos con
estructura celular muy regular.
2.1. CASO DE CÉLULAS AISLADAS
Las células se encuentran inmersas en una solución isotónica ; están como
flotando en el medio sin entrar en contacto permanente unas células con otras.
Las células no están sujetas por ningún tejido conjuntivo, formando parte de un
órgano o tejido más complejo.
Las células que podemos estudiar pueden estar de forma natural en este
estado aislado. Este es el caso de espermatozoides, óvulos, glóbulos rojos, etc.
También podemos estudiar el comportamiento de células que forman parte
de tejidos, aunque previamente tenemos que separarlas y aislarlas de la
estructura superior de la que forman parte.
2.2. CASO DE CÉLULAS EN TEJIDOS
Mediante el modelo de Krogh podremos aplicar el modelo de transporte de
agua para estudiar la deshidratación de un tejido. Desafortunadamente el
modelo de Krogh no es aplicable a un tejido cualquiera; sólo es válido para
tejidos con una arquitectura interna muy regular, de forma que pueda
visualizarse como la repetición de una celda unitaria, a nivel de células y
capilares. Una analogía , a modo de ejemplo, sería la estructura cristalina del
cloruro sódico, formada por la repetición de una celda unitaria.
Bajo las condiciones mencionadas anteriormente, el transporte de agua en
un tejido podemos predecirlo con las mismas ecuaciones que en el caso de
células aisladas, introduciendo cambios apropiados en la geometría.
El modelo de Krogh
El modelo de Krogh busca establecer una analogía geométrica entre
un tejido y una célula aislada. De esta manera el comportamiento de una
célula aislada sería análogo al comportamiento de un tejido, desde el
punto de vista del transporte de agua.
Por esta razón, el objetivo del modelo de Krogh es buscar
información geométrica de la estructura interna del tejido, para
extrapolarla posteriormente a una célula aislada.
83
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
El modelo de Krogh visualiza al órgano o tejido, desde el punto de
vista geométrico, como una estructura que se construye a partir de una
celda unitaria que se repite indefinidamente.
Esta celda unitaria se representa como un cubo en cuyo interior se
encuentra localizado un cilindro, como se ve en la figura que se muestra
en la siguiente página.
El cilindro que se encuentra en el interior del cubo, simula la parte del
tejido formada por capilares y regiones intercelulares, mientras que la
región del cubo, excluido el cilindro interior, simula la parte del tejido
formado por células.
84
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Partimos de la suposición de que el transporte de agua entre células
adyacentes es despreciable frente al transporte de agua que se establece entre
las células y las regiones vasculares e intracelulares.
En estas condiciones el área del cilindro interior es el área disponible que
tienen las células para intercambiar agua con el medio exterior, en este caso
capilares y pequeñas regiones intercelulares.
Esta área de la célula aislada, cuyo comportamiento es análogo al del tejido,
desde el punto de vista del transporte del agua sería el área del cilindro.
La región del cubo que excluye al cilindro interior representa el volumen de
células que forman el tejido. El volumen total de la célula aislada cuyo
comportamiento es análogo al del tejido, sería este volumen.
Las dimensiones geométricas del modelo de Krogh
experimentalmente, a través de un análisis visual de los tejidos.
se
obtienen
La dimensión característica ?X es la media delas distancias que hay entre
los vasos capilares (de centro a centro de vaso capilar). Un ejemplo de estas
medidas se ven en la microfotografía adjunta:
Esta microfotografía muestra en tonos claros las
secciones transversales de capilares, mientras que las
regiones oscuras son hepatocitos, células del hígado.
La fotografía corresponde al hígado de la rana
R.sylvatica .
La media de células que encontramos entre
capilares es de 2 a 4 hepatocitos.
La fotografía ha sido tomada del artículo Liver
Freezing Response of the Freeze-Tolerant Wood
Frog, Rana Sylvatica in the Presence and Absence
of Glucose de la revista Cryobiology número 38.
El radio del cilindro interior, rvo es el radio de los capilares. Para determinar
este radio hay dos caminos:
o Empírico. Medimos este radio directamente en las
microfotografias, utilizando un software adecuado para tratar las
imágenes.
o Analítico. Mediante el estudio de las microfotografías podemos
establecer cual es la proporción de células y capilares en el tejido, en
términos de áreas, puesto que las fotografías son planas.
El radio rvo se puede calcular a partir de la siguiente ecuación:
2
2
p ·rvo = proporción de capilares · ?X
Ec. 165
85
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
La longitud característica L se determina imponiendo la condición de que las
células que forman parte del tejido deben tener el mismo volumen total que
esas mismas células tras haber sido aisladas previamente. La razón de esta
imposición es que el único volumen conocido es el de las células aisladas.
El ejemplo clásico de aplicabilidad del modelo de Krogh es el hígado, cuya
estructura interna es muy simple pues básicamente está constituido por una
distribución regular de hepatocitos ( las células mayoritarias en el hígado ) y
capilares. Las dimensiones características del modelo de Krogh para el caso
del hígado de rana de los bosques R. sylvatica son:
o
o
o
o
o
o
74% del área de la fotografía lo ocupan los hepatocitos.
26% del área de la fotografía lo ocupan los capilares.
?X=64±17.9 µm
rvo = 12.2±5.3 µm (método empírico)
rvo = 18.4±5.2 µm (método analítico)
L=0.71 µm (volumen célula aislada es 2145
µm3 )
86
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV-3. HIPÓTESIS SIMPLIFICATORIAS DEL MODELO IDEAL
Las hipótesis simplificatorias que vamos a aplicar a nuestro modelo de
transporte para cuantificar la deshidratación celular serán:
1) La solución extracelular se asume de dimensiones infinitas, de
manera que su composición no se verá afectada por el agua evacuada
desde las células en su proceso de deshidratación.
2) La solución intracelular es considerada una solución diluida ideal.
Esta hipótesis es muy útil pues simplifica mucho las ecuaciones.
Recordamos que una disolución diluida ideal era aquella en la que las
moléculas de soluto sólo interaccionaban con moléculas de disolvente. La
elevada dilución de las soluciones que vamos a tratar apoya el uso de esta
hipótesis. Sin embargo la naturaleza de electrolito fuerte del cloruro sódico,
da origen a intensas fuerzas iónicas que tienen como consecuencia
interacciones soluto-soluto considerables, incluso para diluciones muy altas.
Por eso el modelo el modelo de disolución diluida ideal no es estrictamente
válido para las disoluciones de electrolitos fuertes.
3) Las presiones parciales de los solutos disueltos tanto dentro como
fuera de la célula serán despreciables. Esta hipótesis simplificatoria es muy
razonable, dada la enorme volatilidad del agua líquida o del hielo,
cuantificada a través de su presión de vapor, frente a la de los solutos que
vamos a tener disueltos, como muestran los datos de sus presiones de
vapor, ridículamente pequeños incluso a muy altas temperaturas:
Ø Presión de vapor del agua líquida a 0ºC es 5579 mmHg
Ø Presión de vapor del ClNa a 825ºC es 1mmHg
Ø Presión de vapor del glicerol a 125ºC es 1mmHg
4) El vapor en equilibrio con las soluciones, tanto intracelular como
extracelular tienen comportamiento de gas ideal. Esta hipótesis
simplificatoria es muy razonable pues trabajamos a presiones moderadas (1
atmósfera) y a temperaturas muy bajas.
5) La solución extracelular está permanentemente en equilibrio
termodinámico con el hielo que se forma. Esta hipótesis asume que la
87
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
velocidad con la que el agua se transforma en hielo es lo suficientemente
rápida como para permitir que la composición de la disolución líquida aun
existente sea la composición de equilibrio que corresponde a la temperatura
del sistema. Los cambios de composición son capaces de seguir a los
cambios de temperatura.
Esta hipótesis se basa en observaciones experimentales donde incluso a
velocidades de enfriamiento de hasta 300000ºC/min, no se aprecia
subenfriamiento en el medio extracelular una vez que existe hielo en él. [11]
Estas condiciones pueden no darse en la solución intracelular, cuando el
causante del cambio de composición es el flujo osmótico. Si el fenómeno
físico de la ósmosis no modifica la composición del sistema lo
suficientemente deprisa, la composición del sistema no coincide con la
composición de equilibrio para cada temperatura del sistema. La disolución
intracelular estará por tanto subenfriada.
6) El calor latente de fusión del hielo se disipa lo suficientemente deprisa
como para no interferir en el perfil de enfriamiento que queremos imponer al
sistema. Esto significa que si imponemos un perfil de enfriamiento lineal,
cada uno de los puntos del sistema van a seguir dicho perfil.
7) Como consecuencia de la hipótesis de disolución diluida ideal, el
volumen molar parcial del disolvente coincide con el volumen molar del
disolvente puro. Estamos aplicando la regla de Lewis-Randall al disolvente.
La aplicación de esta regla lleva a asumir que las interacciones
intermoleculares entre las moléculas de agua son las mismas en una
disolución acuosa y en el caso de tener únicamente disolvente puro. Esta
simplificación es muy razonable en disoluciones muy diluidas donde las
moléculas de disolvente sólo interaccionan con otras moléculas de
disolvente.
8) Otra consecuencia de la hipótesis de disolución diluida ideal es que el
volumen molar parcial de los solutos coincide con su volumen molar a
dilución infinita. El volumen molar del componente i a dilución infinita es el
valor que tiene el volumen molar del componente i en el límite en el que la
concentración de soluto tiende a cero. Se representa por Vi8 .
9) La membrana celular permanece intacta durante el proceso de
enfriamiento. Esta hipótesis se basa en experiencias de laboratorio, para un
gran número de células en un extenso rango de protocolos de
enfriamiento.[11]
88
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
10) La membrana celular se considera una membrana semipermeable
perfecta que sólo permite el intercambio de agua. A pesar de no ser
estrictamente cierta, esta simplificación no producirá errores apreciables en
la mayoría de los casos. Esta simplificación se basa en el hecho de que la
permeabilidad de las membranas celulares al agua, es mucho mayor que al
mas permeable de los solutos. Consideremos por ejemplo el caso de
glóbulos rojos de bovino. La permeabilidad al agua a 20ºC es 5·105 veces
más grande que la permeabilidad al glicerol. El transporte de glicerol a
través de la membrana es despreciable frente al transporte de agua, en las
escalas temporales en las que nos movemos.[12]
11) El área de la membrana celular permanece constante durante el
proceso de enfriamiento, para el caso de células pequeñas(<10-16 m3), y se
mantiene proporcional al volumen para el caso de células grandes(>10-15
m3).
Mediante esta hipótesis simplificatoria estamos asumiendo que la célula
no se pliega sobre si misma. Esto es más probable que suceda en el caso
de células pequeñas como espermatozoides o glóbulos rojos; es más
improbable en el caso de grandes células como óvulos. En la tabla adjunta
se muestra el volumen de distintas células; cuanto mayor es su volumen,
mayor es la probabilidad de que la célula se pliegue sobre si misma,
conforme se deshidrata.
TIPO DE CÉLULA
Esperma de ratón
Glóbulos rojos de bovino
Hepatocitos de ratón
Óvulos de ratón
VOLUMEN/m3
3.1629·10-17
4.1·10-17
240·10-17
18775.2·10-17
En el caso de grandes células parece razonable establecer una relación
entre el área de la membrana y su volumen, para tener en cuenta el hecho
de que la pliega sobre si misma.
Una relación empírica que buenos resultados es la mostrada a
continuación donde Vcell es el volumen total de la célula:
A=(36·p )? ·V? cell
Ec. 166
89
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
90
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV-4. LAS VARIABLES Y PARÁMETROS DEL MODELO.
El enorme grado de complejidad que tiene la más simple de las células de
un organismo vivo, hace necesario simplificar nuestra visión de dicha célula
para poder establecer un modelo físico de su comportamiento.
Para nosotros una célula será simplemente una “bolsa” rellena de una
solución salina.
La bolsa, es decir, la célula tendrá una geometría regular, bien esférica,
bien cilíndrica.
El envoltorio de la bolsa, es decir, la membrana celular tendrá propiedades
de membrana semipermeable perfecta, como ya se ha comentado
anteriormente. Las dos características principales que van a definir el
comportamiento de la membrana son:
o Tamaño. Es el área de membrana disponible para intercambiar
agua con el medio exterior. Es muy fácil de calcular, debido a que
hemos asignado una geometría regular a la célula.
o Permeabilidad. Este parámetro define la facilidad con la que el
agua puede atravesar la membrana ante un gradiente de
concentraciones. Su magnitud estará afectada por la temperatura y
en menor medida por la concentración de solutos en la solución
intracelular. Debido a la importancia de este parámetro lo
desarrollaremos en otro apartado.
El contenido de la “bolsa”, es decir, el medio intracelular estará constituido
por dos regiones:
o Volumen osmóticamente inactivo. En esta región incluimos
orgánulos internos de la célula, el núcleo celular, macromoléculas
como por ejemplo proteinas, etc. Son partes internas de la célula que
no van a intervenir en el proceso del transporte del agua.
o Volumen osmóticamente activo. En esta región incluimos la
solución intracelular en la que están flotando los orgánulos internos,
el núcleo, etc.
La composición de esta solución intracelular es muy compleja, como para
ser tratada con la teoría de la fisicoquímica. Para nosotros la solución
intracelular va a estar constituida por los siguientes elementos:
§ Agua
§ Cloruro sódico
§ Crioprotectores permeables.
Los moles de cloruro sódico y de crioprotector se calcularán a partir de su
concentración inicial y del volumen osmóticamente activo inicial.
91
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Debido a la hipótesis simplificatoria de que a través de la membrana sólo va
a existir flujo de agua, los moles de soluto, es decir, de cloruro sódico y de
crioprotectores van a permanecer constantes mientras dure la deshidratación
celular, hasta que se alcancen las condiciones de saturación.
Por lo tanto un parámetro clave para poder resolver numéricamente el
modelo es el conocimiento del volumen osmóticamente activo inicial.
El volumen osmóticamente inactivo inicial se calcula a partir de la
construcción del gráfico de Boyle-van’t Hoff (BVH).[4]
En el eje vertical del gráfico BVH representamos la fracción de volumen
total de la célula en un instante arbitrario con respecto al volumen total inicial
de la célula. En el eje horizontal representamos los valores de la inversa de la
molalidad de la disolución intracelular.
Un ejemplo de este tipo de gráficos se muestra en la figura adjunta,
obtenido para el caso de tejido de tejido de hígado de rata:
El gráfico adjunto
ha sido obtenido del
artículo
Quantitative
Measurement
and
Prediction
of
Biophysical Response
During Freezing in
Tisúes publicado por
John C. Bischof. [4]
Para poder dibujar el gráfico hay que seguir una serie de pasos:
§ Someter todas las muestras a una misma velocidad de
enfriamiento conocida. Para obtener el gráfico anterior se impuso una
velocidad de 5ºC/min.
§ Detener el enfriamiento de cada una de las muestras a una
temperatura diferente. Tendremos tantas muestras como puntos
queramos tener en el gráfico. En el caso del ejemplo las
temperaturas a las que se detuvo el proceso de enfriamiento
estuvieron en el rango de -4ºC a -20ºC.
92
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
§ Mantenemos las muestras a la temperatura constante final, el
tiempo suficiente como para que el medio intracelular alcance el
equilibrio con el medio exterior, eliminando así todo el
subenfriamiento de la solución intracelular.
§ Sometemos a las muestras a un proceso de enfriamiento
súbito, sumergiéndolas en nitrógeno líquido. Con este procedimiento
buscamos solidificar la muestra, bien con formación de hielo, bien por
alcanzar condiciones de estado vítreo, deteniendo cualquier proceso
de deshidratación. Esto me va a permitir analizar por microscopio
cómo era el estado de deshidratación del sistema a la temperatura a
la que se detuvo el proceso de enfriamiento a la velocidad de
-5ºC/min.
§ Mediante esta inspección visual puedo conocer el volumen de
disolución que aun permanece dentro de la célula para cada una de
las temperaturas a las que se detuvo el proceso de enfriamiento.
Llegados a este punto conozco los pares de valores ( V / Vo ; T ).
Ahora necesito información sobre la evolución de la concentración
con la temperatura para poder dibujar el gráfico BVH.
§ Suponiendo que la disolución es diluida ideal y que va a
permanecer con bajo grado de subenfriamiento en todo el rango de
temperaturas de estudio, puedo estimar la concentración a partir de
la curva de descenso crioscópico; recordamos que esta ecuación
relaciona la concentración de una disolución con su temperatura de
solidificación, en un proceso de equilibrio. Para la obtención del
gráfico del ejemplo se empleó la expresión simplificada del descenso
crioscópico dada por la ecuación Ec145, como ya se ha visto
previamente
en
el
CAPÍTULO
1
de
FUNDAMENTOS
TERMODINÁMICOS y que tenía la siguiente expresión:
1 1.858
=
m
∆T
donde ∆T = 273 − T
donde m es la molalidad del la disolución y T la temperatura del
sistema, siendo ?T el descenso crioscópico.
§ Conociendo los pares de valores ( m, T ) y (V/Vo , T) puedo
dibujar el gráfico BVH. Una extrapolación lineal del gráfico hasta una
molalidad infinita (inverso de la molalidad igual a cero) me da la
fracción del volumen celular que es osmóticamente inactivo. El corte
de la curva BVH con el eje vertical me da la fracción de volumen
osmóticamente inactivo. Esta extrapolación es razonable, pues
cuando he expulsado todo el volumen que puede ser evacuado a
través de la membrana celular( volumen osmóticamente activo), la
concentración de solutos disueltos dentro de la célula sería infinito;
en estas condiciones dentro de la célula únicamente permanece lo
que hemos venido en llamar volumen osmóticamente inactivo.
93
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Como resumen podemos afirmar que para poder plantear el modelo físico
de deshidratación celular necesito conocer:
Ø
Ø
Ø
Ø
La permeabilidad de la membrana.
El volumen osmóticamente activo inicial.
La concentración inicial de solutos dentro de la célula.
El área de la membrana.
94
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV-5. EL COEFICIENTE DE PERMEABILIDAD O LA CONDUCTIVIDAD
HIDRÁULICA DE LA MEMBRANA CELULAR
5.1. INTRODUCCIÓN
En los últimos años, se han llevado a cabo diversos estudios teóricos sobre
la cinética del transporte de agua en las células sometidas a procesos de
enfriamiento a temperaturas inferiores a los cero grados centígrados.
En todos estos modelos teóricos, las repuestas de las células a los sucesos
termodinámicos asociados a los procesos de enfriamiento, se caracterizan
mediante ciertos parámetros físicos asociados a la naturaleza de las células,
como pueden ser su tamaño o la concentración natural de sales en su interior.
El más importante de todos estos parámetros físicos es la permeabilidad de
la membrana celular, puesto que el comportamiento de la célula durante el
enfriamiento, desde el punto de vista del transporte de agua, depende
fundamentalmente de este parámetro.
La permeabilidad de una membrana a un cierto componente, el agua en
nuestro caso, mide la facilidad con la que dicho componente fluye a través de
la membrana ante un gradiente de presiones osmóticas. Así cuanto mayor sea
el valor de la permeabilidad, mayor será el flujo de agua para un gradiente de
presiones osmóticas dado.
95
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
5.2. LEY DE LA PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA CELULAR
La ley de permeabilidad que vamos a emplear en nuestro modelo, va a
tener en cuenta la variación del valor de la conductividad hidráulica con la
temperatura mediante una relación de Arrhenius:
LP (T ) = LPg ⋅ e
−
E Lg  1 1
⋅ −
R  T Tg




Ec. 167
donde LPg es la conductividad hidráulica a la temperatura de referencia Tg ,
y ELg es la energía de activación aparente para el transporte de agua a través
de la membrana.
Existen otras expresiones que parece ser que se ajustan mejor a los datos
experimentales. Introducir una ecuación diferente a la que vamos a emplear
solo introduciría ligeras modificaciones en los resultados, siendo inmediato
cambiar las ecuaciones del modelo de deshidratación.
Esta ley de comportamiento refleja el hecho empírico de que cuanto menor
es la temperatura del sistema, menor es la permeabilidad de la membrana. De
esta manera la membrana celular pierde su carácter semipermeable para pasar
a tener un carácter impermeable, por debajo de una cierta temperatura crítica.
Cuando enfriamos el sistema por debajo de dicha temperatura crítica, el
proceso de deshidratación se detiene, aumentando indefinidamente el
subenfriamiento de la solución intracelular; esto se traduce en un aumento de
la probabilidad de formación de hielo intracelular.
A modo de ejemplo mostramos la evolución de los coeficientes de
permeabilidad con la temperatura para los casos de espermatozoides[22] y
óvulos[5] de ratón.
P E R M E A B ILIDAD DE LA MEMBRANA
DE ESPERMATOZOIDES DE RATÓN.
P E R M E A B ILIDAD DE LA MEMBRANA
DE OVULOS DE RATÓN
0.08
0.009
Coeficiente de permeabilidad/(micras/min atm)
Coeficiente de permeabilidad/ (micras/min atm)
0.01
0.008
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
Temperatura/ºC
-35
-40
-45
-50
Figura 1
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
Temperatura/ºC
-40
-45
-50
-55
Del análisis de estos dos gráficos, observamos que la conductividad
hidráulica de los óvulos de ratón es un orden de magnitud superior al de los
espermatozoides. La temperatura crítica para la cual la membrana se vuelve
96
-60
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
impermeable en el caso de los espermatozoides de ratón está entorno a los
–30ºC, mientras que para el caso de óvulos de ratón está en torno a los –45ºC.
Experimentos de laboratorio muestran que la permeabilidad de la
membrana celular, además de variar con la temperatura del sistema, también
depende de la concentración de soluto en el medio extracelular[15].
Por ejemplo, la conductividad hidráulica Lp , de fibroblastos de hámster, se
reduce a la mitad cuando tenemos una concentración 0.2 M de dimetil sulfóxido
(DMSO), con respecto a la que tendríamos en una solución isotónica. Cuando
continuamos aumentando la concentración de DMSO por encima de 0.2M, la
permeabilidad no se reduce, permaneciendo aproximadamente constante[15].
Otro ejemplo lo encontramos en el caso de óvulos de hámster, para el que
se ha deducido una ecuación empírica que relaciona la concentración de
solutos en el medio extracelular, con la conductividad hidráulica de la
membrana [15]:
 1
1 
 Ec. 168
LP = 1.135 − 0.154 ⋅ 
−
 0.3 M t 
donde Mt es la osmolalidad del medio exterior.
En la representación gráfica que se muestra a continuación se observa un
comportamiento asintótico de LP hacia el valor de 0.63 µm/min atm , cuando la
composición del medio está entre 1.5 y 3 osmolal.
Este valor de la permeabilidad representa aproximadamente el 50% del
valor de la permeabilidad en un medio isotónico.
COEFICIENTE DE PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA DE ÓVULOS
DE HÁMSTER EN FUNCIÓN DE LA MOLALIDAD EXTRACELULAR
Coeficiente de permeabilidad/(micras/min atm)
1.2
1.1
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0
1
2
3
4
5
6
7
Molalidad /(moles/kg de disolvente)
8
9
10
Figura 2
97
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Puesto que la mayoría de las muestras tratadas con crioprotector tiene
concentraciones superiores a 1.5÷3 osmolal, el efecto de las concentración de
soluto afecta al valor del coeficiente de permeabilidad antes de comenzar el
proceso de enfriamiento.
En base a lo expuesto, parece necesario introducir en el modelo de
permeabilidad algún mecanismo que tenga en cuenta la presencia de agentes
crioprotectores.
La manera que vamos a tener de contemplar, la presencia de
crioprotectores en nuestro modelo, será la de reducir a la mitad el valor de la
permeabilidad de referencia LPg , cuando en el sistema haya presente
crioprotectores. Obviamente el valor de la permeabilidad de referencia se habrá
determinado en ausencia de crioprotectores. Esta reducción del valor de la
permeabilidad de referencia a la mitad, se traduce en una reducción de la
permeabilidad de la membrana celular para todas las temperaturas. A modo de
ejemplo, mostramos en la siguiente página, la evolución de la permeabilidad de
la membrana de espermatozoides de ratón, con la temperatura para los casos
de ausencia y presencia de crioprotectores en el medio.
PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA
DE ESPERMATOZOIDES DE RATÓN
Coeficiente de permeabilidad/(micras/min atm)
0.01
0.009
sin crioprotector
con crioprotector
0.008
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
Temperatura/ºC
-35
-40
-45
-50
Figura 3
Esta reducción de la permeabilidad para todas las temperaturas, genera una
mayor dificultad de la célula para deshidratarse. Es de esperar, por tanto
mayores retenciones de agua dentro de la célula, y en consecuencia mayores
serán los subenfriamientos que se alcanzarán.
98
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Como resumen podemos describir el modelo de permeabilidad como sigue:
Ø Sin crioprotector:
LP = LPg ⋅ e
−
E Lp  1 1
⋅ −
R  T Tg




Ec. 169
Ø Con crioprotector:
−
1
LP = ⋅ LPg ⋅ e
2
E Lp  1 1
⋅ −
R  T Tg




Ec. 170
No hay evidencias experimentales que establezcan una relación entre la
concentración de soluto y la energía de activación ELpg.
99
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
5.3. DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DE LOS PARÁMETROS DEL MODELO DE
PERMEABILIDAD
Los pasos fundamentales que hay que seguir, para poder conocer los
valores numéricos de la permeabilidad de la membrana a una temperatura
conocida y la energía de activación son:
1) Mediante ensayos de laboratorio, obtener datos sobre la
deshidratación celular a distintas temperaturas para una velocidad de
enfriamiento conocida.
2) Ajustar los datos experimentales a las ecuaciones teóricas,
donde los únicos datos desconocidos son los parámetros de la
permeabilidad: LPg y ELPg.
Las dos técnicas más importantes que hoy día se emplean para cuantificar
la deshidratación celular son:
1) El método de las Dos etapas: es una técnica de análisis directo.
Mediante una inspección visual de la muestra cuantificamos su
deshidratación.
2) El método de la calorimetría de escaneo diferencial: es una
técnica de análisis indirecto. Medimos el calor liberado en el cambio
de fase de agua líquida a hielo durante el enfriamiento de la muestra.
100
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
5.3.1 MÉTODO DE LAS DOS ETAPAS (TWO – STEP)
El método de las Dos etapas es una técnica basada en el análisis visual
directo de las muestras durante el proceso de deshidratación de las células,
que tiene lugar cuando enfriamos el sistema por debajo de los cero grados
centígrados.
La aplicabilidad de este método está limitada por la geometría de las
células. La razón está en la simplificación que a continuación describimos: a
partir del área proyectada por las células(información en dos dimensiones que
obtenemos en las fotografías) podemos estimar el volumen de dichas células
(información tridimensional). Esta extrapolación es razonable para células de
geometrías aproximadamente esféricas, donde a partir de una fotografía puedo
medir el diámetro y conocer así su volumen, pero es inapropiada para células
con geometría arbitraria.
El desarrollo del método se lleva a cabo en dos pasos, de ahí su nombre:
PASO 1: Sometemos la muestra a una velocidad de enfriamiento baja que
favorezca la deshidratación celular.
Cada muestra es enfriada a una temperatura diferente; cuanto más
baja sea la temperatura a la que enfriemos más tiempo dura la etapa
de deshidratación, y por tanto mayor será la cantidad de agua
expulsada del medio intercelular. Es de esperar que cuanto más baja
sea la temperatura mayor será la cantidad de hielo que se forme en el
medio extracelular.
PASO 2: Una vez que la muestra es enfriada hasta su temperatura final, la
introducimos en nitrógeno líquido. Esta etapa somete a la muestra a
una velocidad de enfriamiento ultrarrápida. Este paso se denomina
“criofijación”.
La razón de ser de esta etapa y de su nombre se basa en el hecho de
que para muestras pequeñas (<1 mm3), como las que nos ocupan, el
tiempo característico para el transporte del calor es varios órdenes de
magnitud inferior al tiempo característico para el transporte de masas.
Matemáticamente queda expresado como:
 L2 
ttransporte calor =   << ttrasporte
α 
masa

V0
= 
 LP ⋅ A ⋅ ∆π

 Ec. 171

donde: V0 : volumen característico del sistema
Lp : permeabilidad de la membrana
A : área de la membrana
101
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
?p : incremento de presiones osmóticas a través de la
membrana
Lp A ?p : velocidad característica de deshidratación
ttransporte masa: tiempo característico necesario para evacuar todo
el agua de un sistema de volumen característico V0 .
L: longitud característica del sistema.
L2: área característica del sistema.
a : conductividad térmica
ttranspote calor : tiempo característico necesario para evacuar el
calor necesario del sistema para reducir su temperatura la unidad.
Por lo tanto, cuando sometemos al sistema a un enfriamiento tan rápido, el
agua retenida dentro de la célula no se modifica, alcanzándose las condiciones
de solidificación (puede ser vitrificación, congelación, o las dos cosas, que es lo
más probable), sin que se haya producido una deshidratación significativa.
Esta etapa lo que pretende es mantener indefinidamente el sistema en unas
condiciones estables. Seguidamente se pasa a un laborioso proceso de
tratamiento con resinas que aquí no vamos a describir.
Para poder cuantificar visualmente cuánto se han deshidratado las células,
necesitamos una fotografía de referencia en la que las células de la muestra no
se hayan deshidratado nada. Esta fotografía se obtiene no sometiendo la
muestra a la primera etapa, pasando directamente al paso 2 (de criofijación).
Como ejemplo de método mostramos las microfotografías de muestras de
hígado de ratón[4].
Las áreas oscuras, marcadas con asteriscos corresponden a las células del
tejido, mientras que las áreas claras, marcadas con flechas corresponden a
regiones extracelulares donde se ha formado hielo.
102
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Figura 4
La fotografía A es la muestra de referencia en la que la muestra fue
sometida a un enfriamiento súbito, sin que las células tuvieran tiempo de
deshidratarse. En esta fotografía podremos observar cómo sería el tejido en su
estado natural.
En la fotografía B el sistema fue enfriado hasta los –4ºC a la velocidad de
–5ºC/min. Ahora la cantidad de hielo extracelular formado es mayor, puesto
que además del agua del medio intercelular interviene el agua evacuada por
las células.
En la fotografía C el sistema fue enfriado hasta los –8ºC a la misma
velocidad, dando más tiempo para que las células se deshidraten. Por lo tanto
es de esperar, y así lo muestra la fotografía, la cantidad de hielo formado en el
exterior es mayor.
En la fotografía D el sistema fue enfriado hasta los –20ºC. Se aprecia una
elevada formación de hielo, quedando las células aprisionadas en pequeños
canales, donde sufren una enorme deformación, que puede dar origen a la
rotura de la membrana celular y por tanto a la muerte de la célula.
103
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
5.3.2 MÉTODO DE LA CALORIMETRÍA DE ESCANEO DIFERENCIAL (DIFFERENTIAL
SCANNING CALORIMETRY. DSC)
El fundamento físico en el que está basado esta técnica es que el calor
liberado por el cambio de fase de agua líquida a hielo, en muestras con células
osmóticamente activas, es mayor que el calor liberado en las mismas
muestras, pero con las células osmóticamente inactivas.
La diferencia de calor evacuado entre los dos casos descritos, se puede
relacionar con el volumen de agua retenido dentro de la célula:
V (T ) = V0 −
∆q (T )
⋅ (V0 − Vb ) Ec. 172
∆q
donde V(T) es el volumen de disolución retenida en la célula, Vo es el volumen
inicial de la célula, Vb es el volumen osmóticamente inactivo, ?q es la diferencia
total de calor, y ?q(T) es la diferencia de calor para cada temperatura.
Esta técnica no tiene la limitación de la geometría celular, como la que tenía
la de las Dos Etapas.
Una breve descripción del método DSC se muestra a continuación, para el
caso particular de hepatocitos de ratón:
Paso 1: la muestra es enfriada a una velocidad pequeña, en nuestro caso
5ºC/min , hasta que empieza a formarse hielo en el medio extracelular, a unos
–2.5ºC.
Paso 2: calentamos la muestra hasta la temperatura de cambio de fase,
que para el caso del hígado de ratón, es de –0.53ºC. La muestra en estas
condiciones aun contiene algo de hielo en el medio extracelular. Este hielo
servirá como agente nucleante para la formación de hielo cuando enfriemos por
debajo de la temperatura de cambio de fase,-0.53ºC para los hepatocitos de
ratón.
Paso 3: la muestra es enfriada hasta –50ºC a una velocidad pequeña,
-5ºC/min . Medimos el calor liberado durante el cambio de fase originado en el
medio extracelular con las células osmóticamente activas.
Paso 4: calentamos la muestra hasta –0.53ºC a una velocidad de
100ºC/min.
104
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Paso 5: para diferenciar entre el calor liberado durante el cambio de fase en
el medio extracelular, del liberado por el agua del medio intracelular que ha
sido evacuada al medio extracelular, sometemos la muestra a un proceso de
enfriamiento rápido(200ºC/min) hasta los –50ºC. Este enfriamiento súbito
provoca que las células se vuelvan osmóticamente inactivas.
Paso 6: calentamos la muestra hasta –0.53ºC a una velocidad de
100ºC/min. Como resultado del paso 5, el agua intracelular así como sus
proteinas y sales estarán mezcladas con el medio extracelular, es decir, en el
paso 5 hemos provocado la rotura de la membrana celular.
Paso 7: la muestra es enfriada hasta –50ºC a una velocidad pequeña de
–5ºC/min. Medimos el calor liberado por el medio, donde no existen
membranas que regulen la evacuación de agua del interior de las células, no
estando la formación de hielo limitada por este mecanismo. Por tanto el calor
liberado en esta etapa, debe ser mayor que en caso donde el agua disponible
para congelarse estaba limitada por la regulación ejercida por la membrana.
Esta regulación no existe y todo el agua está disponible para cambiar de fase.
Un ejemplo de la evolución de los calores liberados viene en la figura
adjunta.
Figura 5
105
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV-6. MODELO TEÓRICO IDEAL
6.1. INTRODUCCIÓN
En este apartado vamos a desarrollar las ecuaciones del modelo teórico,
que nos permitirán cuantificar cómo se va deshidratando la célula conforme
enfriamos el sistema, para el caso de soluciones diluidas ideales.
En ninguna de las ecuaciones se tendrá en cuenta la presencia de agentes
crioprotectores.
Primeramente obtendremos las ecuaciones, sin especificar ningún tipo
concreto de perfil de enfriamiento, para posteriormente particularizarlas para un
perfil lineal, un perfil cuadrático, y un perfil exponencial de enfriamiento.
También desarrollaremos las ecuaciones que nos permitirán cuantificar la
deshidratación celular en el caso de mantener la temperatura del sistema
constante.
Introduciremos el concepto de “Curva de Equilibrio”, que nos permitirá
cuantificar el subenfriamiento del medio intracelular en función de la velocidad
de enfriamiento y de la temperatura del sistema.
106
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
6.2. EL MODELO TEÓRICO IDEAL PARA UN PERFIL DE ENFRIAMIENTO ARBITRARIO
En el capítulo de ÓSMOSIS hemos visto que cuando hay una membrana
semipermeable que separa dos disoluciones, se produce un flujo espontáneo
de disolvente puro, desde la disolución menos concentrada hacia la más
concentrada.
Para el caso de soluciones diluidas ideales, la ecuación de van’t Hoff
relacionaba la concentración de soluto con la presión osmótica.
π = C B ⋅ R ⋅ T Ec. 173
donde CB es la concentración en moles / litro de la disolución.
Por lo tanto se producirá un flujo espontáneo de disolvente puro, desde la
región de MENOR presión osmótica hacia la región de MAYOR presión osmótica.
El caudal de agua evacuado por la célula, será proporcional a la diferencia
de presiones osmóticas entre el medio intracelular y extracelular, cuyo origen
es el desequilibrio de potenciales químicos. Consideraremos caudal positivo, al
caudal que sale de la célula.
Con este criterio de signos, el caudal evacuado (positivo), será proporcional
a la fuerza impulsora , es decir, la presión osmótica en el exterior menos la
presión osmótica en el interior.
El caudal de agua evacuado es a su vez igual a la variación del volumen de
disolvente de la célula(volumen osmóticamente activo), cambiado de signo,
puesto que conforme evacuamos caudal (positivo), disminuye el volumen de la
célula.
dV
= − Caudal evacuado Ec. 174
dt
Introduciendo la proporcionalidad entre caudal evacuado y diferencia de
presiones osmóticas podemos escribir:
(
)
(
dV
dV
∝ − π ex − π in ⇒
∝ π in − π ex
dt
dt
)
Ec. 175
donde p in y p ex son las presiones osmóticas en el interior y en el exterior de la
célula respectivamente.
La constante de proporcionalidad es el Coeficiente de Permeabilidad o
Conductividad Hidráulica , que como vimos en el apartado 5.1 del capítulo 4
nos informaba de la facilidad con la que se produce el flujo de fluido a través de
una membrana.
107
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Para el caso concreto que estamos tratando, vamos a definir la
permeabilidad como la magnitud de caudal que atravesaría la unidad de área
de membrana, ante una diferencia de presiones osmóticas unitaria.
Con esta definición la ecuación de proporcionalidad pasa a ser una igualdad
de la forma:
(
dV
= Lp (T ) ⋅ A ⋅ π in − π ex
dt
)
Ec. 176
donde V es el volumen de disolución intracelular, Lp(T) es el coeficiente de
permeabilidad, que como ya vimos dependía fuertemente de la temperatura.
Las unidades de la permeabilidad serán m3/(min·m2·atm). El parámetro A es el
área de membrana, por donde tiene lugar el flujo de agua.
Las presiones osmóticas de las disoluciones, podemos expresarlas en
función de las presiones de vapor, como ya vimos en el capítulo de Ósmosis.
P
R ⋅T
⋅ ln Ain, l
VA
P
*
π in =
π
ex
P*
R ⋅T
=
⋅ ln Aex,l
VA
P
Ec. 177
donde VA es el volumen molar parcial del disolvente, P*A,l es la presión de
vapor del disolvente puro, y Pin, Pex son las presiones de vapor de la solución
intracelular y extracelular respectivamente.
Aplicando estas relaciones a la ecuación de deshidratación y teniendo en
cuenta la hipótesis simplificatoria 7 (apartado IV-3), que decía que el volumen
molar parcial del disolvente es aproximadamente igual al volumen molar del
disolvente puro, podemos escribir:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
P ex
Ec. 178
=
ln
⋅
dt
VA*
P in
donde V*A es el volumen molar del disolvente puro.
A continuación vamos a desarrollar el cociente de las presiones de vapor:
Ø solución intracelular : aplicando la ley de Raoult ideal tenemos.
P in = PA*,l (T ) ⋅ x inA + PB* (T ) ⋅ x Bin Ec. 179
donde P*A,l y P*B son las presiones de vapor del agua líquida y de la sal
y xinA y xinB son las fracciones molares de agua y sal respectivamente.
108
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Aplicando la hipótesis simplificatoria 3 (apartado IV-3), que desprecia las
presiones de vapor de los solutos frente a la del disolvente, y teniendo
en cuenta además que xinA>>xinB , al tratarse de una disolución diluida,
podemos escribir:
P in ≈ PA*,l (T ) ⋅ x inA
Ec. 180
Ø solución extracelular : vamos a demostrar que la presión de vapor del
medio extracelular, donde tenemos una disolución líquida en equilibrio
con hielo, es aproximadamente igual a la presión de vapor del hielo puro:
P ex ≈ PA*, s (T )
Ec. 181
Consideramos un recipiente cerrado, en el que tenemos una disolución
líquida en equilibrio con hielo, al igual que ocurre en el medio extracelular.
Supongamos que en la interfase entre la disolución y el vapor con el que
está en equilibrio no hay hielo. Por lo tanto la presión de vapor será únicamente
la del disolvente líquido y la del soluto.
El potencial químico del disolvente en la disolución será igual que el
potencial químico del disolvente en el vapor, por estar el vapor en equilibrio
termodinámico con la disolución.
109
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
µ A,l (T ) = µ A, g (T ) Ec. 182
El potencial químico del disolvente en la fase vapor, aplicando la hipótesis 4
(apartado IV-3) de que el vapor tiene comportamiento de gas ideal será:
µ A, g (T ) = µ A0 + R ⋅ T ⋅ ln
PA,l
P0
Ec. 183
Por lo tanto podemos escribir:
µ A,l (T ) = µ A0 + R ⋅ T ⋅ ln
PA,l
P0
Ec. 184
Consideremos ahora un recipiente cerrado en el que tenemos hielo. Una
vez alcanzadas las condiciones de equilibrio termodinámico, la presión de
vapor del gas en equilibrio con el hielo, será la presión de vapor del hielo.
Aplicando, al igual que antes, la igualdad de potenciales químicos y la
hipótesis de gas ideal, podemos escribir:
µ
*
A, s
(T ) = µ
*
A, g
(T ) = µ + R ⋅ T ⋅ ln
0
A
PA*, s
P0
Ec. 185
Puesto que en el medio extracelular la disolución acuosa líquida está
permanentemente en equilibrio con el hielo formado, se cumplirá la igualdad de
potenciales químicos:
µ A,l (T ) = µ *A, s (T ) Ec. 186
Sustituyendo Ec.184 y Ec.185, en Ec.186:
µ A0 + R ⋅ T ⋅ ln
PA,l
P0
= µ A0 + R ⋅ T ⋅ ln
PA*, s
P0
Ec. 187
110
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
De esta última igualdad se deduce que la contribución de la disolución
líquida a la presión de vapor es igual a la presión de vapor del hielo:
P ex = PAex,l + PBex ≈ PA*,l + PBex Ec. 188
Aplicando la hipótesis simplificatoria 3 (apartado IV-3), de despreciar la
presión de vapor de los solutos frente a la de el disolvente, llegamos a la
expresión deseada, que identificamos como Ec.181:
P ex ≈ PA*, s (T ) Ec. 189
Tras las simplificaciones efectuadas a las expresiones de las presiones de
vapor de las disoluciones intracelular y extracelular podemos obtener el
cociente de presiones de vapor de Ec.180 y Ec.189:
*
P ex PA, s (T ) 1
≈
⋅
Ec. 190
P in PA*,l (T ) x inA
sustituyendo Ec.190 en Ec.178, la ecuación de deshidratación queda:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dt
VA*
 PA*, s (T )

⋅  ln *
− ln x inA  Ec. 191
 P (T )

A, l


Seguidamente emplearemos la ecuación de Clausius-Clapeyron para
calcular las presiones de vapor de las sustancias puras en función de la
temperatura:
(
)
L (T )
d
ln PA*,l = V 2
dT
R ⋅T
(
)
L (T )
d
ln PA*, s = S 2 Ec. 192
dT
R ⋅T
donde LV(T),LS(T) son los calores latentes de vaporización y sublimación
respectivamente.
Integrando ambas ecuaciones en función de la temperatura:
 T L (T ) 
PA*, l (T ) = PA*, l (T0 ) ⋅ exp ∫ V 2 dT 
T R ⋅T

 0

 T L (T ) 
PA*, s (T ) = PA*, s (T0 ) ⋅ exp ∫ S 2 dT 
T R ⋅T

 0

Ec. 193
111
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
El cociente de presiones de vapor aplicando los resultados de integrar la
ecuación de Clausius-Clapeyron, Ec.193, quedará:
PA*,l (T )
PA*, s (T )
PA*,l (T )
PA*, s (T )
=
*
T
 T LS (T )
 T LS (T ) − LV (T ) 
LV (T )  PA,l (T0 )

⋅
−
=
⋅
exp
exp
dT
dT
∫T R ⋅ T 2  PA*,s (T0 )  T∫ R ⋅ T 2 dT 
 T∫ R ⋅ T 2
PA*, s (T0 )
0
0

0

=
 T LF (T ) 

exp
⋅
dT 
 T∫ R ⋅ T 2

PA*, s (T0 )
0

PA*,l (T0 )
PA*,l (T0 )
Ec. 194
donde LF(T) es el calor latente de fusión.
Sustituyendo en la ecuación Ec.191:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dt
VA*
 PA*, s (T0 ) T LF (T )

 Ec. 195
dT
ln
x
⋅  ln *
+∫
−
A
 PA,l (T0 ) T R ⋅ T 2

0


Tomando T0 = 273.15 K, la presión de vapor del hielo y del agua líquida
pura coinciden y por tanto la ecuación queda:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dt
V A*
 T L (T )

⋅  ∫ F 2 dT − ln x A  Ec. 196
 273.15 R ⋅ T

En la ecuación de deshidratación la única variable dependiente que vamos
a considerar es el volumen de disolución osmóticamente activo, en el interior
de la célula, y la única variable independiente a tener en cuenta va a ser la
temperatura del sistema.
Por ello la variación del volumen con el tiempo debemos expresarlo en
función de la temperatura:
dV dV dT
dV
=
⋅
= F (T ) ⋅
Ec. 197
dt
dT dt
dT
donde F(T) es una función de la temperatura particular de cada perfil de
enfriamiento.
Por la misma razón, la fracción molar de disolvente debemos expresarla en
función del volumen de disolución intracelular y en función de la temperatura
del sistema:
xA =
nA
Ec. 198
n A + ν B ⋅ nB
donde nA , nB son los moles de disolvente(agua) y de soluto(ClNa)
respectivamente, y ?B es el coeficiente de disociación de la sal.
112
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Si multiplicamos y dividimos por el volumen molar del agua pura, nada
cambia:
xA =
n A ⋅ V A*
Ec. 199
n A ⋅ V A* + ν B ⋅ n B ⋅ V A*
El volumen de disolución intracelular es:
V = n A ⋅ V A + n B ⋅ VB Ec. 200
donde VA y VB son los volúmenes molares parciales del agua y la sal
respectivamente.
Aplicando las hipótesis simplificatorias 7 (apartado IV-3), de aproximar el
volumen molar parcial del disolvente al volumen molar del disolvente puro, y 8,
de aproximar el volumen molar parcial de los solutos al volumen molar a
dilución infinita, podemos escribir:
V ≈ n A ⋅ V A* + n B ⋅ V B∞ Ec. 201
donde V*A es el volumen molar del disolvente puro, y V8 B es el volumen molar
a dilución infinita del soluto.
Por lo tanto la fracción molar de disolvente queda:
xA =
V − n B ⋅ VB∞
V − n B ⋅ V B∞ + ν B ⋅ n B ⋅ V A*
Ec. 202
Finalmente la ecuación de deshidratación celular queda:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dT
V A* ⋅ F (T )
 T LF (T )

V − n B ⋅ VB∞
 Ec. 203
⋅  ∫
dT
−
ln
2
∞
* 
R
⋅
T
V
−
n
⋅
V
+
ν
⋅
n
⋅
V
B
B
B
B
A 
 273.15
Vamos a emplear una ecuación semiempírica que relaciona el calor latente
de fusión del agua pura, con la temperatura[11]. Esta expresión es de la forma:
LF (T ) = a + b ⋅ (T − α ) − c ⋅ (T − α ) 2 + d ⋅ (T − α ) 3 Ec. 204
donde
a=6004.8 J / mol
b=38.016 J / mol·K
c=0.11088 J / mol·K2
d=0.00090432 J / mol·K3
a=273.15 K
113
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Mediante la representación gráfica que mostramos a continuación del calor
latente de vaporización, vemos que va disminuyendo con la temperatura.
CALOR LATENTE DE FUSIÓN DEL AGUA
6200
6000
Entalpía de Fusión/(J/mol)
5800
5600
5400
5200
5000
4800
4600
4400
4200
0
-5
-10
-15
-20
-25
Temperatura/ºC
-30
-35
-40
Nos interesa la integración de la ecuación Ec.204, para sustituirla en la
ecuación Ec.203. Esta será:
 1 1  b + 2 ⋅α ⋅ c + 3 ⋅α 2 ⋅ d
T
⋅ ln −
⋅  −  +
R
T0
 T0 T 
c + 3 ⋅ α ⋅ ⋅d
d
−
⋅ (T − T0 ) +
⋅ T 2 − T02
R
2⋅ R
LF (T )
a − b ⋅α − c ⋅α 2 − d ⋅α 3
dT
=
∫ 2
R
T0 R ⋅ T
T
(
)
Ec. 205
114
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
6.3. LA CURVA DE EQUILIBRIO. EL SUBENFRIAMIENTO
6.3.1 INTERPRETACIÓN FÍSICA
En el apartado IV-3 de Hipótesis Simplificatorias vimos que la solución
extracelular estaba permanentemente en equilibrio termodinámico con el hielo
formado, gracias a que la velocidad con la que el agua se transformaba en
hielo era lo suficientemente alta como para que en cada instante la
composición del medio extracelular fuera la composición de equilibrio, marcada
por la temperatura del sistema.
Sin embargo, el medio intracelular no corre la misma suerte. La composición
de la solución intracelular no coincide con la composición de equilibrio, que es
la composición del medio extracelular, por estar éste permanentemente en
equilibrio.
Es de especial interés para este proyecto cuantificar el alejamiento del
equilibrio con el que evoluciona el medio intracelular, pues su conocimiento nos
permitirá cuantificar la probabilidad de formación de hielo.
Para poder cuantificar esta probabilidad necesitamos conocer el
desequilibrio en términos de temperaturas. La temperatura, para cada instante
de tiempo, de un sistema que evoluciona por sucesivos estados de equilibrio,
es diferente a la temperatura de ese mismo sistema pero cuando no evoluciona
por estados de equilibrio. Esto significa que cuando la composición de un
sistema es una determinada, su temperatura es diferente, según haya
evolucionado por estados de equilibrio o no.
A la diferencia entre la temperatura de un sistema y a la que tendría si
evolucionara por sucesivos estados de equilibrio se denomina
subenfriamiento. Este va a ser el parámetro que cuantificará el alejamiento
del equilibrio. Así cuanto mayor sea el subenfriamiento, mayor será el
alejamiento del equilibrio.
Lo que pretendemos en la siguiente pregunta es determinar la ecuación que
relaciona la temperatura con la composición del sistema, cuando este
evoluciona por sucesivos estados de equilibrio. Esta relación se cumple en el
medio extracelular. Por lo tanto la ecuación de Equilibrio describe la evolución
del medio extracelular, mientras que la ecuación de Deshidratación que hemos
deducido anteriormente describe la evolución del medio intracelular.
115
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
6.3.2 LA ECUACIÓN DE LA CURVA DE EQUILIBRIO
Cuando una célula se encuentra en equilibrio termodinámico con el medio
que le rodea, deben darse simultáneamente tres tipos de equilibrio:
Ø Equilibrio mecánico: la presión del medio intracelular debe estar
compensada con el estado tensional de la membrana y con la presión
del medio extracelular. Supondremos que este equilibrio es instantáneo y
se da en todo momento.
Ø Equilibrio difusivo: para que el sistema se encuentre en equilibrio
difusivo, no deben producirse transportes de materia dentro de la célula,
ni entre la célula y el medio exterior.
El equilibrio difusivo interno, es decir, la ausencia de transporte de
materia dentro de la célula, está garantizado debido a que las reducidas
dimensiones de las células evita la existencia de fuertes gradientes de
concentración.
Para que exista equilibrio difusivo entre la célula y el medio extracelular,
los cambios de composición dentro de la célula, causados por la
ósmosis, y que la deshidrata, deben de ser lo suficientemente rápidos
como para seguir a la composición de equilibrio que viene determinada
por la temperatura del sistema, y que es igual a la composición del medio
exterior.
Los flujos de agua, deben de ser instantáneos, para que en cada instante
de tiempo exista equilibrio difusivo entre la célula y el medio exterior.
Salvo en ese instante infinitesimal de evacuación de agua instantánea,
en el resto del tiempo característico de cambio de la temperatura del
sistema, no hay evacuación de agua.
Este equilibrio difusivo instantáneo, es decir, la ausencia de evacuación
de agua, se garantiza imponiendo que la presión osmótica a ambos
lados de la membrana celular sea igual.
Aplicando la relación entre la presión osmótica y la presión de vapor, la
igualdad de presiones osmóticas se transforma en una igualdad de
presiones de vapor.
Ø Equilibrio térmico: supondremos que la temperatura dentro de la célula
es uniforme e igual a la del medio extracelular que la rodea. Los
gradientes de temperatura en el sistema son muy pequeños debido a las
reducidas dimensiones que tiene. Por tanto el equilibrio térmico está
garantizado en todo momento.
Esto no será cierto cuando estemos considerando tejidos. En este caso
la temperatura del sistema no será uniforme y necesitaremos plantear
ecuaciones de equilibrio térmico, que habría que resolver
simultáneamente junto con las ecuaciones de deshidratación celular.
116
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Como conclusión llegamos a que para imponer una condición de equilibrio
termodinámico, tan sólo necesitamos imponer una condición de equilibrio
difusivo, puesto que el equilibrio mecánico, y térmico se satisfacen en todo
momento.
El equilibrio difusivo lo imponemos mediante la igualdad de presiones de
vapor:
P ex (T ) = P in (T ) Ec. 206
donde Pex(T) es la presión de vapor del medio extracelular, y Pin (T) es la
presión de vapor del medio intracelular.
Como ya justificamos anteriormente, la presión de vapor de la solución
extracelular es aproximadamente igual a la presión de vapor del hielo que se
ha formado:
P ex (T ) ≈ PA*, s (T ) Ec. 207
La presión de vapor de la solución intracelular es aproximadamente igual a
la presión de vapor del agua en la solución, multiplicada por la fracción molar
del agua en la solución intracelular:
P in (T ) ≈ PA*,l (T ) ⋅ x A Ec. 208
Aplicando Clausius-Clapeyron calculo las variaciones de la presión de vapor
del hielo y del agua líquida con la temperatura:
 T LV (T ) 
P (T ) = P (T0 ) ⋅ exp ∫
dT 
T R ⋅T 2

0

*
A,l
*
A, l
 T L (T ) 
PA*, s (T ) = PA*, s (T0 ) ⋅ exp ∫ S 2 dT 
T R ⋅T

0

Ec. 209
Sustituyendo las ecuaciones Ec.206 y Ec.207, en la ecuación Ec.208:
xA =
PA*, s (T )
PA*,l (T )
Ec. 210
Sustituyendo las ecuaciones Ec.209 en la ecuación Ec.210:
xA =
 T LF (T ) 

⋅
exp
dT  Ec. 211
 T∫ R ⋅ T 2

PA*, l (T0 )
 0

PA*, s (T0 )
donde LF(T) es el calor latente de fusión.
117
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Si elegimos T0 = 273.15K (a esa temperatura se cumple la igualdad de
presiones de vapor del hielo y del agua líquida pura), entonces:
 T L (T ) 
x A = exp ∫ F 2 dT  Ec. 212
 273.15 R ⋅ T

Por último expresando la fracción molar de disolvente en función del
volumen de disolución dentro de la célula, al igual que hicimos al desarrollar el
modelo teórico de deshidratación, llegamos a la ecuación de Equilibrio:
 T LF (T ) 
V − n B ⋅ VB∞
 ∫
exp
dT  Ec. 213
=
2

V − n B ⋅ VB∞ + ν B ⋅ n B ⋅ V A*
 273.15 R ⋅ T

118
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
6.4. PARTICULARIZACIÓN DE LAS ECUACIONES DEL MODELO
6.4.1 INTRODUCCIÓN
Cuando planteábamos la ecuación diferencial que describía el proceso de
deshidratación celular, al someter el sistema a un proceso de enfriamiento, la
forma de éste se introducía en la ecuación mediante la función F(T), siendo
F(T), la derivada primera con respecto al tiempo de la ley de enfriamiento T(t).
F (T ) =
dT
Ec. 214
dt
Para que la ecuación Ec.214 sea cierta, la derivada a la derecha de la
igualdad debe ser una función de la temperatura. Sin embargo, cuando
calculamos dicha derivada obtenemos una función del tiempo. Para expresar la
derivada en función de la temperatura, despejamos de la ley de enfriamiento el
tiempo en función de la temperatura, sustituyendo dicha relación en la
expresión de la derivada.
En este apartado vamos a obtener expresiones de la función F(T), para
distintas leyes de enfriamiento. Aunque se pueden plantear infinidad de estas
leyes, nosotros sólo vamos a contemplar tres:
Ø Ley de enfriamiento lineal
Ø Ley de enfriamiento cuadrática
Ø Ley de enfriamiento exponencial
119
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
6.4.2 LEY DE ENFRIAMIENTO LINEAL
El perfil de enfriamiento lineal es, con diferencia, la ley de enfriamiento más
empleada en criopreservación, lo que, como veremos, no significa que sea la
mejor.
La expresión matemática de un enfriamiento lineal es de la forma:
T (t ) = − B ⋅ t + T0 Ec. 215
donde T0 es la temperatura inicial del sistema, que en nuestro caso son
273K, y B es una constante positiva, que permite parametrizar la familia de
perfiles de enfriamiento lineales.
La interpretación física del parámetro B la vemos calculando la derivada
primera de la temperatura con el tiempo:
dT
= − B Ec. 216
dt
Efectivamente, B es la velocidad de enfriamiento del sistema, y tiene
dimensiones de °C ⁄ min.
En un perfil lineal de enfriamiento, la velocidad con la que se reduce la
temperatura es constante.
La función F(T) será:
F (T ) =
dT
= − B Ec. 217
dt
Sustituyendo Ec.217 en Ec.203, la ecuación diferencial de la deshidratación
celular, obtenemos:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dT
V A* ⋅ (− B)
 T L (T )

V − n B ⋅ VB∞

⋅  ∫ F 2 dT − ln
∞
*  Ec. 218
V − nB ⋅ VB + ν B ⋅ nB ⋅ V A 
 273.15 R ⋅ T
120
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
6.4.3 LEY DE ENFRIAMIENTO CUADRÁTICA
La expresión matemática que vamos a emplear para un perfil de
enfriamiento cuadrático, será de la forma:
1
T (t ) = T0 − k1 ⋅ t − k 2 ⋅ t 2 Ec. 219
2
donde T0 es la temperatura inicial del sistema, que como en el caso anterior
es 273K , y k1,k2 son unas constantes positivas, que al igual que en el caso
lineal, permiten parametrizar la familia de perfiles de enfriamiento cuadráticos.
La interpretación física de los parámetros k1 y k2 , la obtenemos calculando
las derivadas primera y segunda de la ecuación Ec.219 con respecto al tiempo:
dT
= − k1 − k 2 ⋅ t
dt
Ec. 220
d 2T
= −k 2
dt 2
Podemos ver como k1 es la velocidad de enfriamiento en el instante inicial
(t=0), y k2 es la aceleración con la que se produce la disminución de la
temperatura. Por lo tanto las dimensiones de k1 serán ºC ⁄ min, mientras que las
de k2 serán °C ⁄ min2 .
Las características principales de este enfriamiento cuadrático son:
Ø la velocidad de enfriamiento es creciente, es decir, cuanto mas baja
es la temperatura del sistema, mas rápidamente disminuye la
temperatura.
Ø La aceleración del enfriamiento es negativa y constante.
Para obtener el valor de la función F(T) , calcularemos la derivada
primera de la temperatura con respecto al tiempo y después la
expresaremos en función de la temperatura:
1) Calculo la derivada primera de Ec.219.
F (T ) =
dT
(T ) = −k1 − k 2 ⋅ t Ec. 221
dt
2) Expreso la variable tiempo, en función de la temperatura.
Despejaremos el tiempo de la ley de enfriamiento (Ec.219):
121
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
1
k2 ⋅ t 2 + k1 ⋅ t − (T0 − T ) = 0
2
t=
− k1 ± k12 + 2 ⋅ k2 ⋅ (T0 − T )
Ec. 222
k2
La variable t debe ser real y positiva. Se garantiza que es
real porque el radicando es positivo, por ser una suma de
números positivos, ya que k12>0, k2>0 , y T0-T>0.
Para que t sea positivo es necesario, además de tomar la
solución que suma la raíz, que se cumpla la siguiente
desigualdad:
− k1 + k12 + 2 ⋅ k 2 ⋅ (T0 − T ) > 0
k12 < k12 + 2 ⋅ k 2 ⋅ (T0 − T )
Ec. 223
Al ser k2>0 y T0-T>0, vemos que la desigualdad se cumple.
Por lo tanto la ecuación que relaciona la variable tiempo con la
temperatura del sistema es:
t=
− k1 + k12 + 2 ⋅ k 2 ⋅ (T0 − T )
k2
Ec. 224
La función F(T) la obtendremos, sustituyendo Ec.224 en Ec.221:
F (T ) =
− k + k12 + 2 ⋅ k 2 ⋅ (T0 − T )
dT
(T ) = −k1 − k 2 ⋅ 1
dt
k2
Ec. 225
F (T ) = − k12 + 2 ⋅ k 2 ⋅ (T0 − T )
Finalmente sustituyendo Ec.225 en Ec.203, tendremos la ecuación de la
deshidratación celular cuando el sistema está sometido a un enfriamiento
cuadrático.
Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
 T L (T )

V − n B ⋅ V B∞
dV

=
⋅  ∫ F 2 dT − ln
∞
*
dT V A* ⋅ (− k12 + 2 ⋅ k 2 ⋅ (T0 − T ) )  273.15 R ⋅ T
V − n B ⋅ VB + ν B ⋅ n B ⋅ V A 
Ec. 226
122
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
6.4.4 LEY DE ENFRIAMIENTO EXPONENCIAL
La expresión matemática de un enfriamiento exponencial es de la forma:

t
T (t ) = T0 ⋅ exp − k ⋅
T0


 Ec. 227

donde T0 es la temperatura del sistema, que es 273K, y k es una constante
positiva, que permite parametrizar la familia de perfiles de enfriamiento
exponenciales.
Para poder interpretar esta constante, calculamos la derivada primera de la
temperatura con el tiempo:

dT
k
t 
= −T0 ⋅ ⋅ exp − k ⋅  Ec. 228
dt
T0
T0 

dT
dt
= −k Ec. 229
t =0
El parámetro k es por tanto la velocidad con la que comienza a enfriarse el
sistema, y por tanto tiene dimensiones de °C ⁄ min.
Las principales características de este perfil de enfriamiento exponencial
son:
Ø la velocidad de enfriamiento es decreciente, es decir, cuanto mas
baja es la temperatura del sistema, mas lentamente disminuye la
temperatura.
Ø La aceleración del enfriamiento es positiva y decreciente con el
tiempo:

d 2T k 2
t
=
⋅ exp − k ⋅
2
T0
T0
dt


T
 = k 2 ⋅ 2 Ec. 230
T0

Como la temperatura disminuye con el tiempo, también lo hará la
aceleración.
Para obtener la expresión de F(T), calcularemos la derivada primera de la
temperatura con el tiempo, y a continuación la expresaremos en función de la
temperatura:
1) La derivada primera viene dada por Ec.228.
F (T ) =

dT
t
(T ) = −k ⋅ exp − k ⋅
dt
T0


 Ec. 231

123
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
2) Expresando la variable tiempo en función de la temperatura.

t
T = T0 ⋅ exp − k ⋅
T0



t
 ⇒ exp − k ⋅
T0


 T
 =
Ec. 232
 T0
Sustituyendo Ec.232 en Ec.231, obtenemos el valor de la función F(T):
F (T ) =
dT
T
Ec. 233
= −k ⋅
dt
T0
Finalmente sustituyendo esta expresión en la ecuación Ec.203,
obtendremos:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
T
dT
V A* ⋅ (−k ⋅ )
T0
 T L (T )

V − n B ⋅ VB∞

⋅  ∫ F 2 dT − ln
∞
*  Ec. 234
V − nB ⋅ VB + ν B ⋅ nB ⋅ V A 
 273.15 R ⋅ T
124
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
6.5. MODELO DE DESHIDRATACIÓN PARA UN PERFIL DE ENFRIAMIENTO NULO
6.5.1 INTRODUCCIÓN
Es una práctica extendida en los protocolos de criopreservación, someter
las muestras a temperatura constante durante un periodo de tiempo más o
menos largo. En este apartado vamos a obtener la ecuación diferencial que
permite modelar la deshidratación celular en este caso.
Cuando resolvamos la ecuación, analizaremos qué efecto tiene el
mantenimiento de la temperatura constante sobre el alejamiento de la
condiciones de equilibrio de la solución intracelular.
125
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
6.5.2 PLANTEAMIENTO DE LAS ECUACIONES
La ecuación que va a describir la deshidratación celular en una etapa a
temperatura constante va a ser igual a la que empleábamos para describir la
deshidratación durante un enfriamiento,( Ec.203) salvo que ahora la variable
independiente no va a ser la temperatura, puesto que va a permanecer
constante, sino el tiempo.
dV L g (TCTE ) ⋅ A ⋅ R ⋅ TCTE
=
dt
V A*
 TCTE L (T )

V (TCTE ) − n B ⋅ VB∞

⋅  ∫ F 2 dT − ln
*
∞

V (TCTE ) − n B ⋅ VB + ν B ⋅ n B ⋅ V A 
 273.15 R ⋅ T
Ec. 235
En esta ecuación la temperatura no es una variable, sino una constante, la
temperatura constante a la cual mantenemos la muestra durante un cierto
periodo de tiempo.
126
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV-7. RESOLUCIÓN NUMÉRICA DE LAS ECUACIONES DEL MODELO IDEAL
7.1. INTRODUCCIÓN
En este apartado vamos a resolver las ecuaciones diferenciales de la
deshidratación celular, que planteamos en el apartado anterior, mostrando las
soluciones en forma de gráficos.
Calcularemos las soluciones, para dos tipos de células:
Ø Espermatozoides de ratón.
Ø Óvulos de ratón.
Esta diversidad de tamaños me permitirá analizar qué efecto tiene el
tamaño de las células sobre el proceso de deshidratación celular.
Para cada tipo de célula, ensayamos tres tipos diferentes de perfiles de
enfriamiento: lineal, cuadrático, y exponencial. Para poder comparar unos
perfiles con otros, escogeremos adecuadamente los parámetros de los perfiles.
La resolución de las ecuaciones diferenciales las hemos llevado a cabo en
un ordenador, mediante el programa MATLAB, en su versión 5.3.
Para integrar las ecuaciones diferenciales hemos recurrido a la herramienta
de calculo ode (ordinary differential ecuation), disponible en MATLAB.
La herramienta ode maneja diferentes tipos de algoritmos numéricos de
resolución. Nosotros en este proyecto hemos empleado dos:
1) Ode45: Esta herramienta informática emplea el método Runge-Kutta
de cuarto y quinto orden. Es un método de un paso, es decir, para
calcular la solución en un instante de tiempo t, tan sólo necesito
conocer la solución en el instante de tiempo justamente anterior.
2) Ode15s: Esta otra herramienta emplea un método de orden variable,
basado en fórmulas de diferenciación numérica (numerical
differentiation formula, NDF). Este algoritmo lo hemos tenido que
emplear porque el que empleaba ode45 no daba buenos resultados,
dado que introducía al ordenador en un proceso de cálculo infinito.
A estas herramientas de integración debemos de pasarles las ecuaciones a
integrar. Por ello para la resolución de una ecuación, necesitamos desarrollar dos
programas:
1) Programa que contenga el código de la ecuación diferencial que
queremos resolver. En este programa no se especifican los valores
127
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
numéricos de los parámetros físicos de las células, por lo que estos
programas son validos para cualquier tipo de célula.
2) Programa que realice la integración de la ecuación contenida en el
programa, anteriormente comentado, mediante las herramientas
ode45 o bien ode15s. En este programa si se especifica el valor
numérico de los parámetros de las células, por lo que necesitaremos
tantos programas de este tipo, como tipos de células tengamos.
128
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.2. LOS PERFILES DE ENFRIAMIENTO
Cuando particularizamos las ecuaciones de deshidratación para unos perfiles
de enfriamiento lineal, cuadrático, y exponencial, estos quedaban en función de
unos parámetros que había que especificar. Las expresiones matemáticas de los
perfiles de enfriamiento eran:
Ø perfil lineal : T = T0 − B ⋅ t
1
⋅ k2 ⋅ t 2
2

t 
Ø perfil exponencial: T = T0 ⋅ exp − k 
T0 

Ø perfil cuadrático: T = T0 − k1 ⋅ t −
La razón de contemplar varios perfiles de enfriamiento, es la de poder elegir el
que de unos mejores resultados en el proceso de deshidratación, si es que alguno
es mejor que los demás.
Para ello debemos comparar los efectos de los perfiles de enfriamiento. Para
poder comparar los tres perfiles entre si, debemos buscar expresiones que
relacionen los parámetros de los tres modelos, entre si.
Nosotros vamos a relacionar los parámetros del perfil cuadrático y exponencial,
con el parámetro del modelo lineal, que nos va a servir de referencia. La razón de
esta elección es que, como se ha dicho, los protocolos de criopreservación
actuales emplean casi exclusivamente perfiles lineales de enfriamiento.
El parámetro k del perfil exponencial lo calculo imponiendo que la velocidad
inicial de enfriamiento, coincida con la velocidad de enfriamiento constante del
perfil lineal.
Ø Perfil lineal :
dT
= − B Ec. 236
dt
Ø Perfil exponencial:

dT
t
= − k ⋅ exp − k
T0
dt


dT
 ⇒
dt

= − k Ec. 237
t =0
La igualdad de la velocidad de enfriamiento inicial del perfil exponencial, con la
velocidad del perfil lineal nos lleva al valor de k:
k = B Ec. 238
129
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
El parámetro k1 del perfil cuadrático lo determino, imponiendo de nuevo que la
velocidad inicial del enfriamiento, coincida con la velocidad de enfriamiento
constante del perfil lineal.
Ø Perfil lineal:
dT
= − B Ec. 239
dt
Ø Perfil cuadrático:
dT
dT
= − k1 − k 2 ⋅ t ⇒
dt
dt
= − k1 Ec. 240
t =0
Por lo tanto el valor de k1 será:
k1 = B Ec. 241
El parámetro k2 del perfil cuadrático lo determino, imponiendo que la
aceleración constante del enfriamiento cuadrático, coincida con la aceleración
inicial del enfriamiento exponencial, en valor absoluto, pues recordamos que el
perfil cuadrático tenía una aceleración negativa, mientras que el exponencial tenía
una aceleración positiva.
Ø Perfil exponencial:

d 2T k 2
t
=
⋅ exp − k
2
T0
T0
dt


d 2T
 ⇒ 2
dt

t =0
k2
=
Ec. 242
T0
Ø Perfil cuadrático:
d 2T
d 2T
= −k 2 ⇒
= k 2 Ec. 243
dt 2
dt 2
Igualando ambas expresiones obtenemos el valor de k2 :
k2 =
k2
Ec. 244
T0
Sustituyendo el valor de k en función de B tenemos:
130
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
k2 =
B2
Ec. 245
T0
Con estas relaciones entre los parámetros de los perfiles de enfriamiento, sus
expresiones matemáticas quedan:
Ø Perfil lineal :
T = T0 − B ⋅ t Ec. 246
Ø Perfil cuadrático:
B2
T = T0 − B ⋅ t −
⋅ t 2 Ec. 247
2 ⋅ T0
Ø Perfil exponencial:

t
T = T0 ⋅ exp − B
T0


 Ec. 248

Una representación grafica de las velocidades de enfriamiento frente a la
temperatura, con un valor del parámetro B=100°C ⁄ min se muestra a continuación:
131
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
COMPARATIVA DE
VELOCIDADES DE ENFRIAMIENTO
-60
Velocidad de enfriam iento/(oC/m in)
-70
-80
perfil exponencial
-90
perfil lineal
-100
-110
perfil cuadratico
-120
-130
0
-10
-20
-30
-40
-50
Temperatura/oC
-60
-70
-80
-90
Figura 6
Vemos como un perfil lineal, siempre tiene la misma velocidad de enfriamiento,
un perfil cuadrático tiene una velocidad de enfriamiento creciente, mientras que
uno exponencial tiene la velocidad de enfriamiento decreciente.
132
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
133
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3. CURVAS DE DESHIDRATACIÓN PARA ESPERMATOZOIDES DE RATÓN
7.3.1 DATOS FÍSICOS
Para poder resolver las ecuaciones de deshidratación y de equilibrio,
necesitamos conocer una serie de datos físicos referentes a la célula que estemos
considerando, en nuestro caso, espermatozoides de ratón.
La ecuación de deshidratación que pretendemos resolver, con el programa
MATLAB es:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dT
V A* ⋅ F (T )
 T LF (T )

V − n B ⋅ V B∞

 Ec. 249
⋅ ∫
−
dT
ln
2
∞
* 
−
⋅
+
⋅
⋅
⋅
V
n
V
n
V
R
T
ν
B
B
B
B
A 
 273.15
Los datos físicos necesarios, referentes a la célula son:
Ø Permeabilidad de la membrana, Lg(T): Su expresión en función de la
temperatura era:
LP = LPg ⋅ e
−
E Lp  1 1
⋅ −
R  T Tg




Ec. 250
Necesitaremos conocer, la permeabilidad de referencia Lpg , la
energía de activación ELp y la temperatura de referencia Tg.
Ø Área de la membrana celular, A.
Ø Numero de moles de sal dentro de la célula, nB: Este dato lo
obtendremos a partir de la concentración inicial de sales dentro de la
célula y del volumen de disolución inicial dentro de la célula.
Ø Volumen de disolución inicial dentro de la célula, V0 : Este dato lo
obtendremos a partir del volumen inicial de la célula, y de la fracción
de volumen osmóticamente inactivo, que recordamos se obtenía a
partir del grafico de Boyle-van’t Hoff. (BVH),como se vió en el
apartado IV-4.
Como tenemos una derivada primera del volumen de disolución intracelular con
respecto a la temperatura, necesitaremos conocer el volumen y la temperatura en
el instante inicial:
134
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Ø El volumen en el instante inicial, es el volumen osmóticamente activo,
V0, en el instante inicial.
Ø La temperatura inicial, no es la temperatura a la que comenzamos a
enfriar al sistema, sino la temperatura a la que comienza el proceso
de deshidratación, que no comienza hasta que en el medio
extracelular, comienza a formarse hielo. Esta temperatura es por
tanto, la de cambio de fase sólido-liquido, cuando la solución
intracelular tiene su concentración inicial, igual a la del medio
extracelular. Esta temperatura no será 0°C sino algo menor, debido al
efecto del descenso crioscópico de la sal disuelta.
Los valores numéricos de los parámetros físicos, anteriormente descritos, para
el caso particular de espermatozoides de ratón [22]son:
Ø Permeabilidad de la membrana
o Permeabilidad de referencia: LPg=0.01 µm ⁄ (min atm)
o Energía de activación: ELp=94.1 KJ ⁄ mol
o Temperatura de referencia: Tg=273.15 K
Las dimensiones de Lp serán por tanto µm ⁄ (min⋅atm). Sin embargo
nosotros necesitamos que tenga las dimensiones m4 ⁄ (min⋅J), para lo
cual debemos dividir la expresión de la permeabilidad por la
constante de proporcionalidad 1.01325×105.
Ø Área de la membrana: La calculo asumiendo que el espermatozoide,
es un cilindro de 0.46 µm de radio, y de 122 µm de altura[22]:
A = 2π ⋅ (0.46) 2 + 2π ⋅ 0.46 ⋅ 122 = 353.94 µm 2 = 3.5394 ⋅ 10 −10 m 2 Ec. 251
Ø Volumen de disolución inicial.
o Fracción de volumen celular osmóticamente inactivo: 61%
o Volumen celular: Lo calculo asumiendo que el espermatozoide
es un cilindro con las dimensiones dadas anteriormente:
Vcell , 0 = π ⋅ (0.46) 2 ⋅ 122 = 81.1 µm 3 Ec. 252
Por lo tanto el volumen de disolución intracelular en el instante inicial
es:
V0 = (1 − 0.61) ⋅ 81.1 = 31.629 µm 3 = 3.1629 ⋅ 10 −17 m 3 Ec. 253
135
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Ø Numero de moles de sal dentro de la célula.
o Concentración inicial de la sal: 0.285 M
o Volumen de disolución inicial: V0=3.1629×10-17 m3.
Por lo tanto el numero de moles de soluto, será el producto de la
concentración molar, por el volumen de disolución intracelular:
n B = 0.285
1000 litros
moles
× 3.1629 ⋅ 10 −17 m 3 ×
= 9.014 ⋅ 10 −15 moles Ec. 254
litro
1 m3
Ø La temperatura inicial, justo antes de comenzar el proceso de
deshidratación calcula internamente el programa de MATLAB.
Además de estos datos físicos, específicos de las células de espermatozoides,
necesitamos conocer otros datos físicos:
Ø Volumen molar del agua pura: VA*=18×10-6 m3 ⁄ moles.
Ø Volumen molar a dilución infinita de la sal: VB∞=1.66×10-5 m3 ⁄ mol.
136
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.2 PROGRAMACIÓN EN MALTAB DE LAS ECUACIONES DIFERENCIALES
En este apartado vamos a describir brevemente, como hemos programado en
MATLAB las ecuaciones diferenciales, tanto de la curva de deshidratación, como
de la curva de equilibrio, para posteriormente ser integradas.
El programa que describe en lenguaje MATLAB la ecuación de deshidratación,
por ejemplo para el caso de un perfil de enfriamiento lineal es:
function
varargout=enfr_id_lineal(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa)
if nargin<12 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa)
R=8.3143;
SLf=integralLf(t);
Lp=Lpg*exp(-E_Lg/R*(1/t-1/Tg))/(1.01325*1e5);
VmA=18*1e-6;MA=18;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos: sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
F=B;%perfil de enfriamiento lineal
aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F));
dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))];
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[273 190];
y0=[3.1629*1e-17];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
137
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
La primera línea de comandos, nos indica que el archivo cuyo nombre es
enfr_id_lineal es una función, que recibe una serie de parámetros, que son
las variables que se encuentran entre paréntesis, y devuelve un valor, en la
variable varargout, un nombre predeterminado de MATLAB, que permite
devolver uno o varios datos a la vez, según sea necesario.
varargout=enfr_id_lineal(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa)
Las variables de entrada son:
Ø t: Es la temperatura absoluta.
Ø y: Es el volumen de disolución intracelular en m3.
Ø flag: Es una variable de control interno de MATLAB. Nosotros no
tenemos control sobre ella
Ø B: Es la velocidad de enfriamiento lineal, en función de la cual
habíamos expresado los parámetros del resto de perfiles de
enfriamiento; sus dimensiones son °C ⁄ min.
Ø Vi: Es el volumen de disolución intracelular inicial, en m3.
Ø n2: Es el numero de moles de sal disuelta en la solucion intracelular.
Ø A: Es el área de la membrana celular, en m2.
Ø Lpg: Es la permeabilidad de referencia, en µm ⁄ min⋅atm.
Ø E_Lg: Es la energía de activación en J ⁄ mol.
Ø Tg: Es la temperatura de referencia de la permeabilidad de la
membrana.
Ø ncpa: Es el numero de moles de crioprotector, que aun no vamos a
considerar.
Ø Vmcpa: Es el volumen molar a dilución infinita del crioprotector.
Las siguientes líneas de código, dan unos valores por defecto al numero de
moles de crioprotector, y al volumen molar a dilución infinita del mismo.
if nargin<12 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
Por defecto no considero la presencia de crioprotector. El crioprotector que
vamos a considerar, cuando consideremos su presencia, por defecto es el glicerol.
138
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Las siguientes líneas de código, permiten estructurar el archivo en
subfunciones, según la casuística:
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
Si en la variable de control interno no hay nada, entonces el programa llama a
la subfunción f que contiene el código de la ecuación diferencial.
Si en la variable de control interno esta el valor 'init' entonces el programa
llama a la subfunción init.
La siguiente parte del código, corresponde a la subfunción f que contiene la
representación en el lenguaje de programación de MATLAB a la ecuación
diferencial de deshidratación:
function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa)
R=8.3143;
SLf=integralLf(t);
Lp=Lpg*exp(-E_Lg/R*(1/t-1/Tg))/(1.01325*1e5);
VmA=18*1e-6;MA=18;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos: sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
F=B;%perfil de enfriamiento lineal
aux=(Lp*A*R*t/(VmA*F));
dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))];
En esta parte podemos comentar que la expresión de la integral del calor
latente de fusión del hielo, queda oculta, por estar desarrollada en otro archivo,
llamado integralLf al que le pasamos como parámetro la temperatura del
sistema y devuelve el valor de la integral en la variable SLf.
Por otra parte aparecen una serie de variables que pasamos a comentar a
continuación:
Ø
Ø
Ø
Ø
MA: Es el peso molecular de agua, en gramos por mol.
v2: Es la constante de disociación de la sal.
Vm2: Es el volumen molar a dilución infinita de la sal, VB∞.
nsol: Es una variable en la que incluimos los moles de sal, y de
crioprotector.
139
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Ø Vsol: Es una variable en la que incluimos el volumen ocupado por la
sal y el crioprotector.
Por ultimo tenemos el desarrollo de la subfunción init,en la que se detallan
el intervalo de integración en la variable tspan, el valor inicial de la variable
dependiente, es decir, el volumen inicial de disolución intracelular, en la variable
y0. La ultima línea contiene información sobre los decimales que va a contemplar
el programa de integración.
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[273 190];
y0=[3.1629*1e-17];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
La programación de la curva de equilibrio se muestra a continuación:
function [t,y]=DescCrio_integrado(Vi,n2,ncpa,Vmcpa)
if nargin<4 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;
end
if nargin<3 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
R=8.3143;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
VmA=18*1e-6;
Vsol=n2*Vm2+ncpa*Vmcpa;
nsol=(v2*n2+ncpa);
a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273;
fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R;
fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R;
fact3=(c+3*d*z)/R;
fact4=d/(2*R);
T=[190:1:272.99];
To=273;
integralLf=fact1*(1/To-1./T)+fact2*log(T./To)-fact3*(T-To)+fact4*(T.^2To^2);
Q=exp(integralLf);
V_eq=Vsol+(Q./(1-Q))*nsol*VmA;
t=T;
y=V_eq;
Recordamos que la expresión de la curva de equilibrio era de la forma:
140
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
 T LF (T ) 
V − n B ⋅ VB∞
= exp ∫
dT  Ec. 255
2
V − n B ⋅ VB∞ + ν B ⋅ n B ⋅ V A*
R
⋅
T
 273.15

El código de programación, tras las explicaciones dadas anteriormente, no
merece ningún comentario.
Por último mostramos el código del archivo que contiene la expresión de la
integral de el calor latente de fusión del hielo:
function y=integralLf(T)
a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273;
R=8.3143;
fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R;
fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R;
fact3=(c+3*d*z)/R;
fact4=d/(2*R);
To=273;
y=fact1*(1/To-1/T)+fact2*log(T/To)-fact3*(T-To)+fact4*(T^2-To^2);
141
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
142
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.3 REPRESENTACIÓN GRAFICA DE LA DESHIDRATACION
7.3.3.1 Programación en MATLAB de la integración de la ecuación diferencial de la
deshidratación celular
En este apartado vamos a describir brevemente como hemos programado en
MATLAB, la integración de las ecuaciones diferenciales de deshidratación,
mediante la herramienta ode, que permite resolver ecuaciones diferenciales
ordinarias.
El código para la integración de la ecuación de deshidratación del esperma de
ratón, que habíamos almacenado en el archivo enfr_id_lineal es:
Vi=3.1629*1e-17;% DATO
n2=9.014*1e-15;% DATO
A=3.5394*1e-10;% DATO
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
if ncpa==0
Lpg=0.01*1e-6;%DATO
E_Lpg=94.1*1e3;%DATO
else
Lpg=.004*1e-6;%DATO
E_Lpg=63.6*1e3;%DATO
end
Tg=273.15;%DATO
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
plot(t0-273,V0,'r--')
Ti=interp1(V0,t0,1);
for B=[-5 -15 -50 -1000]
tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lpg,
Tg,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
plot(t1-273,V1,'LineWidth',1)
axis([-55 0 0 1]);
hold on;
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
En las primeras líneas de código, asignamos los valores numéricos de los
parámetros físicos de los espermatozoides. En Vi introducimos el volumen inicial
osmóticamente activo de la célula, expresado en m3. En la variable n2
introducimos el número de moles que hay dentro de la célula, en cualquier
instante, y que son iguales a los moles iniciales, por ser la membrana
143
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
impermeable a dicho componente. En A introducimos el área de la membrana
celular.
En la siguiente línea de código introducimos en la variable options
parámetros de cálculo que le indican al integrador con que precisión debe trabajar
para buscar la solución.
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
Las siguientes líneas de código son sentencias condicionales que asignan
valor a los parámetros de permeabilidad de la membrana, según tengamos o no
crioprotector en el medio intracelular.
En la siguiente línea de comandos generamos la curva de equilibrio.
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
Mediante la llamada al archivo DescCrio_id_integrado vamos generando
pares de valores de la curva de equilibrio, que almacenamos en la matriz
[t0,y0], donde t0 es la columna que contiene las temperaturas, e y0 contiene
los volúmenes en m3 de la célula.
A continuación dibujamos la curva de equilibrio, representando la temperatura
en ºC, en el eje horizontal, y la fracción del volumen de disolución intracelular con
respecto al que había en el instante inicial, en el eje vertical.
En la siguiente línea de código, calculamos cual es la temperatura de cambio
de fase líquido-sólido, para la disolución intracelular en el instante inicial.
Ti=interp1(V0,t0,1);
Su determinación se lleva a cabo, mediante una interpolación lineal, en puntos
de la curva de equilibrio. Dicha temperatura será la que tenga el sistema, cuando
evolucionando por sucesivos estados de equilibrio, tenga una concentración igual
a la que tiene el medio intracelular, cuando el volumen de la célula es el volumen
inicial, por tanto la fracción de volumen inicial sea la unidad.
A continuación nos encontramos con un bucle, que va a repetir la
integración de la ecuación de deshidratación, para distintas velocidades de
enfriamiento, como son 5, 15, 50, y 1000ºC/min.
Dentro del bucle, primeramente indicamos en intervalo de integración, para
posteriormente pasar a la integración propiamente dicha, mediante el comando
ode15s.
144
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
tspan=[Ti,190]
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lp
g,Tg,ncpa,[]);
Al comando ode15s le pasamos como parámetros: el nombre del archivo
que contiene la ecuación diferencial a integrar, en nuestro caso
'enfr_id_lineal' , el intervalo de integración tspan, el volumen inicial de
la célula Vi, parámetros para indicar la precisión de cálculo, ocultos en la
variable options , la velocidad de enfriamiento B, el volumen inicial de la
célula Vi, el número de moles del medio intracelular n2, en área de la
membrana A, la permeabilidad de referencia Lpg, la energía de activación
E_Lpg, la temperatura de referencia de la permeabilidad Tg, el número de
moles de crioprotector, ncpa y por último el volumen molar del crioprotector
empleado, que como está en blanco, se tomará el valor por defecto que es
para el glicerol.
Los resultados de la integración son devueltos en una matriz, cuya primera
fila, t1 contiene los valores de las temperaturas, y cuya segunda fila y1,
contiene los valores de los volúmenes de solución intracelular, en m3.
Finalmente dibujamos las curvas, mediante el comando plot.
145
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.3.2 Representación gráfica de la deshidratación.
Primeramente vamos a mostrar cuál es la solución de la ecuación de
deshidratación que obtendríamos, si en vez de considerar como intervalo de
integración la temperatura que va desde el punto de cambio de fase de agua
líquida a hielo, hasta los 253K, considerásemos el intervalo de temperaturas que
va desde la temperatura inicial del sistema, 273K hasta los 253K.
Para el caso de una deshidratación lineal, con una velocidad de enfriamiento
de 15ºC/min tenemos:
Figura 7
El programa que permite calcular este gráfico se encuentra en el anexo
PROGRAMAS en el apartado 1.
En la solución gráfica de la ecuación de deshidratación vemos cómo la célula
toma agua del medio exterior mientras no se alcance la temperatura de cambio de
fase, que viene marcada por la intersección de la curva de equilibrio, con la
horizontal que pasa por la fracción del volumen inicial uno. Esta temperatura la
calcula internamente el programa, y en este caso es 271.8852K es decir, 1.1148ºC.
146
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Este hinchamiento de la célula no tiene sentido, pues mientras no se alcancen
las condiciones para formar hielo en el medio exterior, no hay nada que rompa el
equilibrio isotónico de la célula con el medio exterior, y por tanto el volumen celular
permanece invariable.
Por lo tanto la solución gráfica es la que se muestra en la Figura 8:
Figura 8
Este gráfico se obtiene a partir del programa del apartado 7.3.3.1 pero teniendo
en cuenta una única velocidad de enfriamiento, la de 15ºC/min.
La integración de la curva de equilibrio sólo se lleva a cabo en el intervalo de
temperaturas que va desde los 271.8852K hasta la temperatura final de
enfriamiento, por lo que el software no dibuja la evolución desde los 273K hasta
los 271.8852K. Sin embargo para una mejor comprensión del gráfico, hemos
dibujado, con un color diferente, el tramo horizontal correspondiente a esa región,
que el programa no es capaz de mostrar.
Sobre este gráfico resulta muy fácil observar el fenómeno del subenfriamiento
de la solución intracelular, y la diferente composición del medio intracelular con
respecto al medio extracelular.
147
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Recordamos que la curva de equilibrio nos mostraba cuál era la nueva
temperatura de cambio de fase líquido-sólido, cuando añadíamos al sistema
soluto. Esta nueva temperatura era inferior a los 0ºC para el caso del agua,
fenómeno que denominábamos Descenso Crioscópico. En el gráfico, vemos cómo
conforme la solución intracelular va perdiendo agua, y por tanto va aumentando la
concentración de los solutos disueltos, la temperatura de cambio de fase es cada
vez menor, es decir, para formar hielo ya no basta con llegar a los 0ºC sino que
hay que ir a temperaturas más bajas.
El medio intracelular, cuya evolución viene dada por la curva de deshidratación,
de color azul, siempre tiene una temperatura inferior a la de cambio de fase.
Figura 9
En la figura 9 podemos apreciar cómo por ejemplo la temperatura T1=
271.5074K es la de cambio de fase cuando la fracción del volumen de la célula
con respecto al inicial es 0.8, mientras que para esa misma deshidratación la
temperatura en el interior de la célula es de T2=269.1881K. Vemos, por tanto,
cómo la temperatura intracelular está por debajo de la de cambio de fase. A la
diferencia es a lo que se llama SUBENFRIAMIENTO que en nuestro caso es de
2.3193ºC.
Para poder calcular estas temperaturas intermedias hemos introducido en el
listado del programa del apartado 7.3.3.1 las siguientes líneas de código:
148
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
T1=interp1(V0,t0,.8)
T2=interp1(V1,t1,.8)
Como ya hemos comentado anteriormente, la formación de hielo es de
naturaleza probabilística, es decir, que aunque estemos por debajo de la
temperatura de cambio de fase no tiene porqué formarse hielo. La formación de
hielo es más probable cuanto más alejados estemos de dicha temperatura de
cambio de fase o lo que es lo mismo, cuanto mayor sea el subenfriamiento del
medio intracelular.
La curva de equilibrio, además de indicar el descenso crioscópico de la
solución intracelular, también mostraba la evolución de la concentración de solutos
en el medio extracelular, por evolucionar ésta por sucesivos estados de equilibrio.
Por lo tanto, para una determinada temperatura del sistema, la concentración
de solutos en el medio intracelular vendrá dada por la curva de deshidratación,
mientras que la concentración de solutos en el medio extracelular vendrá dada por
la curva de equilibrio.
Figura 10
Cuando la temperatura del sistema, es de –4ºC, la composición del medio
extracelular es la correspondiente a la que tendría el medio intracelular cuando,
evolucionando por sucesivos estados de equilibrio (un enfriamiento infinitamente
149
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
lento), su volumen fuese el 26.68% del que tenía en el instante inicial. Esto se
traduce en una concentración de soluto igual a 1.068M. Por otra parte la
composición del medio intracelular es la asociada a un volumen que es el 77.75%
del que tenía en el instante inicial, es decir, 0.3665M. Recordamos que la
concentración de moles de soluto, tanto en el medio intracelular, como en el
extracelular era de 0.285M.
Para poder calcular los volúmenes relativos a la temperatura de –4ºC hemos
introducido en el listado del programa del apartado 7.3.3.1 las siguientes líneas de
código:
V01=interp1(t0,V0,269)
V02=interp1(t1,V1,269)
Vemos que el medio extracelular está en todo momento más concentrado, que
el medio intracelular. Esta diferencia de concentración se traduce en un flujo de
agua, que sale de la célula, y cuyo objetivo es aumentar la concentración de la
solución dentro de la célula, para así igualarse con la del medio exterior. Este
fenómeno ya fue descrito en el capítulo 2 , y se le denomina Flujo Osmótico.
150
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.3.3 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre la deshidratación
A continuación vamos a mostrar cómo son las curvas de deshidratación para
distintas velocidades de enfriamiento. Dichas curvas serán mostradas
simultáneamente en un mismo gráfico, para poder así estudiar el efecto que tiene
la velocidad de enfriamiento sobre la deshidratación celular.
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
-1000ºC/m in
0.9
0.8
0.7
-100ºC/m in
0.6
-50ºC/m in
0.5
0.4
-15ºC/m in
0.3
-5ºC/m in
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 11
El programa empleado para obtener este gráfico es el que se explicó en el
apartado 7.3.3.1.
Lo primero que podemos comentar de la figura 11 es que el rango de
temperatura que estamos contemplando es muy superior al de los gráficos
anteriores. Aquí llegamos hasta –55ºC mientras que antes sólo habíamos llegado
hasta –20ºC. La razón de ampliar el rango de temperaturas es que por debajo de
–20ºC suceden cosas interesantes.
Lo más destacado de este gráfico es que cuanto más elevada es la velocidad
de enfriamiento, menor es la deshidratación sufrida por la célula, para cada
temperatura del sistema.
151
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Por ejemplo, si enfriamos el sistema a una velocidad de 15ºC/min, cuando la
temperatura del sistema es de –10ºC, la fracción del volumen celular con respecto
al inicial es del 13.55%, lo que significa que hemos evacuado el 86.45% del agua
disponible, muy próximo al límite teórico, marcado por la curva de equilibrio a esa
temperatura, igual a una evacuación del 89.19% del agua disponible.
Sin embargo, si elevamos la velocidad de enfriamiento hasta los 50ºC/min, la
fracción de volumen con respecto al inicial, a los –10ºC es del 64.90%, es decir,
que sólo hemos evacuado el 35.10% del agua disponible.
Para obtener estos resultados numéricos deberíamos añadir las siguientes
líneas de código al programa dado en el apartado 7.3.3.1:
V01=interp1(t0,V0,263)
V02=interp1(t1,V1,263)
Figura 12
La razón de esta aparente pérdida de capacidad para deshidratarse, que
manifiesta la célula a altas velocidades de enfriamiento, es que mientras la
velocidad de enfriamiento puede ser todo lo alta que deseemos, la velocidad de
deshidratación está limitada por la permeabilidad de la membrana, a un rango de
152
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
valores típicos, que originan una descompensación entre la velocidad a la que
cambia la temperatura y la velocidad a la que se evacua agua, cuando la
velocidad de enfriamiento es demasiado alta.
Es de esperar que cuanto mayor sea la permeabilidad de la membrana,
mayores serán los valores típicos de velocidad de deshidratación. Por ello
necesitaremos mayores velocidades de enfriamiento para descompensar la tasa
de enfriamiento con la de deshidratación, y así poner de manifiesto un pérdida en
la capacidad de la célula para deshidratarse. Para comprobar esto supongamos
que la permeabilidad de la membrana la multiplicamos por 5, manteniendo
constantes el resto de parámetros físicos.
Los resultados que obtenemos se muestran en la figura 13.
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
0.9
0.8
0.7
0.6
-50ºC/m in
0.5
0.4
-15ºC/m in
0.3
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 13
Este gráfico se obtiene sustituyendo el valor de la permeabilidad dado en el
programa del apartado 7.3.3.1, por otra permeabilidad cinco veces superior.
Observamos cómo ahora la deshidratación alcanzada, para ambas velocidades
de enfriamiento, es igual a la marcada por el límite teórico de la curva de equilibrio.
153
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Otro fenómeno que podemos observar cuando analizamos el gráfico donde se
muestran las deshidrataciones para distintas velocidades de enfriamiento, es que
independientemente de que el sistema haya sido enfriado lenta o rápidamente, la
deshidratación se detiene por debajo de una cierta temperatura. En el caso que
nos ocupa, del espermatozoide de ratón, esta temperatura está en torno a los –
35ºC.
Para verlo más claramente, hemos vuelto a dibujar el gráfico, marcando la
región, donde ya no hay deshidratación celular, en la figura 14.
Figura 14
La razón de este fenómeno, se discutió en el apartado 5 de EL COEFICIENTE DE
PERMEABILIDAD O LA CONDUCTIVIDAD HIDRÁULICA DE LA MEMBRANA CELULAR del
Capítulo 4. Se explicó, que cuanto más baja era la temperatura, menor era la
permeabilidad de la membrana, hasta que llegábamos a una temperatura, para la
cual la membrana se hacía impermeable. En el caso de espermatozoides de ratón
esta temperatura estaba en torno a los –35ºC. Por debajo de esta temperatura la
membrana es impermeable, impidiéndose el flujo osmótico de agua, deteniéndose
de esta manera el proceso de deshidratación.
La evolución de la deshidratación celular en función del tiempo, para varias
velocidades de enfriamiento, se muestra en la figura 15:
154
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
0.9
0.8
0.7
-100ºC/m in
0.6
0.5
0.4
0.3
-50ºC/min
0.2
0.1
-15ºC/m in
0
0
0.5
1
1.5
TIEMPO/minutos
2
2.5
3
Figura 15
Los programas que permiten obtener este gráfico, se muestran en el anexo
PROGRAMAS, en el apartado 2.
En este gráfico, además de las conclusiones obtenidas anteriormente,
podemos ver también que, cuanto mayor es la velocidad de enfriamiento, menor
es el tiempo necesario para que la célula finalice el proceso de deshidratación.
Vemos también que el instante en el que comienza la deshidratación es
ligeramente diferente, para cada velocidad de enfriamiento. Esto era de esperar
pues, cuanto mayor sea la velocidad de enfriamiento, antes se alcanzarán los –
1.1148ºC, que recordamos era la temperatura a la que comenzaba a formarse
hielo en el medio extracelular.
155
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.3.4 Deshidratación para perfiles de enfriamiento no lineales
A continuación vamos a mostrar la evolución de la deshidratación, cuando el
perfil de enfriamiento no es lineal. Plantearemos el caso de un perfil cuadrático y
uno exponencial.
Para poner de manifiesto las posibles ventajas e inconvenientes de estos
perfiles, trazaremos las curvas de deshidratación juntas en un mismo gráfico.
Trazaremos las curvas, para el caso de perfiles de enfriamiento lineales con
velocidades de enfriamiento de 15, 50 y 1000ºC/min. Los perfiles no lineales
tendrán unas velocidades de enfriamiento iniciales, siguiendo las prescripciones
del apartado 6.4 del capítulo 4.
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
-1000ºC/min
0.9
0.8
perfil lineal
perfil cuadrático
0.7
perfil exponencial
0.6
-50ºC/m in
0.5
0.4
0.3
-15ºC/min
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 16
Los programas que permiten obtener este gráfico, se encuentran en el anexo
PROGRAMAS, en el apartado 3.
Analizando los resultados dados por el gráfico, vemos que cuando la velocidad
de enfriamiento es o muy alta o muy baja, no se observa ninguna diferencia en el
proceso de deshidratación celular, superponiéndose las curvas.
156
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Sin embargo, para velocidades de enfriamiento intermedias, se observan
diferencias. Cuando enfriamos mediante un perfil cuadrático, la célula se
deshidrata menos que con un perfil lineal. Por otra parte, cuando enfriamos con un
perfil exponencial, la célula se deshidrata más que con un perfil lineal.
Puesto que lo que nos interesa es alcanzar la máxima deshidratación posible,
para así tener grandes descensos crioscópicos, el mejor perfil de enfriamiento es
uno exponencial.
Las mismas conclusiones se obtienen si analizamos la evolución de la
deshidratación en función del tiempo.
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
Perfil lineal
Perfil cuadrático
0.9
Perfil exponencial
0.8
0.7
100ºC/m in
0.6
0.5
0.4
50ºC/m in
0.3
0.2
0.1
15ºC/m in
0
0
0.5
1
1.5
TIEMPO/minutos
2
2.5
3
Figura 17
Los programas que hemos empleado para obtener este gráfico, se encuentran
en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 4.
Generalizando, interesan perfiles con velocidades de enfriamiento
decrecientes, como es el caso del perfil exponencial, frente a perfiles con
velocidades de enfriamiento constantes, como es el caso del perfil lineal, o
velocidades crecientes, como es el caso del perfil cuadrático.
157
CAPITULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
158
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.4 REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL SUBENFRIAMIENTO
7.3.4.1 Programación en MATLAB del subenfriamiento
Para analizar la evolución del subenfriamiento de la solución intracelular,
con respecto a la temperatura del sistema, hemos desarrollado el siguiente
programa.
Vi=3.1629*1e-17;%DATO
n2=9.014*1e-15;%DATO
A=3.5394*1e-10;%DATO
ncpa=0
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO
end
Tgo=273.15;%DATO
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
for B=[-5 -15 -50]
Tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lg
o,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
t02=interp1(y0,t0,y1);
if ncpa==0
plot(t1-273,t02-t1)
else
plot(t1-273,t02-t1,'g')
end
hold on;
axis([-55 0 0 30]);
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR');
Para calcular el subenfriamiento, primero calculamos la curva de equilibrio,
cuya solución viene dada por el par de vectores columna t0,y0. A
continuación calculamos la curva de deshidratación, cuyo resultado se
almacena en t1,y1.
El subenfriamiento se obtendría calculando la diferencia de temperatura que
hay entre la curva de equilibrio y la de deshidratación para una composición
dada. Si tomamos como composición de referencia la proporcionada por la
integración de la curva de deshidratación, es decir, el vector columna y1,
159
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
entonces necesitamos conocer las correspondientes temperaturas de la curva
de equilibrio que tienen asociadas dichas composiciones.
Interpolando las composiciones de la curva de la curva de deshidratación
y1, en la curva de equilibrio t0,y0, obtendremos las temperaturas de la curva
de equilibrio que tienen una composición igual a las composiciones del medio
intracelular, dadas por la resolución de la curva de deshidratación.
En el programa esta interpolación se hace mediante el comando interp1 :
t02=interp1(y0,t0,y1);
Por lo tanto la curva de equilibrio tiene ahora dos formas de ser expresada:
•
•
Forma 1: t0,y0, constituida por 83 pares de puntos.
Forma 2: t02,y1, constituida por 46 pares de puntos.
La curva de deshidratación tiene una única representación, dada por
t1,y1, formada por 46 pares de puntos.
160
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.4.2 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el subenfriamiento
A continuación vamos a mostrar los resultados que se obtienen al ejecutar
el programa anterior.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
25
-50ºC/min
20
15
-35ºC/m in
10
-30ºC/m in
5
-15ºC/m in
-5ºC/m in
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 18
En el eje vertical de la figura 18 representamos el subenfriamiento del medio
intracelular, medido en grados centígrados, mientras que en el eje horizontal,
mostramos la temperatura del sistema.
En la representación gráfica observamos
comportamiento del subenfriamiento, conforme
velocidad de enfriamiento del sistema.
una evolución en
vamos aumentando
el
la
Para bajas velocidades de enfriamiento, el subenfriamiento aumenta hasta
alcanzar un máximo local, posteriormente disminuye para aumentar luego
indefinidamente. Cuanto mayor es la velocidad de enfriamiento, mayor es el
valor del máximo local y menor es la temperatura a la que se produce. En la
tabla adjunta se muestran los máximos locales cuando estos se producen.
VELOCIDAD DE
ENFRIAMIENTO /( ºC/min)
SUBENFRIAMIENTO/ºC
TEMPERATURA DEL
SISTEMA/ ºC
-5
-15
-30
1.6749
4.1653
9.2192
-3.7219
-7.4918
-14.1716
161
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Para poder obtener los valores numéricos de los máximos locales del
subenfriamiento, hemos tenido que modificar el programa dado en el apartado
7.3.4.1,añadiendo nuevas líneas de código. El programa modificado, se
muestra en el anexo PROGRAMAS , en el apartado 5.
Para altas velocidades de enfriamiento no se observa la presencia de
ningún máximo local, siendo la evolución del subenfriamiento monótonamente
creciente.
La velocidad crítica que limita estos dos modos de comportamiento del
subenfriamiento está en torno a los 35ºC/min. A esta velocidad de enfriamiento,
el subenfriamiento presenta un punto de inflexión, a los –25ºC
aproximadamente.
Para poder comprender por qué el subenfriamiento evoluciona según se ha
descrito anteriormente, tenemos que conocer cuales son los factores que le
afectan.
Fundamentalmente hay dos factores que determinan el subenfriamiento del
sistema:
1) La permeabilidad de la membrana.
1.a) Cuanto menor sea el valor de la permeabilidad, mayores serán los
subenfriamientos del sistema para cada temperatura.
Esta afirmación es fácil de comprender. El subenfriamiento es la
diferencia de temperatura que existe entre dos soluciones intracelulares de
la misma composición, es decir, con la misma fracción de volumen con
respecto al inicial, siendo el enfriamiento en una de ellas infinitamente lento
(curva de equilibrio), y finito en la otra.
Cuando se enfría infinitamente despacio, el flujo osmótico originado por la
formación de hielo en el medio extracelular, es capaz de mantener la solución
intracelular en equilibrio con el medio exterior, sin importar el valor de la
permeabilidad de la membrana. El hecho de que la permeabilidad sea muy
baja, es decir, exista una gran dificultad para evacuar agua, no impide que el
flujo osmótico permita mantener el equilibrio entre el medio intracelular y
extracelular. Esto es debido a que los cambios de temperatura son tan lentos
que los cambios de composición en el medio extracelular por la formación del
hielo son prácticamente inapreciables, y por lo tanto con flujos osmóticos
infinitesimales logramos equilibrar el medio intracelular con el extracelular.
Sin embargo cuando la velocidad de enfriamiento es finita, los cambios de
composición en el medio extracelular, se producen a una velocidad apreciable.
Así para mantener el equilibrio entre el interior y el exterior de la célula, ya no
basta con flujos osmóticos infinitesimales, sino que se requieren caudales de
deshidratación de una cierta magnitud.
162
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Cuanto menor sea la permeabilidad, mayor será la dificultad para evacuar
agua, y por tanto menor será el caudal del flujo osmótico.
Cuanto mayor sea la discrepancia entre el caudal osmótico requerido para
mantener el equilibrio, y el caudal que realmente existe, mayores serán las
diferencias entre el caso de velocidad de enfriamiento lento, donde siempre
tenemos equilibrio, y el caso de enfriamiento finito. Esta discrepancia se
traduce en un mayor subenfriamiento.
La conclusión es que cuanto menor sea la permeabilidad, mayor es el
subenfriamiento.
Esto lo podemos comprobar gráficamente, mostrando el subenfriamiento a
una velocidad de enfriamiento de 15ºC/min, para el caso de espermatozoides
de ratón y para el caso de que multipliquemos el valor de la permeabilidad de la
membrana por 2.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
5
4.5
4
3.5
permeabilidad
original
3
2.5
2
permeabilidad
doble de la
original
1.5
1
0.5
0
0
-2
-4
-6
-8
-10
-12
TEMPERATURA/ºC
-14
-16
-18
-20
Figura 19
El programa necesario para poder dibujar este gráfico, se encuentra en el
anexo PROGRAMAS, en el apartado 6.
Vemos como efectivamente, a mayor permeabilidad, tenemos un menor
subenfriamiento.
163
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
1.b) El valor de la permeabilidad de la membrana celular es función de la
temperatura. Cuanto menor es la temperatura del sistema, menor es el
valor de la permeabilidad.
Por lo descrito anteriormente, podemos afirmar que cuanto menor es
la temperatura del sistema, mayor debería ser el subenfriamiento por ser
cada vez menor la permeabilidad.
Esto se observa en el comienzo del proceso de enfriamiento, para
velocidades de enfriamiento lentas, y en su totalidad cuando la velocidad
de enfriamiento es alta.
2) El gradiente de concentraciones.
Por lo que hemos explicado hasta ahora, queda claro que el origen
último del subenfriamiento es la magnitud del caudal del flujo osmótico.
Una reducción del valor de la permeabilidad de la membrana celular,
para un gradiente de concentración dado, reduce el flujo osmótico
aumentando de esta manera el subenfriamiento.
Sin embargo al cambiar el valor de la permeabilidad, el gradiente de
concentración no permanece constante. Cuando se reduce la
permeabilidad al disminuir la temperatura, mayor es la dificultad para
evacuar agua. El efecto primario o principal que esto tiene es el de
reducir el flujo osmótico. Pero al reducirse el flujo osmótico, la diferencia
de concentración entre el medio intracelular y extracelular aumenta.
Puesto que el flujo osmótico es directamente proporcional al
gradiente de concentración, la reducción de la permeabilidad de la
membrana tiene un efecto secundario de disminuir el subenfriamiento.
La conclusión es que al disminuir la temperatura el gradiente de
concentración entre el medio intracelular y extracelular aumenta,
reduciéndose el subenfriamiento.
Vemos por tanto que existen dos efectos contrapuestos: la reducción
de la permeabilidad que hace aumentar el subenfriamiento, y el aumento
del gradiente de concentración que hace disminuir el subenfriamiento.
Para altas velocidades de enfriamiento, el efecto de la reducción de la
permeabilidad es dominante frente al efecto del aumento del gradiente
de concentración, siendo la respuesta del sistema la de un aumento
indefinido del subenfriamiento.
Para bajas velocidades de enfriamiento se distinguen tres etapas en
la evolución del subenfriamiento:
•
Etapa 1: El efecto de la reducción de la permeabilidad es
dominante frente al del aumento del aumento del gradiente de
concentración, resultando un aumento del subenfriamiento.
164
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
•
•
Etapa 2: El efecto del aumento del gradiente de concentración
es dominante frente al de reducción de la permeabilidad,
resultando una disminución en el subenfriamiento.
Etapa 3: Finalmente el efecto de la reducción de la
permeabilidad se hace definitivamente dominante, resultando
un aumento indefinido del subenfriamiento.
Como resumen mostramos gráficamente las tres etapas, para una velocidad
de enfriamiento de 15ºC/min:
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
10
9
Etapa 1
8
Etapa 2
Etapa 3
7
6
5
4
3
2
1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
TEMPERATURA/ºC
-35
-40
-45
Figura 20
165
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.4.3 El subenfriamiento para perfiles de enfriamiento no lineales
Vamos a mostrar cómo son los subenfriamientos cuando sometemos el
sistema a perfiles de enfriamiento lineales, cuadráticos y exponenciales.
Los mostraremos en un único gráfico para tratar de justificar cuál es el mejor
perfil de enfriamiento. Para poder comparar los diferentes perfiles, tomaremos
los parámetros de los distintos perfiles de enfriamiento tal como se explicaron
en el apartado 7.2 .
La resolución gráfica de los subenfriamientos para los distintos perfiles es la
que se muestra a continuación:
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
Lineal
25
-50ºC/m in
Cuadrático
E x ponencial
20
-35ºC/m in
15
10
-30ºC/min
-15ºC/min
5
-5ºC/min
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 21
El programa necesario para obtener este gráfico, se encuentra en el anexo
PROGRAMAS, en el apartado 7.
Analizando el gráfico, vemos que para bajas y para altas velocidades de
enfriamiento, las diferencias en el subenfriamiento son muy pequeñas.
Igualmente hay pocas diferencias a temperaturas próximas a los cero grados
centígrados.
Para velocidades de enfriamiento intermedias y también a muy bajas
temperaturas se aprecian diferencias notables. Los perfiles de enfriamiento
166
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
exponenciales dan subenfriamientos menores que los lineales, mientras que en
los cuadráticos es al contrario.
Puesto que cuanto mayor es el subenfriamiento, mayor es la probabilidad
de formación de hielo, el mejor perfil de enfriamiento es el exponencial.
167
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.5 REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL FLUJO OSMÓTICO
7.3.5.1 Programa en MATLAB del flujo osmótico
Para analizar la evolución del flujo osmótico, con respecto a la temperatura
del sistema, hemos desarrollado el siguiente programa.
Vi=3.1629*1e-17;%DATO
n2=9.014*1e-15;%DATO
A=3.5394*1e-10;%DATO
ncpa=0;%DATO
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO
end
Tgo=273.15;%DATO
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
for B=[ -15 ]
tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,
A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
n=size(y1);
for i=1:1:n(1,1)
Q(i)=-B*1e18*enfr_id_lineal(t1(i),y1(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,
E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
end
plot(t1-273,Q,'b','LineWidth',1)
axis([-55 0 0 70]);
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)');
clear Q;
end
Este programa se emplearía para calcular el flujo osmótico, cuando la célula
se enfría con un perfil lineal, a una velocidad de 15ºC/min.
Para calcular el caudal evacuado por la célula, aplicamos un sencillo
balance de masas. La masa de agua evacuada por la célula es igual a la
reducción de masa dentro de la célula. Como la densidad del agua permanece
168
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
prácticamente constante, el balance de masas se transforma en un balance de
volúmenes:
Q=
dV dV dT
=
⋅
dt
dT dt
La derivada del volumen de la célula, con respecto a la temperatura del
sistema es precisamente la expresión de la ecuación diferencial que pretendo
resolver, y que está codificada en lenguaje MATLAB en el archivo
'enfr_id_lineal'. Por ello el caudal de agua evacuada para cada
temperatura del sistema, se programa del siguiente modo:
Q(i)=-*enfr_id_lineal(t1(i),y1(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
El resto de variables son análogas al de los otros programas.
169
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.5.2 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el caudal de flujo osmótico
A continuación vamos a aplicar el programa anteriormente descrito para
mostrar cual es la evolución del caudal de agua evacuado por la célula, en el
proceso de deshidratación.
Representamos los caudales de deshidratación para distintas velocidades
de enfriamiento, en función de la temperatura del sistema en la figura 22.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras 3 /min)
80
70
60
50
40
-1000ºC/m in
30
-50ºC/m in
-30ºC/min
20
-15ºC/min
-5ºC/min
10
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 22
En el eje vertical del gráfico de la figura 22 mostramos el caudal de agua
evacuada por la célula, expresado en micras cúbicas por minutos, mientras que
en el eje horizontal mostramos la temperatura del sistema, en grados Celsius.
Lo primero que hay que hacer notar del gráfico, es que el caudal inicial de
deshidratación no es nulo. En nuestro caso, cuando alcanzamos la temperatura
de cambio de fase , que recordamos era –1.1148ºC, el caudal evacuado por la
célula es de 1.8921 µm3 ⁄ min, independientemente de la velocidad de
enfriamiento. Este valor numérico del caudal en el instante inicial se obtiene del
primer elemento del vector Q , que contiene el valor de los caudales.
Para explicar el comportamiento de la evolución del caudal osmótico,
recurriremos a los conceptos que empleamos para explicar la evolución del
subenfriamiento.
170
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
El caudal osmótico, dependía de dos factores, cuyos efectos eran opuestos:
•
•
La permeabilidad de la membrana. Conforme disminuye la
temperatura, la membrana reduce su permeabilidad. Este efecto
tiende a reducir el valor del caudal osmótico.
El gradiente de concentraciones. Conforme disminuye la
temperatura, la diferencia de concentración entre el medio
intracelular y extracelular va aumentando, como consecuencia de
la impermeabilización de la membrana. Este efecto tiende a
aumentar el valor del caudal osmótico.
En el inicio del enfriamiento, a temperaturas elevadas el valor de la
permeabilidad es bastante alto, y por tanto el efecto del gradiente de
concentraciones es dominante frente al de la permeabilidad. Sin embargo llega
un momento en que ambos efectos se contrarrestan, alcanzándose un máximo
en la evolución del caudal, para posteriormente disminuir, y tender
asintóticamente al caudal nulo, al ser dominante el efecto de la reducción de la
permeabilidad de la membrana.
Sin embargo, hay algo en el gráfico que no tiene sentido. El gráfico nos
muestra que cuanto mayor es la velocidad de enfriamiento, mayor es el caudal
de deshidratación, a cualquier temperatura. Por otra parte, cuando
estudiábamos los gráficos de deshidratación, vimos que cuanto mayor era la
velocidad de enfriamiento, menor era la deshidratación que sufría la célula, por
lo que los caudales deberían ser mayores conforme disminuyésemos la
velocidad de enfriamiento, por sufrir estas células una mayor deshidratación.
Para resolver esta aparente contradicción hay que tener en cuenta que
aunque los caudales para cada temperatura sean mayores, a altas velocidades
de enfriamiento, el tiempo durante el que están actuando es menor, siendo por
tanto el caudal acumulado menor, que en el caso de tener menores caudales
pero actuando durante más tiempo.
Efectivamente, si dibujamos la evolución del caudal de deshidratación en
función del tiempo, para una velocidad de enfriamiento alta, y para otra baja,
tenemos el gráfico que mostramos en la figura 23.
171
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras 3 /min)
80
70
-50ºC/min
60
50
40
-5ºC/min
30
20
10
0
0
0.5
1
1.5
TIEMPO/MIN
2
2.5
3
Figura 23
El programa empleado para poder dibujar este gráfico, se muestra en el
anexo PROGRAMAS, en el apartado 8.
Vemos como efectivamente, a pesar de tener un caudal mayor, en
promedio, durante el enfriamiento rápido, la deshidratación dura menos tiempo.
El caudal medio evacuado por una célula durante un enfriamiento a 15ºC/min
es de 7.1949 µ3⁄min, mientras que el caudal medio para un enfriamiento de
50ºC/min es de 25.43 µ3 ⁄ min.
Si calculamos el área bajo estas curvas, llegaremos a la conclusión de que
durante el enfriamiento lento el caudal acumulado, durante el proceso de
deshidratación es mayor, que en el caso del enfriamiento rápido. Para el caso
de un enfriamiento a 15ºC/min, el caudal acumulado, es decir, el caudal total
evacuado es de 30.7070 µm3, mientras que para un enfriamiento de 50ºC/min
es de 23.673 µm3.
Para obtener los valores numéricos, tanto de la media de los caudales
evacuados, como del área bajo la curva de caudal, hemos de introducir nuevas
líneas de código, sobre el programa que me permitió dibujar la evolución del
caudal osmótico con respecto al tiempo. Estas modificaciones se muestran en
el anexo PROGRAMAS en el apartado 9.
172
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
La contradicción queda por tanto resuelta. Tan sólo queda encontrar la
razón por la cual a altas velocidades de enfriamiento se dan mayores máximos
en el caudal de deshidratación.
La razón de nuevo la encontramos analizando los factores que afectan al
valor del caudal de deshidratación. Puesto que la velocidad de enfriamiento
afecta por igual al valor de la permeabilidad, es decir, la permeabilidad
depende de la temperatura, pero no de cómo se modifica ésta. Por lo tanto el
causante del elevado caudal para altas velocidades de enfriamiento debe ser el
gradiente de concentración. Si representamos gráficamente la evolución de la
concentración de soluto dentro de la célula, y fuera de ella obtenemos el
siguiente gráfico:
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
10
9
-15ºC/m in
medio extracelular
medio intracelular
CONCENTRACIÓN/(mol/m3)
8
-30ºC/min
7
6
-35ºC/min
5
4
3
2
-50ºC/min
1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 24
El programa necesario para poder dibujar este gráfico, se encuentra en el
anexo PROGRAMAS, en el apartado 9.
Vemos cómo, para altas velocidades de enfriamiento, la diferencia de
concentración entre la solución intracelular y extracelular es mayor ,para cada
temperatura. Puesto que el flujo osmótico es directamente proporcional a dicho
gradiente de concentración, es una consecuencia lógica que tengamos
mayores caudales, en promedio, para un enfriamiento rápido, frente a uno más
lento.
173
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Es conveniente hacer un comentario adicional, acerca de la evolución de los
caudales del flujo osmótico en función del tiempo. Hemos visto como cuanto
mayor es la velocidad de enfriamiento, mayor es el máximo de caudal, y mayor
es en promedio el caudal evacuado. Un mayor caudal saliendo por los poros de
la membrana celular, supone una mayor presión ejercida sobre la paredes de
los poros de la membrana. Si el pico de caudal es demasiado elevado, puede
dar lugar a la rotura del poro, y en consecuencia, a la rotura de la membrana.
Por lo tanto, velocidades de enfriamiento demasiado elevadas, pueden dar
lugar a la muerte celular, por rotura de la membrana.
174
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.5.3 Curvas de flujo osmótico para perfiles de enfriamiento no lineales
A continuación vamos a mostrar la evolución del caudal evacuado por la
célula, cuando la sometemos a enfriamientos que siguen un perfil no lineal.
Para poder comparar con el caso lineal, representaremos simultáneamente el
flujo osmótico, para un perfil lineal, uno cuadrático, y otro exponencial.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
80
lineal
cuadrático
exponenc ial
CAUDAL DE AGUA(micras 3 /min)
70
60
50
-50ºC/m in
40
30
-30ºC/m in
20
-15ºC/m in
10
-5ºC/min
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 25
El programa necesario para poder dibujar el gráfico anterior se muestra
en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 10.
Al analizar este resultado gráfico, vemos como no hay diferencias
apreciables en la evolución del caudal evacuado por la célula, entre los
distintos perfiles de enfriamiento.
Recordamos que las velocidades que aparecen indicadas en el gráfico,
son las velocidades iniciales de los perfiles cuadrático y exponencial.
175
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.6 REPRESENTACIÓN GRÁFICA A TEMPERATURA CONSTANTE
7.3.6.1 Introducción
En los protocolos de criopreservación que se han desarrollado hasta la
fecha, es una práctica habitual mantener las muestras a temperatura constante
durante un cierto periodo de tiempo[10, 15, 17].
En este apartado vamos a analizar qué efecto tiene sobre una célula, que
ha sido enfriada siguiendo un determinado perfil de enfriamiento, el hecho que
detengamos el proceso de enfriamiento, y mantengamos la temperatura del
sistema constante.
Primeramente, vamos a razonar que fenómenos físicos se pueden esperar
que sucedan en la célula cuando en un instante determinado del
subenfriamiento mantenemos la temperatura constante. A continuación
determinaremos numéricamente la evolución de la deshidratación durante el
periodo de temperatura constante, si es que existe deshidratación, y así
comprobar los razonamientos hechos anteriormente. Por último simularemos
un protocolo de enfriamiento, que intercale periodos de temperatura constante,
entre etapas de enfriamiento lineal.
Comenzaremos pues razonando que es lo que podemos esperar que
suceda cuando la célula, tras ser sometida a un perfil de enfriamiento, se
mantiene a temperatura constante.
Hasta ahora, hemos visto que cuando enfriamos a una célula a una
velocidad de enfriamiento finita, sin importar el tipo de perfil, la temperatura en
el interior de la célula está por debajo de la temperatura de cambio de fase, es
decir, el sistema está subenfriado. El subenfriamiento es tanto mayor cuanto
mayor sea la velocidad del enfriamiento. El subenfriamiento es un fenómeno
indeseable pues cuanto mayor es, mayor es la probabilidad de que se forme
hielo en el interior de la célula.
La razón que encontramos para explicar este fenómeno fue que la velocidad
con la que debía aumentar la concentración de la solución intracelular para no
tener subenfriamiento, es decir, para estar en equilibrio con la composición del
medio extracelular, requería una velocidad de evacuación de agua desde el
interior de la célula, que el mecanismo de la ósmosis era incapaz de
proporcionar.
Sin embargo, si mantenemos la temperatura del sistema constante, el
medio extracelular ya no modificará su composición. El medio intracelular
estará más diluido debido al subenfriamiento que padece, pero mientras
persista la situación de temperatura constante, la ósmosis va igualando las
176
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
composiciones, hasta que finalmente desaparece el subenfriamiento, y con él
la probabilidad de que se forme hielo.
Vemos por tanto que mantener el sistema a temperatura constante, lo
estabiliza, reduciendo o eliminando el subenfriamiento acumulado durante
etapas anteriores de enfriamiento.
A continuación vamos a calcular la evolución de esta deshidratación, y ver
así cuanto tiempo es necesario para reducir el subenfriamiento hasta un valor
razonable.
177
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.6.2 Programación en MATLAB de la deshidratación a temperatura
constante.
Los programas que hemos desarrollado para ver como evoluciona la
deshidratación de la célula con respecto al tiempo son dos. El primero contiene
la ecuación diferencial que modela la deshidratación a temperatura constante,
mientras que el segundo programa se encarga de integrar la ecuación dada por
el primer programa.
El programa que contiene la ecuación diferencial de la deshidratación en el
caso de un periodo a temperatura constante es:
function
varargout=Tcte_id(t,y,flag,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,tiempoTcte,to,nc
pa,Vmcpa)
if nargin<14 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;% CASO GLICEROL.
end
if nargin<13 | isempty(ncpa)
ncpa=0;%por defecto no hay crioprotector.
end
if nargin<12 | isempty(to)
to=0;%el tiempo cuenta a partir de cero
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init(to,tiempoTcte);
case 'events'
[varargout{1:3}]=events(t,y,Vi,n2,A,ncpa);
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function dydt=f(t,y,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,ncpa,Vmcpa)
R=8.3143;
SLf=integralLf(Tcte);
Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/Tcte-1/Tgo))/(1.01325*1e5);
VmA=18*1e-6;MA=18;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
aux=(Lg*A*R*Tcte/VmA);
sum=log((y-Vsol)/((y-Vsol)+VmA*nsol));
dydt=[aux*(SLf-sum)];
function [tspan,y0,options]=init(to,tiempoTcte)
tspan=[to to+tiempoTcte];
y0=[3.1629*1e-17];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
Las únicas variables nuevas, con respecto a las que hemos estado viendo
hasta ahora son Tcte y tiempoTcte. La primera le muestra al programa cual
es la temperatura constante a la que sometemos el sistema. La segunda le
indica al programa cuanto tiempo dura esta etapa.
178
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
El programa que contiene la integración de la ecuación anterior es :
Vi=3.1629*1e-17;
n2=9.014*1e-15;
A=3.5394*1e-10;
Tcte=268;%TEMPERATURA A LA QUE SE LLEVA A CABO LA DESHIDRATACIÓN.
tiempoTcte=1;%DURACIÓN DE ETAPA A T CTE EN MINUTOS.
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
for ncpa=[0]
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;
E_Lgo=94.1*1e3;
else
Lgo=.004*1e-6;
E_Lgo=63.6*1e3;
end
Tgo=273.15;
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
Veq=interp1(t0,y0,Tcte);
for B=[-5 -15 -30 -50]
Tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,T
go,ncpa,[]);
Vo=interp1(t1,y1,Tcte);
[t2,y2]=ode45('Tcte_id',[],Vo,options,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,tiemp
oTcte,[],ncpa,[]);
V2=y2./Vi;
if ncpa==0
plot(t2,V2,'b','LineWidth',1)
else
plot(t2,V2,'g','LineWidth',1)
end
hold on;
n=size(t2);
Vfinal=y2(n(1,1));
plot(t2,t2.*Veq./(Vi*t2),'r:')
hold on;
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TIEMPO/MIN');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
clear all;
Este programa se emplearía para estudiar la deshidratación a una
temperatura constante de 268K durante un periodo de tiempo de un minuto.
En la primera parte del programa introducimos los parámetros físicos de la
célula. A continuación determinamos cual es el volumen mínimo que podría
179
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
alcanzar la célula si la mantenemos indefinidamente a temperatura constante,
es decir, calculamos el volumen de equilibrio para esa temperatura.
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
Veq=interp1(t0,y0,Tcte);
A continuación calculamos cual es el volumen de la célula, cuando la
temperatura alcanza los 268K.
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,T
go,ncpa,[]);
Vo=interp1(t1,y1,Tcte);
Por último calculamos la deshidratación a temperatura constante, y
dibujamos el gráfico.
El programa está preparado para comparar la deshidratación con y sin
crioprotector de ahí que exista un bucle con respecto a la variable ncpa que
contiene los moles disueltos de crioprotector en el interior de la célula.
180
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.6.3 Resolución numérica y representación gráfica de la deshidratación a
temperatura constante
A continuación vamos a mostrar gráficamente cómo se va deshidratando la
célula cuando, tras ser enfriada a una velocidad de 50ºC/min, se mantiene su
temperatura constante cuando alcanza los 268K (-5ºC).
Primero vamos a mostrar la deshidratación durante el enfriamiento lineal a
50ºC/min. Esto se muestra en la figura 26.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
Punto en el que comienz a
la etapa a temperatura
constante.
0.9
0.8
0.7
0.6
-50ºC/m in
0.5
0.4
0.3
curva de equilibrio
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 26
Cuando la etapa de temperatura constante comienza, el volumen de la
célula es un 88.64% del que tenía inicialmente. La máxima deshidratación que
podemos alcanzar para esa temperatura viene dada por la curva de equilibrio, y
es igual a 21.39% del volumen inicial.
La evolución de la deshidratación con el tiempo, a partir del instante en el
que el sistema alcanza los –5ºC se muestra en la figura 27.
181
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
Volumen de la célula
cuando comienza la
etapa de temepratura
constante
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
Volumen de la célula en el equilibrio a la temperatura de -5ºC
0.1
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
TIEMPO/MIN
0.5
0.6
0.7
Figura 27
Vemos cómo en menos de un minuto, el medio intracelular ha alcanzado las
condiciones de equilibrio.
182
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.3.6.4 Aplicación de la etapa de deshidratación a temperatura constante para
la optimización de protocolos de enfriamiento
En el apartado anterior 7.3.6.3, hemos mostrado cómo en una etapa a
temperatura constante, el subenfriamiento se reduce.
Estas etapas de temperatura constante podemos intercalarlas entre etapas
de enfriamiento, para ir recortando el subenfriamiento, que el enfriamiento finito
induce en el interior de la célula.
A modo de ejemplo vamos a analizar un protocolo en el que el
subenfriamiento nunca sea superior a los 5ºC. Cada vez que alcancemos esta
cota, dejaremos de enfriar, manteniendo el sistema a temperatura constante el
tiempo necesario, para que el volumen celular sea al menos un 99% del
máximo alcanzable para esa temperatura, es decir, un 99% del volumen de
equilibrio.
El número de etapas no conviene que sea demasiado elevado. En el
ejemplo que proponemos a continuación, una célula será sometida a una
velocidad de enfriamiento de 30ºC/min, aplicando 4 etapas de temperatura
constante. La resolución del sistema muestra que la cota de 5ºC de
subenfriamiento se da en este caso a los –6ºC, -31ºC, -36ºC, y 42ºC
aproximadamente. La evolución del subenfriamiento se muestra en la figura 28.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
5
4.5
4
SUBENFRIA M IENTO
3.5
3
2.5
2
1.5
1
Tem p e r a tura cte
0.5
Enfriam iento
lineal a 30ºC/m in
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 28
183
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Aquí podemos apreciar lo poderosa que es esta herramienta, para no
incurrir en elevados valores de subenfriamiento, manteniendo de este modo
controlado la posible formación de hielo. Para poder apreciar mejor la bondad
de este método podemos superponer la evolución del subenfriamiento, si no
intercalamos etapas a temperatura constante. Esto se muestra en la figura 29
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
10
Enfria m i e n to
lineal a 30ºC/m in
9
8
Etapa de
tem p e ratura
cons tante
SUBENFRIAMIENTO
7
6
Enfriam iento
lineal a 30ºC/m in
continuo
5
4
3
2
1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 29
El programa necesario para poder dibujar los dos gráficos anteriores se
encuentra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 11.
La evolución de la deshidratación con la temperatura, cuando intercalamos
estas etapas de temperatura constante se muestra en la figura 30.
184
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
1
Curva de equilibrio
0.9
0.7
Enfriam iento lineal
a 30ºC/m in a tramos
Temperatura
constante
0.6
Enfriam iento lineal
a 30ºC/m in continuo
FRACCION VOLUMEN INICIA L
0.8
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 30
El programa necesario para poder obtener el gráfico anterior se muestra en
el anexo PROGRAMAS, en el apartado 12.
Podemos ver cómo tras la primera etapa de temperatura constante, las
deshidrataciones sucesivas para reducir el subenfriamiento son muy pequeñas,
pero por encontrarse cerca del equilibrio es más costoso en tiempo aproximar
la curva a la de equilibrio. Además en el tramo final de deshidratación donde la
curva se hace muy horizontal, los subenfriamientos crecen muy deprisa
requiriéndose con una mayor frecuencia el uso de etapas a temperatura
constante, para mantener controlado el subenfriamiento.
En estos gráficos, donde estamos representando frente a la temperatura,
las etapas de enfriamiento, parecen predominar (ocupan la mayor parte del
gráfico), frente a las de temperatura constante. Sin embargo sucede todo lo
contrario como vemos en el gráfico de la figura 31 donde mostramos la
deshidratación con respecto al tiempo.
185
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
1
Enfriam iento
lineal a 30ºC/min
0.9
Temperatura cte
FRACCION VOLUMEN INICIA L
0.8
Enfriam iento
lineal a 30ºC/min
s in etapas de
temperatura
constante
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
1
2
3
4
TIEMPO/min
5
6
7
Figura 31
El programa necesario para poder obtener el gráfico anterior se muestra en
el anexo PROGRAMAS, en el apartado 13.
Vemos cómo efectivamente, las etapas de temperatura constante, son las
que consumen la mayor parte del tiempo del protocolo.
También hemos dibujado cómo sería la evolución del protocolo si no
aplicásemos ninguna etapa de temperatura constante, para controlar el
subenfriamiento. Aparentemente son muy parecidas, sin embargo esto es
engañoso.Vemos que la curva a trazos que representa la evolución de la
deshidratación sin etapas a temperatura constante, finaliza antes de los tres
minutos. En el programa esta curva de dibuja hasta que llega a los 190K, es
decir, los –83ºC. Sin embargo la curva con tramos a colores rojo y verde que
representa la deshidratación con etapas de temperatura constante, cuando
finaliza la última etapa de temperatura constante, en torno a los seis minutos,
tan sólo ha alcanzado los –42ºC aproximadamente.
De esto se deduce que la evolución de la deshidratación es muy diferente.
A continuación mostramos una tabla que contiene la duración de cada una
de las etapas en segundos, así como la temperatura final de la etapa de
enfriamiento lineal, que es la misma que la de temperatura constante, y el
tiempo acumulado del protocolo, es decir lo que va durando el protocolo.
186
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Etapa
Duración de la
etapa de
enfriamiento
lineal/s
Duración de la
etapa de
temperatura
constante/s
Temperatura
final de la etapa
a temperatura
constante/ºC
Duración del
protocolo/min
1
2
3
4
12.6259
49.3260
11.2512
10.2177
28.5938
33.0584
73.4934
153.1938
-6.3129
-30.9759
-36.6016
-41.7104
0.6870
2.0601
3.4725
6.1960
El programa que se encarga de dibujar la evolución de la deshidratación con
el tiempo, nos proporciona también los valores numéricos de esta tabla.
Si fuéramos más exigentes a la hora de controlar el subenfriamiento,
podríamos establecer que este alcanzara un valor máximo de 2ºC, por ejemplo.
Esto se traducirá en un protocolo más seguro, puesto que tenemos menos
probabilidades de formar hielo dentro de la célula, pero también sería un
protocolo más largo y complicado pues el número de etapas a temperatura
constante deben aumentar. Efectivamente, si establecemos como
subenfriamiento límite los 2ºC, necesitaríamos 10 etapas de temperatura
constante, para poder alcanzar los –35ºC. Esto se ve en la figura 32.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
2
Enfriam iento
lineal a 30ºC/min
1.8
Temperatura cte
1.6
SUBENFRIA M IENTO
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 32
187
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
El programa necesario para poder dibujar este gráfico es el mismo que el
del caso anterior, salvo que el número de etapas es ahora 10, y el
subenfriamiento máximo admisible es 2ºC..
En la figura 32, vemos lo complicado que se hace controlar el
subenfriamiento, por debajo de los –20ºC, necesitándose un elevado número
de etapas a temperatura constante.
La evolución de la deshidratación con la temperatura la mostramos en la
figura 33.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCION VOLUMEN INICIA L
1
0.9
Enfriam iento
lineal a 30ºC/min
0.8
Temperatura cte
Curva de equilibrio
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 33
Finalmente la evolución de la deshidratación con el tiempo se muestra en la
figura 34.
188
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCION VOLUMEN INICIA L
1
0.9
Enfriam iento
lineal a 30ºC/min
0.8
Temperatura cte
Enfriam iento
lineal a 30ºC/m in
sin etapas de
temperatura
constante
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
TIEMPO/min
3.5
4
4.5
5
Figura 34
Es importante no equivocarse al decir que este protocolo dura menos que el
descrito en la figura 31, a pesar de que tiene más etapas. En el protocolo el
sistema llegaba hasta los –42ºC aproximadamente, mientras que este, solo
alcaza los –35ºC.
La tabla que muestra las evoluciones del protocolo se muestra a
continuación.
Etapa
Duración de la
etapa de
enfriamiento
lineal/s
Duración de la
etapa de
temperatura
constante/s
Temperatura
final de la etapa
a temperatura
constante/ºC
Duración del
protocolo/min
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6.2520
4.7825
30.9070
6.1542
4.5987
3.7804
4.2298
3.9272
3.3347
2.5324
50.6662
15.1855
8.6828
11.2664
12.1529
16.2405
18.9547
27.4238
29.8253
33.6247
-3.1260
-5.5172
-20.9708
-24.0479
-26.3472
-28.2375
-30.3524
-32.3159
-33.9833
-35.2495
0.9486
1.2814
1.9413
2.2316
2.5108
2.8445
3.2309
3.7534
4.3061
4.9087
189
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Como conclusión podemos decir, que el emplear etapas de temperatura
constante como herramienta para controlar el subenfriamiento del sistema es
menos interesante de lo que al principio imaginábamos, debido a que se
requieren un elevado número de ellas a bajas temperaturas para mantener el
subenfriamiento dentro de unos límites razonables.
Esto se traduce en una mayor duración del protocolo, con lo que podemos
causar daños a la célula, por mantenerla demasiado tiempo en contacto con
altas concentraciones de electrolitos y de crioprotector en caso de añadirlo.
Por lo tanto si queremos emplear esta herramienta, que se ha mostrado
muy eficaz para controlar los subenfriamientos, debemos optimizar la
frecuencia de su aplicación para preservar la integridad de la célula,
manteniendo controlado lo más posible el subenfriamiento, pero no
prolongando excesivamente en el tiempo la exposición a altas concentraciones
de electrolitos.
El objetivo fundamental de un protocolo de criopreservación es llevar el
sistema hasta una temperatura segura, en un tiempo razonable para evitar
daños asociados a la alta concentración de solutos disueltos, habiendo
generado la mínima cantidad de hielo intracelular, tanto en el medio
intracelular, como en el extracelular.
El tiempo razonable se controlaría, limitando el número de etapas en la que
la temperatura permaneciera constante, así como la duración de dicha etapa,
mientras que minimizar la cantidad de hielo formado se controlaría con el
máximo subenfriamiento admisible.
Ambos objetivos se contraponen, puesto que cuanto menor sea el
subenfriamiento máximo, mayor será el número de etapas a temperatura
constante que necesitaremos para alcanzar una temperatura fija.
Para mostrar estas ideas podemos preparar un programa similar a los que
hemos empleado para dibujar los protocolos descritos hasta ahora, pero en el
que el número de etapas de temperatura constante no sea fijado por el
programador, sino que venga determinado en función de alguna condición. En
el apartado 14 del anexo PROGRAMAS, se muestra el programa que dibuja el
subenfriamiento en función del tiempo, con la condición de que el número de
etapas sea tal que la temperatura del sistema sea de –40ºC, siempre que el
número de etapas sea inferior a 20. Esto significa que si el sistema necesita
más de 20 etapas para alcanzar los –40ºC, no llegará a esa temperatura, para
no alargar excesivamente la duración del protocolo.
Al aplicar este programa al caso de un subenfriamiento límite de 2ºC, el
número de etapas necesarias para alcanzar los –40ºC es de 14. La evolución
de este protocolo se muestra en la tabla adjunta.
190
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Etapa
Duración de la
etapa de
enfriamiento
lineal/s
Duración de la
etapa de
temperatura
constante/s
Temperatura
final de la etapa
a temperatura
constante/ºC
Duración del
protocolo/min
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
6.2520
4.7825
30.9070
6.1542
4.5987
3.7804
4.2298
3.9272
3.3347
2.5324
2.7781
3.1217
1.9001
2.0895
50.6662
15.1855
8.6828
11.2664
12.1529
16.2405
18.9547
27.4238
29.8253
33.6247
37.9019
55.2292
45.4131
54.8505
-3.1260
-5.5172
-20.9708
-24.0479
-26.3472
-28.2375
-30.3524
-32.3159
-33.9833
-35.2495
-36.6386
-38.1994
-39.1495
-40.1942
0.9486
1.2814
1.9413
2.2316
2.5108
2.8445
3.2309
3.7534
4.3061
4.9087
5.5867
6.5592
7.3478
8.2968
La evolución gráfica del subenfriamiento con el tiempo se muestra en la
figura 35.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
10
Subenfriam iento durante
enfriam iento lineal continuo.
Etapa de enfriam iento lineal
9
8
Etapa de tem p e r a tura cons tante
SUBENFRIAMIENTO
7
6
5
4
3
Límite de subenfriam iento
2
1
0
0
1
2
3
4
5
TIEMPO/min
6
7
8
9
Figura 35
191
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Hasta ahora los protocolos se han llevado a cabo a una única velocidad de
enfriamiento lineal, de 30ºC/min. ¿Qué efecto tiene sobre el protocolo la
modificación de dicha velocidad?
En la figura 36 mostramos simultáneamente dos protocolos de enfriamiento
donde el subenfriamiento máximo admisible es de 5ºC, pero en uno la
velocidad de enfriamiento lineal es de 30ºC/min, y en el otro es de 90ºC/min.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
30
Enfriam iento lineal continuo a 30ºC/min
25
Enfriam iento lineal continuo a 90ºC/min
SUBENFRIAMIENTO
Enfriam iento lineal a tramos a 30ºC/min
Enfriam iento lineal a tramos a 90ºC/min
20
15
10
Lím ite del subenfriam iento
5
0
0
1
2
3
4
5
6
TIEMPO/min
7
8
9
10
Figura 36
Se ve cómo una mayor velocidad de enfriamiento se traduce en un mayor
número de etapas para llegar a una temperatura determinada, que
establecimos en –40ºC, y en una mayor duración del protocolo. Pasamos de 4
etapas que duran aproximadamente seis minutos durante el enfriamiento a
30ºC/min, a 8 etapas y nueve minutos durante el enfriamiento a 90ºC/min.
En el caso de que la velocidad de enfriamiento sea menor de los 30ºC/min,
se tiene en cuenta en la figura 37.
192
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
30
Enfriam iento continuo
lineal a 30ºC/min
SUBENFRIA M IENTO
25
Enfriam iento continuo
lineal a 15ºC/min
Enfriam iento a tramos
lineal a 30ºC/min
20
Enfriam iento a tramos
lineal a 15ºC/m in
15
10
Límite de subenfriam iento
5
0
0
1
2
3
4
TIEMPO/min
5
6
7
8
Figura 37
El número de etapas necesarias se reduce drásticamente a dos, pero esto
se debe fundamentalmente a que a tan baja velocidad de enfriamiento no se
requiere la introducción de una etapa a enfriamiento constante hasta los dos
minutos y medio aproximadamente. Por el contrario la duración del protocolo es
superior, al ser la velocidad de enfriamiento menor.
Etapa
Duración de la
etapa de
enfriamiento
lineal/s
Duración de la
etapa de
temperatura
constante/s
Temperatura
final de la etapa
a temperatura
constante/ºC
Duración del
protocolo/min
1
2
150.2700
21.5173
84.0262
180.0000
-37.5675
-42.9468
3.9049
7.2636
Llegamos a la conclusión de que cuanto mayor sea la velocidad de
enfriamiento, más rápidamente crece inicialmente el subenfriamiento, y por
tanto antes se requiere la ejecución de etapas de temperatura constante. Esto
se traduce en un mayor número de ellas. Por lo tanto el menor tiempo que
duran las etapas de enfriamiento se compensa con el mayor número de etapas
de enfriamiento constante necesarias. Esto constituye un problema de
optimización que se escapa a los objetivos de este proyecto y que resultaría
interesante abordar en un futuro.
193
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.4. ANÁLISIS TEÓRICO DEL EFECTO DE LOS PARÁMETROS FÍSICOS DE LAS CÉLULAS
SOBRE LA DESHIDRATACIÓN
7.4.1 INTRODUCCIÓN
Hasta ahora hemos estudiado el proceso de deshidratación con un único
tipo de célula, el espermatozoide de ratón. Hemos calculado los
subenfriamientos típicos, así como los flujos osmóticos para diversas
velocidades de enfriamiento.
Si aplicamos los mismos perfiles de enfriamiento a otro tipo de células,
¿tendremos los mismos subenfriamientos y flujos osmóticos? Si la respuesta
fuera afirmativa, un único protocolo de enfriamiento, optimizado para un tipo de
célula particular como por ejemplo esperma de ratón, serviría para
criopreservar cualquier otro tipo de célula. Esto sería muy deseable pues
podrían desarrollarse protocolos altamente optimizados, mediante un gran
número de ensayos de laboratorio, para conservar esperma humano o
cualquier otro tipo de célula humana, empleando células de otros animales en
los ensayos. Por el contrario, si los subenfriamientos y flujos osmóticos varían
de un tipo a otro de célula, cuando aplicamos un mismo perfil de enfriamiento,
debemos buscar para cada tipo de célula su propio protocolo particular.
A continuación comprobaremos estudiando la deshidratación de un óvulo de
ratón no fertilizado, que el protocolo de criopreservación universal no existe, es
decir, cada tipo de célula tiene su propio protocolo.
Por último discutiremos el efecto que tiene sobre la deshidratación dos
parámetros físicos de la célula:
•
•
La permeabilidad de la membrana celular.
El ratio Área de la membrana / Volumen de la célula.
194
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.4.2 EL ÓVULO DE RATÓN NO FERTILIZADO
7.4.2.1 Parámetros físicos
Para poder resolver las ecuaciones de deshidratación y de equilibrio,
necesitamos conocer una serie de datos físicos, referentes a la célula que
estemos considerando, en nuestro caso, óvulos de ratón no fertilizados.
Los datos físicos necesarios para desarrollar el modelo matemático son
exactamente los mismos que los que necesitamos para el caso del
espermatozoide de ratón.
Los valores numéricos de los parámetros físicos, anteriormente descritos,
para el caso particular de espermatozoides de ratón son:
Ø Permeabilidad de la membrana
o Permeabilidad de referencia: LPg=0.43 µm ⁄ (min atm)
o Energía de activación: ELp=58.6152 KJ ⁄ mol
o Temperatura de referencia: Tg=293 K
Ø Área de la membrana: La calculo asumiendo que el óvulo es una
esfera de 38.26 µm de radio:
A = 4 ⋅ π ⋅ (38.26) 2 = 18400 µm 2 = 184 ⋅ 10 −10 m 2
Ø Volumen de disolución inicial.
o Fracción de volumen celular osmóticamente inactivo: 20%
o Volumen celular: Lo calculo asumiendo que el óvulo es una
esfera con las dimensiones dadas anteriormente:
4
Vcell ,0 = π ⋅ (38.26) 3 = 234690 µm 3
3
Por lo tanto el volumen de disolución intracelular en el instante
inicial es:
V0 = (1 − 0.20) ⋅ 234690 = 187752 µm 3 = 18775.2 ⋅ 10 −17 m 3
Ø Numero de moles de sal dentro de la célula.
o Concentración inicial de la sal: 0.376 M
o Volumen de disolución inicial: V0=18775.2×10-17 m3.
Por lo tanto el numero de moles de soluto, será el producto de la
concentración molar, por el volumen de disolución intracelular:
n B = 0.376
1000 litros
moles
× 18775.2 ⋅ 10 −17 m 3 ×
= 70595 ⋅ 10 −15 moles
litro
1 m3
195
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.4.2.2 Comparativa de la deshidratación celular
Haciendo uso de los mismos programas que empleamos para obtener la
evolución de la deshidratación en espermatozoides de ratón, pero utilizando los
parámetros físicos propios de los óvulos de ratón no fertilizados, vamos a
estudiar el proceso de deshidratación así como la evolución de los
subenfriamientos.
En la figura 38 mostramos simultáneamente la evolución de la
deshidratación en espermatozoides y óvulos no fertilizados de ratón, cuando
son sometidos a una misma velocidad de enfriamiento lineal de 30ºC/min:
DESHIDRATACIÓN CELULAR
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
0.9
Óvulo de ratón
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
E s perma de ratón
0.3
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 38
Se ve cómo para una misma velocidad de enfriamiento los óvulos de ratón
han sufrido una menor deshidratación. Hay por tanto una mayor tendencia a
retener agua dentro de la célula, para cada temperatura.
Si estudiamos la evolución del subenfriamiento de la solución intracelular,
obtendremos los resultados que se muestran en la figura 39.
196
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
SUBENFRIA M IENTO INTRACELULAR
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
25
Óvulo de ratón
enfriado a 30ºC/m in
20
E s perma de ratón
enfriado a 30ºC/m in
15
10
5
0
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
TEMPERATURA/ºC
-15
-10
-5
0
Figura 39
Para cada temperatura los subenfriamientos sufridos por los óvulos de
ratón, son mayores que en los espermatozoides. Por lo tanto la probabilidad de
que se forme hielo en el interior de la célula es mayor.
Para optimizar el protocolo de criopreservación de los óvulos de ratón
debemos emplear velocidades de enfriamiento menores.
Si efectivamente empleamos velocidades de enfriamiento menores, la
evolución del subenfriamiento se muestra en la figura 40, mientras que la
evolución de la deshidratación celular se muestra en la figura 41.
197
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
SUBENFRIAMIENTO INTRACELULAR
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
esperma
óvulo
25
20
-50ºC/m in
-5ºC/min
15
10
-30ºC/min
-3ºC/m in
5
-1
-10
0
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
TEMPERATURA/ºC
-15
-10
-5
0
Figura 40
DESHIDRATACIÓN CELULAR
1
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
esperma
0.9
óvulo
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
-30ºC/m in
-3ºC/m in
0.3
-10
-50ºC/min
-1
0.2
-5ºC/m in
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 41
198
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Del análisis de los resultados obtenidos, las velocidades de enfriamiento
características para un óvulo de ratón no fertilizado son de un orden de
magnitud inferior al compararlas con las velocidades aplicadas a
espermatozoides de ratón.
La conclusión final a la que llegamos es que cada célula necesita un
protocolo de criopreservación a la medida. La razón de esta necesidad de
particularizar el protocolo a cada célula, vamos a comprobar que se debe a los
parámetros físicos de la célula, como la permeabilidad de su membrana, o el
tamaño de la célula entre otros. Nosotros sólo estudiaremos dos factores: la
permeabilidad, y un parámetro que caracteriza dos propiedades de la célula, su
tamaño y su forma, el ratio Área de la membrana/ Volumen de la célula.
199
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.4.3 PARÁMETROS FÍSICOS DE LAS CÉLULAS QUE AFECTAN AL PROCESO DE
DESHIDRATACIÓN
7.4.3.1 La permeabilidad de la membrana celular
La permeabilidad de la membrana fue modelada en el apartado 5.2 del
capítulo 4 mediante la ley de Arrhenius.
LP (T ) = LPg ⋅ e
−
E Lg  1 1
⋅ −
R  T Tg




donde LPg es la conductividad hidráulica a la temperatura de referencia Tg ,
y ELg es la energía de activación aparente para el transporte de agua a través
de la membrana.
Si la temperatura de referencia es la misma, y aumentamos la
permeabilidad de referencia y/o disminuimos la energía de activación, la
permeabilidad de la membrana aumenta. Para estudiar el efecto de la
permeabilidad sobre la deshidratación, modificaremos los parámetros del
espermatozoide de ratón. Si incrementamos la permeabilidad, aumentando por
ejemplo la permeabilidad de referencia al triple de su valor, los resultados que
se obtienen se muestran en la figura 42.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
0.9
Permeabilidad natural
0.8
Permeabilidad triple
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 42
200
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
El proceso de deshidratación se ha llevado en ambos casos siguiendo un
perfil de enfriamiento lineal a 30ºC/min.
Al incrementar la permeabilidad, la célula pierde agua con mayor facilidad,
siendo la extensión de la deshidratación más acusada, para todas las
temperaturas. Es de esperar que el subenfriamiento sea menor cuanto mayor
sea la permeabilidad de la membrana. Para comprobarlo mostramos la
evolución del subenfriamiento, en la figura 43.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
Permeabilidad natural
Permeabilidad triple
25
20
15
10
5
0
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
TEMPERATURA/ºC
-15
-10
-5
0
Figura 43
Por lo tanto, cuanto mayor es la permeabilidad de la membrana celular,
menores son los subenfriamientos, para una velocidad de enfriamiento dada, y
por tanto menor es la probabilidad de formación de hielo intracelular. También
podríamos decir, que cuanto mayor es la permeabilidad de la membrana,
mayores son las velocidades de enfriamiento que podemos aplicar, sin que el
subenfriamiento supere ciertos límites.
201
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
7.4.3.2 Ratio Área membrana / Volumen celular
Para una forma geométrica dada, cuanto mayor es el volumen de la célula,
menor es el ratio Área / Volumen:
3
,donde r es el radio de la esfera.
r
2
Cilindros: Ratio ≈ ,donde r es el radio de la base del cilindro.
r
•
Esferas: Ratio =
•
En el caso del cilindro hemos despreciado el área de las bases. Vemos
como efectivamente al aumentar el tamaño, el ratio disminuye. Además
podemos comprobar cómo el ratio de la esfera es mayor que el del cilindro.
Para ver el efecto que tiene el tamaño de la célula en el proceso de
deshidratación, triplicaremos el radio de la base del cilindro con el que hemos
modelado la geometría de un espermatozoide., y lo compararemos con la
deshidratación sufrida por la célula de tamaño natural, habiendo aplicado un
mismo perfil de enfriamiento lineal de 30ºC/min. Esto se ve en la figura 44.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
Tamaño original
0.9
Tamaño con radio triple
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 44
El ratio del espermatozoide original es de 11.19 µm-1, mientras que el del
espermatozoide con un radio triple al del original es de 3.7581 µm-1. Por lo
tanto cuanto mayor es el tamaño de la célula, y por tanto menor es su ratio
,mayor es la dificultad que presenta la célula para deshidratarse, para una
202
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
velocidad de enfriamiento dada, y una geometría constante. Desde otro punto
de vista podríamos decir que cuanto mayor es el tamaño de la célula, menores
deben ser las velocidades de enfriamiento para alcanzar una cierta
deshidratación a una determinada temperatura.
El análisis del subenfriamiento del medio intracelular se muestra en la figura
45.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
25
20
Célula con radio
triple del original
15
Célula con radio
original
10
5
0
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
TEMPERATURA/ºC
-15
-10
-5
0
Figura 45
El subenfriamiento, y por tanto la probabilidad de formación de hielo
intracelular es mayor, cuanto mayor es la célula, para una geometría, y una
velocidad de enfriamiento dada.
Como conclusión de este análisis podemos afirmar que cuanto mayor sea el
tamaño de una célula, menores deben de ser las velocidades típicas de
enfriamiento, para mantener el nivel de subenfriamiento en niveles aceptables,
y lograr elevadas deshidrataciones. Esto concuerda con lo visto al analizar la
deshidratación de los óvulos de ratón. El tamaño de un óvulo es muy superior
al de un espermatozoide, requiriéndose velocidades de enfriamiento de un
orden de magnitud inferior a las requeridas para enfriar espermatozoides.
También podemos sacar otra conclusión, con respecto a la geometría de la
célula. Es bien sabido que dado un volumen fijo, la geometría esférica es la que
presenta una menor superficie. Supongamos que tenemos dos células de
aproximadamente el mismo tamaño. La primera tiene una geometría muy
203
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
esférica, mientras que la segunda no. Si aplicamos el mismo perfil de
enfriamiento a los dos tipos de células, es de esperar que en la célula esférica
el subenfriamiento sea mayor que en el observado en la célula no esférica,
debido al menor ratio que presenta la célula esférica.
Por lo tanto células de geometría aproximadamente esférica requieren
perfiles de enfriamiento menores que células, que teniendo el mismo volumen
tienen una geometría no esférica.
204
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV-8. MODELO TEÓRICO NO IDEAL
8.1. REVISIÓN DE LAS HIPÓTESIS SIMPLIFICATORIAS
Las ecuaciones diferenciales que describen la deshidratación celular, bien
durante un enfriamiento, bien durante un periodo a temperatura constante,
obtenidas hasta este momento, sólo son aplicables para el caso en que la
solución intracelular tenga comportamiento de solución diluida ideal.
Como ya se comentó en el apartado 3 de Hipótesis Simplificatorias del
Modelo Ideal, la consideración de solución diluida es razonable, pero la de
considerar la solución como ideal, no tanto. Esto era debido a la naturaleza de
electrolito fuerte del cloruro sódico, que daba origen a intensas fuerzas iónicas.
Estas fuerzas tenían como consecuencia interacciones soluto-soluto
considerables, incluso para diluciones muy altas.
Por esta razón, vamos a replantear las ecuaciones del modelo de
deshidratación, para que tengan en cuenta el hecho de que la solución no tiene
comportamiento ideal.
Aplicaremos la teoría de Debye-Huckel para caracterizar el comportamiento
de la solución no ideal. Recordamos que esta teoría era aplicable al caso de
soluciones diluidas de electrolitos fuertes, como el caso que nos ocupa.
Como seguimos asumiendo que la solución permanece diluida, el resto de
hipótesis simplificatorias que adoptamos para el modelo ideal son aplicables al
modelo no ideal.
Las ecuaciones que desarrollaremos, al igual que en el caso ideal, no van a
tener en cuenta, por ahora, la presencia de agentes crioprotectores.
En este apartado también desarrollaremos la ecuación de la curva de
equilibrio y particularizaremos las ecuaciones del modelo de deshidratación
para perfiles de enfriamiento lineal, cuadrático, y exponencial.
Por último deduciremos las ecuaciones del modelo ideal, como caso límite
de las ecuaciones del modelo no ideal, para comprobar la validez del modelo
no ideal.
205
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.2. EL MODELO TEÓRICO NO IDEAL PARA UN PERFIL DE ENFRIAMIENTO ARBITRARIO
La ecuación que describía el proceso de deshidratación celular en términos
de presiones osmóticas, para el caso del modelo ideal era
(
dV
= L p (T ) ⋅ A ⋅ π in − π ex
dt
)
Ec. 256
donde V es el volumen de la disolución intracelular, Lp(T) es el coeficiente de
permeabilidad, A es el área de la membrana, y p in, p ex son las presiones
osmóticas en el interior y el exterior de la célula respectivamente.
Sin embargo, para llegar a esta ecuación Ec.256 no se tuvo en cuenta en
ningún momento que la solución fuese diluida ideal, salvo cuando planteamos
la ecuación de Van’t Hoff, que relacionaba la presión osmótica con la
concentración de soluto.
π = C B ⋅ R ⋅ T Ec. 257
donde p es la presión osmótica y CB es la concentración de soluto en
moles / litro . Esta ecuación es sólo aproximadamente válida en el caso de
soluciones diluidas no ideales, lo cual no afecta para nada a la obtención de la
ecuación de deshidratación.
Por lo tanto la ecuación de deshidratación en función de las presiones
osmóticas es aplicable al caso de soluciones diluidas no ideales.
El paso siguiente que se dio para obtener la ecuación de deshidratación en
el modelo ideal, fue relacionar las presiones osmóticas con las presiones de
vapor, a través de unas ecuaciones que fueron deducidas en el Capítulo 2, de
ÓSMOSIS.
PA,l
R ⋅T
=
⋅ ln in
VA
P
*
π
in
π ex
PA*,l
R ⋅T
=
⋅ ln ex
VA
P
Ec. 258
donde VA es el volumen molar parcial del disolvente, P*A,l es la presión de
vapor del disolvente puro, y Pin, Pex son las presiones de vapor de la solución
intracelular y extracelular respectivamente.
Para la deducción de estas ecuaciones no se tiene en cuenta, en ningún
momento, la hipótesis de solución diluida ideal. Por lo tanto la ecuación de
deshidratación en función de las presiones de vapor de la solución intracelular
y extracelular, son válidas para el caso de soluciones diluidas no ideales:
206
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
P ex
=
⋅
ln
Ec. 259
dt
V A*
P in
El siguiente paso que dimos en la obtención de la ecuación del modelo
teórico ideal, fue desarrollar las expresiones de la presión de vapor.
Ø Solución intracelular: aquí se produce una diferencia notable. En el caso
del modelo teórico ideal, aplicábamos la ley de Raoult ideal.
P in = PA*,l (T ) ⋅ x inA + PB* (T ) ⋅ x Bin Ec. 260
donde P*A,l y P*B son las presiones de vapor del agua líquida y de la sal
y xinA y xinB son las fracciones molares de agua y sal respectivamente.
Sin embargo en el caso que nos ocupa, del modelo teórico no ideal,
aplicaremos la ley de Raoult no ideal:
P in = PA*,l (T ) ⋅ a inA + PB* (T ) ⋅ a Bin Ec. 261
donde aAin y
aBin
respectivamente.
son las actividades del agua y de la sal
Despreciando la presión de vapor de la sal frente a la de disolvente,
tenemos:
P in ≈ PA*,l (T ) ⋅ a inA = PA*,l (T ) ⋅ γ inA ⋅ x inA Ec. 262
donde ?Ain es el coeficiente de actividad del disolvente en la solución
intracelular y xAin es la fracción molar del disolvente.
Ø Solución extracelular: al igual que en el caso del modelo teórico ideal, la
presión de vapor del medio extracelular es aproximadamente igual a la
presión de vapor del hielo puro.
P ex ≈ PA*, s (T ) Ec. 263
Esto es así porque para la deducción de la relación anterior, no se tuvo
en cuenta la hipótesis de solución diluida ideal.
El cociente de las presiones de vapor tras los desarrollos anteriores queda:
*
P ex PA, s (T ) 1
≈
⋅
Ec. 264
P in PA*,l (T ) a inA
207
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
La ecuación de deshidratación queda:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dt
V A*
 PA*, s (T )

⋅  ln *
− ln a inA  Ec. 265
 P (T )

A, l


Aplicando la ecuación de Clausius-Clapeyron, el cociente de las presiones
de vapor de las sustancias puras será:
PA*,l (T )
PA*, s (T )
=
 T LF (T ) 

⋅
exp
dT  Ec. 266
 T∫ R ⋅ T 2

PA*,s (T0 )
0

PA*,l (T0 )
donde LF(T) es el calor latente de fusión. Tomando T0= 273.15 K, la presión de
vapor del hielo y del agua líquida pura, coinciden. Teniendo esto en cuenta y
sustituyendo Ec265 en Ec266 se tiene:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dt
V A*
 T L (T )

⋅  ∫ F 2 dT − ln a A  Ec. 267
 273.15 R ⋅ T

Expresando las variaciones del volumen en
temperatura(Ec197), la ecuación de deshidratación queda:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dT
V A* ⋅ F (T )
función
de
la
 T LF (T )

⋅  ∫
dT − ln a A  Ec. 268
2
 273.15 R ⋅ T

donde F(T), recordamos que era la variación de la temperatura del sistema con
respecto al tiempo:
F (T ) =
dT
Ec. 269
dt
A partir de aquí es donde se produce la diferencia fundamental entre el
modelo teórico ideal y no ideal. En el modelo teórico ideal, expresábamos la
fracción molar del disolvente, xAin en función del volumen de la disolución
intracelular V:
V − n B ⋅ VB∞
Ec. 270
xA =
V − n B ⋅ VB∞ + ν B ⋅ n B ⋅ V A*
donde VA* es el volumen molar del disolvente puro, y VB8 es el volumen molar
a dilución infinita de el soluto.
En el modelo teórico no ideal, buscamos expresar la actividad del disolvente
aAin en función del volumen de la disolución intracelular.
208
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Para obtener la ecuación del modelo no ideal vamos a seguir los siguientes
pasos:
Ø Paso 1: relacionamos la actividad del disolvente aAin , con la
concentración de soluto y el coeficiente de actividad del soluto.
Aplicamos la ecuación de Gibbs-Duhem a temperatura y presión
constante a la solución intracelular:
n A ⋅ dµ A + n B ⋅ dµ B = 0 Ec. 271
donde nA y nB son los moles de agua y de sal (ClNa) repectivamente, y
µA
y µB son los potenciales químicos del agua y de la sal
respectivamente.
El potencial químico del disolvente es:
µ A = µ *A + R ⋅ T ⋅ ln a A Ec. 272
Una variación infinitesimal de µA a temperatura y presión constante
es:
dµ A = R ⋅ T ⋅ d ln a A Ec. 273
El potencial químico de la sal, considerando que es un electrolito
fuerte es:
µ B = µ B* + ν B ⋅ R ⋅ T ⋅ lnν ± + ν B ⋅ R ⋅ T ⋅ ln γ ± + ν B ⋅ R ⋅ T ⋅ ln m B Ec. 274
donde ?B es la constante de disociación de la sal, ?± es un coeficiente de
disociación iónico medio, ?± es el coeficiente iónico medio de la sal, y mB
es la molalidad de la sal.
Una variación infinitesimal de µB a temperatura y presión constantes
es:
dµ B = R ⋅ T ⋅ν B ⋅ (d ln γ ± + d ln m B ) Ec. 275
Antes de sustituir las expresiones de las variaciones de los
potenciales químicos, vamos a manipular la ecuación de Gibbs-Duhem:
a) Dividimos la ecuación de Gibbs-Duhem entre el número de
moles de disolvente nA:
dµ A +
nB
⋅ dµ B = 0 Ec. 276
nA
209
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
b) Expresamos el cociente nB / nA en función de la molalidad de
la sal mB:
mB =
nB
=
WA
nB
M
nA ⋅ A
1000
⇒
nB
M
= m B ⋅ A Ec. 277
1000
nA
donde nA , nB son los moles de agua y sal (ClNa)
respectivamente, MA es el peso molecular del agua y WA es la
masa de agua expresada en kilogramos.
c) Sustituimos en la ecuación de Gibbs-Duhem:
dµ A + m B ⋅
MA
⋅ dµ B = 0 Ec. 278
1000
Ahora sustituimos los valores de las variaciones infinitesimales de los
potenciales químicos:
0 = R ⋅ T ⋅ d ln a A + m B ⋅
MA
⋅ R ⋅ T ⋅ν B ⋅ (d ln γ ± + d ln m B )
1000
M ⋅ν ⋅ m
d ln a A = − A B B ⋅ (d ln γ ± + d ln m B )
1000
Ec. 279
Ø Paso 2: integramos la actividad del disolvente.
ln a A = −
(
)
M A ⋅ν B
⋅ ∫ m B d ln γ ± + ∫ m B d ln m B + CTE Ec. 280
1000
o Resolución de la integral
∫m
B
∫m
B
⋅ d ln γ ±
⋅ d ln γ ± = ∫ d (m B ⋅ ln γ ± ) − ∫ ln γ ± dm B = m B ⋅ ln γ ± − ∫ ln γ ± dm B Ec. 281
Para resolver la integral de ln?±·dmB debemos expresar el
coeficiente de actividad de la sal (ClNa), en función de la
molalidad de la sal.
Es ahora cuando aplicamos la teoría de Debye-Huckel, que
me permite relacionar el coeficiente de actividad de un
electrolito fuerte con la temperatura del sistema y su molalidad:
1
ln γ ± = − z + ⋅ z − ⋅
A(T ) ⋅ I m 2
1
1 + a ⋅ B(T ) ⋅ I m 2
Ec. 282
210
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
donde z+ es la carga del ión positivo de la sal, z- es la carga
del ión negativo, A(T) y B(T) son parámetros del modelo que
dependen de la naturaleza del disolvente, en nuestro caso
agua, y de la temperatura del sistema, a es el diámetro iónico
medio de la sal, y Im es la fuerza iónica en la escala de
molalidades, cuya expresión es:
Im =
1
∑ mi ⋅ z i2 Ec. 283
2
donde mi es la molalidad de las especies disueltas, y zi es la
carga eléctrica de las especies disueltas.
Vamos a particularizar la ecuación del modelo de DebyeHuckel para el caso de una disolución acuosa de cloruro
sódico.
El cloruro sódico se disocia por completo en disolución, para
dar únicamente iones sodio, e iones cloro, es decir, no se
forman pares iónicos:
ClNa ⇒ Cl − + Na +
Por lo tanto, los parámetros del modelo de la teoría de DebyeHuckel quedan:
z+ = 1
z− = 1
Ec. 284
m Na + = mCl − = mClNa = m B
Sustituyendo Ec284 en Ec283, la fuerza iónica será:
Im =
(
)
(
)
1
1
1
2
mi ⋅ z i2 = m Na + ⋅ z Na
⋅ z Cl2 − = m B ⋅ 12 + m B ⋅ 12 = m B
+ + m
∑
Cl −
2
2
2
Ec. 285
Llevando Ec285 a Ec282 tenemos que el coeficiente de
actividad de la sal es:
lnγ ± = −
A(T ) ⋅ m B
1 + a ⋅ B(T ) ⋅ m B
Ec. 286
Ahora tan sólo queda obtener los valores de a, A(T), B(T):
211
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
1) Diámetro iónico medio a.
a = 2 ⋅ Radio Iónico Medio
a = 2⋅
Radio Iónico Cl − + Radio Iónico Na +
2
o
Ec. 287
o
o
o
1.81 Α + 0.95 Α
a = 2⋅
= 2 ⋅ 1.38 Α = 2.76 Α = 276 ⋅ 10 −12 m
2
A(T ) = (2π ⋅ N A ⋅ ρ A )
1
2


e2

⋅ 

π
⋅
ε
⋅
ε
⋅
k
⋅
T
4
r
A
0
,


1
Kg 

α =  2π ⋅ 6.022 ⋅ 10 23
⋅ 10 3 3 
mol
m 

1
2
3
2
= α ⋅T
= 6057.3147
1
2
⋅K
mol
1
3
2
3
2
= Ec. 289
2
2
 2⋅ NA ⋅ ρA 

B(T ) = e ⋅ 

ε
⋅
ε
⋅
k
⋅
T
0
r
,
A


1
2
= β ⋅T
−1
2
Ec. 290


Kg
1


⋅ 10 3 3
2 ⋅ 6.022 ⋅ 10 23
mol
m

β = 1.602 ⋅ 10 −19 C ⋅ 
2

J 
−12 C
⋅ 78.38 ⋅ 1.38066 ⋅ 10 − 23 
 8.85 ⋅ 10
J ⋅m
K

= 56.8107 ⋅ 10
9
Kg
1
2
mol
⋅K
1
2
Ec. 288
⋅




−19 2
2
(1.602 ⋅ 10 ) C


⋅
2


−12 C
− 23 J
⋅ 78.38 ⋅ 1.38066 ⋅ 10
 4π ⋅ 8.85 ⋅ 10

J ⋅m
K

Kg
−3
1
1
2
=
Ec. 291
2
⋅m
Aplicando los resultados obtenidos a partir de la teoría de
Debye-Huckel la integral del segundo miembro de Ec281
queda:
∫ lnγ
±
⋅ dm B = ∫ −
A(T ) ⋅ m B
1 + a ⋅ B (T ) ⋅ m B
dm B Ec. 292
Las variables T
y mB
son termodinámicamente
independientes, es decir, a partir de la temperatura no puedo
conocer la concentración de la sal en mi sistema, y viceversa.
212
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Por lo tanto, en la integral, la temperatura actúa como un
parámetro de integración:
Aplicamos un cambio de variable en Ec292:
u = 1 + a ⋅ B(T ) ⋅ m B Ec. 293
Tomando la diferencial de Ec293, teniendo en cuenta que la
temperatura es un parámetro:
du = a ⋅ B(T ) ⋅ d m B Ec. 294
Sustituyendo en la expresión Ec292 tengo:
u
u2
2⋅u
2 ⋅ A(T )
a ⋅ B (T )
⋅
=
−
⋅
⋅
du
=
−
du
ln
γ
dm
A
(
T
)
∫ ± B
∫ 1 + u a 2 ⋅ B 2 (T )
a 3 ⋅ B 3 (T ) ∫ 1 + u
Ec. 295
Para resolver la integral en Ec295 aplicamos la integración por
partes:
u2
u ⋅ du
∫ 1 + u du = ∫ u ⋅ 1 + u
x=u
⇒ dx = du
u ⋅ du
dy =
⇒ y = u − ln(1 + u )
1+ u
Ec. 296
Sustituyendo:
u2
∫ 1 + u du = u ⋅ (u − ln(1 + u) ) − ∫ (u − ln(1 + u))du =
= u 2 − u ⋅ ln(1 + u ) − ∫ u ⋅ du + ∫ ln(1 + u )du =
= u 2 − u ⋅ ln(1 + u ) −
=
u2
+ ((1 + u ) ⋅ ln(1 + u ) − (1 + u ) ) =
2
Ec. 297
u2
+ ln(1 + u ) − (1 + u )
2
Deshaciendo el cambio de variables Ec292 queda:
213
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
(
)

 a ⋅ B(T ) ⋅ m 2
B
2 ⋅ A(T ) 
+ ln 1 + aB(T ) m B − 
 Ec. 298
2
∫ ln γ ± dmB = − a 3 ⋅ B 3 (T ) ⋅ 

 − 1 + aB(T ) m
B


(
)
(
)
Finalmente, la integral que estábamos calculando(Ec281),
queda:
∫m
B
 − A(T ) m B
d ln γ ± = m B ⋅ 
 1 + a ⋅ B (T ) m
B

(
)

−



 a ⋅ B(T ) ⋅ m 2

B



+

 Ec. 299

2


2 A(T )

− − 3 3
⋅  + ln 1 + a ⋅ B(T ) ⋅ m B − 
a ⋅ B (T ) 


 − 1 + a ⋅ B (T ) ⋅ m B







(
(
)
o Resolución de la integral
∫m
B
d ln m B = ∫ m B
∫m
B
)
d ln m B
dm B
= m B Ec. 300
mB
Ø Paso 3: la expresión final de la actividad del disolvente es:
 A(T )m B m B

+
−

 1 + a ⋅ B(T ) m B



 aB(T ) m 2
 

B


+


 
2

 
M ⋅ν
2 A(T ) 
ln a A = − A B  + 3 3
+
ln(
1
+
(
)
)
−
aB
T
m

 +  + CTE Ec. 301
B
1000  a B (T ) 
 

−
(
1
+
(
)
)
aB
T
m
B

 


 

 

+ m

B






(
)
Ø Paso 4: determinación de la constante de integración CTE.
Si particularizamos la ecuación de la actividad del disolvente
(Ec301)a una temperatura conocida Tref entonces, tanto la actividad aA
del disolvente, como la molalidad del soluto mB, quedan definidas:
214
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
a A, ref = x A, ref ⋅ γ A,ref = x A,ref ⋅ γ A (Tref )
x A,ref =
m B , ref =
V (Tref ) − n BVB∞
Ec. 302
V (Tref ) − n BVB∞ + ν B n BV A*
nB
ρ A V (Tref ) − n BV B∞
(
)
El valor de la constante de integración será:
 A(Tref )m B ,ref m B ,ref


−
+

 1 + a ⋅ B(Tref ) m B ,ref


2
 aB(T ) m
 

ref
B , ref

 

+

 
2


 
2
A
(
T
)
M ⋅ν 
ref
+ A B + 3 3
 + ln(1 + aB(Tref ) m B ,ref ) −  +  Ec. 303
1000
a B (Tref ) 
 

(
1
aB
(
T
)
m
)
−
+

 
ref
B , ref


 


 


+ m B ,ref




(
CTE = ln a A,ref
)
El valor del coeficiente de actividad a la temperatura de referencia en
Ec303 lo determinaremos a partir de la expresión de la curva de
descenso crioscópico. La expresión de la curva de descenso crioscópico,
para el caso particular del agua, era de la forma
∆H m* , fus , A (T )
T
ln (γ A ⋅ x A ) =
∫
273
R ⋅T
dT Ec. 304
Despejando el coeficiente de actividad, y particularizándolo para la
temperatura de referencia Tref tenemos:
γ A (Tref ) =
1
x A,ref
Tref
∫
273
∆H m* , fus , A (T )
R ⋅T
dT Ec. 305
siendo Tref la temperatura a la cual conozco el descenso crioscópico
?Tref =273-Tref .
La expresión del calor latente de fusión del hielo que vamos a emplear
es el que aplicamos en el caso del modelo teórico ideal, que recordamos
(Ec204) que era de la forma:
215
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
∆H m* , fus , A (T ) = a + b ⋅ (T − α ) − c ⋅ (T − α ) 2 + d ⋅ (T − α )3 Ec. 306
donde
a=6004.8 J / mol
b=38.016 J / mol·K
c=0.11088 J / mol·K2
d=0.00090432 J / mol·K3
a=273.15 K
Integrando Ec306 y sustituyendo en Ec305 obtenemos el valor de el
coeficiente de actividad a la temperatura de referencia Tref:
 a − b ⋅α − c ⋅α 2 − d ⋅α 3  1
1 
⋅
−
+

 273 T 
R

ref 


2
1
+ b + 2 ⋅ α ⋅ c + 3 ⋅ α ⋅ d ⋅ ln Tref −
γ A (Tref ) =
273
R
x A (Tref ) 
 c + 3 ⋅ α ⋅ ⋅d
d
2
−
⋅ (Tref − 273) +
⋅ Tref − 273 2
2⋅ R

R

(




 Ec. 307





)
Ø Paso 5: sustituyendo Ec307 en Ec303 y ésta en Ec301 finalmente la
expresión de la ecuación que describe la deshidratación celular en el
caso de considerar a la solución intracelular una solución diluida no ideal
resulta ser:






 T
L (T )
M ⋅ν
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T 
=
⋅  ∫ F 2 dT + A B
*
dT
1000
V A ⋅ F (T )
273.15 R ⋅ T







 A(T )m B m B

+

−


 1 + aB(T ) m B




2
 aB(T ) m
 


B


+





2

 2 A(T ) 





⋅ + 3 3
⋅  + ln 1 + aB (T ) m B −  + − CTE 
 a B (T ) 

 

1
(
)
−
+
aB
T
m
B


 


 


 


+ m


B








(
)
(
(
)
)
Ec. 308
Para poder resolver la ecuación Ec308 necesitaremos expresar las
molalidades en función del volumen de disolución dentro de la célula:
216
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
mB =
nB
ρ A ⋅ V (T ) − n B ⋅ VB∞
(
)
Ec. 309
donde nB es el número de moles de sal presentes en la solución
intracelular, ?A es la densidad másica del agua, V(T) es el volumen de
disolución dentro de la célula, y VB8 es el volumen molar a dilución
infinita de la sal.
217
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.3. LA CURVA DE EQUILIBRIO NO IDEAL
Al igual que en el caso del modelo teórico ideal, la curva de Equilibrio
describe la evolución de la composición del medio intracelular, cuando es
enfriado a una velocidad infinitamente lenta. De esta manera el medio
intracelular evolucionaría por sucesivos estados de equilibrio.
A la diferencia entre la temperatura del medio intracelular y a la que tendría
si evolucionara por sucesivos estados de equilibrio, se denomina
subenfriamiento.
La ecuación de la curva de equilibrio describe la evolución del medio
extracelular, mientras que la ecuación de Deshidratación no ideal que hemos
deducido anteriormente describe la evolución del medio intracelular.
Al igual que en el caso del modelo teórico ideal, para imponer la condición
de equilibrio termodinámico entre el medio extracelular e intracelular, tan sólo
necesitamos imponer una condición de equilibrio difusivo, puesto que el
equilibrio mecánico y térmico se satisfacen en todo momento.
El equilibrio difusivo lo imponemos mediante la igualdad de presiones de
vapor:
P ex (T ) = P in (T ) Ec. 310
donde Pex(T) es la presión de vapor del medio extracelular, y Pin (T) es la
presión de vapor del medio intracelular.
Como ya justificamos anteriormente, la presión de vapor de la solución
extracelular es aproximadamente igual a la presión de vapor del hielo que se
ha formado:
P ex (T ) ≈ PA*, s (T ) Ec. 311
La presión de vapor de la solución intracelular es aproximadamente igual a
la presión de vapor del agua en la solución, multiplicada por la actividad del
agua en la solución intracelular:
P in (T ) ≈ PA*,l (T ) ⋅ a A Ec. 312
Aplicando Clausius-Clapeyron calculo las variaciones de la presión de vapor
del hielo y del agua líquida con la temperatura:
218
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
 T L (T ) 
PA*,l (T ) = PA*,l (T0 ) ⋅ exp ∫ V 2 dT 
T R ⋅T

0

Ec. 313
T
 LS (T ) 
*
*
dT 
PA, s (T ) = PA, s (T0 ) ⋅ exp ∫
T R ⋅T 2

0

La igualdad de presiones de vapor toma la forma:
aA =
PA*, s (T )
PA*,l (T )
=
 T LF (T ) 

⋅
exp
dT  Ec. 314
 T∫ R ⋅ T 2

PA*,l (T0 )
0

PA*, s (T0 )
donde LF(T) es el calor latente de fusión.
Elegimos T0 = 273.15K ( esa temperatura cumple la igualdad de presiones
de vapor del hielo y del agua líquida pura), quedando la expresión de la
actividad como sigue:
 T L (T ) 
a A = exp ∫ F 2 dT  Ec. 315
 273.15 R ⋅ T

Tomando logaritmos neperianos a ambos lados de la igualdad tenemos:
T
ln a A =
LF (T )
dT Ec. 316
2
273.15 R ⋅ T
∫
Sustituyendo la expresión de la actividad del disolvente (Ec301) tenemos la
ecuación de la Curva de Equilibrio en función de la molalidad del soluto:
 A(T )m B m B

+
−

 1 + a ⋅ B (T ) m B



2
 aB (T ) m
 

B


+


 
2
T
 
M A ⋅ν B  2 A(T ) 
LF (T )
−
+
+
aB
T
m
−
+
CTE
dT
ln(
1
(
)
)
+
=
+ 3 3

B


2
∫
1000  a B (T ) 
R
T
⋅

273
.
15


 − (1 + aB (T ) m B )
 


 

 

+ mB





(
)
Ec. 317
219
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Para obtener la expresión de la curva de equilibrio en función de el volumen
de disolución dentro de la célula, tengo que relacionar la molalidad de soluto
con dicha variable:
mB =
nB
ρ A ⋅ V (T ) − n B ⋅ VB∞
(
)
Ec. 318
donde nB es el número de moles de sal presentes en la solución intracelular,
?A es la densidad másica del agua, V(T) es el volumen de disolución dentro de
la célula, y VB8 es el volumen molar a dilución infinita de la sal.
220
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.4. PARTICULARIZACIÓN DE LAS ECUACIONES DEL MODELO NO IDEAL
8.4.1 INTRODUCCIÓN
Al igual que cuando planteábamos la ecuación de deshidratación del
modelo ideal, cuando aquí planteamos la ecuación de deshidratación del
modelo no ideal, la ley de enfriamiento quedó definida de forma arbitraria,
mediante la función F(T). Esta función, recordamos que era la derivada primera
con respecto al tiempo, de la ley de enfriamiento.
F (T ) =
dT
Ec. 319
dt
En este apartado vamos a obtener expresiones de la función F(T), para
distintas leyes de enfriamiento. Aunque se pueden plantear infinidad de estas
leyes, nosotros sólo vamos a contemplar tres:
Ø Ley de enfriamiento lineal
Ø Ley de enfriamiento cuadrática
Ø Ley de enfriamiento exponencial
221
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.4.2 LEY DE ENFRIAMIENTO LINEAL
El perfil de enfriamiento lineal, es con diferencia la ley de enfriamiento más
empleada en criopreservación.
La expresión matemática de un enfriamiento lineal es de la forma(apartado
6.4.2):
T (t ) = − B ⋅ t + T0 Ec. 320
donde T0 es la temperatura inicial del sistema, que al igual que en el caso
ideal es 273K, y B es una constante que permite parametrizar la familia de
perfiles de enfriamiento lineales.
La función F(T) es:
F (T ) =
dT
= − B Ec. 321
dt
Sustituyendo esta expresión en la ecuación diferencial de la deshidratación
celular(Ec308), obtenemos:






 T L (T )
⋅
⋅
⋅
L
T
A
R
T
(
)
M ⋅ν
dV
g
⋅  ∫ F 2 dT + A B
=
*
dT
1000
⋅
V A ⋅ (− B)
R
T
273.15







 A(T )m B m B

+

−


 1 + aB(T ) m B




2
 aB(T ) m
 


B


+





2

 2 A(T ) 


⋅ + 3 3
⋅  + ln 1 + aB(T ) m B −  +  − CTE 
 a B (T ) 

 


 − 1 + aB(T ) m B
 


 






+ m B








(
)
(
(
)
)
Ec. 322
222
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.4.3 LEY DE ENFRIAMIENTO CUADRÁTICA
La expresión matemática de un enfriamiento cuadrático es de la
forma(apartado 6.4.3):
1
T (t ) = T0 − k1 ⋅ t − k 2 ⋅ t 2 Ec. 323
2
donde T0 es la temperatura inicial del sistema, igual a 273K, k1 recordamos
que, al igual que en el caso ideal, era la velocidad inicial de enfriamiento, y k2
era la aceleración constante con la que se produce la disminución de la
temperatura del sistema.
La función F(T) es :
F (T ) = − k12 + 2 ⋅ k 2 ⋅ (T0 − T ) Ec. 324
La ecuación de la deshidratación celular, cuando el sistema está sometido a
un enfriamiento cuadrático, se obtiene sustituyendo Ec324 en Ec308:






 T L (T )
L
T
⋅
A
⋅
R
⋅
T
(
)
M ⋅ν
dV

g
=
⋅  ∫ F 2 dT + A B
dT V A* ⋅ (− k12 + k 2 ⋅ (T0 − T ) ) 273.15 R ⋅ T
1000







 A(T )m B m B

+

−


 1 + aB(T ) m B




2
 aB(T ) m
 


B


+





2

 2 A(T ) 



⋅ + 3 3
⋅  + ln 1 + aB(T ) m B −  +  − CTE 
a
B
(
T
)



 


 − 1 + aB(T ) m B
 


 


 


+ m B








(
)
(
(
)
)
Ec. 325
223
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.4.4 LEY DE ENFRIAMIENTO EXPONENCIAL
La expresión matemática de un enfriamiento exponencial es (apartado
6.4.4):

t
T (t ) = T0 ⋅ exp − k ⋅
T0


 Ec. 326

donde T0 es la temperatura del sistema, igual a 273K, y k es una constante
que permite parametrizar la familia de perfiles de enfriamiento exponenciales.
La función F(T) es:
F (T ) =
dT
T
= −k ⋅
Ec. 327
dt
T0
Sustituyendo la Ec327 en la ecuación Ec308 obtenemos:






T
L (T )
M ⋅ν
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T 
=
⋅  ∫ F 2 dT + A B
T
dT
1000
R ⋅T
V A* ⋅ (−k ⋅ ) 273.15

T0






 A(T )m B m B

+

−


 1 + aB(T ) m B




 aB(T ) m 2
 


B


+





2

 2 A(T ) 
 

⋅ + 3 3
⋅  + ln 1 + aB(T ) m B −  +  − CTE 
 a B (T ) 

 


 − 1 + aB(T ) m B
 


 


 


+ m B








(
)
(
(
)
)
Ec. 328
224
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.5. MODELO DE DESHIDRATACIÓN A TEMPERATURA CONSTANTE
Como ya se ha comentado anteriormente es una práctica habitual en los
protocolos de criopreservación el mantener las muestras a temperatura
constante durante un cierto periodo de tiempo, para a continuación continuar
enfriando el sistema.
Lo que pretendemos en este apartado es obtener la ecuación diferencial
que permita modelar la deshidratación celular cuando sometemos la muestra a
un periodo de temperatura constante.
La ecuación que va a describir la deshidratación celular en una etapa a
temperatura constante va a ser igual a la que empleábamos para describir la
deshidratación durante un enfriamiento(Ec308), salvo que ahora la variable
independiente no va a ser la temperatura, puesto que va a permanecer
constante, sino el tiempo.
dV L g (TCTE ) ⋅ A ⋅ R ⋅ TCTE
=
dt
V A*






 TCTE L (T )
M ⋅ν

⋅  ∫ F 2 dT + A B
1000
R
⋅
T
273.15







 A(TCTE )m B m B

+

−


 1 + aB(TCTE ) m B




2
 aB(T ) m
 


CTE
B


+





2

 2 A(T ) 



⋅ + 3 3 CTE ⋅  + ln 1 + aB (TCTE ) m B −  +  − CTE 
a
B
T
(
)

CTE


 


 − 1 + aB(TCTE ) m B
 


 






+ m B








(
)
(
(
)
)
Ec. 329
En esta ecuación la temperatura no es una variable, sino una constante, la
temperatura constante a la cual mantenemos la muestra durante un cierto
periodo de tiempo.
Para expresar la ecuación de deshidratación en función del volumen de
disolución intracelular empleamos la siguiente ecuación que relaciona la
molalidad del soluto con el volumen de disolución intracelular:
mB =
nB
ρ A ⋅ V (T ) − n B ⋅ VB∞
(
)
Ec. 330
donde nB es el número de moles de sal presentes en la solución intracelular,
?A es la densidad másica del agua, V(T) es el volumen de disolución dentro de
la célula, y VB8 es el volumen molar a dilución infinita de la sal.
225
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.6. OBTENCIÓN DE LAS LEYES IDEALES A PARTIR DE LAS NO IDEALES
8.6.1 INTRODUCCIÓN
Las ecuaciones que hemos obtenido para el modelo no ideal de
deshidratación deben servir para describir el proceso de deshidratación ideal,
puesto que este es un caso particular de aquel.
Por lo tanto una manera de comprobar que las ecuaciones del modelo no
ideal son correctas, es que a partir de ellas, podamos deducir las ecuaciones
clásicas del modelo de deshidratación ideal, imponiendo alguna condición de
idealidad.
Los pasos que vamos a seguir para comprobar la validez de las ecuaciones
del modelo no ideal serán:
Ø Determinación de la condición de idealidad.
Ø Sustitución de la condición de idealidad en la ecuación del modelo
no ideal.
Ø Comparación de la ecuación del modelo no ideal( con la condición
de idealidad), con las ecuaciones del modelo ideal.
226
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.6.2 DETERMINACIÓN DE LA CONDICIÓN DE IDEALIDAD
Para intentar obtener una condición de idealidad, vamos primero a
comparar las ecuaciones del modelo ideal y no ideal.
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dt
V A*
 T L (T )

⋅  ∫ F 2 dT − ln x A  Modelo Ideal
 273.15 R ⋅ T

Ec. 331
T

LF (T )
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T 
=
⋅  ∫
dT − ln a A  Modelo No Ideal
2
dt
V A*
 273.15 R ⋅ T

donde xA es la fracción molar de soluto en la solución intracelular, y aA es la
actividad del soluto en la solución intracelular.
Puesto que aA=γA·xA , haciendo γA=1, obtengo la ley ideal a partir de la ley
no ideal. La ley de deshidratación no ideal la tengo expresada en función de los
parámetros de la teoría de Debye-Huckel, A(T), y B(T). ¿Cómo afecta el que
γA=1 a los parámetros de la teoría de Debye-Huckel?
Si a la disolución no ideal le aplicamos la ecuación de Gibbs-Duhem, a
temperatura y presión constante tenemos:
d ln a A = −
M A ⋅ν B ⋅ m B
⋅ (d ln γ ± + d ln m B ) Ec. 332
1000
Si a la disolución ideal, le aplicamos la misma ecuación, tenemos:
d ln x A = −
M A ⋅ν B ⋅ m B
⋅ (d ln m B ) Ec. 333
1000
Comparando ambas ecuaciones, vemos que haciendo γ± =1 entonces la
actividad coincide con la fracción molar de disolvente en la disolución
intracelular, es decir, que se cumple que γA=1.
Por lo tanto imponer que γA=1 es análogo a imponer que γ± =1.
¿Cómo afecta el que γ± =1 a los parámetros de la teoría de Debye-Huckel?
La expresión de el coeficiente de actividad iónico medio, obtenido a partir de
la teoría de Debye-Huckel era de la forma(apartado I-7):
lnγ ± = −
A(T ) ⋅ m B
1 + a ⋅ B(T ) ⋅ m B
Ec. 334
Si imponemos que γ± =1 en la expresión anterior, llegamos a que A(T)=0.
227
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Por lo tanto, la condición de idealidad que me permitiría obtener la ley de
deshidratación ideal, a partir de la no ideal, es imponer que el parámetro del
modelo de Debye-Huckel A(T), sea nulo para todas las temperaturas.
228
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.6.3 SUSTITUCIÓN DE LA CONDICIÓN DE IDEALIDAD EN LA ECUACIÓN DEL MODELO NO
IDEAL
La expresión de la ecuación de deshidratación del modelo no ideal, era de
la forma(Ec308)






 T
L (T )
M ⋅ν
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T 
=
⋅  ∫ F 2 dT + A B
*
1000
dT
V A ⋅ F (T )
273.15 R ⋅ T







 A(T )m B m B

+

−


 1 + aB(T ) m B




2
 aB(T ) m
 


B


+





2

 2 A(T ) 



⋅ + 3 3
⋅  + ln 1 + aB(T ) m B −  +  − CTE 
 a B (T ) 

 


 − 1 + aB(T ) m B
 


 


 


+ m


B








(
)
(
(
)
)
Ec. 335
donde la expresión de la constante de integración tenía la forma(Ec303):
 A(Tref )m B ,ref m B ,ref

−

+
 1 + a ⋅ B(Tref ) m B ,ref



2
 aB(T ) m
 

ref
B , ref

 

+

 
2


 
2
A
(
T
)
M ⋅ν 
ref
+ A B + 3 3
 + ln(1 + aB(Tref ) m B ,ref ) −  + 
1000
a B (Tref ) 
 

(
1
aB
(
T
)
m
)
−
+

 
ref
B , ref


 


 

+ m B ,ref





(
CTE = ln a A,ref
)
Ec. 336
Si imponemos la condición de idealidad, de hacer nulo el parámetro A(T)
deberíamos obtener las ecuaciones del modelo de deshidratación no ideal. Si
sustituimos A(T)=0 en Ec335:
T

L F (T )
M ⋅ν
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T 
=
⋅
dT + A B ⋅ [m B ] − CTE 0  Ec. 337

∫
*
2
dT
1000
V A ⋅ F (T )
273.15 R ⋅ T

donde CTE0 es el valor de la constante de integración, imponiéndole la
condición de idealidad(sustituimos A(T)=0 en Ec336):
229
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
CTE 0 = ln a A, ref +
M A ⋅ν B
m B ,ref
1000
[
]
Ec. 338
230
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
8.6.4 COMPARACIÓN DE LAS ECUACIONES DEL MODELO IDEAL, CON LA CONDICIÓN DE
IDEALIDAD, CON LAS ECUACIONES DEL MODELO IDEAL
Para poder comparar las ecuaciones del modelo no ideal, con las del
modelo ideal, una vez que se ha aplicado la condición de idealidad, primero
debemos expresar la ecuación del modelo no ideal, en función del volumen de
la disolución intracelular.
La expresión de la ecuación del modelo no ideal, con la condición de
idealidad es de la forma:
T

LF (T )
M ⋅ν
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T 
=
dT + A B ⋅ [m B ] − CTE 0  Ec. 339
⋅

∫
*
2
dT
1000
V A ⋅ F (T )
273.15 R ⋅ T

La ecuación que relaciona la molalidad del soluto disuelto en la disolución
intracelular, mB, con el volumen de disolución intracelular es de la forma:
mB =
nB
ρ A ⋅ V (T ) − n B ⋅ VB∞
(
)
Ec. 340
donde nB es el número de moles de sal presentes en la solución intracelular,
?A es la densidad másica del agua, V(T) es el volumen de disolución dentro de
la célula, y VB8 es el volumen molar a dilución infinita de la sal.
Sustituyendo la expresión de la molalidad en la ecuación de deshidratación,
y teniendo en cuenta que 1 ⁄ρA=V*A·(1000 / MA) , donde ρA es la densidad del
disolvente en Kg ⁄ m3, V*A es el volumen molar del disolvente en m3 ⁄ mol, y MA
es el peso molecular del disolvente en gramos ⁄ mol, tenemos:
T

L F (T )
ν B ⋅ n B ⋅ V A*
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T 
=
⋅
dT
+
− CTE 0  Ec. 341

∫
*
2
∞
dT
V A ⋅ F (T )
V (T ) − n B ⋅V B
273.15 R ⋅ T

Haciendo lo mismo con la expresión de la constante de integración
tenemos:
CTE 0 = ln a A,ref +
ν B ⋅ n B ⋅ V A*
Ec. 342
V (Tref ) − n B ⋅ VB∞
La expresión de la ley de deshidratación ideal, era de la forma:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dT
V A* ⋅ F (T )
 T L (T )

V − n B ⋅ V B∞
 Ec. 343
⋅  ∫ F 2 dT − ln
* 
∞
V − nB ⋅ VB + ν B ⋅ n B ⋅ V A 
 273.15 R ⋅ T
231
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Una primera impresión nos dice que no hemos podido deducir la ley ideal, a
partir de la no ideal. Sin embargo vamos a demostrar que esto no es así, y para
ello vamos a hacer uso de la hipótesis simplificatoria, que asumía que la
disolución estaba diluida.
Antes de aplicar esta hipótesis vamos a rescribir la expresión de la fracción
molar del disolvente(Ec202):
ln x A = ln
 ν B ⋅ n B ⋅ V A*
V − n B ⋅ V B∞
1 +
=
−
ln
∞
V − n B ⋅ VB∞ + ν B ⋅ n B ⋅ V A*
 V − nB ⋅ VB

 Ec. 344

Si la solución está diluida entonces:
ν B ⋅ n B ⋅ V A*
<< 1 Ec. 345
V − n B ⋅ V B∞
y entonces podemos escribir:
 ν ⋅ n ⋅V *
− ln x A = ln1 + B B A∞
 V − n B ⋅ VB
 ν B ⋅ n B ⋅ V A*
 ≈
Ec. 346
∞
 V − n B ⋅ VB
Sustituyendo esta aproximación en la ley de deshidratación ideal(Ec343),
tenemos:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dT
V A* ⋅ F (T )
 T L (T )
ν ⋅ n ⋅V *
⋅  ∫ F 2 dT + B B A∞
V − nB ⋅ VB
 273.15 R ⋅ T

 Ec. 347


Esta ley tan solo difiere en una constante, con respecto a la ley obtenida a
partir de la ley de comportamiento no ideal.
Vamos a comprobar que la constante CTE0 es nula, cuando le aplicamos la
hipótesis de disolución diluida:
CTE = ln x A,ref
0
ν B ⋅ n B ⋅ V A*
+
V (Tref ) − n B ⋅ VB∞
solucion
diluida
= ln x A,ref + ln x A (Tref ) = ln x A,ref + ln x A, ref = 0
Ec. 348
Por lo tanto llegamos a la conclusión, de que la ley de deshidratación no
ideal permite estudiar el caso ideal, siempre bajo la condición de disolución
diluida.
232
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
IV-9. RESOLUCIÓN NUMÉRICA DE LAS ECUACIONES DEL MODELO NO
IDEAL
9.1. INTRODUCCIÓN
En este apartado vamos a resolver las ecuaciones diferenciales de la
deshidratación celular, que planteamos en el apartado anterior, mostrando las
soluciones en forma de gráficos.
En este apartado, sin embargo el fin último de calcular la solución numérica
de las ecuaciones no ideales, no va a ser dibujar la evolución gráfica de la
deshidratación, sino comparar las soluciones del modelo ideal, con las
soluciones del modelo no ideal.
Si las soluciones difieren mucho entonces debemos volver a trazar todos los
gráficos que obtuvimos en el apartado 7 de Resolución Numérica de las
Ecuaciones del Modelo Ideal, incluían además de la deshidratación, la
evolución del subenfriamiento, el flujo osmótico, etc.
Por el contrario si las soluciones son razonablemente parecidas, no se
volverán a calcular todos los gráficos del apartado 7, pero empleando las
ecuaciones no ideales, y además todos los puntos nuevos que desarrollemos a
partir de ese momento, se llevarán a cabo empleando las ecuaciones del
modelo ideal, por la mayor comodidad que tiene manejar unas ecuaciones más
sencillas.
Los perfiles de enfriamiento que empleemos serán análogos a los
empleados en el apartado 7 de Resolución Numérica de las Ecuaciones del
Modelo Ideal.
233
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
9.2. CURVAS DE DESHIDRATACIÓN PARA ESPERMATOZOIDES DE RATÓN
9.2.1 DATOS FÍSICOS
Para poder resolver las ecuaciones de deshidratación y de equilibrio,
necesitamos conocer una serie de datos físicos, referentes a la célula que
estemos considerando, en nuestro caso, espermatozoides de ratón.
La ecuación de deshidratación que pretendemos resolver, con el
programa MATLAB es:






 T
M ⋅ν
L F (T )
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T 
⋅
=
dT + A B
 ∫
*
2
dT
1000
V A ⋅ F (T )
273.15 R ⋅ T







 A(T )m B m B


+
−


 1 + aB(T ) m B




2
 aB(T ) m
 


B


+





2

 2 A(T ) 



⋅  + ln 1 + aB(T ) m B −  +  − CTE 
⋅ + 3 3
 a B (T ) 
 


 − 1 + aB(T ) m B
 



 



 

+ m


B








(
)
(
(
)
)
Si analizamos la ecuación anterior, comprobaremos que no se requieren
datos físicos adicionales referentes a la célula, con respecto a los ya
proporcionados en el apartado 7.3.1 , para poder abordar la resolución
numérica de la ecuación no ideal.
La única información adicional que es necesario conocer, con respecto al
caso ideal, son los parámetros del modelo de Debye-Huckel, a, A(T) y B(T),
que ya fueron obtenidos en el apartado 8.2, y que son válidos para cualquier
tipo de célula, siempre y cuando la sal que consideremos sea cloruro
sódico.
234
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
9.2.2 PROGRAMACIÓN EN MATLAB DE LAS ECUACIONES DIFERENCIALES
En este apartado tan sólo vamos a mostrar el programa que describe la
ecuación diferencial de la deshidratación del modelo no ideal. Con la
descripción que se hizo del programa que modelaba la ecuación diferencial
de la deshidratación del modelo ideal, en el apartado 7.3.2, es suficiente
para comprender este programa.
El programa que describe en lenguaje MATLAB la ecuación de
deshidratación, por ejemplo para el caso de un perfil de enfriamiento lineal
es:
function
varargout=enfr_NOid_integrado(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vm
cpa)
if nargin<12 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL.
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
case 'events'
[varargout{1:3}]=events(t,y,Vi);
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[273 190];
y0=[3.1629*1e-17];%CASO MOUSE SPERM
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
MA=18;
R=8.3143;
SLf=integralLf(t);
Lg=(Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5));
VmA=18*1e-6;
v2=2;
Vm2=2.69611*1e-5;
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);
roA=1000;
a=276*1e-12;
alfa=6057.3147;
beta=56.81071417*1e9;
AT=alfa*t^(-1.5);
BT=beta*t^(-.5);
m2=n2/(roA*(y-Vsol));
mcpa=ncpa/(roA*(y-Vsol));
aux=(1+a*BT*sqrt(m2));
aux0=(Lg*A*R*t/(VmA*B));
sum1=(-AT*m2*sqrt(m2)/aux);
sum2=(2*AT/(a^3*BT^3))*(.5*(aux-1)^2+log(aux)-aux);
CTE=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa);
dydt=[aux0*(SLf+.001*MA*v2*(sum1+sum2+m2+mcpa/v2)-CTE)];
235
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
El programa CTEintegrar que modela el valor de la constante de
integración de la ecuación de deshidratación del modelo no ideal, es:
function y=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa)
if nargin<8 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL.
end
if nargin<7 | isempty(ncpa)
ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector
end
VmA=18*1e-6;roA=1000;MA=18;
v2=2;
Vm2=2.69611*1e-5;
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);
a=276*1e-12;
alfa=6057.3147;
beta=56.81071417*1e9;
Vref=Vi;
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa,Vmcpa);
V0=y0./Vi;
Tref=interp1(V0,t0,1);
xAref=(Vref-Vsol)/(Vref-Vsol+VmA*(v2*n2+ncpa));
SLfref=integralLf(Tref);
gammaref=1/xAref*exp(SLfref);
aAref=xAref*gammaref;
m2ref=n2/(roA*(Vref-Vsol));
mcparef=ncpa/(roA*(Vref-Vsol));
ATref=alfa*Tref^(-1.5);
BTref=beta*Tref^(-.5);
auxref=(1+a*BTref*sqrt(m2ref));
sum1ref=(-ATref*m2ref*sqrt(m2ref)/auxref);
sum2ref=(2*ATref/(a^3*BTref^3))*(.5*(auxref-1)^2+log(auxref)-auxref);
y=log(aAref)+.001*MA*v2*(sum1ref+sum2ref+m2ref+mcparef/v2);
Por último comentar que el programa integralLf , que calcula la
integral del calor latente de fusión del hielo, es el mismo que en el caso
ideal.
236
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
9.2.3 REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA DESHIDRATACIÓN
9.2.3.1 Programación en MATLAB de la integración de la ecuación diferencial
de la deshidratación celular
Al igual que en el apartado anterior, aquí tan solo vamos a mostrar el
programa que permite integrar la ecuación diferencial de la deshidratación no
ideal, cuya programación en MATLAB se describió en el apartado anterior.
La herramienta que emplearemos al igual que en el caso ideal, será la
herramienta ode.
Con las orientaciones dadas en el apartado 7.3.3.1 sobre el
funcionamiento del programa en el caso ideal, es suficiente para poder
comprender este programa.
Vi=3.1629*1e-17;%DATO
n2=9.014*1e-15;%DATO
A=3.5394*1e-10;%DATO
ncpa=0;
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO
end
Tgo=273.15;%DATO
options00=odeset('Events','on','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t00,y00,TE,YE,IE]=ode15s('enfr_NOid_integrado',[],Vi,options00,.00001,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V00=y00/Vi;
Ti=min(TE);
plot(t00-273,V00,'r:')
hold on;
for B=[-5 -15 -50 -1000]
tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t2,y2]=ode15s('enfr_NOid_integrado',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo
,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V2=y2./Vi;
if ncpa==0
plot(t2-273,V2,'b')
else
plot(t2-273,V2,'g')
end
axis([-55 0 0 1]);
hold on;
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
237
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
9.2.3.2 Representación gráfica de la deshidratación
Al igual que en el caso ideal, la integración de la curva de equilibrio solo
se lleva a cabo, en el intervalo de temperaturas que va desde los 271.8852K
hasta la temperatura final de enfriamiento, por lo que el software no dibuja la
evolución desde los 273K hasta los 271.8852K. Las razones de esta
limitación ya fueron expuestas en el apartado 7.3.3.2.
A continuación mostraremos la evolución de la deshidratación de
espermatozoides de ratón para distintas velocidades de enfriamiento lineal,
empleando las ecuaciones del modelo no ideal.
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
1
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
-1000ºC/m in
0.9
0.8
0.7
0.6
-50ºC/m in
0.5
0.4
-15ºC/m in
0.3
-5ºC/m in
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 46
El programa que permite obtener el gráfico de la figura 46 es el mostrado
en el apartado 9.2.3.1.
Como ya comentamos en la introducción, la obtención de este gráfico es
tan sólo un paso previo necesario, para ahora poder comparar la solución
dada por las ecuaciones ideales frente a esta solución.
Si representamos la evolución de la deshidratación ideal, y
simultáneamente trazamos mediante puntos la evolución de la
deshidratación no ideal, obtenemos una medida de lo buena que es la
hipótesis de solución diluida ideal, que hicimos al desarrollar las ecuaciones
del modelo ideal. El gráfico lo mostramos en la figura 47.
238
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
ESPERMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
-1000ºC/min
0.9
Deshidratación no ideal
0.8
Deshidratación ideal
Descenso crioscópico ideal
0.7
Descenso crioscópico no ideal
0.6
-50ºC/m in
0.5
0.4
-15ºC/m in
0.3
-5ºC/m in
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 47
En el gráfico anterior, los círculos negros marcan la evolución de la
deshidratación celular empleando las ecuaciones del modelo no ideal,
mientras que las líneas azules, marcan la evolución de la deshidratación,
cuando empleamos las ecuaciones del modelo ideal.
El programa que permite calcular este gráfico se encuentra en el anexo
Programas en el apartado 15.
Esta solución gráfica, nos lleva a pensar que la hipótesis de solución
diluida ideal, es muy razonable, pues los resultados que proporciona son
prácticamente idénticos, a los obtenidos cuando consideramos que la
solución es diluida, pero no ideal.
Hay que hacer hincapié aquí, en el hecho de que tan sólo hemos puesto
en tela de juicio la hipótesis de idealidad de las soluciones intra y
extracelular, pero no hemos puesto en tela de juicio el carácter de solución
diluida. Esto significa que si trato de modelar la solución intracelular, la
manera más precisa sería empleando las ecuaciones del modelo no ideal,
pero acabamos de ver que si empleamos las ecuaciones del modelo ideal,
los errores que cometemos son muy pequeños, y no vale la pena emplear la
formulación más compleja del modelo no ideal.
Sin embargo, tanto en el caso ideal como no ideal trabajamos con la
hipótesis de solución diluida. Esta hipótesis debería ser revisada, al igual
239
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
que hemos hecho con la hipótesis de idealidad, debido a que en el proceso
de deshidratación la solución tanto intracelular como extracelular, aumentan
su concentración en sales, y puede que en algún instante la hipótesis de
solución diluida no sea correcta, aunque puede ocurrir que los resultados de
un modelo que contemplen esta posibilidad sean muy parecidos a los
resultados del modelo que aquí estamos desarrollando, y que no tienen en
cuenta la posibilidad de que en algún momento la hipótesis de solución
diluida no sea cierta, al igual que nos ha ocurrido con la hipótesis de
idealidad.
A continuación vamos a mostrar numéricamente cual es la desviación
máxima que presenta el comportamiento ideal, frente al no ideal, para cada
una de las velocidades de enfriamiento, así como la temperatura a la que se
produce dicho máximo.
Velocidad de
enfriamiento/ºC/min
Error relativo máximo
Temperatura/ºC
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
-40
-45
-50
-55
-60
13.8428%
14.6054%
15.0762%
15.2829%
15.5559%
16.5138%
17.9140%
8.1526%
2.5174%
0.9224%
0.4073%
0.3883%
-6.0996
-8.2910
-10.9022
-12.6966
-16.2375
-18.5490
-62.3133
-66.8282
-47.2994
-43.0053
-10.1218
-10.3766
El error relativo, lo hemos calculado mediante la siguiente expresión:
Error Re lativo =
Volumen Unitario Ideal − Volumen Unitario NO Ideal
⋅ 100
Volumen Unitario NO Ideal
Ec. 349
Los valores de la tabla se obtienen con el mismo programa que se ha
empleado para dibujar el gráfico de la figura 47.
En la tabla adjunta, se observa cómo para bajas velocidades de
enfriamiento, el error relativo que cometemos al tomar la evolución del
modelo ideal, frente al del modelo no ideal, aunque no es bajo, es un error
aceptable. Para altas velocidades de enfriamiento, por el contrario el error
es insignificante, siendo el máximo menor, cuanto mayor es la velocidad de
enfriamiento.
Vamos a comprobar a continuación si esta pauta de comportamiento se
sigue con otros perfiles de enfriamiento y con otros tipos de células.
240
CAPÍTULO 4
LA DESHIDRATACIÓN CELULAR
Para el caso de un perfil de enfriamiento exponencial, los errores
relativos máximos se muestran en la tabla adjunta:
Velocidad de enfriamiento
inicial/ºC/min
Error relativo máximo
Temperatura/ºC
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
-40
-45
-50
-55
-60
13.7403%
14.6196%
15.0465%
15.1915%
15.7050%
15.8304%
16.5189%
12.5283%
4.0886%
1.4984%
0.6754%
0.3902%
-6.2542
-8.1832
-10.2680
-12.7900
-15.5842
-19.6434
-28.0313
-83.0000
-62.6293
-40.3483
-41.1572
-10.4491
El comportamiento es análogo, salvo que para tener errores relativos
muy pequeños debemos tener velocidades de enfriamiento mayores.
El programa que permite calcular los valores de esta tabla se muestran
en el anexo de Programas en el apartado 16.
Todos estos resultados nos llevan a la conclusión de que el error que
cometemos al emplear el modelo de solución diluida ideal, en vez del
modelo de disolución diluida, es tanto mayor, cuanto menor sea la velocidad
de enfriamiento. Así para estudiar el comportamiento de la deshidratación
celular a bajas velocidades de enfriamiento, es más conveniente emplear el
modelo de disolución diluida, mientras que para el estudio de la
deshidratación a altas velocidades de enfriamiento los resultados que
obtenemos con este modelo son prácticamente idénticos a los que
proporciona el modelo de disolución diluida ideal (el error es menor del 1%).
241
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
242
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
V. CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
V-1. INTRODUCCIÓN
En 1949, Polge y sus colaboradores descubrieron que al añadir glicerol a una
muestra de espermatozoides, antes de comenzar el proceso de criopreservación,
el número de células que sobrevivían al llevarlas de nuevo a temperatura
ambiente era muy superior al que se había observado hasta entonces. Debido a
esta propiedad del glicerol de proteger a las células durante la criopreservación y
posterior descongelación, se le denominó AGENTE CRIOPROTECTOR, cuyas siglas en
inglés son CPA (crioprotective agent). Desde entonces se han descubierto una gran
cantidad de sustancias con propiedades crioprotectoras.
Los agentes crioprotectores se clasifican en dos categorías:
•
Agentes crioprotectores permeables: Son aquellos que atraviesan la
membrana celular y ejercen su acción crioprotectora desde el interior de
la célula. A este grupo pertenecen los agentes crioprotectores más
usados hoy en día, como son el glicerol, el dimetil sulfoxido (DMSO), o el
1-2 propanodiol. Todos estos compuestos tienen en común que sus
moléculas son pequeñas, es decir, tienen un peso molecular
relativamente bajo; así el glicerol tiene 92.09 de peso molecular, lo que
le permite atravesar la membrana celular.
Agentes crioprotectores no permeables: Son aquellos que no pueden
atravesar la membrana celular, por el excesivo tamaño de sus
moléculas, ejerciendo la acción crioprotectora desde el exterior de la
célula. A este grupo pertenecen azúcares como la glucosa, sacarosa,
fructosa, y polímeros, como el polivinil pirrolidón. El tamaño de estas
moléculas es muy superior a las del grupo anterior. Así por ejemplo, el
peso molecular de la sacarosa es 342.
•
A pesar del uso de estas sustancias en los protocolos de criopreservación es
una práctica habitual, los mecanismos de protección no son del todo conocidos.
Los mecanismos que con certeza se saben que actúan a favor de la supervivencia
celular son mecanismos físicos:
•
Dilución de los electrolitos: La alta concentración de los electrolitos en
las últimas etapas de la deshidratación celular, fue señalado como uno
de los mecanismos causantes de la muerte celular. Al añadir
243
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
•
•
crioprotector disminuimos la concentración de los electrolitos, y por
tanto reducimos el riesgo de muerte.
Disminución de la concentración de agua: El otro mecanismo que
causaba muerte celular era la formación de hielo intracelular. Al
introducir en el medio más moléculas (de crioprotector), los cristales de
hielo en crecimiento tienen una mayor dificultad para encontrar
moléculas de agua y seguir así creciendo, reduciendo de esta manera
el riesgo de muerte celular.
Aumento de la viscosidad: Al añadir sustancias crioprotectoras al medio
intracelular, la viscosidad de éste aumenta. Esto reduce la movilidad de
las moléculas en su seno, por lo que la formación de cristales de hielo
se ve menguada, aumentando de esta manera la probabilidad de
supervivencia.
Otros mecanismos de naturaleza bioquímica, se sospecha que son también
causantes de la elevada tasa de supervivencia que se alcanza al añadir agentes
crioprotectores. Estos mecanismos escapan al tratamiento matemático y por tanto
a las posibilidades de este proyecto. Tan sólo comentaremos a modo de ejemplo,
que agentes crioprotectores polares, como el DMSO, podrían estabilizar la
membrana celular mediante interacciones electrostáticas.
Además de los mecanismos físicos descritos anteriormente, y cuyo efecto
beneficioso es bastante evidente, hay otro mecanismo físico. Éste es el efecto
coligativo, es decir, la adición del soluto al disolvente, cuyo efecto beneficioso no
está del todo claro. En el apartado 3 de este capítulo nos encargaremos de
analizar estos efectos.
A pesar de los bien conocidos efectos beneficiosos de los agentes
crioprotectores, éstos pueden ser muy dañinos, especialmente cuando son
empleados en altas concentraciones. Los principales efectos dañinos son dos:
•
•
Toxicidad: Los agentes crioprotectores son sustancias químicas que en
condiciones normales no se encuentran en el interior de las células. Por
ello, cuando atraviesan la membrana celular y se difunden por el medio
intracelular, lo que realmente estamos haciendo es envenenar a la
célula. Sin embargo como el metabolismo celular está muy ralentizado,
la acción tóxica de los crioprotectores se ve muy disminuida, salvo que
empleemos muy altas concentraciones a temperaturas relativamente
altas (en el entorno de los 0ºC).
Ósmosis: Los agentes crioprotectores se añaden al medio extracelular y
desde ahí se difunden hasta las proximidades de la célula. En ese
momento tenemos un medio extracelular con una concentración de
solutos superior a la que hay en el medio intracelular. Como
consecuencia de este desequilibrio la célula comienza a deshidratarse.
Puesto que la velocidad con la que los crioprotectores atraviesan la
membrana celular es mucho más pequeña que la velocidad con la que
244
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
el agua es evacuada, la extensión de la deshidratación es muy grande y
muy rápida, fenómeno que se ha comprobado ser dañino para la célula.
En este capítulo, también pretendemos modelar este fenómeno para
tener así herramientas con las que diseñar protocolos de adición de
crioprotectores, que minimicen estos daños.
245
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
V-2. PROTOCOLO DE ADICIÓN DE AGENTES CRIOPROTECTORES
2.1. INTRODUCCIÓN
En este apartado vamos a desarrollar un modelo matemático que nos permita
conocer la evolución del volumen celular, cuando añadimos al medio extracelular
agentes crioprotectores, tanto permeables como no permeables.
La repuesta celular, cuando añadimos crioprotectores al medio, se divide en
dos etapas:
•
•
Deshidratación rápida e intensa.
Rehidratación de la célula, más pausada.
La naturaleza de esta respuesta se debe a la diferente permeabilidad que
presenta la membrana celular frente al agua, y los crioprotectores permeables. Por
ejemplo, para el caso de glóbulos rojos de bovino la permeabilidad de la
membrana al agua es 5×105 veces superior que la que presenta frente al glicerol.
¿cuáles son las consecuencias de esta discrepancia? Cuando introducimos una
célula en un medio con una concentración de solutos superior a la isotónica,
debido a la presencia de agentes crioprotectores, se desencadenan una serie de
mecanismos para devolver el equilibrio entre la célula y el medio extracelular:
•
•
Mecanismo A: El agua del medio intracelular sale de la célula para
incrementar la concentración de solutos en su interior.
Mecanismo B: Los agentes crioprotectores del medio extracelular
penetran en el interior de la célula, para incrementar la concentración de
solutos en su interior.
Puesto que el mecanismo A, de evacuación de agua, es mucho más efectivo
que el mecanismo B, el primer efecto es una deshidratación rápida e intensa de la
célula. Sin embargo puesto que la concentración de crioprotector en el interior de
la célula no para de crecer, llega un momento en que la concentración de solutos
en el interior de la célula es superior a la existente en el medio extracelular, por lo
que comienza a entrar agua en el interior de la célula. Esta rehidratación de la
célula prosigue hasta que la concentración de crioprotector en el interior de la
célula se iguala con la que hay en el medio extracelular.
246
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
2.2. MODELO MATEMÁTICO
2.2.1 DESHIDRATACIÓN INICIAL POR LA PRESENCIA DE CRIOPROTECTORES EN EL MEDIO
EXTRACELULAR.
Partiremos de la ecuación de deshidratación que hemos venido empleando
hasta este momento(Ec178):
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
P ex
=
⋅
ln
Ec. 350
dt
VA*
P in
Aplicando en la ecuación Ec350 la ley de Raoult (apartado 3.2 del capítulo 1),
tanto a la presión del medio intracelular como del medio extracelular, y
despreciando la presión parcial ejercida por los solutos :
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
x ex
=
⋅ ln in Ec. 351
dt
VA*
x
donde xex y xin son las fracciones molares del disolvente en el medio extracelular e
intracelular respectivamente.
Suponiendo que no entra crioprotector en todo el proceso de deshidratación, la
fracción molar de disolvente en el medio intracelular (Ec202) queda:
xin =
∞
V − nB ⋅ VmB
Ec. 352
∞
*
V − nB ⋅ VmB
+ ν B ⋅ nB ⋅ VmA
Si consideramos que la concentración de sales y crioprotectores no cambia en
el medio extracelular, la fracción molar de disolvente no se modificará a lo largo de
todo el proceso de deshidratación, siendo por tanto igual a la que había
inicialmente :
ex
ex
x ex = 1 − x Bex − xCPAp
− xCPAnp
Ec. 353
donde xBex es la fracción molar de sal en el medio extracelular, xCPApex es la
fracción molar de crioprotector permeable en el medio extracelular, y xCPAnpex es la
fracción molar de crioprotector no permeable en el medio extracelular.
Sustituyendo en la ecuación Ec350, llegamos a la ecuación deseada:
dV L p (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
*
dt
VmA
∞


V − n B ⋅ VmB
 ln( x ex ) − ln
 Ec. 354
∞
* 
V − n B ⋅ VmB + ν B ⋅ n B ⋅ VmA 

247
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
2.2.2 REHIDRATACIÓN PROGRESIVA DE LA CÉLULA DEBIDO A LA ENTRADA DE
CRIOPROTECTORES PERMEABLES
Puesto que la permeabilidad de las membranas celulares al agua es muy
superior que la permeabilidad a cualquier crioprotector permeable, supondremos
que la transferencia del crioprotector al interior de la célula se produce en
condiciones de equilibrio osmótico. Para entenderlo mejor, el sistema está
evolucionando por sucesivos estados de equilibrio pues al ser tan lenta la
velocidad de transferencia de moles de crioprotector al interior de la célula,
respecto de la velocidad tan elevada con la que se transfiere agua, que es la
velocidad con la que se alcanza el equilibrio, el sistema nunca abandona el estado
de equilibrio.
Por lo tanto a lo largo de todo el proceso de rehidratación se cumplirá la
igualdad de presiones osmóticas(apartado 2.4 del capítulo 2):
π in = π ex Ec. 355
Aplicando la ecuación de van’t Hoff,(apartado 2.1 del capítulo 2) que
relacionaba la presión osmótica con la temperatura, para el caso de soluciones
diluidas ideales, tenemos:
R ⋅ T ⋅ ∑ min = R ⋅ T ⋅ ∑ mex Ec. 356
donde min y mex son las molalidades de los solutos en el medio intracelular y
extracelular respectivamente.
Suponiendo que la concentración de solutos en el medio extracelular no
cambia, la suma de molalidades de solutos en el medio extracelular es conocida e
igual a las concentraciones iniciales.
La suma de molalidades del medio intracelular será:
∑m
in
=
nCPAp
ν B ⋅ nB
+
Ec. 357
MA
MA
nA ⋅
nA ⋅
1000
1000
El volumen de la disolución intracelular podemos expresarlo como se muestra
en la ecuación Ec358:
*
∞
∞
V ≈ n A ⋅ VmA
+ n B ⋅ VmB
+ nCPAp ⋅ VmCPAp
Ec. 358
Despejando el número de moles de disolvente nA, en la Ec358 y sustituyéndolo
en la ecuación Ec357, tenemos:
248
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
∑m
in
ν B ⋅ n B + nCPAp
=
(V − n B ⋅ V
∞
mB
− nCPAp ⋅ V
∞
mCPAp
MA
)⋅
*
1000 ⋅ VmA
Ec. 359
Aplicando Ec356 a la ecuación Ec359 y despejando el volumen de disolución
intracelular:
V =
ν B ⋅ n B + nCPAp
∞
∞
+ n B ⋅ VmB
+ nCPAp ⋅ VmCPAp
Ec. 360
MA
ex
⋅∑m
*
1000 ⋅ VmA
Para poder conocer la evolución del volumen de la disolución intracelular
durante el proceso de rehidratación, dada por la ecuación Ec360, necesitamos
conocer cómo se va modificando el número de moles de crioprotector presentes
en el medio intracelular. Esta evolución la obtenemos planteando una ecuación de
balance de materia similar a la que planteamos en su momento para modelar la
deshidratación celular durante el enfriamiento(Ec 176):
dnCPAp
dt
(
ex
in
= PCPAp ⋅ A ⋅ mCPAp
− mCPAp
)
Ec. 361
donde PCPAp es la permeabilidad de la membrana celular al crioprotector
permeable, A es el área de la membrana, y mCPApex y mCPApin son las molalidades
del crioprotector permeable en el medio extracelular e intracelular
respectivamente. La molalidad del crioprotector en el medio extracelular es
conocida, mientras que la del medio intracelular es de la forma:
in
=
mCPAp
in
in
nCPAp
nCPAp
=
Ec. 362
MA
MA
∞
∞
in
nA ⋅
(V − nB ⋅ VmB − nCPAp ⋅ VmCPAp ) ⋅
*
1000
1000 ⋅ VmA
Sustituyendo Ec360, en la ecuación Ec362:
in
CPAp
m
=
in
nCPAp
ν B ⋅ nB + n
in
CPAp
⋅ ∑ mex Ec. 363
Sustituyendo Ec363 en Ec361:
dnCPAp
dt
in
 ex

nCPAp

 Ec. 364
= PCPAp ⋅ A ⋅ ρ A ⋅ mCPAp −
in


ν
⋅
n
+
n
B
B
CPAp 

249
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
El sistema de ecuaciones constituido por la ecuación del volumen de disolución
intracelular(Ec360), y la ecuación Ec364, nos permite calcular la evolución del
volumen de disolución intracelular y también la evolución de la concentración del
crioprotector en el interior de la célula.
A continuación vamos a aplicar las ecuaciones aquí deducidas para obtener la
evolución gráfica de la deshidratación de óvulos de ratón, en presencia de glicerol
como crioprotector permeable, y de sacarosa como crioprotector no permeable.
250
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
2.3. RESOLUCIÓN NUMÉRICA PARA ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS
2.3.1 DATOS NUMÉRICOS
Los datos físicos de los óvulos de ratón no fertilizados fueron expuestos en el
apartado 7.4.2.1 del capítulo 2 de LA DESHIDRATACIÓN CELULAR. Todos estos datos
son de aplicación en el modelo matemático de la deshidratación ante la presencia
de crioprotectores en el medio, pero necesitamos un dato más, la permeabilidad
de la membrana celular frente al crioprotector permeable. En relación con este
parámetro disponemos del dato de la permeabilidad al glicerol a 20ºC.
Pglicerol=6×10-6 m/min
Probablemente la permeabilidad de la membrana al glicerol será una función
de la temperatura, al igual que la permeabilidad al agua. Sin embargo debido a la
ausencia de datos físicos, no podemos obtener esta relación. No obstante debido
a que la adición de crioprotectores se realiza en un rango de temperaturas muy
estrecho, comparado con el rango de temperaturas en el que nos movemos
cuando enfriamos a las células, y puesto que el valor de la permeabilidad es muy
pequeño, podemos emplear este valor de la permeabilidad para temperaturas
distintas a los 20ºC, pudiendo incluso emplearla hasta una temperatura de 0ºC.
251
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
2.3.2 ADICIÓN DE CRIOPROTECTORES EN UNA SOLA ETAPA
En este apartado vamos a discutir los fenómenos que ocurren en una célula
cuando la sumergimos en un medio que tiene las concentraciones finales de
crioprotectores. En la figura adjunta tenemos la evolución del volumen celular
respecto del inicial cuando sumergimos a la célula en un medio que tiene una
concentración de glicerol (crioprotector permeable) 3M, y una concentración de
sacarosa (crioprotector no permeable) 0.3M, a una temperatura de 20ºC.
ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS
1
0.9
Fracción del volumen inicial
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
Tiempo/min
Figura 48
Los programas necesarios para poder dibujar el gráfico de la figura 48, se
encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 17.
En la evolución del volumen celular observamos dos etapas. Una primera
etapa de deshidratación muy rápida, dura 36 segundos, y muy intensa, se llega a
una deshidratación del 92.39%, y una segunda etapa de rehidratación que tarda
aproximadamente 15 minutos en alcanzar el valor de equilibrio, que no es el
volumen inicial de la célula sino el 53.2% del volumen inicial, debido a la presencia
de crioprotectores no permeables. Efectivamente si no añadimos sacarosa al
medio, la evolución del volumen celular es como se indica en la figura 49:
252
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS
1
0.9
Fracción del volumen inicial
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
Tiempo/min
20
25
30
Figura 49
Ahora la primera etapa de deshidratación dura 45 segundos, llegándose a una
deshidratación máxima del 91%. El volumen celular transcurridos 30 minutos es
del 96.74% del volumen inicial, y si dejamos evolucionar el sistema 10 minutos
más, llegamos hasta el 98.63% del volumen inicial.
Por lo tanto el efecto de la adición de crioprotector no permeable es el de
inducir una deshidratación permanente en la célula antes del proceso de
enfriamiento celular:
253
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS
1
0.9
0M
Fracción del volumen inicial
0.8
0.1M
0.7
0.2M
0.6
0.3M
0.5
0.4M
0.5M
0.4
0.3
1M
0.2
0.1
0
0
5
10
15
Tiempo/min
20
25
30
Figura 50
La duración y la deshidratación máxima de la primera etapa también varía
según la concentración de sacarosa, según podemos ver en la figura 50:
Concentración molar de
sacarosa
0M
0.1M
0.2M
0.3M
0.4M
0.5M
1M
Duración de la etapa de
deshidratación / segundos
45.3248
41.8839
39.2249
36.6463
34.2371
31.8886
22.2703
Volumen relativo al inicial
8.99%
8.51%
8.05%
7.61%
7.20%
6.81%
5.15%
En la tabla anterior vemos como al aumentar la concentración de sacarosa en
el medio, la deshidratación final es cada vez mayor, y el tiempo empleado para
ello es cada vez menor.
A continuación en la figura 51 vamos a mostrar cual es el efecto que tiene la
mayor o menor concentración de crioprotector permeable sobre el volumen
celular.
254
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS
1
0.9
1M
3M
0.8
Fracción del volumen inicial
5M
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
Tiempo/min
20
25
30
Figura 51
En el gráfico observamos que al aumentar la concentración de crioprotector
permeable en el medio, la extensión de la deshidratación máxima es mayor y se
alcanza en menor tiempo, siendo además más lenta la rehidratación.
Concentración de
glicerol
1M
3M
5M
Duración etapa de
deshidratación
/segundos
192.7904
45.3248
20.1395
Volumen relativo
mínimo
Volumen relativo a
los 30 minutos
25.59%
8.99%
4.74%
99.94%
98.63%
97.11%
Como comentario final podemos decir que la adición de sacarosa, o de
cualquier otro tipo de crioprotector no permeable, tiene unos efectos que en
principio son muy deseables, pues permite deshidratar a la célula antes de que
comencemos a enfriar el sistema, y por lo tanto antes de que el agua pueda
formar hielo. Sin embargo la rapidez con la que se produce esta deshidratación es
dañina para las células, por lo que interesaría alargar el tiempo en el que se
produce la deshidratación. Con este objetivo, en el apartado siguiente
analizaremos las evoluciones del volumen celular cuando añadimos los
crioprotectores poco a poco.
255
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
2.3.3 ADICIÓN DE CRIOPROTECTORES EN VARIAS ETAPAS
A continuación vamos a mostrar cómo evoluciona el volumen celular cuando
vamos añadiendo poco a poco los crioprotectores. Nosotros vamos a proponer un
protocolo en el que primero añadimos el crioprotector no permeable (sacarosa)
que suele tener una toxicidad baja al ser productos químicos que de forma natural
se encuentran en el cuerpo, y además permanecen fuera de la célula, para
posteriormente añadir el crioprotector permeable, que tiene mayor toxicidad por
ser productos químicos que no se encuentran de forma natural en los organismos
vivos.
En el programa que hemos diseñado, la concentración final de crioprotector se
divide entre el número de etapas que deseamos, incrementándose en cada etapa
la concentración una cantidad fija, hasta alcanzar la concentración final. La
duración de cada etapa viene dada por el tiempo que tarda el sistema en alcanzar
el valor de equilibrio.
En el gráfico de la figura 52 mostramos un protocolo de adición de sacarosa
primero y de glicerol después, en tres etapas cada uno, hasta alcanzar la
concentración final de 0.3M para la sacarosa y de 3M para el glicerol, todo ello a
una temperatura de 20ºC.
PROTOCOLO DE ADICICIÓN DE CRIOPROTECTORES
EN ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS
1
Adición de sacarosa
0.9
Adición de glicerol
Fracción del volumen inicial
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
Tiempo/minutos
20
25
30
Figura 52
256
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
Los programas necesarios para poder dibujar este gráfico, se encuentran en el
anexo PROGRAMAS, en el apartado 18.
En este gráfico de la figura 52 apreciamos la enorme diferencia que existe
entre un protocolo con etapas frente a uno sin etapas. Si sometemos la muestra a
las concentraciones finales de crioprotector la deshidratación se lleva a cabo en
escasos segundos, mientras que en un protocolo donde la concentración de los
crioprotectores aumenta progresivamente, el tiempo requerido para la
deshidratación máxima es del orden de unos pocos minutos. En la tabla adjunta se
muestra la duración de las etapas de deshidratación, tanto las debidas a la
sacarosa, como las debidas al glicerol.
Concentración
final de
sacarosa
0.1M
0.2M
0.3M
0.3M
0.3M
0.3M
Concentración
final de glicerol
Duración de la
etapa /minutos
Duración del
protocolo /minutos
0M
0M
0M
1M
2M
3M
7.0668
4.2108
2.8195
1.5513
0.3969
0.1598
7.0668
11.2776
14.0971
15.6484
16.0453
16.2051
Volumen
relativo
V/Vi
0.7744
0.6268
0.5224
0.1960
0.1137
0.0761
El intento de alargar la duración de la etapa de deshidratación al añadir
sacarosa, ha sido un éxito, durando 14 minutos, no así con la etapa de
deshidratación debida al glicerol, que ha durado tan sólo 2 minutos. Podríamos
aumentar el número de etapas para añadir el glicerol, como se muestra en la
figura 53, pero la exactitud de los datos es dudosa, pues el modelo se basa el la
rápida deshidratación que permite hacer la simplificación de que nada de glicerol
entra mientras la célula se deshidrata. Esto es estrictamente falso cuando la
duración de la etapa de deshidratación debida al glicerol se alarga.
257
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
PROTOCOLO DE ADICICIÓN DE CRIOPROTECTORES
EN ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS
1
Adición de sacarosa
0.9
Adición de glicerol
Fracción del volumen inicial
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
Tiempo/minutos
20
25
30
Figura 53
Ahora el número de etapas de adición del glicerol se ha incrementado hasta
diez, logrando de esta manera aumentar la duración de la etapa de
deshidratación.
Concentración
final de
sacarosa
0.1 M
0.2 M
0.3 M
0.3 M
0.3 M
0.3 M
0.3 M
0.3 M
0.3 M
0.3 M
0.3 M
0.3 M
0.3 M
Concentración
final de glicerol
Duración de la
etapa
Duración del
protocolo /minutos
0M
0M
0M
0.3 M
0.6 M
0.9 M
1.2 M
1.5 M
1.8 M
2.1 M
2.4 M
2.7 M
3M
7.0668 min
4.2108 min
2.8195 min
3.4427 min
1.7447 min
59.67 seg
39 seg
26.72 seg
18.87 seg
13.64 seg
10.58 seg
7.77 seg
6.23 seg
7.0668
11.2776
14.0971
17.5398
19.2845
20.2790
20.9288
21.3741
21.6886
21.9159
22.0923
22.2218
22.3256
Volumen
relativo
V/Vi
0.7744
0.6268
0.5224
0.3541
0.2651
0.2101
0.1725
0.1454
0.1248
0.1087
0.0957
0.0851
0.0761
258
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
Ahora la duración de la etapa de deshidratación a causa del glicerol es de 8
minutos.
259
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
V-3. EFECTOS COLIGATIVOS DE LOS CRIOPROTECTORES PERMEABLES
3.1. INTRODUCCIÓN
En este apartado vamos a desarrollar un modelo matemático de deshidratación
celular, asociado a los procesos de enfriamiento, que tenga en cuenta la presencia
de agentes crioprotectores en el medio intracelular, es decir, solo tendremos en
cuenta la existencia de agentes crioprotectores permeables. Este modelo tendrá
en cuenta la presencia de agentes crioprotectores, desde un punto de vista
coligativo, es decir, el único que efecto que tendrá la presencia de crioprotectores
permeables vendrá asociada a que simplemente tendremos una mayor cantidad
de moles de soluto en el medio intracelular.
En los modelos matemáticos de deshidratación que estamos empleando, el
único efecto que podrá tener la presencia de crioprotectores no permeables será
la de comenzar el proceso de deshidratación celular asociado al enfriamiento,
sobre una célula previamente deshidratada.
Una vez planteado el modelo matemático, lo programaremos en lenguaje
MATLAB para su resolución numérica y compararemos los resultados con el caso
de ausencia de crioprotector. De esta manera podremos deducir los posibles
efectos beneficiosos de la adición de crioprotectores desde el punto de vista de los
efectos coligativos.
260
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
3.2. MODELO MATEMÁTICO
Para obtener el modelo matemático de deshidratación asociado a los procesos
de enfriamiento, partiremos de la ecuación Ec178 de balance de agua, en función
del cociente de presiones de vapor, entre el medio intracelular y extracelular, pues
hasta ese momento, en ningún momento se comenta nada acerca de la
composición del medio:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
P ex
=
⋅ ln in Ec. 365
dt
VA*
P
donde V*A es el volumen molar del disolvente puro, Lg(T) es el coeficiente de
permeabilidad, A es el área de la membrana, R es la constante universal de los
gases, T es la temperatura del sistema, y Pin, Pex son las presiones de vapor de la
solución intracelular y extracelular respectivamente.
A continuación vamos a desarrollar el cociente de las presiones de vapor,
donde ya si que tenemos que tener en cuenta la composición del medio
intracelular:
Ø Solución intracelular : aplicando la ley de Raoult ideal tenemos.
*
in
P in = PA*,l (T ) ⋅ x inA + PB* (T ) ⋅ x Bin + PCPA
(T ) ⋅ xCPA
Ec. 366
donde P*A,l , P*B , y P*CPA son las presiones de vapor del agua líquida ,
de la sal y del crioprotector y xinA , xinB ,y xinCPA son las fracciones molares
de agua , sal, y crioprotector respectivamente.
Aplicando la hipótesis simplificatoria 3 (apartado IV-3), que desprecia las
presiones de vapor de los solutos frente a la del disolvente, y teniendo en
cuenta además que xinA>>xinB ,y que xinA>>xinCPA al tratarse de una
disolución diluida,
podemos escribir:
P in ≈ PA*,l (T ) ⋅ x inA
Ec. 367
Ø Solución extracelular : como ya se demostró en el apartado 6.2 del capítulo
4 de DESHIDRATACIÓN CELULAR, la presión de vapor del medio extracelular,
donde tenemos una disolución líquida en equilibrio con hielo, es
aproximadamente igual a la presión de vapor del hielo puro:
P ex ≈ PA*, s (T )
Ec. 368
261
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
Por lo tanto la ecuación de deshidratación, en función de la composición del
medio intracelular, es idéntica a la que obtuvimos en el caso de ausencia de
crioprotectores(Ec191):
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dt
VA*

 P* (T )
⋅  ln A*, s
− ln x inA  Ec. 369

 P (T )
A, l


Aplicando las ecuaciones de Clausius-Clapeyron que relacionaban las
presiones de vapor con la temperatura, y tomando como temperatura de
referencia T=273.15K, la ecuación de deshidratación queda:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dt
V A*
 T LF (T )

 Ec. 370
ln
⋅  ∫
dT
−
x
A
2

R
⋅
T
 273.15

En la ecuación de deshidratación la única variable dependiente que vamos a
considerar es el volumen de disolución osmóticamente activo, en el interior de la
célula, y la única variable independiente a tener en cuenta va a ser la temperatura
del sistema.
Por ello la variación del volumen con el tiempo debemos expresarlo en función
de la temperatura:
dV dV dT
dV
=
⋅
= F (T ) ⋅
Ec. 371
dt
dT dt
dT
donde F(T) es una función de la temperatura particular de cada perfil de
enfriamiento, que son las funciones que desarrollamos en el apartado 6.4 del
capítulo 4 de DESHIDRATACIÓN CELULAR.
Por la misma razón, la fracción molar de disolvente debemos expresarla en
función del volumen de disolución intracelular y en función de la temperatura del
sistema, y es aquí donde reside la diferencia entre el modelo sin crioprotector y el
modelo con crioprotector:
xA =
nA
Ec. 372
n A + ν B ⋅ n B + nCPA
donde nA , nB y nCPA son los moles de disolvente(agua) ,de sal(ClNa) y de
crioprotector respectivamente, y ?B es el coeficiente de disociación de la sal.
Si multiplicamos y dividimos por el volumen molar del agua pura, nada cambia:
262
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
xA =
n A ⋅ V A*
Ec. 373
n A ⋅ V A* + ν B ⋅ n B ⋅ V A* + nCPA ⋅ V A*
El volumen de disolución intracelular es:
V = n A ⋅ V A + n B ⋅ VB + nCPA ⋅ V CPA Ec. 374
donde VA , VB y VCPA son los volúmenes molares parciales del agua, sal, y
crioprotector respectivamente.
Aplicando las hipótesis simplificatorias 7 de aproximar el volumen molar parcial
del disolvente al volumen molar del disolvente puro, y 8 de aproximar el volumen
molar parcial de los solutos al volumen molar a dilución infinita, podemos escribir:
∞
V ≈ n A ⋅ V A* + n B ⋅ V B∞ + nCPA ⋅ VCPA
Ec. 375
donde V*A es el volumen molar del disolvente puro, V8 B es el volumen molar a
dilución infinita de la sal, y V∞CPA es el volumen molar a dilución infinita del
crioprotector.
Por lo tanto la fracción molar de disolvente queda:
∞
V − n B ⋅ VB∞ − nCPA ⋅ VCPA
xA =
Ec. 376
∞
V − n B ⋅ V B∞ − nCPA ⋅ VCPA
+ (ν B ⋅ n B + nCPA ) ⋅ V A*
Para simplificar la notación de la expresión anterior, definimos las siguientes
variables:
•
•
∞
Volumen ocupado por los solutos: Vsol = n B ⋅ V B∞ + nCPA ⋅ VCPA
Moles de soluto disueltos: n sol = ν B ⋅ n B + nCPA
Aplicando estas definiciones a la Ec376 tenemos:
xA =
V − Vsol
Ec. 377
V − Vsol + nsol ⋅ V A*
Finalmente la ecuación de deshidratación celular cuando tiene en cuenta la
presencia de agentes crioprotectores queda:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dT
V A* ⋅ F (T )
 T L (T )

V − Vsol
 Ec. 378
⋅  ∫ F 2 dT − ln
* 
V − Vsol + n sol ⋅ V A 
 273.15 R ⋅ T
263
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
La ecuación de la curva de descenso crioscópico, cuando tiene en cuenta la
presencia de agentes crioprotectores queda:
 T LF (T ) 
V − Vsol
= exp ∫
dT  Ec. 379
2
V − Vsol + n sol ⋅ V A*
R
⋅
T
 273.15

La ecuación que describe la deshidratación celular, cuando la temperatura del
sistema permanece constante, cuando tenemos en cuenta la presencia de
crioprotectores en la solución intracelular queda:
dV L g (TCTE ) ⋅ A ⋅ R ⋅ TCTE
=
dt
V A*
 TCTE LF (T )

V (TCTE ) − Vsol
 Ec. 380
⋅ ∫
dT
−
ln
2
* 

R
⋅
T
V
(
T
)
−
V
+
n
⋅
V
CTE
sol
sol
A 
 273.15
264
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
3.3. ANÁLISIS DEL EFECTO DE LA PRESENCIA DE CRIOPROTECTORES PERMEABLES EN EL
MEDIO INTRACELULAR
3.3.1 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE DESHIDRATACIÓN
A continuación vamos a mostrar la evolución de la deshidratación celular en
espermatozoides de ratón para una única velocidad de enfriamiento de 30ºC/min ,
variando la concentración de glicerol en el interior de la célula:
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
0.9
Descenso crios c ópic o
sin crioprotectores
0.8
Descenso crioscópico
con crioprotectores
0.7
Deshidratac ión
s in c rioprotectores
0.6
Deshidratac ión
s in c rioprotectores
0.5
2M
0.4
1M
0.3
0.5M
0.2
0.1
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 54
Los programas necesarios para poder dibujar el gráfico de la figura 54 son los
mismos que los que empleamos para calcular la deshidratación en ausencia de
crioprotectores.
Claramente se ve que el efecto que tiene la adición de crioprotectores
permeables, es una menor deshidratación celular. Así por ejemplo en ausencia de
crioprotectores el volumen celular es un 7.8512% del inicial a los –20ºC, mientras
que cuando tenemos una concentración 1M de glicerol, el volumen celular es tan
solo del 50.4903% a la misma temperatura. Sin embargo como la deshidratación
máxima admisible, marcada por la curva de descenso crioscópico, varía con la
concentración de crioprotector, debemos emplear un parámetro de deshidratación
265
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
relativo a esa deshidratación máxima. Definimos la tasa de deshidratación relativa
como:
TDR (T ) =
1 − Volumen celular relativo al inicial a la temperatura T
Ec. 381
1 − Volumen relativo de la curva de descenso crioscopico a T
En la tabla adjunta, mostramos la evolución de la tasa de deshidratación
relativa en función de la concentración de crioprotector:
Concentración de
glicerol
0M
0.5M
1M
2M
Volumen relativo
Volumen relativo al
en curva descenso
inicial/%v
crioscópico/%v
7.8512
5.2393
39.5545
13.0630
50.4903
20.8867
68.2149
36.5340
TDR(-20ºC)
97.2438%
69.5279%
62.5807%
50.0820%
Los datos de la tasa de deshidratación relativa si son comparables, y vemos
como mientras en ausencia de glicerol, cuando la célula alcanza los –20ºC, el 97%
del agua total disponible para ser evacuada, a sido expulsada de la célula,
mientras que cuando tengo glicerol con una concentración 1M, tan sólo he
expulsado el 69.5% del agua que es posible evacuar.
Vemos por tanto que cuanto mayor es la concentración de crioprotector, menor
es la cantidad de agua evacuada para cada temperatura, siendo también menor la
cantidad máxima de agua que es posible expulsar fuera de la célula. Este valor
que denominamos ADD(T), (Agua Disponible para Deshidratación), se define de la
siguiente forma:
ADD (T ) = (1 − Volumen celular relativo en la curva de descenso crioscopico a T ) ⋅ 100
Ec. 382
En la tabla adjunta se muestran los valores del ADD para el espermatozoide de
ratón a los –20ºC:
Concentración de glicerol
0M
0.5M
1M
2M
ADD(-20ºC)
94.7607%
86.9370%
79.1133%
63.4660%
Vemos como efectivamente al aumentar la concentración de glicerol, la
cantidad de agua máxima que podríamos evacuar es cada vez menor. Cuando no
tengo glicerol, el 94.7% del agua del interior de la célula puede ser expulsada por
266
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
deshidratación, mientras que cuando tengo glicerol con una concentración 1M, tan
solo el 79% del agua del interior de la célula se podría expulsar.
Esta disminución de la deshidratación celular es en principio perjudicial, pues
tenemos más agua en el interior de la célula para formar hielo. Al formarse más
hielo, mayores serán los daños producidos en el interior de la célula.
267
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
3.3.2 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE DESHIDRATACIÓN A TEMPERATURA CONSTANTE
En este apartado vamos a estudiar la evolución de la deshidratación celular
para una temperatura constante y una única velocidad de enfriamiento,
modificando la concentración intracelular de crioprotector permeable. Los
resultados para el caso de espermatozoides de ratón, a una temperatura de
–10ºC, y a una velocidad de –30ºC/min, se muestran en la figura 55.
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA
1
s in c rioprotector
0.9
con crioprotector
0.8
2M
0.7
0.6
0.5
1M
0.4
0.3
0.5M
0.2
0.1
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
TIEMPO/MIN
1.4
1.6
1.8
2
Figura 55
Los programas necesarios para poder dibujar este gráfico, se encuentran en el
anexo PROGRAMAS, en el apartado 19.
La consecuencia más evidente de la adición de crioprotector es la disminución
de la deshidratación celular, debido al mayor volumen relativo que presentan las
células a lo largo de la curva de descenso crioscópico, para cada temperatura,
como se pudo apreciar en el apartado anterior. Recordamos que la deshidratación
a temperatura constante tiene una evolución asintótica hacia el valor marcado por
la curva de descenso crioscópico a la temperatura constante a la que se produce
la deshidratación.
Otra consecuencia importante de la presencia de crioprotectores es el
incremento del tiempo necesario para llegar al valor final de deshidratación. Esto
268
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
en principio no era de esperar puesto que la tasa de deshidratación a alcanzar es
menor. Esta ralentización del proceso de deshidratación a temperatura constante
es indeseable. Esto es debido a que las etapas de evolución a temperatura
constante se intercalaban entre etapas de enfriamiento para estabilizar el sistema,
es decir, reducir el subenfriamiento a valores muy bajos, y por lo tanto una mayor
duración de estas etapas se traducirá en una mayor duración del protocolo,
aumentando los riesgos de muerte celular por mantenerse el medio intracelular en
contacto con concentraciones salinas demasiado altas, durante demasiado
tiempo.
Para comprobar estas sospechas, en la figura 56 mostramos un protocolo de
enfriamiento por etapas a 30ºC/min en ausencia de crioprotectores, y a
continuación el mismo protocolo pero con una concentración 1M, 2M y 5M de
glicerol. El objetivo del protocolo es llegar a los –40ºC siempre y cuando el número
de etapas requeridas sea inferior a 20. por una etapa del protocolo se entiende un
periodo de enfriamiento y un periodo de temperatura constante.
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
FRACCION VOLUMEN INICIA L
1
0.9
Etapas de temperatura
constante
0.8
Etapas de enfriam iento
a 30ºC/min
0.7
5M
0.6
0.5
0.4
2M
0.3
0.2
1M
0.1
0M
0
0
2
4
6
8
10
12
TIEMPO/min
14
16
18
20
Figura 56
Los programas necesarios para poder dibujar el gráfico de la figura 56 se
encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 20.
269
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
En la siguiente tabla mostramos las duraciones de las etapas de temperatura
constante, así como la duración total de los protocolos para las distintas
concentraciones de crioprotector:
Molaridad
Glicerol
0M
1M
2M
5M
Duración Duración Duración Duración Duración Duración Duración Duración
de la
de la
de la
de la
de la
de la
de la
total del
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
Etapa 4
Etapa 5
Etapa 6
Etapa 7 protocolo
/segundos /segundos /segundos /segundos /segundos /segundos /segundos /minutos
30.2
76.7
86.1
108.4
38.1
34.9
57.9
112.5
93.1
34.0
54.6
135.0
187.5
47.0
61.7
172.5
62.2
85.4
217.5
90.0
112.5
277.5
142.5
7.2
7.1
11.4
18.4
Analizando los resultados de esta tabla, observamos como efectivamente al
aumentar la concentración de glicerol, la duración del protocolo aumenta, excepto
cuando tenemos concentraciones 1M de glicerol. En ese caso la duración del
protocolo es aproximadamente igual.
Podemos observar también, como al avanzar en las etapas del protocolo la
duración de la etapa a temperatura constante es también mayor.
En la primera columna podemos ver también como al aumentar la
concentración de glicerol, la duración de la etapa a temperatura constante es cada
vez mayor. Este comportamiento se repite en las otras columnas cuando
excluimos la primera fila que corresponde al caso de ausencia de crioprotectores.
La razón de esta discrepancia solo cabe explicarse por la diferencia de
comportamiento que presenta la deshidratación celular, con y sin crioprotectores.
En la figura 57 mostramos las evoluciones de los subenfriamientos para cada
concentración de glicerol, en los protocolos que hemos visto en la figura 56.
270
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
5
0M de glicerol
0
0
2
4
6
8
10
12
14
5
16
18
20
1M de glicerol
0
0
2
4
6
8
10
12
14
5
16
18
20
2M de glicerol
0
0
2
4
6
8
10
12
14
5
16
18
20
5M de glicerol
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo/minutos
14
16
18
20
Figura 57
Los programas necesarios para poder dibujar este gráfico, se encuentran en el
anexo PROGRAMAS, en el apartado 14.
En estos gráficos se observa más claramente la evolución de la duración de
cada una de las etapas del protocolo, confirmándose de nuevo la mayor duración
del protocolo, cuanto mayor es la concentración de glicerol.
271
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
3.3.3 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE SUBENFRIAMIENTO
En este apartado vamos a estudiar la evolución del subenfriamiento celular
para una única velocidad de enfriamiento, modificando la concentración
intracelular de crioprotector permeable. Los resultados para el caso de
espermatozoides de ratón, y una velocidad de –30ºC/min, se muestran a
continuación.
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
S in c rioprotector
Con glicerol
25
20
15
1M
2M
3M
5M
10
5
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 58
Los programas necesarios para poder dibujar el gráfico de la figura 58 se
encuentran en el anexo Programas, en el apartado 5.
Podemos observar dos etapas en la evolución del subenfriamiento, para el
caso de presencia de crioprotectores. Una primera etapa donde el subenfriamiento
con crioprotector es menor que en el caso de su ausencia, y otra etapa donde el
ocurre lo contrario.
Cuanto mayor es la concentración del glicerol, menor es el subenfriamiento
para cada temperatura, y más baja es la temperatura a la cual se igualan el
subenfriamiento con y sin crioprotector.
272
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
Para el caso de una velocidad de enfriamiento alta de 50ºC/min obtenemos el
gráfico de la figura 59:
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
30
SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
S in c rioprotector
Con glicerol
25
20
15
1M
2M
3M
10
5M
5
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 59
A altas velocidades de enfriamiento donde el subenfriamiento en células sin
crioprotector es monótonamente creciente, la presencia de agentes crioprotectores
reduce el subenfriamiento para todas las temperaturas. No se distinguen dos
etapas como en el caso anterior. En este caso la adición de crioprotector es muy
beneficiosa pues reduce el subenfriamiento a cualquier temperatura.
Como conclusión podemos decir que el efecto de añadir crioprotector a una
muestra depende de la velocidad de enfriamiento:
•
•
si la velocidad de enfriamiento es baja, la presencia de crioprotector es
beneficiosa a altas temperaturas pues reduce el subenfriamiento con
respecto al caso de no añadir crioprotector. Sin embargo es perjudicial a
bajas temperaturas por ser el subenfriamiento mayor.
Si la velocidad de enfriamiento es alta, la presencia de crioprotector es
beneficiosa para todas las temperaturas al reducirse el subenfriamiento
con respecto al caso de no añadir crioprotector.
273
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
3.3.4 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE FLUJO OSMÓTICO
En este apartado vamos a estudiar el efecto que la concentración de
crioprotectores tiene sobre el caudal del flujo osmótico. Para ello obtenemos, en la
figura 60 la evolución del caudal osmótico en espermatozoides de ratón, en
función del tiempo, para una única velocidad de enfriamiento de 30ºC/min,
modificado la concentración de glicerol en el interior de la célula:
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras 3 /min)
70
sin crioprotector
60
con glicerol
50
40
1M
30
2M
20
10
5M
0
0
0.5
1
1.5
TIEMPO/MIN
2
2.5
3
Figura 60
Los programas necesarios para poder dibujar este gráfico se encuentran en el
anexo Programas, en el apartado 8.
En el gráfico de la figura 60 podemos distinguir dos etapas en la evolución del
caudal de agua evacuada, cuando hay presente crioprotectores. Una primera
etapa donde el caudal osmótico es menor cuando hemos añadido glicerol al
medio, y una segunda etapa donde ocurre todo lo contrario. También observamos
que cuanto mayor sea la concentración de crioprotector, menor es el caudal para
cada instante de tiempo. Esto conecta con la idea de la menor deshidratación al
añadir crioprotector al medio, que vimos en el apartado 3.3.1.
Como conclusión podemos decir que la presencia de agentes crioprotectores
en el medio intracelular, hace que el caudal de agua evacuado sea más uniforme
274
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
con el tiempo. Las puntas de caudal pueden dañar a la célula, puesto que cuanto
mayor es el caudal, mayor es la presión ejercida sobre las paredes del poro,
siendo mayor el riesgo de rotura de la membrana celular.
275
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
3.3.5 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE CONCENTRACIÓN DE CLORURO SÓDICO
En este apartado vamos a estudiar el efecto que la concentración de
crioprotectores tiene sobre la concentración de cloruro sódico en el medio
intracelular. Para ello obtenemos en la figura 61 la evolución de la concentración
en espermatozoides de ratón, en función de la temperatura, para una única
velocidad de enfriamiento de 30ºC/min, modificado la concentración de glicerol en
el interior de la célula:
E S P E RMATOZOIDE DE RATÓN
10
s in crioprotector
9
con glicerol
CONCENTRACIÓN/(mol/m3)
8
7
6
5
4
3
2
1M
1
2M
5M
0
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
TEMPERATURA/ºC
-40
-45
-50
-55
Figura 61
Los programas necesarios para poder dibujar este gráfico, se encuentran en el
anexo Programas, en el apartado 9.
En el gráfico de la figura 61 podemos observar la drástica reducción de la
concentración de cloruro sódico, al añadir crioprotector. Este efecto se debe
fundamentalmente a dos factores:
•
•
Efecto de dilución del glicerol.
La menor deshidratación celular al añadir crioprotector.
Este efecto del crioprotector es enormemente beneficioso, ya que según vimos
al analizar las causas de la muerte celular, las altas concentraciones de cloruro
276
CAPÍTULO 5
LOS CRIOPROTECTORES
sódico en el interior de la célula, eran uno de los dos factores que llevaban a la
muerte de la célula. Como al añadir crioprotector, la concentración de cloruro
sódico se mantiene aproximadamente constante, eliminamos este factor como
causante de la muerte celular, quedando como único factor dominante la
formación de hielo intracelular.
277
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
278
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
VI. CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
VI-1. INTRODUCCIÓN
El proceso de deshidratación celular, permite aumentar la concentración de
los solutos disueltos, tanto de la sal como del crioprotector, en el medio
intracelular. Este fenómeno se debe a la naturaleza semipermeable de la
membrana celular, que tan sólo permite el paso de agua pero no de los solutos
disueltos en ella. Así ante un aumento de la concentración del medio
extracelular, la célula responde expulsando agua, pero no los solutos disueltos
en ella, lo que permite aumentar la concentración de la solución intracelular y
alcanzar así un equilibrio con el medio exterior.
El medio extracelular está igualmente sometido a un proceso de aumento
de la concentración de las sales, en él disueltas. Este fenómeno se debe a la
ausencia de los solutos disueltos en agua, en la fase hielo. Por lo tanto
conforme aumenta la proporción de agua que está en forma de hielo, aumenta
la concentración de los solutos disueltos, en la fracción de agua que aun
permanece en fase líquida.
El proceso de aumento de concentración de las disoluciones es deseable
puesto que, permite mantener en estado líquido disoluciones acuosas a
temperaturas muy por debajo de los de los 0ºC, gracias al fenómeno del
descenso crioscópico, es decir, la reducción de la temperatura del punto de
cambio de fase sólido-líquido, debido a la presencia de solutos disueltos.
Para simplificar el planteamiento del problema, supondremos que las
especies químicas disueltas en el medio intracelular, son iguales a las del
medio extracelular.
El proceso de concentración de las disoluciones, tanto intracelular, como
extracelular, no puede mantenerse de manera indefinida. Al final, se alcanzarán
las condiciones de saturación de los distintos solutos disueltos. Cuando se
alcanzan las condiciones de saturación de un determinado soluto, su
concentración en la disolución no podrá seguir aumentando, permaneciendo
constante, e igual a la concentración de saturación. Sin embargo el proceso de
deshidratación celular, en el medio intracelular, y la formación de hielo en el
medio extracelular, tienden a concentrar la solución, pero como esto no es
posible, precipitan parte de las sales disueltas.
Por lo tanto mientras no se alcancen las condiciones de saturación, la
cantidad de moles de solutos disueltos, permanecerá constante; no así su
concentración, que irá aumentando. Cuando la solución esté saturada, el
279
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
número de moles
concentración.
disueltos
disminuye
para
mantener
constante
la
Es decir, hay una primera etapa donde la concentración de los solutos
disueltos va aumentando con el tiempo, con la condición de que el número total
de moles de soluto disueltos permanece constante. Esta etapa continúa
mientras no se alcancen las condiciones de saturación. La segunda etapa
comienza cuando se alcanzan las condiciones de saturación de uno de los
solutos disueltos. Conforme enfriamos, la concentración de dicho soluto
permanece constante, e igual al valor de saturación, mientras que la cantidad
de moles disueltos de dicho soluto va disminuyendo con el tiempo, debido al
proceso de precipitación. Las otras especies químicas, que constituyen el
soluto y que aun no han alcanzado las condiciones de saturación, continúan
aumentando su concentración y manteniendo constante la cantidad de moles
disueltos, es decir, aun no han comenzado a precipitar.
Para poder visualizar gráficamente los procesos que hemos descrito,
emplearemos diagramas de fases, introduciendo el concepto del punto
Eutéctico.
Basándonos en los diagramas de fases, y en el análisis de los grados de
libertad, estudiaremos los fenómenos que acontecen, tanto en el medio
intracelular, como extracelular.
Por último plantearemos un modelo de deshidratación celular que tenga en
cuenta el hecho de que las soluciones quedan saturadas en sal.
Haremos este estudio, primero en el caso de ausencia de crioprotectores,
para posteriormente tenerlos en cuenta. Sólo tendremos en cuenta
crioprotectores permeables.
280
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
VI-2. ANÁLISIS DEL LÍMITE DE SOLUBILIDAD SIN PRESENCIA DE
CRIOPROTECTORES
2.1. DIAGRAMAS DE FASES. LOS SISTEMAS EUTÉCTICOS SIMPLES
2.1.1 INTERPRETACIÓN DEL DIAGRAMA DE FASES
El diagrama de equilibrio de un sistema de dos componentes miscibles en
estado líquido, pero inmiscibles en estado sólido, y que se denomina sistema
eutéctico simple, se muestra en la figura 62.
DIAGRAMA DE FASES DEL CLORURO SÓDICO
0
A
-5
Temperatura/ºC
-10
B
-15
C
D
-20
E
-25
-30
0
5
10
15
20
25
Frac c ión en peso de la sal(% )
30
35
Figura 62
El programa necesario para poder obtener este gráfico se encuentra en el
anexo PROGRAMAS, en el apartado 21.
En el diagrama podemos distinguir cuatro regiones limitadas por tres curvas.
La curva AC es la curva de congelación y representa estados en los que el
disolvente sólido puro, está en equilibrio con la disolución líquida. La curva BC
es la curva de solubilidad y representa estados en los que la sal pura o
solvatada precipitada y la disolución líquida están en equilibrio.
281
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
La curva AC o curva de congelación es una curva de descenso crioscópico,
que nos va marcando el descenso del punto de congelación del agua, cuando
se añade la sal, viniendo dada la relación entre la cantidad de sustancia
añadida y el punto de congelación, por la ecuación que se muestra a
continuación, supuesta la disolución diluida ideal.
ln x A =
∆H f , A T − T A0
⋅
Ec. 383
R
T ⋅ TA0
donde xA es la fracción molar de disolvente puro en la disolución, TA0 es el
punto de congelación del disolvente puro, T es el nuevo punto de congelación
debido al aumento de la concentración del soluto disuelto, y ∆Hf,A es el calor
latente de fusión del disolvente puro.
Esta ecuación ya fue deducida teóricamente en el Capítulo 1 de
Fundamentos Termodinámicos, en el apartado 14.2 Descenso del Punto de
Congelación.
La curva BC se obtiene por los mismos razonamientos termodinámicos que
la curva AC, cambiando los papeles del soluto y el disolvente. Sin embargo,
vamos obtener teóricamente la ecuación de solubilidad, pues la que hemos
empleado en el programa para dibujar el gráfico, es ligeramente diferente a la
que obtendríamos de sustituir los papeles del soluto y disolvente en la ecuación
del descenso crioscópico.
2.1.1.1 Curva de solubilidad
En el caso de la solubilidad de un sólido en un líquido, la sustancia que
está en las dos fases es el soluto; por tanto en el equilibrio podemos
escribir:
µ Bs = µ Bl Ec. 384
donde µBs es el potencial químico del soluto sólido puro, y µBl es el potencial
químico del soluto en la disolución.
El potencial químico del soluto es:
µ Bl = µ B* + RT ln x B Ec. 385
donde µB* es el potencial químico del soluto puro, en fase líquida, y xB es la
fracción molar del soluto en la disolución saturada.
Operando resulta:
− ln x B =
µ B* − µ Bs ∆G f
Ec. 386
=
RT
RT
282
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
donde ∆Gf es la variación de la energía libre de un proceso de fusión.
Considerando un proceso infinitesimal, y que el sistema tiene dos grados
de libertad, podemos escribir:
d ln x B = −
=−
1  ∆G f
⋅ d
R  T
1 ∂
⋅
R ∂T

1  ∂
 = − ⋅ 
R  ∂T

 ∆G f

 T
 ∆G f

 T

∂  ∆G f
dT + 
∂p  T

 Gibbs − Helmholtz ∆H f
 dT
dT
=
RT 2

  P =CTE
dp  =
 
Ec. 387
donde ∆Hf es el calor latente de fusión del soluto puro.
Integramos entre unas condiciones de saturación conocidas, y unas
condiciones arbitrarias:
xB
∫
xB 0
T
d ln x B =
∆H f
∫ RT
2
dT ⇒ ln
T0
∆H f  1 1 
xB
 −  Ec. 388
=
xB0
R  T0 T 
donde xB0 y T0 son unas condiciones de saturación de la solución
conocidas, y xB y T son unas condiciones arbitrarias de saturación.
Por tanto la ecuación que expresa la solubilidad ideal de los solutos
sólidos en soluciones líquidas es:
 ∆H f
x B = x B 0 ⋅ exp
 R
 1 1 
⋅  −   Ec. 389
 T0 T  
Esta misma relación se cumple para fracciones en peso, puesto que la
fracción molar y la fracción en peso son directamente proporcionales.
283
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
2.1.2 ANÁLISIS DE GRADOS DE LIBERTAD
La regla de las fases nos indica cual es el número de variables
termodinámicas, que son necesarias para especificar el estado del sistema, a
falta de conocer la masa total del sistema.
La forma más común de formular la regla de las fases es:
GL = C − F + 2 Ec. 390
donde GL es el número de grados de libertad, C es el número de componentes
presentes en el sistema, y F es el número de fases del sistema.
Vamos a hacer un análisis de los grados de libertad de todas las regiones
de las que consta el diagrama de fases que nos ocupa.
Por encima de la curva de congelación (curva AC) y de la curva de
solubilidad (curva BC) el sistema está constituido por una única fase, una
disolución líquida de disolvente puro(agua), y de soluto puro(sal). Por lo tanto el
número de grados de libertad del sistema será:
C=2 agua y cloruro sódico
F=1 disolución líquida
GL=2-1+2=3
El sistema tiene tres grados de libertad. Si mantenemos constante la
presión, el sistema resulta entonces bivariante, es decir, necesitamos dos
variables termodinámicas para especificar el estado del sistema. Esto significa
que si especificamos su temperatura, no tendremos definido un sistema
concreto, pues disoluciones con distinta composición pueden tener la misma
temperatura. Necesitamos especificar otra variable del sistema, por ejemplo la
fracción en peso del soluto en la disolución.
Por lo tanto fijando la temperatura y la fracción en peso del soluto, el
sistema queda totalmente definido, es decir, podemos representarlo en el
diagrama de fases con un punto.
284
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
DIAGRAMA DE FASES DEL CLORURO SÓDICO
0
A
-5
Tem p e ratura
del s is tem a
* Disolución
líquida
Temperatura/ºC
-10
B
-15
C
D
-20
E
C o mposición de la
disolución líquida
-25
-30
0
5
10
15
20
25
Fracción en peso de la sal(% )
30
35
Figura 63
La región que queda limitada por las curvas AC, CD, y DA representa un
sistema formado por dos fases, disolvente sólido puro(hielo), en equilibrio con
la disolución líquida. El número de grados de libertad de este sistema será:
C=2 agua y cloruro sódico
F=2 hielo y disolución líquida
GL=2-2+2=2
El sistema tiene dos grados de libertad. Si mantenemos constante la presión
del sistema, entonces resulta monovariante, es decir, tan sólo necesitamos
conocer una única variable termodinámica para especificar el estado del
sistema.
Si fijamos la temperatura del sistema, existe una única composición de la
disolución líquida, que esté en equilibrio con el hielo a esa temperatura. Dicha
composición viene dada por la curva de descenso crioscópico (curva AC).
Análogamente si fijamos la composición de la disolución líquida en equilibrio
con el hielo, la temperatura a la cual este equilibrio es posible, es única,
viniendo dada por la curva de descenso crioscópico.
Por tanto, fijando bien la temperatura del sistema bien la composición de la
disolución líquida, el sistema queda totalmente definido, es decir, podemos
representar cada fase del sistema, por medio de un punto en el diagrama de
285
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
fases. Como el sistema está constituido por dos fases, el sistema estará
definido por dos puntos, uno sobre la curva de descenso crioscópico, que
representa a la disolución líquida, y otro sobre el eje vertical izquierdo, que
representa al disolvente sólido puro(hielo).
DIAGRAMA DE FASES DEL CLORURO SÓDICO
0
A
-5
*
Tem p e ratura
del s is tem a
Temperatura/ºC
-10 Hielo
* Disolución
líquida
B
-15
C
D
-20
E
Composición de
la disolución líquida
-25
-30
0
5
10
15
20
25
Frac c ión en peso de la sal(% )
30
35
Figura 64
La región que queda limitada por las curvas BC, CE, y EB representa un
sistema formado por dos fases, soluto sólido puro o solvatado (sal precipitada)
en equilibrio con la disolución líquida. El número de grados de libertad del
sistema será por tanto:
C=2 agua y cloruro sódico
F=2 soluto sólido puro, disolución líquida
GL=2-2+2=2
El sistema tiene dos grados de libertad. Si mantenemos constante la presión
del sistema, éste resulta entonces con un único grado de libertad. Necesitamos
conocer una única variable para especificar el estado del sistema.
Si fijamos la temperatura del sistema, existe una única composición de la
disolución que está en equilibrio con el soluto sólido puro o solvatado (sal
precipitada), a esa temperatura, y que viene dada por la curva de solubilidad.
Por tanto fijando bien la temperatura del sistema bien la composición de la
disolución líquida, el sistema queda totalmente definido, pudiéndose
286
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
representar por dos puntos en el diagrama de fases. La disolución líquida sobre
la curva de solubilidad, y el soluto sólido sobre el eje vertical derecho. Sin
embargo en los gráficos que hemos manejado hasta ahora, la afirmación
anterior no es del todo correcta, pues el eje vertical derecho está sobre un 35%
en peso de sal en la solución, y para poder dibujar el punto que representa a la
sal precipitada, debería estar sobre el 100%.
DIAGRAMA DE FASES DEL CLORURO SÓDICO
0
A
-5
Temperatura/ºC
-10
B
Tem p e r a tura
del s is tem a
-15
Disolución
líquida
*
C
D
-20
Sal
* 100%
E
-25
C o mposición de la
disolución líquida
-30
0
5
10
15
20
25
Frac c ión en peso de la sal(% )
30
35
Figura 65
La región del diagrama de fases que queda por debajo de la curva DCE
representa un sistema formado por dos fases, soluto sólido puro o solvatado
(sal precipitada), en equilibrio con el disolvente sólido puro(hielo). El número de
grado de libertad de este sistema será:
C=2 agua y cloruro sódico
F=2 soluto sólido puro o solvatado, disolvente sólido puro
GL=2-2+2=2
El sistema tiene dos grados de libertad. Si mantenemos constante la
presión, entonces nos quedamos con un único grado de libertad. Necesitamos
conocer una variable para especificar el estado del sistema.
Si fijamos la temperatura del sistema, éste queda totalmente definido, pues
podemos identificar los puntos que representan a las dos fases del sistema
sobre el diagrama, uno sobre el eje vertical derecho (soluto sólido puro o
solvatado) y otro sobre el eje vertical izquierdo (disolvente sólido puro).
287
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
DIAGRAMA DE FASES DEL CLORURO SÓDICO
0
A
-5
Temperatura/ºC
-10
B
-15
C
D
-20
Hielo
-25
Temperatura del sistem a
*
E
Sal
precipitada
100%
*
-30
0
5
10
15
20
25
Frac c ión en peso de la sal(% )
30
35
Figura 66
Para finalizar vamos a analizar los grados de libertad del punto eutéctico. El
punto eutéctico es el punto donde se cortan las curvas AC, y BC, y representa
un sistema en el que coexisten tres fases, soluto sólido puro o solvatado (sal
precipitada), disolvente sólido puro (hielo), y disolución líquida. El número de
grados de libertad de este sistema será:
C=2 agua, cloruro sódico
F=3 soluto sólido puro, disolvente sólido puro, disolución líquida
GL=2-3+1=1
El sistema en dicho punto tiene un único grado de libertad. Si mantenemos
la presión constante, el sistema resulta invariante, es decir, con cero grados de
libertad. El estado eutéctico viene determinado por una única temperatura y
una única composición.
Para el caso de soluciones acuosas de cloruro sódico el punto eutéctico se
da a una temperatura de –21.2ºC y con una concentración del cloruro sódico
del 22.5% en peso. Estos valores son ligeramente diferentes a los que marcan
la gráfica.
El sistema no modificará ni su temperatura ni su composición,
mientras no se modifique el número de fases presentes.
288
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
2.1.3 EJEMPLO
Veamos qué sucede cuando una disolución líquida de composición k, se
enfría a lo largo de la línea kp, a presión constante.
DIAGRAMA DE FASES DEL CLORURO SÓDICO
0
A
*k
-5
*l
Temperatura/ºC
-10
ñ
m
*
n
*
*
B
-15
C
ll
D
-20
*
E
*
PE
-25
*p
-30
0
5
10
15
20
25
Frac c ión en peso de la sal(% )
30
35
Figura 67
En el punto k, el sistema está constituido por una disolución líquida. Cuando
enfriamos esta disolución y alcanzamos el punto l, comienza a separarse
disolvente sólido puro, es decir, comienza a formarse hielo; el sistema está
ahora constituido por dos fases, la disolución líquida en equilibrio con el hielo
formado.
Esta formación de hielo deja a la disolución líquida cada vez más
concentrada en el soluto, es decir, el cloruro sódico, con la consiguiente
disminución de la temperatura de equilibrio, que se desplaza a lo largo de la
curva AC, lo que nos permite tener una disolución acuosa líquida a
temperaturas inferiores a los cero grados centígrados.
El punto m del diagrama, representa un sistema en el que coexisten una
disolución líquida, representada por el punto n, y disolvente sólido puro(hielo),
representado por el punto ñ. El conocimiento de la posición del punto m,
suministra información adicional; podemos conocer la proporción que hay entre
las dos fases en equilibrio, a través de la regla de la palanca.
289
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
A medida que se forma más hielo, se alcanza un punto en el que la solución
se satura de sal(cloruro sódico), comenzando a precipitar la sal como un sólido
puro o solvatado. Esta situación está representada en el diagrama de fases por
el punto ll. Este punto representa un estado en el que coexisten tres fases,
disolvente sólido puro(hielo), soluto sólido puro o solvatado(sal precipitada), y
disolución líquida con la composición del eutéctico.
En este momento el sistema se hace invariante, a una presión fija. Si
seguimos enfriando el sistema, se formará más hielo, y precipitará más sal,
pero sin modificarse ni la temperatura del sistema, ni la composición de la
disolución líquida que aun existe, y que es la composición del eutéctico. Esta
situación se prolonga mientras exista disolución líquida. Cuando desaparece
todo el líquido, el sistema estará compuesto por dos fases sólidas, hielo y sal
precipitada. La temperatura de este sistema ahora si disminuye, conforme lo
enfriamos, hasta que llegamos al punto final p.
290
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
2.2. EFECTO DE LA SOLUBILIDAD EN EL PROCESO DE DESHIDRATACIÓN
A continuación vamos a describir los procesos que acontecen tanto en el
medio intracelular como extracelular, ayudándonos del diagrama de fases y de
un análisis de los grados de libertad del sistema, que se vieron en la pregunta
anterior.
En el proceso de deshidratación celular, podemos distinguir dos etapas,
cuando consideramos el hecho de que el cloruro sódico no puede aumentar su
concentración indefinidamente.
La primera etapa de deshidratación tiene lugar mientras en el medio
extracelular no se alcancen las condiciones del punto eutéctico. La segunda
etapa comienza cuando el medio extracelular alcanza a dicho punto eutéctico.
2.2.1 PRIMERA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN
El medio extracelular, a partir de la temperatura de cambio de fase
sólido-líquido, igual a –1.1148ºC, correspondiente al punto 1 del gráfico,
comienza a formar hielo, concentrando la solución extracelular en sales.
Este proceso de formación de hielo y de concentración del medio
extracelular prosigue hasta que no alcancemos las condiciones del punto
eutéctico.
EVOLUCIÓN DEL MEDIO EXTRACELULAR
0
1
*
-5
Curva de descenso
crioscópico
Temperatura/ºC
-10
Curva de
solubilidad
-15
2
*Punto
-20
Eutéctico
-25
-30
0
5
10
15
20
25
Fracción en peso de sal(% )
30
35
Figura 68
291
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
La evolución del medio extracelular se lleva a cabo sobre la curva de
descenso crioscópico, debido a que éste evoluciona por sucesivos estados
de equilibrio. El análisis de los grados de libertad del medio extracelular es:
C=2 Agua, cloruro sódico
F=2 Hielo, disolución líquida
GL=2-2+2=2
Si consideramos que la presión del medio extracelular es constante y
conocida, el número de grados de libertad se reduce en uno, resultando un
sistema monovariante. Fijando la temperatura del sistema, su composición
es dada. A partir de ahora consideraremos siempre la hipótesis de presión
constante.
Mientras, el medio intracelular comienza a deshidratarse en respuesta al
aumento de concentración del medio extracelular. Esta deshidratación
modelada mediante la ecuación deducida en el apartado 6.4.2 Ley de
Enfriamiento Lineal, del capítulo de Deshidratación Celular, continúa hasta
alcanzar la temperatura del punto eutéctico (punto A).
En el gráfico de la figura 69, dibujamos la evolución de la deshidratación
de células de espermatozoides de ratón, cuando son enfriadas mediante un
perfil de enfriamiento lineal, de 30ºC/min.
DESHIDRATACIÓN DE ESPERMA DE RATÓN
0
*1
-5
Curva de descenso
c rioscópico
Temperatura/ºC
-10
Curva de
solubilidad
-15
2
Temperatura
del eutéctico
-20
A
* Punto
eutéctico
-25
-30
0
5
10
15
20
Fracción másica/%
25
30
35
Figura 69
292
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
El programa necesario para poder dibujar el gráfico anterior se muestra
en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 22.
El análisis de los grados de libertad del medio intracelular es:
C=2 Agua, cloruro sódico
F=1 disolución líquida
GL=2-1+1=2
Como podemos ver, el sistema resulta bivariante.
2.2.2 SEGUNDA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN
Cuando el medio extracelular alcanza las condiciones del punto
eutéctico, el sistema extracelular en su conjunto no puede disminuir su
temperatura, y la disolución líquida extracelular en particular no puede
seguir aumentando su concentración.
La razón de este comportamiento está en que el medio extracelular tiene
cero grados de libertad, como consecuencia de la aparición de una nueva
fase, la sal sólida pura o solvatada que ha precipitado.
C=2 Agua, cloruro sódico
F=3 Hielo, solución líquida saturada, sal precipitada
GL=2-3+1=0
La razón de que aparezca una nueva fase reside en la imposibilidad de
seguir aumentando la concentración de la disolución líquida extracelular.
Cuando alcanzamos el punto eutéctico, parte del agua que forma la
disolución líquida saturada forma hielo. Este proceso tendería a incrementar
la concentración de la sal en la disolución líquida saturada, lo cual es
imposible, por lo que parte de la sal precipita.
Esta situación de inmovilismo térmico y de concentración persistirá
mientras no se reduzca en uno, el número de fases presentes en el sistema,
según se puede ver en el análisis de grados de libertad que se hizo
anteriormente. Esto significa que, mientras no desaparezca la última gota de
solución líquida saturada, para dar hielo y sal precipitada, el medio
extracelular permanecerá en las condiciones del punto eutéctico.
Por otra parte la evolución de la deshidratación de la célula, va a
depender de la velocidad con la que se produzca esta transformación de la
solución líquida saturada, en hielo y sal precipitada.
Vamos a considerar dos casos extremos.
•
En el primero la velocidad con la que se produce la
transformación de la solución líquida saturada, en hielo y sal
precipitada es lo suficientemente pequeña, como para permitir
que el medio intracelular alcance el equilibrio con el medio
293
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
•
extracelular, alcanzando la composición del punto eutéctico, y
aun permanezca solución líquida saturada en el medio
extracelular.
En el segundo la velocidad con la que se produce la
trasformación a hielo y sal precipitada, es infinita, es decir, el
tiempo necesario para que la solución líquida saturada
desaparezca es infinitamente pequeño. El sistema extracelular
permanece en las condiciones del punto eutéctico un instante
infinitesimal.
Una deshidratación real de una célula se encontrará entre ambos casos
extremos.
A continuación vamos a describir cómo sería la evolución de la
deshidratación celular en cada caso.
294
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
2.2.2.1 Caso 1: La solución líquida saturada extracelular desaparece después
de alcanzar el equilibrio con el medio intracelular
Cuando el sistema extracelular alcanza las condiciones del punto
eutéctico (punto 2), el medio intracelular llega a la temperatura de dicho
punto eutéctico, pero con una concentración en sales menor (punto A).
DESHIDRATACIÓN DE ESPERMA DE RATÓN
0
*1
-5
Curva de descenso
c rioscópico
Temperatura/ºC
-10
Curva de
solubilidad
-15
2
Temperatura
del eutéctico
-20
A
* Punto
eutéctico
-25
-30
0
5
10
15
20
Fracción másica/%
25
30
35
Figura 70
Puesto que el medio extracelular tiene cero grados de libertad, su
temperatura no cambia a pesar de seguir enfriando al sistema. La
energía retirada del sistema se invierte en transformar la disolución
líquida saturada extracelular, en hielo y sal precipitada.
Como la temperatura del medio intracelular viene impuesta por las
condiciones del medio extracelular, la temperatura del interior de la
célula también permanecerá constante. Por lo tanto el sistema
intracelular continúa deshidratándose, pero bajo una condición de
temperatura impuesta constante.
El análisis de grados de libertad del medio intracelular en esta
situación es:
C=2 Agua, cloruro sódico
F=1 Disolución líquida
GL=2-1+1=2
295
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Como tenemos una condición de temperatura impuesta, el número de
grados de libertad se reduce en uno, resultando un sistema
monovariante. Esto es coherente con lo que acabamos de explicar, pues
independientemente de la composición de la solución intracelular, su
temperatura es constante y conocida.
La célula continúa deshidratándose bajo estas condiciones, hasta que
llega al punto eutéctico (punto 2). Una vez que el medio intracelular
alcanza los parámetros del punto eutéctico, la deshidratación se detiene,
por encontrarse el interior de la célula en equilibrio con el exterior.
DESHIDRATACIÓN DE ESPERMA DE RATÓN
0
*1
-5
Medio extracelular
Temperatura/ºC
-10
Medio intracelular
-15
P rimera etapa
de deshidratación
A
-20
2
*
Segunda etapa
de deshidratac ión
a temperatura
constante
-25
-30
0
5
10
15
20
Fracción másica/%
25
30
35
Figura 71
El número de grados de libertad del medio intracelular, en el punto
eutéctico es:
C=2 Agua, cloruro sódico
F=1 Disolución líquida
GL=2-1+1=2
La condición de temperatura impuesta reduce en uno el número de
grados de libertad. La condición de flujo osmótico nulo, es decir, la
ausencia de deshidratación, reduce de nuevo en uno los grados de
libertad, por lo que al final el sistema intracelular, al igual que el medio
extracelular resulta invariante.
296
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
El sistema en estas condiciones permanece como paralizado, pues
no modifica ni su temperatura ni su composición. Esta situación de
inmovilismo concluye cuando la última gota de solución líquida saturada
extracelular se transforma en hielo y sal precipitada, momento en el cual
la temperatura del sistema comienza de nuevo a disminuir, al tener tanto
el sistema intracelular como extracelular un grado de libertad.
Análisis de los grados de libertad del medio extracelular.
C=2 Agua, cloruro sódico
F=2 Hielo, sal precipitada
GL=2-2+1=1
Análisis de los grados de libertad del medio intracelular.
C=2 Agua, cloruro sódico
F=1 Disolución líquida saturada
GL=2-1+1=2
Como la condición de flujo osmótico nulo permanece, el número de
grados de libertad se reduce en uno, resultando un sistema
monovariante.
A partir de este momento el subenfriamiento del sistema intracelular
crece indefinidamente, puesto que la temperatura del sistema es
monótonamente decreciente, y la temperatura de equilibrio para la
composición del sistema, es la temperatura del eutéctico, de manera que
por cada grado centígrado que disminuya la temperatura del sistema, el
subenfriamiento aumenta en un grado centígrado.
Si consideramos que justamente cuando el medio intracelular alcanza
las condiciones del punto eutéctico, en el medio extracelular la última
gota de disolución líquida saturada desaparece, la evolución del
subenfriamiento es la indicada en la figura 72.
297
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
Subenfriam iento/ºC
25
20
15
10
-30ºC/m in
5
0
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
Temperatura/ºC
-15
-10
-5
0
Figura 72
El programa necesario para poder dibujar este gráfico se muestra en
el anexo PROGRAMAS, en el apartado 23.
Observamos como al llegar a la temperatura del eutéctico el
subenfriamiento se reduce a cero, para posteriormente crecer
indefinidamente de forma lineal. La línea a trazos indica cual hubiera sido
la evolución del subenfriamiento de no existir la condición de temperatura
impuesta desde el medio extracelular.
Llegaremos a una temperatura en la que sea imposible evitar la
formación de hielo intracelular. Cuando aparezca hielo dentro de la
célula el número de grados de libertad se reduce a cero.
La temperatura interior de la célula permanecerá constante mientras
exista solución líquida saturada intracelular. En el momento en que sólo
tengamos hielo y sal precipitada dentro de la célula, el sistema volverá a
ser monovariante, es decir, volverá a reducirse la temperatura.
Debido al desequilibrio térmico entre el interior y el exterior de la
célula, el medio intracelular se enfriará más deprisa que el extracelular,
hasta que finalmente ambos tengan la misma temperatura.
Para ver el efecto de la velocidad de enfriamiento, consideramos
varias velocidades de enfriamiento lineal.
298
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
La evolución de la concentración de la sal con respecto a la
temperatura del sistema se muestra en la figura 73:
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
0
-5
Temperatura/ºC
-10
-10ºC/m in
-25
-15
-60 -40
-30
Deshidratación a temperatura constante
-20
-25
-30
0
5
10
15
20
Fracción másica/%
25
30
35
Figura 73
La evolución del subenfriamiento para distintas velocidades de
enfriamiento se muestra en la figura 74.
299
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
Subenfriam iento/ºC
25
20
-60ºC/min
15
-40ºC/m in
10
-25
-30
5
-10
0
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
Temperatura/ºC
-15
-10
-5
0
Figura 74
300
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
2.2.2.2 Caso 2: La solución líquida saturada extracelular desaparece
instantáneamente
Cuando el sistema extracelular alcanza las condiciones del punto
eutéctico (punto 2), el medio intracelular llega a la temperatura de dicho
punto eutéctico, pero con una concentración en sales menor (punto A).
DESHIDRATACIÓN DE ESPERMA DE RATÓN
0
*1
-5
Curva de descenso
c rioscópico
Temperatura/ºC
-10
Curva de
solubilidad
-15
2
Temperatura
del eutéctico
-20
A
* Punto
eutéctico
-25
-30
0
5
10
15
20
Fracción másica/%
25
30
35
Figura 75
Como el medio intracelular deja de ser invariante instantáneamente,
la temperatura del sistema no permanece constante en ningún momento.
En esta situación tenemos un medio extracelular formado
exclusivamente por hielo y sal precipitada, y un medio intracelular
constituido por una solución líquida.
Este medio intracelular continuará deshidratándose, y disminuyendo
su temperatura. Sin embargo la ley de deshidratación que seguirá, será
distinta, pues ahora en el medio extracelular tan solo tenemos hielo y sal
precipitada. No obstante, para poder modelar matemáticamente la
deshidratación de la célula en esta nueva etapa, vamos a suponer que
alrededor de cada célula existe una delgada capa de solución líquida
saturada, de composición constante e igual a la del eutéctico. Esta
hipótesis, que denominamos Hipótesis de la Capa Líquida Saturada se
explica más detalladamente en el siguiente apartado, junto con el
desarrollo del modelo matemático de la deshidratación.
301
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
La evolución gráfica de la deshidratación se muestra en la gráfica de
la figura 76, donde mostramos el caso de un enfriamiento lineal a
30ºC/min.
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
0
1
Curva de descenso crioscópico
-5
Temperatura/ºC
-10
1ª etapa de
deshidratación
-15
A
Temperatura
del eutéctico
-20
2ª etapa de
deshidratación
2
Curva de
solubilidad
B
-25
-30
0
5
10
15
20
Fracción másica/%
25
30
35
Figura 76
Los programas necesarios para poder obtener este gráfico, se
encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 24.
La célula continúa deshidratándose bajo estas condiciones, hasta el
punto de corte con la curva de solubilidad, punto B. En este punto, el
medio intracelular alcanza las condiciones de saturación. Un análisis de
los grados de libertad se muestra a continuación.
C=2 Agua, cloruro sódico
F=2 Disolución líquida saturada, sal precipitada
GL=2-2+1=1
En esta nueva situación, conforme enfriamos el sistema, la
temperatura, tanto del medio intracelular, como del extracelular
disminuyen.
Bajo la hipótesis de la Capa Líquida Saturada, alrededor de la célula
hay una delgada capa de disolución líquida con la composición del
eutéctico. Puesto que la composición del medio intracelular, que está
saturado, tiene una concentración inferior a la del eutéctico, la célula
302
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
tiende a seguir deshidratándose, y puesto que la concentración no puede
aumentar, comienza a precipitar sal en el interior de la célula.
Teóricamente continuaríamos hasta tener en el interior de la célula
únicamente sal. Sin embargo, probablemente debido a problemas para
transportar agua hacia la membrana, en su interior siempre quedará
solución líquida saturada. En el momento en que se deshidrata por
completo la célula, la capa de líquido saturado alrededor de la célula
desaparece. La evolución del sistema es por tanto una vertical.
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
0
1
-5
Curva de descenso crioscópico
Temperatura/ºC
-10
1ª etapa de
deshidratación
-15
-20
2
A
Temperatura
del eutéctico
2ª etapa de
deshidratación
Curva de
solubilidad
B
3ª etapa de
deshidratación
-25
-30
0
5
10
15
20
Fracción másica de sal/%
25
30
35
Figura 77
A partir de este momento el sistema estará constituido por un medio
extracelular formado por hielo y sal precipitada, y un medio intracelular
formado por sal precipitada, y algo de solución líquida saturada. La
temperatura del sistema en estas condiciones se reduce
indefinidamente.
El subenfriamiento de este proceso de deshidratación crece
indefinidamente, sin excluir la existencia de máximos locales al comienzo
del subenfriamiento. A partir del punto de corte con la curva de
solubilidad, punto B, por cada grado centígrado que disminuye la
temperatura del sistema, el subenfriamiento aumenta un grado
centígrado, es decir, todo el descenso de temperatura se invierte en el
subenfriamiento.
303
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
La evolución gráfica del subenfriamiento, para el caso de
espermatozoides de ratón, enfriados mediante un perfil lineal de
–30ºC/min se muestra en la figura 78:
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
25
Subenfriam iento/ºC
3ª etapa
20
15
2ª etapa
1ª etapa
10
5
0
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
Temperatura/ºC
-15
-10
-5
0
Figura 78
El programa necesario para poder obtener el gráfico anterior, se
muestra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 25.
Para comparar con los subenfriamientos que se producirían si no
tuviésemos límites de solubilidad, hemos dibujado la línea a trazos.
Para ver el efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el fenómeno
de la solubilidad, calculamos las curvas de deshidratación y
subenfriamiento con respecto a la temperatura para varias velocidades
de enfriamiento lineal en la figura 79 y 80 respectivamente.
304
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
0
-5
-10
Temperatura/ºC
-10ºC/m in
-15
-60
-30
-25
-40
-20
-25
-30
-35
-40
0
5
10
15
20
Fracción másica/%
25
30
35
Figura 79
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
30
*
Subenfriam iento/ºC
25
20
-60
-40
15
*
*
10
-30
* *
5
-25
-10ºC/m in
0
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
Temperatura/ºC
-15
-10
-5
0
Figura 80
305
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Como último punto queremos comentar la evolución del sistema
intracelular a partir del punto A. Teóricamente el medio intracelular
debería tender asintóticamente a la composición del eutéctico. Sin
embargo, según observamos siguiendo las líneas a trazos verdes, esto
sólo sucede cuando la velocidad de enfriamiento es suficientemente
pequeña.
¿Qué está sucediendo?. La respuesta es muy simple. La
permeabilidad de la membrana se reduce a cero antes de poder alcanzar
el equilibrio con el medio exterior.
Recordamos que en el caso de las membranas de espermatozoides
de ratón, la permeabilidad se hacía nula en torno a los –35ºC. Vemos
cómo efectivamente en el gráfico, las evoluciones verticales(flujo
osmótico nulo) arrancan desde esa temperatura.
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
0
-10
Temperatura/ºC
-20
-30
-40
-50
-60
0
5
10
15
20
Fracción másica/%
25
30
35
Figura 81
306
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
2.3. MODELOS TEÓRICOS DE DESHIDRATACIÓN CON DISOLUCIONES SATURADAS
2.3.1 MODELO DE DESHIDRATACIÓN CELULAR CON EL MEDIO EXTRACELULAR CON
COMPOSICIÓN CONSTANTE
2.3.1.1 Hipótesis de la Capa Líquida Saturada
En el instante en el que el medio extracelular solo tuviéramos hielo y
sal precipitada, las ecuaciones de deshidratación que hemos planteado,
no serían aplicables. Al plantear estas ecuaciones, supusimos que el
medio extracelular era una solución líquida en equilibrio con el hielo
formado.
Podemos suponer que en el instante en que el medio extracelular
sólo tiene hielo y sal precipitada, la evacuación de agua por parte de la
célula genera, alrededor de ésta, una capa delgada de solución líquida.
Es muy probable que en las regiones adyacentes a la membrana
celular, tengamos sal precipitada. Debido a la pequeña cantidad de masa
de esta película alrededor de la célula, con una pequeña fracción de esa
sal precipitada conseguiríamos alcanzar las condiciones de saturación.
Por lo tanto con estas hipótesis, mientras exista deshidratación
celular, existirá la capa de solución líquida saturada alrededor de cada
célula.
307
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
2.3.1.2 Modelo matemático de la deshidratación
La ecuación para modelar la deshidratación, va a ser Ec178, que fue
obtenida en el apartado 6.2 del capítulo 4.
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
P ex
Ec. 391
⋅
ln
=
dt
VA*
P in
Para un proceso de enfriamiento, la temperatura T, y la variable
tiempo t, están relacionadas. Para un perfil de enfriamiento lineal esta
relación es de la forma:
dT
= − B Ec. 392
dt
Sustituyendo esta expresión en la ecuación Ec391 tenemos:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
P ex
Ec. 393
=
⋅
ln
dT
V A* ⋅ B
P in
A continuación calcularemos las expresiones de las presiones Pex y
P . Cuando se dedujo la ecuación de deshidratación en el apartado 6.2
del capítulo 4, que ahora hemos visto que sólo es válida antes de que
alcancemos las condiciones del punto eutéctico en el medio extracelular,
dichas presiones fueron obtenidas del siguiente modo:
in
•
Presión intracelular Pin. Aplicando la ley de Raoult y
despreciando la contribución a la presión total de los solutos,
llegábamos a la siguiente expresión:
P in = PA*,l (T ) ⋅ x inA Ec. 394
Esta expresión será la que también empleemos en este
modelo.
•
Presión extracelular Pex. Aplicando principios de equilibrio
termodinámico entre fases, y despreciando la contribución a la
presión de los solutos, llegábamos a la siguiente expresión:
P ex = PA*, s (T ) Ec. 395
Sin embargo ahora que conocemos la composición del medio
extracelular, no vamos a emplear dicha expresión, sino que
aplicaremos una análoga a la empleada en el medio
intracelular, aplicando las mismas hipótesis simplificatorias. Por
tanto la expresión de la presión extracelular es de la forma:
308
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
P ex = PA*,l (T ) ⋅ x ex
Ec. 396
A
Sustituyendo en la ecuación Ec393 las ecuaciones Ec394 y Ec396
tenemos:
x ex
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
A
Ec. 397
⋅
ln
=
*
dT
VA ⋅ B
x inA
Recordamos que la expresión de la fracción molar de disolvente, en
función del volumen celular era de la forma(apartado 6.2 del capítulo 4):
xinA =
(
V − nB ⋅ Vm∞, B + nCPA ⋅ Vm∞, CPA
(
∞
m, B
V − nB ⋅ V
∞
m , CPA
+ nCPA ⋅ V
) + (ν
B
)
⋅ nB + nCPA ) ⋅ VA*
Ec. 398
Sustituyendo Ec398 en Ec397, finalmente la expresión de la
deshidratación celular es:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dT
V A* ⋅ B
Vsol = n B ⋅ Vm∞, B


V − Vsol
⋅ ln x ex
A − ln
*
V − Vsol + n sol ⋅ V A 

∞
+ nCPA ⋅ Vm ,CPA
Ec. 399
n sol = ν B ⋅ n B + nCPA
La composición del medio extracelular, la conocemos en términos de
fracción másica. Sin embargo en la ecuación anterior lo que tenemos es
la fracción molar de disolvente. Para poder pasar de fracción másica a
fracción molar, vamos a hacer una suposición. Supongamos que
tenemos una célula hipotética cuya composición es idéntica a la
composición del medio extracelular de mi problema. Supongamos
además que el número de moles dentro de esta célula hipotética son los
mismos que los de la célula de mi problema. En ese caso podemos
escribir:
x ex
A =
V − nB ⋅ VB∞
Ec. 400
V − nB ⋅ VB∞ + ν B ⋅ nB ⋅ VA*
La expresión de la fracción másica, en función del volumen de esta
célula hipotética es:
y =
ex
A
nB ⋅ Vm*, A ⋅
MB
V − Vsol + msol ⋅
MA
Vm*, A
MA
Vsol = nB ⋅ Vm∞, B + nCPA ⋅ Vm∞,CPA
Ec. 401
msol = nB ⋅ M B + nCPA ⋅ M CPA
309
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Sustituyendo en esta expresión, el valor de la composición del
eutéctico, y el número de moles de sal, puesto que el de crioprotector es
nulo, obtenemos un volumen que llamaremos Veut, que sustituido en la
expresión de la fracción molar, nos da la composición del eutéctico, en
términos de fracción molar.
Por lo tanto la expresión final de la ecuación de deshidratación será:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dT
V A* ⋅ B
Vsol = n B ⋅ Vm∞, B


Veut − Vsol
V − Vsol
⋅ ln
− ln
*
*
V − Vsol + n sol ⋅ V A 
 Veut − Vsol + n sol ⋅ V A
+ nCPA ⋅ Vm∞,CPA
n sol = ν B ⋅ n B + nCPA
Ec. 402
310
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
VI-3. ANÁLISIS DEL LÍMITE DE SOLUBILIDAD CON PRESENCIA DE
CRIOPROTECTORES PERMEABLES
3.1. DIAGRAMAS TERNARIOS
3.1.1 INTERPRETACIÓN DEL DIAGRAMA DE FASES TERNARIO TRIDIMENSIONAL
Un diagrama de fases ternario tridimensional se muestra esquemáticamente
en la siguiente figura:
Figura 82
Cada uno de los sistemas binarios A-B, A-C, B-C se asume que son
sistemas eutécticos simples, como el que forma el cloruro sódico con el
agua y que fue descrito en el apartado 2.1 Diagrama de Fases. Los
Sistemas Eutécticos Simples. Estos diagramas binarios los podemos ver en
cada uno de las tres caras verticales del prisma sobre el que está construido
este diagrama. Así, sobre la cara vertical que se apoya en el lado A-C de la
base del prisma, podemos ver claramente un clásico diagrama de fases de
un sistema eutéctico simple. El punto eutéctico del sistema binario A-C sería
el punto E3. La línea TA-E3 es la curva de descenso crioscópico de A al ir
311
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
añadiendo componente C, mientras que la línea TC-E3 es la curva de
solubilidad de la componente C en A.
Este punto eutéctico, recordamos que representaba el límite hasta el que
podíamos reducir la temperatura de cambio de fase sólido-líquido de un
componente puro por adición de otro componente.
Recordamos también, que una disolución líquida con la composición del
eutéctico solidifica a temperatura constante, formando dos fases sólidas
simultáneamente siendo este proceso denominado reacción eutéctica. En el
caso de la mezcla de cloruro sódico y agua, la reacción eutéctica consistía
en la transformación de la disolución líquida con la composición del
eutéctico, en hielo y sal precipitada. El hecho de que esta transformación se
produjera a temperatura constante se debía a que el sistema tenía cero
grados de libertad.
La adición de un tercer componente a cada uno de los sistemas
Eutécticos simples va a reducir los puntos de reacción eutéctica desde E1,E2
y E3 hasta el eutéctico ternario E4. En este punto eutéctico ternario, la
disolución líquida de componente E4 solidificará a temperatura constante
formando tres fases sólidas simultáneas; el sistema en este punto
permanece invariante.
La superficie TAE3E4E1 está generada por una familia de curvas de
descenso crioscópico que parten de la curva TAE1, que es la curva de
descenso crioscópico del sistema binario A-B, y se van modificando
conforme añadimos componente C. Por lo tanto, un punto sobre esta
superficie representa un sistema formado por componente A en fase sólida
y una disolución líquida formada por A, B y C.
312
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Figura 83
Para poder comprender mejor este diagrama podemos suponer que el
componente A es agua, el componente B es cloruro sódico y el componente
C es crioprotector. Por lo tanto, los puntos de la superficie que acabamos de
describir corresponden a sistemas en los que una disolución acuosa de sal
y crioprotector están en equilibrio con hielo.
El análisis de los grados de libertad del sistema es el siguiente:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=2 Hielo, solución líquida
GL=3-2-+1=2
En un sistema que cumpla estas características , tan sólo necesito
conocer la temperatura del sistema y la concentración de uno de los
componentes, para tener totalmente definida la composición de la disolución
líquida.
La superficie TCE3E4E2 está formada por una familia de curvas de
solubilidad que parten de la curva TCE3, que es la curva de solubilidad de
solubilidad del crioprotector (C) en agua (A), y que se van modificando
conforme añadimos cloruro sódico (B). Por lo tanto, un punto sobre esta
superficie representa un sistema formado por una disolución líquida de
313
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
cloruro sódico y crioprotector saturada en crioprotector, en equilibrio con
crioprotector precipitado.
Figura 84
Los grados de libertad del sistema son:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=2 Disolución líquida saturada en
precipitado
GL=3-2+1=2
crioprotector,
crioprotector
La intersección de esta superficie con la descenso crioscópico genera
una curva formada por una familia de puntos eutécticos binarios, que parten
del punto E3 -punto eutéctico del sistema agua-crioprotector- y que se van
modificando conforme añadimos sal (B). Un punto sobre esta línea
representa un sistema formado por una disolución líquida de sal y
crioprotector, saturada en crioprotector y en equilibrio con hielo y
crioprotector precipitado.
Los grados de libertad del sistema son:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=3 Disolución líquida saturada en crioprotector, hielo, crioprotector
precipitado.
314
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
GL=3-3+1=1
En un sistema que cumpla estas características, tan sólo necesitamos
conocer la temperatura del sistema para tener totalmente definida la
composición de la disolución líquida.
La superficie TBE2E4E1 está formada por una familia de curvas de
solubilidad que parten de la curva TBE1, que es la curva de solubilidad del
cloruro sódico (B) en agua (A), y que se va modificando conforme añadimos
crioprotector (C). Por lo tanto, un punto sobre esta superficie representa un
sistema formado por una disolución líquida de cloruro sódico y crioprotector,
saturada en sal y en equilibrio con sal precipitada.
Figura 85
Los grados de libertad del sistema son:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=2 Disolución líquida saturada en ClNa, ClNa precipitado
GL=3-2+1=2
La intersección de estas dos superficies genera una curva formada por
una familia de puntos Eutécticos binarios, que parten del punto E1 –punto
eutéctico del sistema agua-sal (-21ºC, 22.5%p ClNa)- y que se va
modificando conforme añadimos crioprotector (C). Un punto sobre esta línea
315
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
representa un sistema formado por una disolución líquida de sal y
crioprotector, saturada en sal y en equilibrio con hielo y sal precipitada.
Los grados de libertad del sistema son:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=3 Disolución líquida saturada en ClNa, hielo, ClNa precipitado.
GL=3-3+1=1
La intersección de las dos curvas de puntos eutécticos binarios dan lugar
al punto eutéctico ternario E4. Este punto representa un sistema formado por
una disolución líquida acuosa de sal u crioprotector. Saturada en sal y
crioprotector y en equilibrio con hielo, sal precipitada y crioprotector
precipitado.
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=4 Hielo, disolución líquida saturada en sal y crioprotector, ClNa
precipitado, crioprotector precipitado.
GL=3-4+1=0
El sistema en el punto E4 resulta invariante al igual que ocurría con los
puntos Eutécticos en los sistemas binarios.
El sistema eutéctico ternario viene determinado por una única
temperatura y una única composición. El sistema no modificará ni su
temperatura ni su composición mientras no se modifique el número de fases
presentes. Esto en la práctica significa que hasta que todas la disolución
líquida saturada se transforme en hielo y en precipitado de sal y
crioprotector la temperatura del sistema no se reducirá.
316
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.1.2 DIAGRAMA DE FASES BIDIMENSIONAL
3.1.2.1 Interpretación del diagrama
Trabajar con el diagrama de fases tridimensional es muy poco práctico, por
lo complicado de su manejo. En la práctica, a la hora de caracterizar un
sistema ternario se emplean diagramas bidimensionales, en los que se pierden
la información de la temperatura del sistema, y lo único que aparece reflejado
es la composición de la disolución líquida que forma parte del sistema.
Un diagrama de este tipo se obtiene proyectando la intersecciones de las
superficies de descenso crioscópico y solubilidad sobre la base del prisma,
como se muestra en la figura 86.
Figura 86
Vemos como los puntos eutécticos simples E1, E2 y E3 quedan
representados por sus respectivas proyecciones E’1,E’2 y E’3. El punto eutéctico
ternario E4 queda representado por su proyección E’4. Igualmente, vemos como
la curva de puntos eutécticos bifásicos E1E4 al proyectarla queda representada
por la curva E’1E’4. Una representación bidimensional de este sistema ternario
se muestra en la figura 87:
317
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Figura 87
Los vértices del triángulo equilátero representan componentes puros. Los
puntos que pertenecen a los lados del triángulo representan mezclas bifásicas
mientras que puntos en el interior del triángulo representan mezclas de tres
componentes.
318
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.1.2.2 Propiedades de los diagramas bidimensionales
3.1.2.2.1 Coordenadas de un punto del interior del diagrama
Hasta ahora tan solo hemos presentado cuál es la procedencia de un
diagrama de fases bidimensional de un sistema ternario. A continuación
mostraremos como manejar estos diagramas, es decir, dado un punto dentro
del diagrama conocer la composición de la disolución líquida del sistema.
Para conocer la composición de un punto del interior del diagrama
aplicaremos semejanza de triángulos. Consideremos una disolución de tres
componentes representada en el diagrama por el punto M. Si trazamos por
dicho punto paralelas a los tres lados del triángulo obtendremos tres triángulos
interiores semejantes (dibujados en rojo).
Figura 88
Pues bien, la fracción de cada componente en la mezcla se obtiene como el
cociente de las alturas de los triángulos interiores entre la altura del triángulo
del diagrama.
Fracción de A =
Ma
Ec. 403
CD
Fracción de B =
Mb
Ec. 404
CD
Fracción de C =
Mc
Ec. 405
CD
319
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
A continuación vamos a mostrar una forma más sencilla de conocer la
composición de un punto del diagrama sin tener que trazar los triángulos
interiores y calcular el cociente de altura.
Vamos a fijarnos en el triángulo interior de altura Mc:
Figura 89
Por semejanza de triángulos podemos decir que: el cociente entre la
longitud de un lado del triángulo (Mg, AC) y la altura del triángulo (Mc,
CD) se mantiene constante. Por lo tanto, podemos escribir:
Mc Am
Ec. 406
=
CD AC
Puesto que el primer miembro de la igualdad representa la fracción
de componente C en la mezcla, dicha composición viene dada
directamente sobre el lado del triángulo, cuando éste tiene longitud
unitaria (AC=1).
Aplicando los mismos conceptos a los otros dos triángulos interiores
vemos que podemos conocer directamente la composición del sistema
mirando en los lados del triángulo.
320
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Figura 90
En el ejemplo del gráfico anterior, el sistema representado por el punto M
tiene un 20% en peso de glicerol, un 40% en peso de agua, y un 40% en peso
de sal.
321
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.1.2.2.2 Isoplectas
Definimos una isoplecta como la línea recta que parte de un vértice del
diagrama de fase ternario, y cuyo puntos tienen la propiedad de que la
proporción de dos de los componentes de la mezcla permanece cte.
Figura 91
En el gráfico de la figura 91 se muestran isoplectas donde la proporción de
componente B con respecto del C es constante para cada una de las rectas.
Si como supusimos A es agua, B es cloruro sódico y C es crioprotector,
cada una de estas líneas representan soluciones acuosas de sal y
crioprotector, donde la proporción de sal y crioprotector permanece constante.
322
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.1.2.3 Ejemplo
A continuación vamos a explicar como evolucionaría una disolución acuosa
de sal y crioprotector al ser enfriada, sobre un diagrama ternario bidimensional.
Un sistema ternario agua-sal-crioprotector podríamos visualizarlo a modo de
ejemplo mediante el siguiente diagrama de fase ficticio:
Figura 92
El punto M representa el sistema en el instante inicial. Cuando comenzamos
a enfriar el sistema la célula comienza a deshidratarse pero puesto que a
través de la membrana no pasa ni moléculas de sal ni de crioprotector, la
proporción entre dichos solutos permanece constante. Por lo tanto, la evolución
del sistema en esta primera etapa de deshidratación se produce a lo largo de
una isoplecta, según se muestra en la figura 93:
323
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Figura 93
324
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
En el diagrama bidimensional quedaría:
Figura 94
Este proceso de deshidratación continúa hasta que alcanzamos el punto N.
Cuando es sistema alcanza dicho punto la disolución líquida queda saturado en
sal. El sistema estará constituido por una disolución líquida saturada en sal en
equilibrio con hielo.
Si continuamos enfriando el sistema la célula seguirá deshidratándose a lo
largo de la curva E’1E’4. El sistema a lo largo de este proceso estará formado
por hielo, solución líquida saturada en sal y sal precipitada.
Esta deshidratación continúa hasta que alcanzamos el punto eutéctico
ternario E’4. En ese momento el sistema estará formado por hielo, solución
líquida saturada en sal y crioprotector, sal precipitada y crioprotector
precipitado. El sistema permanece a temperatura y composición constante
mientras no desaparezca la disolución líquida, al igual que sucedía con el punto
eutéctico de los sistemas binarios.
325
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.1.3 DIAGRAMA DE FASES BIDIMENSONAL DEL SISTEMA TERNARIO AGUA-CLNAGLICEROL
A continuación vamos a mostrar cómo sería el diagrama de fases, del
sistema ternario formado por agua, cloruro sódico, y el glicerol.
Este tipo de diagramas se obtiene de forma experimental. En el caso
particular que nos ocupa se ha empleado un análisis termal diferencial de
baja temperatura (DTA). Cada muestra fue inicialmente enfriada hasta los
–196ºC a una velocidad de enfriamiento lineal de 25ºC/min. Posteriormente,
las muestras fueron calentadas hasta los 25ºC a una velocidad constante
igual a 10ºC/min.
Los resultados de tales experimentos se muestran en la figura 95:
Figura 95
El punto eutéctico ternario ha sido obtenido por extrapolación y tiene las
siguientes características:
326
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Temperatura:-80ºC
Composición:28%p Agua
63%p Glicerol
9%p Cloruro sódico
En la figura 96 se muestran diferentes isoplectas sobre el diagrama
ternario.
Figura 96
El ratio que aparece en gráfico es la proporción de glicerol, frente a la
cantidad de sal. Así un ratio R=70/30 significa que tenemos 70 partes de
glicerol frente a tan sólo 30 partes de sal. Estos número pueden ser gramos,
moles, tanto por ciento en peso, tanto por ciento en moles, etc. Si
consideramos que son tantos por cientos en peso, podemos relacionar este
ratio con la molaridad inicial de la disolución:
327
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Ratio =
Peso Molecular Glicerol × Volumen inicial disolución
× Molaridad inicial Glicerol
Peso Molecular Cloruro Sódico
Ec. 407
Particularizando los datos numéricos para el caso de espermatozoides de
ratón, la expresión anterior queda:
Ratio = 5.52835 × Molaridad inicial Glicerol Ec. 408
El ratio aparece expresado en el diagrama como un cociente de la forma:
Ratio =
X
Ec. 409
100 − X
Vamos a determinar cual es la molaridad inicial de glicerol para una
isoplecta 70/30. Si sustituimos X=70 en la expresión anterior, obtenemos un
ratio igual a 2.21134. Si este valor del ratio lo sustituimos en la ecuación que
relacionaba el ratio con la molaridad, obtenemos que la molaridad inicial de
Glicerol es 0.4 M.
Como conclusión podemos decir que un espermatozoide de ratón con
una concentración inicial 0.4M de glicerol, no quedará saturada en sal hasta
alcanzar los –35ºC, con una concentración en sal del 15% en peso, y del
36% en peso de glicerol. Si seguimos enfriando la muestra quedará
saturada en Glicerol, a los –80ºC, cuando la composición de la disolución
sea un 9% en peso de sal, y un 63% en peso en glicerol.
328
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.1.4 SIMPLIFICACIÓN DE LA REPRESENTACIÓN BIDIMENSIONAL DE UN SISTEMA
TERNARIO
Cuando el sistema ternario agua-ClNa-crioprotector, evolucionando a lo
largo de una isoplecta, alcanza las condiciones de saturación de la sal,
continúa modificando su concentración de sal disuelta conforme progresa la
deshidratación celular , a lo largo de la línea N-T4, como se indica en la
figura 97.
Figura 97
Esto se ve claramente comparando la concentración de la sal en el
instante en que la solución alcanza las condiciones de saturación
(intersección de la curva MN, con la curva E1E4), que recordamos era
aproximadamente del 15% en peso de sal, y el instante en que la solución
alcanza las condiciones del punto eutéctico ternario, que recordamos era
aproximadamente del 9% en peso de sal.
Vemos como efectivamente la solución saturada va reduciendo el valor
de la saturación desde el 15% hasta el 9% a lo largo de la deshidratación.
Para simplificar el problema vamos a suponer que la solución intracelular
saturada en cloruro sódico, no va a modificar su composición con respecto a
la concentración de sal, es decir, que desde el instante en que alcanzamos
las condiciones de saturación de la sal, hasta el instante en que alcanzamos
329
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
el punto eutéctico ternario, la concentración de sal va a ser en todo
momento del 15%.
Para simplificar un poco más el problema, vamos a suponer además que
las leyes de solubilidad de un componente en agua son las mismas que las
de dicho componente en una solución ternaria. Lo que diferenciará a las dos
leyes de solubilidad será el punto de referencia. Esto significa que si la ley
de solubilidad del cloruro sódico en agua es :
 − ∆H fus ,ClNa  1
1
ref
X ClNa = X ClNa
⋅ exp
⋅  − ref
R
T T

 
  Ec. 410

donde XrefClNa es aproximadamente el 22% y Tref es aproximadamente
–21ºC, entonces la ley de solubilidad del cloruro sódico en agua y glicerol
será la misma, salvo que la saturación comienza a distinta temperatura y
con una concentración diferente:
 − ∆H fus ,ClNa  1
1
ref 2
X ClNa = X ClNa
⋅ exp
⋅  − ref 2
R
T T

 
  Ec. 411

donde Xref2ClNa es aproximadamente el 15% y Tref2 es aproximadamente
–35ºC.
Para seguir las evoluciones de la deshidratación celular del sistema
ternario vamos a emplear una representación gráfica bidimensional sobre
un diagrama rectangular. En el eje vertical representaremos la temperatura
del sistema, mientras que en el eje horizontal representaremos la fracción
másica del soluto, es decir, la de la sal más el crioprotector.
En una representación de este tipo, no tiene sentido dibujar las curvas de
solubilidad que hemos deducido en apartados anteriores, puesto que son
curvas de un solo componente en agua. Por tanto la representación gráfica
de estas curvas serán sobre un diagrama Temperatura-Concentración de un
soluto y no de la suma de concentraciones de dos solutos como tenemos
ahora.
Así la curva de solubilidad del cloruro sódico sólo tiene sentido dibujarla
en un diagrama Temperatura-Fracción másica de ClNa, y la curva de
solubilidad del glicerol sólo tiene sentido dibujarla en el diagrama
Temperatura-Fracción másica de glicerol. Sin embargo para poder visualizar
en un mismo gráfico las distintas fases por las que atraviesa la célula en su
deshidratación, teniendo delimitadas gráficamente las distintas regiones,
vamos a dibujar una curvas de solubilidad “ficticias”. La curva de solubilidad
ficticia del cloruro sódico la calculamos del siguiente modo: la composición
de un sistema ternario que acaba de saturarse en sal es 15% en peso de
sal, y 36% en peso de glicerol, cuando la concentración inicial de glicerol
era 0.4M. la concentración de los solutos en esta solución será la suma de
las concentraciones de sal y glicerol, es decir, un 51% en peso. Esta suma
ficticia, pues sumamos concentraciones de especies químicas diferentes,
330
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
será la concentración de referencia para la curva de solubilidad ficticia del
cloruro sódico.
Curva de solubilidad real del cloruro sódico en el sistema ternario.
 − ∆H fus ,ClNa
X ClNa = 0.15 ⋅ exp
R

1 
1
⋅ −
  Ec. 412
 T 238  
Curva de solubilidad ficticia del cloruro sódico en el sistema ternario.
 − ∆H fus ,ClNa  1
1 
X ClNa = 0.51 ⋅ exp
⋅ −
  Ec. 413
R
T
238



De igual forma se procede para dibujar la curva de solubilidad ficticia del
glicerol, donde debemos tener en cuenta que la concentración del cloruro
sódico permanece constante en todo momento.
Es importante hacer la aclaración de que a la hora de calcular
numéricamente la composición del sistema intracelular cuando se satura, no
empleamos las curvas de solubilidad ficticias, sino las reales. Por ejemplo
para calcular el momento en que el sistema intracelular queda saturado en
sal, lo que haremos será comprobar el momento en que la concentración
másica del cloruro sódico coincida con la concentración másica de
saturación del ClNa. Esto significa que calcularemos la intersección de la
curva de deshidratación y de solubilidad pero en los ejes TemperaturaFracción másica de ClNa.
Con estos datos, las curvas de descenso crioscópico y de solubilidad se
muestran en la figura 98.
331
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
DIAGRAMA DE FASES TERNARIO BIDIMENSIONAL
0
-10
1ª etapa de la curva
de descenso
crioscópico
-20
Temperatura/ºC
-30
-40
-50
Curva de solubilidad
ficticia del cloruro sódico
-60
2ª etapa de la curva
de descenso
crios c ópico
-70
-80
Curva de solubilidad
ficticia del glicerol
* Punto
e u téctico
-90
te rna rio
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/%
80
90
100
Figura 98
El programa necesario para poder dibujar el gráfico anterior se encuentra
en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 26.
Hay dos cosas importantes a comentar en este diagrama. La primera es
que ahora la solución no queda saturada en sal hasta que no alcanzamos
los –35ºC, mientras que cuando no había crioprotectores presentes estaba
en torno a los –20ºC. La segunda es que en ausencia de crioprotectores la
solución quedaba saturada en sal con una concentración del 22% en peso
aproximadamente, mientras que ahora la concentración necesaria de sal
para que la solución quede saturada es del 15% en peso aproximadamente.
La ley de descenso crioscópico con la solución saturada en cloruro
sódico se muestra en el apartado 3.3 de este mismo capítulo.
332
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.2. EFECTO DE LA SOLUBILIDAD EN EL PROCESO DE DESHIDRATACIÓN
En el proceso de deshidratación celular podemos distinguir cuatro etapas,
cuando consideramos el hecho de que tanto el cloruro sódico, como el
crioprotector no pueden aumentar indefinidamente su concentración.
La primera etapa de la deshidratación tiene lugar desde el instante inicial del
enfriamiento, hasta que en el medio extracelular alcanzamos las condiciones
de saturación del cloruro sódico.
La segunda etapa de deshidratación tiene lugar desde el instante en que el
medio extracelular queda saturado en cloruro sódico, hasta el instante en que
el medio intracelular queda también saturado en cloruro sódico.
La tercera etapa de deshidratación tiene lugar desde el instante en que el
medio intracelular queda saturado en cloruro sódico, hasta que en el medio
extracelular alcanzamos las condiciones de saturación del crioprotector.
La última etapa de deshidratación es la que tiene lugar desde el instante en
que el medio extracelular alcanzamos las condiciones de saturación del
crioprotector, hasta que en el medio intracelular se alcanzan también las
condiciones de saturación del crioprotector.
3.2.1 PRIMERA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN
El medio extracelular, a partir de la temperatura de cambio de fase sólidolíquido, que depende de la concentración de crioprotector para una célula dada,
comienza a formar hielo, concentrando la solución extracelular, en cloruro
sódico y crioprotector.
Este proceso de formación de hielo y de concentración del medio
extracelular prosigue mientras no alcancemos las condiciones de saturación del
cloruro sódico.
El análisis de los grados de libertad del medio extracelular en esta etapa de
deshidratación es:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=3 Hielo, disolución líquida
GL=3-2+2=3
Si consideramos que la presión del medio extracelular es constante y
conocida, el número de grados de libertad se reduce en uno, resultando un
sistema bivariante. Fijando la composición del sistema (fracción molar de sal y
de crioprotector), la temperatura es conocida.
A partir de este momento siempre consideraremos que la presión del medio
extracelular es constante y conocida.
333
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Mientras tanto el medio intracelular comienza la deshidratación en
respuesta al aumento de concentración del medio extracelular. Esta
deshidratación, modelada mediante la ecuación deducida en el apartado 2.2
del capítulo Los Crioprotectores, continúa hasta alcanzar la temperatura a la
cual el medio extracelular queda saturado en cloruro sódico. La temperatura del
sistema cuando alcanzamos dicho punto es de –33.95ºC.
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA AGUA-ClNa-GLICEROL
0
-10
-20
Concentración del
medio intracelular
Temperatura/ºC
-30
-40
Concentración del
medio extracelular
-50
-60
-70
-80
-90
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/% p
80
90
100
Figura 99
Los programas necesarios para poder dibujar esta gráfica se encuentran en
el anexo PROGRAMAS, en el aparatado 27.
Hay que hacer notar, que en esta representación gráfica, en el eje horizontal
tenemos la fracción másica de soluto, es decir, la fracción másica del cloruro
sódico, más la fracción másica del crioprotector.
El análisis de los grados de libertad del medio intracelular, en esta primera
etapa de deshidratación es:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=1 Disolución líquida
GL=3-1+2=4
334
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Si consideramos que la presión en el medio intracelular es constante y
conocida, el número de grados de libertad se reduce en uno, resultando un
sistema con tres grados de libertad. Fijando la composición del sistema
(fracción másica de cloruro sódico y crioprotector), y la velocidad de
enfriamiento , la temperatura es conocida.
A partir de este momento siempre consideraremos que la presión del medio
intracelular es constante y conocida.
Resumiendo, la célula se deshidrata bajo estas condiciones:
Medio extracelular: No está saturado en cloruro sódico.
No está saturado en crioprotector.
Medio intracelular: No está saturado en cloruro sódico.
No está saturado en crioprotector.
335
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.2.2 SEGUNDA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN
En esta segunda etapa, en el medio extracelular continúa formándose hielo,
y por tanto se tiende a aumentar la concentración de los solutos disueltos en la
solución líquida aun existente. Sin embargo al haber alcanzado las condiciones
de saturación del cloruro sódico, éste no puede seguir aumentando su
concentración, por lo que parte de los moles disueltos precipitarán. Por el
contrario el crioprotector sigue aumentando su concentración.
El análisis de los grados de libertad del medio extracelular, en esta segunda
etapa de deshidratación es:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=3 Hielo, disolución líquida saturada en ClNa, ClNa precipitado
GL=3-3+1=1
Mientras tanto el medio intracelular continúa la deshidratación, pero
siguiendo una ley de deshidratación diferente a la de la etapa anterior, puesto
que el medio exterior está saturado en sal.
Puesto que sólo conocemos evoluciona parcialmente la concentración del
medio extracelular, puesto que sabemos que la fracción másica de cloruro
sódico es constante pero no sabemos nada acerca de la evolución de la
concentración del crioprotector, no podemos aplicar la ley de Raoult al medio
exterior.
Sin embargo puesto que la concentración de crioprotector, suele ser en el
instante inicial del proceso de enfriamiento, como mínimo del orden de tres
veces la concentración del cloruro sódico, y puesto que esta etapa la
concentración de sal permanece constante, mientras la del crioprotector crece,
la composición del medio extracelular vendrá dada fundamentalmente por la
concentración del crioprotector.
Podemos suponer que el comportamiento del medio extracelular se ve
levemente afectado por la saturación en cloruro sódico, y por lo tanto la ley de
deshidratación de la célula en esta etapa será la misma que la de la etapa
anterior.
Esta simplificación, tendrá tanto menos error, cuanto mayor sea la
proporción de crioprotector frente a la sal en el instante inicial, para que así el
efecto de la sal sobre el comportamiento del medio extracelular sea pequeño.
336
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
0
1
-10
-20
Temperatura/ºC
-30
1ª etapa de
deshidratación
2
2ª etapa de A
-40
deshidratación
B
-50
-60
-70
3
-80
-90
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/% p
80
90
100
Figura 100
Los programas necesarios para poder dibujar esta gráfica se encuentran en
el anexo PROGRAMAS, en el apartado 28.
El análisis de los grados de libertad del medio intracelular en esta segunda
etapa de deshidratación es:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=1 Disolución líquida
GL=3-1+1=3
Resumiendo, la célula se deshidrata en esta segunda etapa bajo estas
condiciones:
Medio intracelular: Si está saturado en cloruro sódico.
No está saturado en crioprotector.
Medio intracelular: No está saturado en cloruro sódico.
No está saturado en crioprotector.
La temperatura final de esta segunda etapa es de –41.14ºC.
337
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.2.3 TERCERA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN
En esta nueva etapa, en el medio extracelular continúa formándose hielo,
mientras precipitan mas moles de sal, y aumenta la concentración de
crioprotector.
El análisis de lo grados de libertad del medio extracelular en esta tercera
etapa son los mismos que en la etapa anterior.
En el medio intracelular comienza a precipitar cloruro sódico, al estar la
solución saturada, mientras aumenta la concentración de crioprotector,
conforme se va deshidratando la célula.
La ley de deshidratación será diferente a la de la etapa anterior, a pesar de
seguir bajo la hipótesis de que la evolución del medio extracelular no se ve
significativamente afectada por estar saturado en sal. La razón está en que la
concentración de moles de sal permanece constante durante toda la etapa.
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
0
1
-10
-20
Temperatura/ºC
-30
1ª etapa de
deshidratación
2
2ª etapa de A
-40
deshidratación
B
-50
-60
3ª etapa de
deshidratación
-70
C
-80
3
-90
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/% p
80
90
100
Figura 101
Los programas necesarios para poder dibujar esta gráfica se encuentran en
el anexo PROGRAMAS, en el apartado 29.
El análisis de los grados de libertad del medio intracelular en esta tercera
etapa de deshidratación es:
338
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=2 Disolución líquida saturada en ClNa, ClNa precipitado
GL=3-2+1=2
Fijando la composición del sistema (fracción molar de crioprotector) y la
velocidad de enfriamiento, la temperatura es conocida.
En el gráfico de la figura 101 se puede observar que la deshidratación en
esta etapa es escasa debido a la pérdida de permeabilidad de la membrana.
339
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.2.4 CUARTA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN
Esta última etapa de deshidratación celular comienza cuando el medio
extracelular queda saturado en crioprotector, además de en cloruro sódico.
Para ver cual será el comportamiento del medio extracelular en estas
condiciones, calculamos el número de grados de libertad:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=4 Hielo, solución líquida saturada en ClNa y crioprotector, ClNa
precipitado, crioprotector precipitado
GL=3-4+1=0
Vemos como el medio extracelular tiene cero grados de libertad. Por lo tanto
el sistema extracelular en su conjunto no puede disminuir su temperatura, y la
disolución líquida en particular no puede seguir aumentando su concentración,
ni en cloruro sódico, ni en crioprotector.
El único proceso que tiene lugar es la reducción del volumen de disolución
líquida saturada extracelular, para formar hielo y precipitar sal y crioprotector.
La evolución de la deshidratación celular va a depender de la velocidad con
la que se produzca esta transformación de la disolución líquida saturada en
hielo y precipitado de sal y crioprotector.
Al igual que hicimos al estudiar la deshidratación celular sin presencia de
crioprotectores, consideraremos dos casos extremos
•
•
En el primero la velocidad con la que se produce la transformación de la
solución líquida saturada, en hielo y precipitado de sal y crioprotector es
lo suficientemente pequeña, como para permitir que el medio intracelular
alcance el equilibrio con el medio extracelular, alcanzando la
composición del punto eutéctico ternario, y aun permanezca solución
líquida saturada en el medio extracelular.
En el segundo la velocidad con la que se produce la trasformación a
hielo y precipitado de sal y crioprotector, es infinita, es decir, el tiempo
necesario para que la solución líquida saturada desaparezca es
infinitamente pequeño. El sistema extracelular permanece en las
condiciones del punto eutéctico ternario un instante infinitesimal.
Una deshidratación real de una célula se encontrará entre ambos casos
extremos.
A continuación vamos a describir cómo sería la evolución de la
deshidratación celular en cada caso.
340
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.2.4.1 La solución líquida saturada extracelular desaparece después de
alcanzar el equilibrio con el medio intracelular
Al igual que ocurría en el caso de ausencia de crioprotector, el medio
extracelular impone una condición de temperatura impuesta sobre el medio
intracelular, que continúa deshidratándose. El número de grados de libertad
del medio intracelular mientras se deshidrata a temperatura constante es:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=2 Disolución líquida saturada en ClNa, ClNa precipitado
GL=3-2+1=2
Como tenemos una condición de temperatura impuesta, el número de
grados de libertad queda reducido a uno. Fijando la composición del
sistema (fracción molar de crioprotector), podemos conocer la temperatura
del sistema, independientemente de la velocidad de enfriamiento.
La célula continúa deshidratándose bajo estas condiciones hasta que
finalmente el medio intracelular queda también saturado en crioprotector,
momento en el cual se detiene la deshidratación por encontrarse el interior de
la célula en equilibrio con el exterior. Sin embargo debido a la
impermeabilización de la membrana, por encontrarnos a tan bajas
temperaturas, impide este acercamiento al equilibrio. La célula no puede
deshidratarse cuando se alcanzan las condiciones de temperatura impuesta.
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
0
1
-10
-20
Temperatura/ºC
-30
1ª etapa de
deshidratación
2
2ª etapa de A
deshidratación
-40
B
-50
-60
3ª etapa de
deshidratación
-70
-80
C
-90
4ª etapa s in
deshidratación
*
3
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/% p
80
90
100
Figura 102
341
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
El número de grados de libertad del medio intracelular en estas condiciones
de bloqueo osmótico por falta de permeabilidad en la membrana es:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=2 Disolución líquida saturada en ClNa, ClNa precipitado
GL=3-2+1=2
La condición de temperatura impuesta reduce en uno el número de
grados de libertad. Igualmente, la condición de flujo osmótico nulo reduce
en uno el número de grados de libertad, resultando un sistema invariante.
El sistema en estas condiciones, permanece como paralizado, no
modifica ni su temperatura ni su composición.
Esta situación de parálisis termina cuando la última gota de solución
líquida extracelular saturada, se transforma en hielo y precipitado de sal y
crioprotector. En ese instante la temperatura del sistema comienza de
nuevo a disminuir, al tener tanto el sistema intracelular, como extracelular un
grado de libertad.
Análisis de los grados de libertad del medio extracelular.
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=3 Hielo, sal precipitada, crioprotector precipitado
GL=3-3+1=1
Análisis de los grados de libertad del medio intracelular.
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=2 Disolución líquida saturada en ClNa, ClNa precipitado
GL=3-2+1=2
Como la condición de flujo osmótico nulo permanece, el número de
grados de libertad se reduce en uno, resultando un sistema monovariante.
A partir de este momento el subenfriamiento del sistema intracelular
crece indefinidamente, puesto que la temperatura del sistema es
monótonamente decreciente, y la temperatura de equilibrio para la
composición del sistema, es constante, de manera que por cada grado
centígrado que disminuya la temperatura del sistema, el subenfriamiento
aumenta en un grado centígrado.
La evolución del subenfriamiento se indica en la figura 103.
342
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
70
60
Temperatura/ºC
50
3ª etapa de
deshidratación
40
30
2ª etapa de
deshidratación
1ª etapa de
deshidratación
20
Temperatura del eutéctico
10
0
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
Fracción másica de solutos/% p
-20
-10
0
Figura 103
El programa necesario para poder dibujar el gráfico anterior se encuentra
en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 30.
Observamos como al llegar a la temperatura del eutéctico el
subenfriamiento NO se reduce a cero, como debiera ocurrir si la
permeabilidad de la membrana fuera no nula. El sistema permanecerá a
dicha temperatura y por tanto manteniendo el subenfriamiento constante,
mientras en el medio extracelular exista solución líquida. En el momento en
que desaparece la última gota de solución líquida saturada extracelular el
subenfriamiento crece indefinidamente. La línea a trazos indica cual hubiera
sido la evolución del subenfriamiento de no existir la condición de
temperatura impuesta desde el medio extracelular.
Llegaremos a una temperatura en la que sea imposible evitar la
formación de hielo intracelular. Cuando aparezca hielo dentro de la célula el
número de grados de libertad se reduce a cero.
La temperatura interior de la célula permanecerá constante mientras
exista solución líquida saturada intracelular. En el momento en que sólo
tengamos hielo y sal precipitada dentro de la célula, el sistema volverá a ser
monovariante, es decir, volverá a reducirse la temperatura.
343
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Debido al desequilibrio térmico entre el interior y el exterior de la célula,
el medio intracelular se enfriará más deprisa que el extracelular, hasta que
finalmente ambos tengan la misma temperatura.
Si artificialmente conseguimos que la permeabilidad celular sea no nula a
bajas temperaturas, reduciendo por ejemplo la energía de activación a la
mitad, tenemos la siguiente evolución de la deshidratación celular:
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
0
1
Deshidratación con
permeabilidad modificada
-10
-20
Deshidratación con
permeabilidad
NO modificada
Temperatura/ºC
-30
-40
2
A
B
-50
-60
-70
3
-80
C
-90
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/%
80
90
100
Figura 104
Vemos que aunque exista permeabilidad a bajas temperaturas, las
condiciones de temperatura impuesta son prácticamente idénticas a las del
estado del eutéctico ternario, por lo la deshidratación a temperatura
constante es un periodo de deshidratación prácticamente despreciable.
Para ver el efecto de la velocidad de enfriamiento, consideramos varias
velocidades de enfriamiento lineal.
La evolución de la concentración de la sal con respecto a la temperatura
del sistema se muestra en la figura 105:
344
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
0
-10
-10ºC/m in
-20
-25
Temperatura/ºC
-30
-30
-40
-40
-60
-50
-60
-70
-80
-90
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/% p
80
90
100
Figura 105
La evolución del subenfriamiento para distintas velocidades de
enfriamiento se muestra en la figura 106 en la siguiente página.
345
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
DE UNA SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
50
45
-60
40
-40
Temperatura/ºC
35
30
-30
25
20
15
-25
10
-10ºC/m in
5
0
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
Fracción másica de solutos/% p
-10
0
Figura 106
346
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.2.4.2 La solución líquida saturada extracelular desaparece instantáneamente
Como el medio extracelular deja de ser invariante instantáneamente, la
temperatura del sistema no permanece constante en ningún momento. Por
lo tanto, el medio intracelular continuará deshidratándose y disminuyendo su
temperatura.
En esta nueva etapa de deshidratación tenemos un medio extracelular
formado por hielo y un precipitado de sal y crioprotector, y un medio
intracelular formado por una solución saturada en sal y un precipitado de
sal.
Para poder modelar matemáticamente la deshidratación, aplicaremos de
nuevo la hipótesis de la Capa Líquida Saturada, de manera que alrededor
de cada célula tendremos en todo momento una delgada película de
solución líquida saturada en sal y crioprotector.
Ahora la evolución de la composición del medio extracelular es conocida
y constante, por lo que podemos aplicarle la ley de Raoult.
El número de grados de libertad del medio intracelular es:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=2 Disolución líquida saturada en ClNa, ClNa precipitado
GL=3-2+1=2
Necesito conocer la composición de la solución intracelular (fracción
molar de crioprotector), y la velocidad de enfriamiento, para poder conocer
la temperatura del sistema.
La célula continúa deshidratándose bajo estas condiciones hasta que
corta a la curva de solubilidad del crioprotector. En ese instante, la solución
intracelular alcanza las condiciones de saturación respecto al crioprotector.
Sin embargo debido a la impermeabilización de la membrana no se
produce deshidratación ninguna, siendo la evolución con respecto a la
temperatura análoga a la del caso anterior, hasta que de igual manera
llegamos a cortar a la curva de solubilidad del crioprotector.
347
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
0
1
-10
-20
Temperatura/ºC
-30
1ª etapa de
deshidratación
2
2ª etapa de A
-40
deshidratación
B
-50
-60
3ª etapa de
deshidratación
-70
-80
C
-90
4ª etapa s in
deshidratación
*
3
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/% p
80
90
100
Figura 107
En esta nueva situación, conforme enfriamos el sistema, la temperatura,
tanto del medio intracelular, como del extracelular disminuyen.
Bajo la hipótesis de la Capa Líquida Saturada, alrededor de la célula hay
una delgada capa de disolución líquida con la composición del eutéctico
ternario. Como la temperatura del sistema sigue disminuyendo, la
solubilidad del crioprotector cada vez es menor, por lo que debe precipitar
parte de los moles disueltos de glicerol, aunque no se produzca
deshidratación alguna.
En el caso de que aun existiese permeabilidad y puesto que la
composición del medio intracelular, que está saturado, tiene una
concentración inferior a la del eutéctico, la célula tendería a seguir
deshidratándose, y puesto que la concentración no puede aumentar,
comienza a precipitar crioprotector en el interior de la célula, además de sal
que ya estaba precipitando desde etapas anteriores de deshidratación.
El número de grados de libertad del medio intracelular en estas nuevas
condiciones es:
C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector
F=3 Solución saturada en ClNa y crioprotector, ClNa precipitado,
crioprotector precipitado
GL=3-3+1=1
348
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
Si la membrana no se impermeabilizase, teóricamente continuaríamos la
deshidratación hasta tener en el interior de la célula únicamente sal y
crioprotector precipitados. Sin embargo, probablemente debido a problemas
para transportar agua hacia la membrana, en su interior siempre quedará
solución líquida saturada. En el momento en que se deshidrata por
completo la célula, la capa de líquido saturado alrededor de la célula
desaparece. La evolución del sistema es una vertical.
Sin embargo la impermeabilización, deja atrapada una cierta cantidad de
agua en el interior de la célula, saturada en sal y crioprotector, que
superado un cierto subenfriamiento formará hielo.
A partir de este momento el sistema estará constituido por un medio
extracelular formado por hielo y un precipitado de sal y crioprotector, y un
medio intracelular formado por un precipitado de sal y crioprotector, y algo
de solución líquida saturada. La temperatura del sistema en estas
condiciones se reduce indefinidamente.
El subenfriamiento de este proceso de deshidratación crece
indefinidamente, sin excluir la existencia de máximos locales al comienzo
del subenfriamiento. A partir del punto de corte con la curva de solubilidad
del crioprotector, punto C, por cada grado centígrado que disminuye la
temperatura del sistema, el subenfriamiento aumenta un grado centígrado,
es decir, todo el descenso de temperatura se invierte en el subenfriamiento.
La evolución gráfica del subenfriamiento, para el caso de
espermatozoides de ratón, enfriados mediante un perfil lineal de
–30ºC/min se muestra en la figura 108:
349
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
SUBENFRIA M IENTO DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
70
60
Temperatura/ºC
50
3ª etapa de
deshidratación
40
30
2ª etapa de
deshidratación
1ª etapa de
deshidratación
20
Temperatura del eutéctico
10
0
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
Fracción másica de solutos/% p
-20
-10
0
Figura 108
La evolución del subenfriamiento es análoga a la del caso anterior.
Si al igual que en caso anterior modificamos artificialmente la
permeabilidad de la membrana, para que no sea impermeable a bajas
temperaturas, el proceso de deshidratación que tiene lugar antes de
alcanzar a la curva de solubilidad del crioprotector es prácticamente
despreciable, por lo que no lo vamos a tener en cuenta en los programas de
MATLAB. Para tener en cuenta esta pequeña etapa de deshidratación, lo
único que haremos será desplazar ligeramente la vertical que representa la
evolución del medio intracelular una vez saturado en glicerol, hacia la
derecha indicando así que en ese pequeño tramo hay una leve e
imperceptible deshidratación.
350
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
0
1
Deshidratac ión con
permeabilidad modificada
-10
-20
Deshidratación con
permeabilidad
NO modificada
Temperatura/ºC
-30
-40
2
A
B
-50
-60
-70
3
-80
C
-90
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/%
80
90
100
Figura 109
Para ver el efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el fenómeno de
la solubilidad, calculamos las curvas de deshidratación y subenfriamiento
con respecto a la temperatura para varias velocidades de enfriamiento
lineal.
351
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR
EN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL
0
-10
-10ºC/m in
-20
-25
Temperatura/ºC
-30
-30
-40
-40
-60
-50
-60
-70
-80
-90
-100
0
10
20
30
40
50
60
70
Fracción másica de soluto/% p
80
90
100
Figura 110
La conclusión del estudio realizado sobre el efecto de la solubilidad en el
proceso de deshidratación de sistemas ternarios, es que apenas si hay
efectos, debido a que la impermeabilización de la membrana anula los
procesos de deshidratación que harían que la solubilidad fuera un factor
determinante.
352
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.3. MODELOS TEÓRICOS DE DESHIDRATACIÓN CON DISOLUCIONES SATURADAS
3.3.1 MODELO DE DESHIDRATACIÓN CON MEDIO INTRACELULAR SATURADO EN
CLORURO SÓDICO
La ecuación para modelar la deshidratación, va a ser la del flujo osmótico,
que fue obtenida en el apartado 6.2 del capítulo 4.
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
P ex
=
⋅
ln
Ec. 414
dt
V A*
P in
Para un proceso de enfriamiento, la temperatura T, y la variable tiempo t,
están relacionadas. Para un perfil de enfriamiento lineal esta relación es de la
forma:
dT
= − B Ec. 415
dt
Sustituyendo esta expresión en la ecuación Ec414 tenemos:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
P ex
=
Ec. 416
⋅
ln
dT
V A* ⋅ B
P in
Aplicando las mismas expresiones y simplificaciones que en el apartado 6.2
del capítulo 4, llegamos finalmente a una ecuación de deshidratación de la
forma:
dV L g (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
=
dt
V A*
 T L (T )

⋅  ∫ F 2 dT − ln x A  Ec. 417
 273.15 R ⋅ T

Lo que va a diferenciar esta ecuación de la que obtuvimos en el apartado
2.2 del capítulo Los Crioprotectores, es la expresión de la fracción molar de
disolvente xA. Cuando desarrollamos la ecuación diferencial que permitía
modelar la deshidratación celular con presencia de crioprotectores la fracción
molar de disolvente era de la forma:
xA =
∞
V − n B ⋅ VB∞ − nCPA ⋅ VCPA
Ec. 418
∞
V − n B ⋅ VB∞ − nCPA ⋅ VCPA
+ ν B ⋅ n B ⋅ V A* + nCPA ⋅ V A*
donde nB son los moles iniciales de sal, y que permanecían constantes durante
todo el proceso de deshidratación.
Sin embargo en el modelo que planteamos a continuación el número de
moles de sal disuelta nB no permanece constante, sino que disminuye con el
tiempo. La razón es que al estar la solución saturada, no puede aumentar la
353
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
concentración en cloruro sódico, al ser ésta constante e igual al valor de
saturación. Como la célula continúa deshidratándose se tendería a seguir
aumentando la concentración en cloruro sódico, pero como esto no es posible,
parte de los moles de sal disueltos deben precipitar, para cumplir así con la
condición de que su concentración permanezca constante.
Por lo tanto el número de moles de sal disuelta dependen del volumen
intracelular que haya en cada momento; a menor volumen, menor cantidad de
moles de sal disueltos. Para obtener la expresión que me relaciona los moles
de sal disueltos, con el volumen de disolución intracelular, aplicaremos la
condición de concentración constante, e igual al valor de saturación. Como
parámetro que mide la concentración emplearemos la fracción másica de
cloruro sódico Xw,B:
X w, B =
nB ⋅ M B
masa de ClNa
=
Ec. 419
masa total
n A ⋅ M A + n B ⋅ M B + nCPA ⋅ M CPA
donde nA, nB, y nCPA son los moles de agua, sal, y crioprotector
respectivamente, y MA, MB, y MCPA son los pesos moleculares del agua, la sal ,
y el crioprotector respectivamente.
Si multiplicamos y dividimos la ecuación Ec419 por V*A ⁄ MA tenemos:
nB ⋅
X w, B =
MB *
⋅VA
MA
M
M
n A ⋅ V + n B ⋅ B ⋅ V A* + nCPA ⋅ CPA ⋅ V A*
MA
MA
Ec. 420
*
A
Como ya sabíamos de desarrollos anteriores, el volumen de la disolución
intracelular cumple de forma aproximada la siguiente igualdad:
∞
V ≈ n A ⋅ V A* + n B ⋅ V B∞ + nCPA ⋅ VCPA
Ec. 421
Por lo tanto la expresión de la fracción másica de cloruro sódico será:
MB
⋅ V A*
MA
Ec. 422
M
M
+ n B ⋅ B ⋅ V A* + nCPA ⋅ CPA ⋅ V A*
MA
MA
nB ⋅
X w, B =
∞
V − n B ⋅ V B∞ − nCPA ⋅ VCPA
Despejando el número de moles de cloruro sódico, y teniendo en cuenta
que la fracción másica de la sal, corresponde al valor de saturación, tenemos:
354
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD

 ∞
M
V − nCPA ⋅ VCPA
− CPA ⋅ V A* 
MA
 Ec. 423

nB =
sat
1
−
X
M
w, B
VB∞ + B ⋅ V A* ⋅
sat
MA
X w, B
355
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.3.2 CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO IDEAL CUANDO LA SOLUCIÓN INTRACELULAR
ESTÁ SATURADA EN CLORURO SÓDICO
Para obtener la evolución del medio extracelular, supusimos que esta
evolución era a través de sucesivos estados de equilibrio. Esta curva la
obteníamos por tanto, a partir de planteamientos de equilibrio. El equilibrio que
planteábamos era el del medio intracelular con el medio extracelular. Por lo
tanto, la evolución de la composición del medio extracelular la obteníamos
como la evolución que tendría el medio intracelular, si éste evolucionara por
sucesivos estados de equilibrio.
La solución intracelular permanecerá en equilibrio termodinámico con la
solución extracelular mientras se produzca la igualdad de presiones de vapor:
 T L f (T ) 
P ex (T ) = P in (T ) ⇒ PA*, s (T ) = PA*,l (T ) ⋅ x inA ⇒ x inA = exp ∫
dT  Ec. 424
2
 273 R ⋅ T

Sustituyendo el valor de la fracción molar de disolvente xAin en función del
volumen de disolución, tenemos:
∞
 T L f (T ) 
V − n B ⋅ V B∞ − nCPA ⋅ VCPA
= exp ∫
dT  = Q Ec. 425
∞
2
V − n B ⋅ VB∞ − ν B ⋅ V A* − nCPA ⋅ VCPA
− V A*
R
⋅
T
 273

(
)
(
)
Despejando el volumen de disolución, tenemos la ecuación de la curva de
descenso crioscópico, cuando la solución intracelular está saturada en cloruro
sódico:


cte1 ν B  *
cte1 1  ∞
 nCPA −
⋅ ∞  ⋅ VCPA ⋅ (1 − Q)
⋅ ∞  ⋅ V A ⋅ Q +  nCPA −
cte2 VB 
cte2 VCPA



V =
Ec. 426
*
ν B ⋅VA
cte2 − 1
⋅ (1 − Q ) −
⋅Q
cte2
cte2 ⋅ VB∞
donde :
 ∞

M
cte1 = nCPA ⋅ VCPA
− CPA ⋅ V A* 
MA


Ec. 427
sat
M B V A* 1 − X w, B
cte2 = 1 +
⋅
⋅
M A V B∞
X wsat, B
356
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD
3.3.3 MODELO DE DESHIDRATACIÓN CON LA SOLUCIÓN INTRACELULAR SATURADA EN
CLORURO SÓDICO, CON EL MEDIO EXTRACELULAR SATURADO EN
CLORURO SÓDICO Y CRIOPROTECTOR
Puesto que esta deshidratación es despreciable frente a las que se han
producido anteriormente, como hemos podido ver en las evoluciones gráficas
realizadas en el apartado anterior, la ecuación que describe esta
deshidratación no ha sido programada en MATLAB.
Al igual que en todos los modelos de deshidratación vistos hasta ahora,
partimos de la siguiente ecuación:
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
P ex
=
⋅
ln
Ec. 428
dT
V A* ⋅ B
P in
Al igual que hicimos en el apartado 2.3.1.2 de este mismo capítulo, las
expresiones de las presiones son:
P in = PA*,l (T ) ⋅ x inA Ec. 429
P ex = PA*,l (T ) ⋅ x ex
Ec. 430
A
De esta manera la expresión de la deshidratación es:
x ex
dV Lg (T ) ⋅ A ⋅ R ⋅ T
A
Ec. 431
=
⋅
ln
*
dT
VA ⋅ B
x inA
El valor de la fracción molar del disolvente en el medio extracelular es
conocida, por ser su composición constante e igual al valor de saturación:
sat
sat
x ex
A = 1 − x B − xCPA Ec. 432
donde xBsat y xCPAsat son las fracciones molares de saturación del cloruro
sódico, y del crioprotector respectivamente.
La expresión de la fracción molar de disolvente en el medio intracelular es
idéntica a la calculada en el apartado 3.3.1:
xA =
∞
V − n B ⋅ VB∞ − nCPA ⋅ VCPA
Ec. 433
∞
V − n B ⋅ VB∞ − nCPA ⋅ VCPA
+ ν B ⋅ n B ⋅ V A* + nCPA ⋅ V A*
donde el número de moles de sal, nB varía según la ley obtenida en el mismo
apartado:
357
CAPÍTULO 6
EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD

 ∞
M
V − nCPA ⋅ VCPA
− CPA ⋅ V A* 
MA
 Ec. 434

nB =
sat
1
−
X
M
w, B
VB∞ + B ⋅ V A* ⋅
sat
MA
X w, B
358
ANEXO
PROGRAMAS
359
ANEXO
PROGRAMAS
VII. ANEXO PROGRAMAS
SECCIÓN 1.01 PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 4. LA DESHIDRATACIÓN
CELULAR
APARTADO 1
PROGRAMA PRINCIPAL
%**************************************************************
% Programa que permite calcular la deshidratación con
% respecto al tiempo con un perfil de enfriamiento lineal.
%**************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
%AQUÍ CALCULO LA CURVA DE EQUILIBRIO
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
if ncpa==0
plot(t0-273,V0,'r--')
else
plot(t0-273,V0,'r:')
end
hold on;
%AQUÍ CALCULO LAS CURVAS DE DESHIDRATACIÓN
for B=[ -15 ]
tspan=[273 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
if ncpa==0
plot(t1-273,V1,'b','LineWidth',1)
else
plot(t1-273,V1,'g','LineWidth',1)
end
axis([-20 0 0 1.2]);
hold on;
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
360
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA DescCrio_id_integrado
function [t,y]=DescCrio_integrado(Vi,n2,ncpa,Vmcpa)
%*********************************************************************
% Subprograma que permite calcular la curva de descenso crioscópico
%*********************************************************************
if nargin<4 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;
end
if nargin<3 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
R=8.3143;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
VmA=18*1e-6;
Vsol=n2*Vm2+ncpa*Vmcpa;
nsol=(v2*n2+ncpa);
a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273;
fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R;
fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R;
fact3=(c+3*d*z)/R;
fact4=d/(2*R);
T=[190:1:272.99];
To=273;
integralLf=fact1*(1/To-1./T)+fact2*log(T./To)-fact3*(T-To)+fact4*(T.^2-To^2);
Q=exp(integralLf);
V_eq=Vsol+(Q./(1-Q))*nsol*VmA;
t=T;
y=V_eq;
361
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA enfr_id_lineal
function varargout=enfr_id_lineal(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
%********************************************************************************
% Subprograma que modela la ecuación diferencial que muestra la deshidratación
% celular cuando el sistema es sometido a un perfil de enfriamiento lineal
%********************************************************************************
if nargin<12 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
R=8.3143;
SLf=integralLf(t);
Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5);
VmA=18*1e-6;MA=18;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
F=B;%perfil de enfriamiento lineal
aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F));
dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))];
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[273 190];
y0=[3.1629*1e-17];%DATO esperma ratón
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
362
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 2
PROGRAMA PRINCIPAL
%*************************************************************************
% Programa que permite calcular la deshidratación celular
% con repecto al tiempo, para varias velocidades de enfriamiento lineal.
%*************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
ncpa=aux;
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
if ncpa==0
plot(t0-273,V0,'r--')
else
plot(t0-273,V0,'r:')
end
hold on;
for B=[-15 -50 -100]
tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
tm1=(273-t1)/(-B);
plot(tm1,V1,'b','LineWidth',1)
axis([0 3 0 1]);
hold on;
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TIEMPO/min');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
363
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 3
PROGRAMA PRINCIPAL
%****************************************************************************
%Programa que permite calcular la deshidratación celular con
%respecto a la temperatura para tres perfiles de enfriamiento distintos:
%lineal,cuadrático, y exponencial.
%****************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
ncpa=aux;
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
if ncpa==0
plot(t0-273,V0,'r--')
else
plot(t0-273,V0,'r:')
end
hold on;
for B=[-15 -50 -1000]
tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
[t2,y2]=ode15s('enfr_id_cuadratico',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
[t3,y3]=ode15s('enfr_id_exponencial',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
V2=y2./Vi;
V3=y3./Vi;
plot(t1-273,V1,'r',t2-273,V2,'b',t3-273,V3,'g','LineWidth',1)
axis([-55 0 0 1]);
hold on;
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
364
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA enfr_id_cuadratico
function varargout=enfr_id_cuadratico(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
%********************************************************************************
% Subprograma que modela la ecuación diferencial que muestra la deshidratación
% celular cuando sometemos el sistema a un perfil de enfriamiento cuadrático
%********************************************************************************
if nargin<12 |isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
R=8.3143;
SLf=integralLf(t);
Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5);
VmA=18*1e-6;MA=18;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
G=B^2/273;
F=-sqrt(B^2+2*G*(273-t));%perfil de enfriamiento cuadratico
aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F));
dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))];
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[273 190];
y0=[3.1629*1e-17];%DATO esperma ratón
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
365
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA enfr_id_exponencial
function varargout=enfr_id_exponencial(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
%********************************************************************************
% Subprograma que modela la ecuación diferencial que muestra la deshidratación
% celular, cuando sometemos al sistema a una perfil de enfriamiento exponencial
%********************************************************************************
if nargin<12 |isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
R=8.3143;
SLf=integralLf(t);
Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5);
VmA=18*1e-6;MA=18;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
k=B/273;
F=k*t;%perfil de enfriamiento exponencial
aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F));
dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))];
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[273 190];
y0=[3.1629*1e-17];%DATO esperma ratón
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
366
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 4
PROGRAMA PRINCIPAL
%*****************************************************************************
%Programa que permite calcular la deshidratación con
%respecto al tiempo para tres perfiles de enfriamiento distintos: lineal,
%cuadrático, y exponencial.
%*****************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
ncpa=aux;
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
if ncpa==0
plot(t0-273,V0,'r--')
else
plot(t0-273,V0,'r:')
end
hold on;
for B=[-15 -50 -100]
tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
[t2,y2]=ode15s('enfr_id_cuadratico',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
[t3,y3]=ode15s('enfr_id_exponencial',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
tm1=(273-t1)/(-B);
V2=y2./Vi;
tm2=273*(B+sqrt(B^2+2*B^2*(1-t2/273)))/B^2;
V3=y3./Vi;
tm3=(273/B)*log(t3/273)
plot(tm1,V1,'r',tm2,V2,'b',tm3,V3,'g','LineWidth',1)
axis([0 3 0 1]);
hold on;
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TIEMPO/minutos');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
Los subprogramas enfr_id_cuadrático y enfr_id_exponencial son
los mismos que los del apartado 3.
367
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 5
PROGRAMA PRINCIPAL
%********************************************************************************
%Programa que permite calcular la evolución
%de los subenfriamientos con respecto a la temperatura, para distintos tipos
%de perfiles de enfriamiento.
%********************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
for B=[-5 -15 -30 -35 -50 ]
Tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
%Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden
%con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración
%de las ecuaciones de deshidratación.
s1=interp1(y0,t0,y1);
%Calculamos los subenfriamientos.
subenfr1=s1-t1;
if ncpa==0
plot(t1-273,subenfr1,'b')
else
plot(t1-273,subenfr1,'g')
end
hold on;
axis([-55 0 0 30]);
%Calculamos el pico del subenfriamiento, si existe. Si no existe
%nos da el último subenfriamiento.
z=size(t1);
i=1;
while (subenfr1(i+1)>subenfr1(i))
i=i+1;
if i==z(1,1)
break;
end
end
%mostramos por pantalla:
%1)la temperatura a la que se alcanza el maximo del subenfriamiento
%2)el maximo de subenfriamiento
%3)posición del subenfriamiento max en el vector de subenfriamientos
%4)dimensión del vector de subenfriamientos
[t1(i)-273,subenfr1(i),i,z(1,1)]
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR');
368
ANEXO
PROGRAMAS
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
369
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 6
PROGRAMA PRINCIPAL
%***********************************************************************************
% Programa que permite calcular la evolución
% de los subenfriamientos con respecto a la temperatura, para uno o
% varios perfiles de enfriamiento lineal.
%***********************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
for B=[-15 ] % VELOCIDAD DE ENFRIAMIENTO
Tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
%integramos de nuevo la ecuacion de deshidratacion pero para una permeabilidad
%de la membrana que es doble de la original.
[t2,y2]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,2*Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
V2=y2./Vi;
%Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden
%con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración
%de las ecuaciones de deshidratación.
s1=interp1(y0,t0,y1);
s2=interp1(y0,t0,y2);
%Calculamos los subenfriamientos.
subenfr1=s1-t1;
subenfr2=s2-t2;
if ncpa==0
plot(t1-273,subenfr1,'r',t2-273,subenfr2,'b')
else
plot(t1-273,subenfr1,'r:',t2-273,subenfr2,'b:')
end
hold on;
axis([-20 0 0 5]);
%Calculamos el pico del subenfriamiento, si existe. Si no existe
%nos da el último subenfriamiento.
z=size(t1);
i=1;
while (subenfr1(i+1)>subenfr1(i))
i=i+1;
if i==z(1,1)
break;
end
end
%mostramos por pantalla:
%1)la temperatura a la que se alcanza el maximo del subenfriamiento
%2)el maximo de subenfriamiento
%3)posición del subenfriamiento max en el vector de subenfriamientos
%4)dimensión del vector de subenfriamientos
[t1(i)-273,subenfr1(i),i,z(1,1)]
370
ANEXO
PROGRAMAS
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR');
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
371
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 7
PROGRAMA PRINCIPAL
%*************************************************************************************
%Programa que permite calcular la evolución de los subenfriamientos con respecto a la
%temperatura, para distintos tipos de perfiles de enfriamiento.
%*************************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
for B=[-5 -15 -30 -35 -50 ]
Tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
[t2,y2]=ode15s('enfr_id_cuadratico',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
[t3,y3]=ode15s('enfr_id_exponencial',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
V2=y2./Vi;
V3=y3./Vi;
%Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden
%con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración
%de las ecuaciones de deshidratación.
s1=interp1(y0,t0,y1);
s2=interp1(y0,t0,y2);
s3=interp1(y0,t0,y3);
%Calculamos los subenfriamientos.
subenfr1=s1-t1;
subenfr2=s2-t2;
subenfr3=s3-t3;
%Dibujamos las evoluciones de los subenfriamientos.
if ncpa==0
plot(t1-273,subenfr1,'r',t2-273,subenfr2,'b',t3-273,subenfr3,'g')
else
plot(t1-273,subenfr1,'r:',t2-273,subenfr2,'b:',t3-273,subenfr3,'g:')
end
hold on;
axis([-55 0 0 30]);
%Calculamos el pico del subenfriamiento, si existe. Si no existe
%nos da el último subenfriamiento.
z=size(t1);
i=1;
while (subenfr1(i+1)>subenfr1(i))
i=i+1;
if i==z(1,1)
break;
end
end
%mostramos por pantalla:
%1)la temperatura a la que se alcanza el maximo del subenfriamiento
%2)el maximo de subenfriamiento para el enfriamiento LINEAL.
%3)posición del subenfriamiento max en el vector de subenfriamientos
%4)dimensión del vector de subenfriamientos
[t1(i)-273,subenfr1(i),i,z(1,1)]
372
ANEXO
PROGRAMAS
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR');
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
Los subprogramas enfr_id_cuadrático y enfr_id_exponencial son
los mismos que los del apartado 3.
373
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 8
PROGRAMA PRINCIPAL
%*********************************************************************************
%Programa que permite calcular la evolución del caudal de flujo osmótico
%con respecto al tiempo, para un perfil de enfriamiento lineal.
%*********************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
for B=[-5 -50]
tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
n=size(y1);
for i=1:1:n(1,1)
Q(i)=-B*1e18*enfr_id_lineal(t1(i),y1(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
end
plot((t1-tspan(1,1))/B,Q,'b','LineWidth',1)
axis([0 3 0 70]);
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TIEMPO/MIN');
ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)');
hold on;
% sumo todos los caudales evacuados para calcular el caudal medio
QT=0;
for i=1:1:n(1,1)
QT=QT+Q(i);
end
%calculo el área bajo cada curva de flujo osmótico,
%que da el agua total evacuada durante la deshidratación.
%Este dato lo meto en la variable z.
z=0;
for i=1:1:n(1,1)-1
h=(Q(i)+Q(i+1))/2;
l=(t1(i+1)-tspan(1,1))/B-(t1(i)-tspan(1,1))/B;
z=z+h*l;
end
% Por pantalla salen tantos vectores como velocidades de enfriamiento
% tengamos. En cada vector tenemos primero el caudal medio y luego la
% integral del caudal.
[QT/n(1,1) z]
clear Q;
end
end
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
374
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 9
PROGRAMA PRINCIPAL
%*********************************************************************************
%Programa que permite calcular la evolución de la
%concentración de moles de sal con respecto a la temperatura, para un perfil de
%enfriamiento lineal.
%*********************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
for B=[-15 -30 -35 -50]
Tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
%calculo los volumenes de la curva de equilibrio que corresponden a las
%temperaturas que son numéricamente igual a las proporcionadas por la
%integración de la deshidratación:t1
y0p=interp1(t0,y0,t1);
%idem pero para la fracción de volumen celular con respecto al inicial.
V0p=interp1(t0,V0,t1);
%calculo las evoluciones de la concentración de moles de soluto, siguiendo
%la curva de equilibrio(Cmo) y siguiendo las curvas de deshidratación(Cm1).
Cm0=(n2)./(y0p*1000);
Cm1=(n2)./(y1*1000);
if ncpa==0
%dibujo las evoluciones de la concentracion siguiendo curvas de deshidratacion
plot(t1-273,Cm1,'b'),axis([-55 0 0 10]);
ylabel('CONCENTRACIÓN/(mol/m3)');
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
hold on;
else
plot(t1-273,Cm1,'g'),axis([-55 0 0 10]);
ylabel('CONCENTRACIÓN/(mol/m3)');
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
hold on;
end
hold on;
end
%dibujo evolución de la concentracion siguiendo curva de equilibrio.
if ncpa==0
plot(t1-273,Cm0,'r')
else
plot(t1-273,Cm0,'r:')
end
end
375
ANEXO
PROGRAMAS
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
376
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 10
PROGRAMA PRINCIPAL
%**************** RESOLUCIÓN PARA ESPERMATOZOIDES DE RATÓN ********************
%Programa que permite calcular la evolución del caudal osmótico con la temperatura
%para un perfil de enfriamiento lineal, cuadrático, y exponencial
%******************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
for B=[-5 -15 -30 -50 ]
tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
[t2,y2]=ode15s('enfr_id_cuadratico',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
[t3,y3]=ode15s('enfr_id_exponencial',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
V2=y2./Vi;
V3=y3./Vi;
n=size(y1);
m=size(y2);
s=size(y3);
for i=1:1:n(1,1)
Q1(i)=1e18*(-B)*enfr_id_lineal(t1(i),y1(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
end
for i=1:1:m(1,1)
Q2(i)=1e18*(sqrt(B^2+2*B^2*(1t2(i)/273)))*enfr_id_cuadratico(t2(i),y2(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
end
for i=1:1:s(1,1)
Q3(i)=1e18*(B)/273*t3(i)*enfr_id_exponencial(t3(i),y3(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
end
[ B Q1(1) Q2(1) Q3(1)]
if ncpa==0
plot(t1-273,Q1,'r',t2-273,Q2,'b',t3-273,Q3,'g','LineWidth',1)
axis([-55 0 0 80]);
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)');
hold on;
%FALTA CALCULAR LAS EVOLUCIONES EL CAUDAL CON EL TIEMPO
%PARA PERFILES DE ENFRIAMIENTO NO LINEALES.
else
subplot(2,1,1),plot(t1-273,Q,'g','LineWidth',1)
axis([-55 0 0 70]);
hold on;
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)');
%SOLO ESTÁ CALCULADA LA EVOLUCIÓN TEMPORAL PARA PERFIL LINEAL DE TEMPERATURA
subplot(2,1,2),plot((t1-tspan(1,1))/B,Q,'g','LineWidth',1)
axis([0 3 0 70]);
title('MOUSE SPERMATOZOA');
xlabel('TIEMPO/MIN');
377
ANEXO
PROGRAMAS
ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)');
hold on;
end
clear Q1;
clear Q2;
clear Q3;
end
end
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
Los subprogramas enfr_id_cuadrático y enfr_id_exponencial son
los mismos que los del apartado 3.
378
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 11
PROGRAMA PRINCIPAL
%***********************************************************************************
% Programa que permite calcular la evolución de
% el subenfriamiento con la temperatura para un protoco de enfriamiento lineal
% a trozos.El número de etapas de enfriamiento a 30ºC/min y de temperatura constante
% es igual a 4. El subenfriamiento máximo admisible es de 5ºC.
%************************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux%DATO:moles iniciales de crioprotector
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
% Calculamos la curva de descenso crioscópico y
%la temperatura inicial de cambio de fase Tini
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Tini=interp1(V0,t0,1);
Ti=Tini;
Vini=Vi;
for B=[-30]%la velocidad de enfriamiento lineal es de 30ºC/min
tm0=0;
To=273;
%Iniciamos el bucle del protocolo.
for wert=1:1:5
%Llamamos a la función subenfr_limite_X, que nos va a proporcionar:
%1. Intervalo de temperatura de la etapa de enfriamiento lineal con la
%
condición de que el subenfriamiento esté por debajo de los XºC, en el
%
vector Tspan.
%2. Los volúmenes de la célula, que cumplen la condición de un subenfriamiento
%
por debajo de los XºC, en el vector V.
%3.La evolución del subenfriamiento durante esta etapa de enfriamiento lineal,
% en el vector subenfr.
%4.La dimensión de los vectores Tspan,V y subenfr, que es igual en todos.
X=5;
[Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[]);
%Llamamos a la función Tramo_Tcte, que nos va a proporcionar:
%1. La evolución del volumen celular en la etapa de temperatura constante, en
el
%
vector Vol.
%2. El intervalo de tiempo de la etapa de temperatura constante, con la
condición
%
de que el volumen al final de esta etapa sea al menos el 95% del volumen de
%
equilibrio marcado por la curva de descenso crioscópico a la temperatura
%
constante a la que se lleva a cabo esta etapa del protocolo, en el vector
time.
%3. La dimensión de los vectores Vol y time, que es la misma.
[Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]);
%Dibujamos los resultados numéricos obtenidos hasta ahora.No dibujamos las
lineas
%verticales de las etapas a temperatura constante, eso lo hacemos manualmente.
%Esta es la razón por la que el bucle tiene 5 etapas a pesar de que tan solo
%buscamos ejecutar 4. Necesitamos una etapa adicional de enfriamiento para
saber
%donde termina la anterior etapa de temperatura constante.
plot(Tspan-273,subenfr,'r')
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
379
ANEXO
PROGRAMAS
ylabel('SUBENFRIAMIENTO');
hold on;
axis([-55 0 0 5]);
clear subenfr;
%Las condiciones iniciales para la siguiente etapa de enfriamiento lineal a
30ºC/min
%son las condiciones finales de la etapa anterior.
Tini=Tspan(dim1)
Vini=Vol(dim2)
end
%Calculamos también la evolución del subenfriamiento cuando no tenemos
%en cuenta las etapas a temperatura constante.
Tspan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
%Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden
%con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración
%de las ecuaciones de deshidratación.
s1=interp1(y0,t0,y1);
%Calculamos los subenfriamientos.
subenfr1=s1-t1;
plot(t1-273,subenfr1,'b')
end
end
clear all;
El subprograma DescCrio_id_integrado es el mismo que el del apartado
1.
380
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA subenfr_limite_X
function
[T,V,subenfr,max]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,Vmcpa)
%**********************************************************************************
%Subprograma que se encarga de obtener la evolución del volumen V,la temperatura T
%y el subenfriamiento en un proceso de enfriamiento lineal a una velocidad
%de enfriamiento B. La función además devuelve la dimensión de estos vectores
%en la variable max.El subenfriamiento maximo es X.
%**********************************************************************************
if nargin<12 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Tspan=[Tini 190];
%calculo la evolución del volumen durante el enfriamiento.
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vini,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
s1=interp1(y0,t0,y1);
%De todos los valores calculados antes, solo me quedo con aquellos volumenes
%que cumplan que el subenfriamiento esté por debajo de los XºC.
i=1;
while s1(i)-t1(i)<X
i=i+1;
end
if s1(i)-t1(i)>X
i=i-1;
end
%Genero a partir de los vectores totales, los vectores que a mi me interesan
%es decir aquellos valores asociados a subenfriamientos menores de XºC.
for k=1:1:i
T(k)=t1(k);
V(k)=y1(k);
subenfr(k)=s1(k)-t1(k);
end
max=i;
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
381
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Tramo_Tcte
function [Vol,time,max]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,Vini,ncpa,Vmcpa)
%******************************************************************************
%Subprograma que me permite calcular la evolución del volumen con el tiempo en
%una etapa a temperatura constante.El programa también devuelve la dimensión
%de los vectores volumen y tiempo.
%******************************************************************************
if nargin<11 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<10 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Veq=interp1(t0,y0,Tcte);
%OJO:SIEMPRE ESTOY CONSIDERANDO QUE EL EQUILIBRIO SE ALCANZA ANTES DE 5 MINUTOS
%calculo la evolución del volumen con respecto al tiempo en la etapa de temperatura cte
%durante un periodo de 5 minutos.
duracion=5;
[t,y]=ode45('Tcte_id',[],Vini,options,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,duracion,[],ncpa,[]);
V=y./Vi;
n=size(t);
vfinal=y(n(1,1));
%No todos lo valores calculados anteriormente, me interesan.Solo me interesan
% los valores de volumen tal que el volumen de la célula sea el 99% del volumen
%en el equilibrio para esa temperatura cte.
i=1;
while (V(i)>1.01*Veq/Vi & t(i)<10)%solo me interesan los valores por encima del 99.5%
del
%volumen de equilibrio siempre que se alcance en un tiempo
%inferior a 10 minutos. Si el tiempo requerido es mayor nos quedamos con la
%deshidratación alcanzada tras esos 10 minutos.
i=i+1;
if i>n
i=i-1;
break;
end
end
for k=1:1:i
Vol(k)=y(k);
time(k)=t(k);
end
max=i;
382
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Tcte_id
function varargout=Tcte_id(t,y,flag,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,tiempoTcte,to,ncpa,Vmcpa)
%****************************************************************************
%Subprograma que modela la ecuación diferencial que describe la evolución
%de la deshidratación celular, durante una etapa de temperatura constante.
%****************************************************************************
if nargin<14 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;% CASO GLICEROL.
end
if nargin<13 | isempty(ncpa)
ncpa=0;%por defecto no hay crioprotector.
end
if nargin<12 | isempty(to)
to=0;%el tiempo cuenta a partir de cero
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init(to,tiempoTcte);
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function dydt=f(t,y,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,ncpa,Vmcpa)
R=8.3143;
SLf=integralLf(Tcte);
Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/Tcte-1/Tgo))/(1.01325*1e5);
VmA=18*1e-6;MA=18;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
aux=(Lg*A*R*Tcte/VmA);
sum=log((y-Vsol)/((y-Vsol)+VmA*nsol));
dydt=[aux*(SLf-sum)];
function [tspan,y0,options]=init(to,tiempoTcte)
tspan=[to to+tiempoTcte];
y0=[3.1629*1e-17];%DATO esperma ratón
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
383
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 12
PROGRAMA PRINCIPAL
%**********************************************************************************
%Programa que permite calcular la evolución de
%la deshidratación con la temperatura para un protocolo lineal a trozos, siendo
%el número de etapas del protocolo un valor fijado por nosotros en la variable wert.
%***********************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de glicerol
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux%DATO
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Tini=interp1(V0,t0,1);
Ti=Tini;
Vini=Vi;
for B=[-30]
tm0=0;
To=273;
for wert=1:1:4
X=5;%subenfriamiento límite
[Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[]);
[Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]);
plot(t0-273,V0,'b',Tspan-273,V/Vi,'r')
hold on;
plot(Tspan(dim1)-273,Vol(dim2)/Vi,'*r',Tspan(dim1)-273,V(dim1)/Vi,'*r')
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FRACCION VOLUMEN INICIAL');
hold on;
axis([-55 0 0 1]);
Tini=Tspan(dim1);
Vini=Vol(dim2);
end
%también dibujamos la evolución con la temperatura de la deshidratación
%sin incluir ninguna etapa a temperatura constante.
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
plot(t1-273,V1,':m','LineWidth',1)
end
end
clear all;
El subprograma DescCrio_id_integrado es el mismo que el del apartado
1.
384
ANEXO
PROGRAMAS
Los subprogramas subenfr_limite_X y Tcte_id son los mismos que los
del apartado 11.
385
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 13
PROGRAMA PRINCIPAL
%**********************************************************************************
%Programa que permite calcular la evolución de
%la deshidratación con el tiempo para un protocolo lineal a trozos, estableciendo
%el número de etapas del protocolo, en la variable wert.
%**********************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de glicerol
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Tini=interp1(V0,t0,1);
Ti=Tini;
Vini=Vi;
for B=[-30]%perfil lineal a 30ºC/min
tm0=0;
To=273;
for wert=1:1:4
X=5%subenfriamiento limite
[Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[]);
[Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]);
tm=(To-Tspan)/(-B);
plot(tm0+tm,V/Vi,'r',tm0+tm(dim1)+time,Vol/Vi,'g')
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TIEMPO/min');
ylabel('FRACCION VOLUMEN INICIAL');
hold on;
Tini=Tspan(dim1);
Vini=Vol(dim2);
tm0=tm0+time(dim2)+tm(dim1);
To=Tspan(dim1);
%Por pantalla mostramos:
%1)el número de la etapa
%2)tiempo en segundos necesarios en la etapa de enfriamiento lineal
%3)tiempo en segundos necesarios en la etapa de temperatura cte
%4)temperatura al final del la etapa enfriamiento+Tcte
%5)tiempo acumulado en minutos
[wert,tm(dim1)*60,time(dim2)*60,Tspan(dim1)-273,tm0]
end
%tambien dibujamos la evolución temporal de la deshidratacion sin incluir
%ninguna etapa a temperatura constante.
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
tm1=(273-t1)/(-B);
plot(tm1,V1,'b:','LineWidth',1)
end
end
clear all;
386
ANEXO
PROGRAMAS
Los subprogramas subenfr_limite_X y Tcte_id son los mismos que los
del apartado 11.
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
387
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 14
PROGRAMA PRINCIPAL
%*****************************************************************************
% Programa que permite calcular la evolución de
% el subenfriamiento con el tiempo para un protoco de enfriamiento lineal
% a trozos, donde el número de etapas del protocolo no viene fijado a priori
% sino que serán las necesarias para llegar a los –40ºC
%******************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0 1];
num=size(CMcpa);
aux=CMcpa*Vi*1000;
conta=1;
for ncpa=aux%DATO:moles iniciales de crioprotector
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Tini=interp1(V0,t0,1);
Ti=Tini;
Vini=Vi;
for X=[2]%FIJAMOS EL SUBENFRIAMIENTO MAXIMO ADMISIBLE DEL PROTOCOLO.
for B=[-30]%la velocidad de enfriamiento lineal es de 30ºC/min
tm0=0;
To=273;
cont=0;
Tini=Ti;
Vini=Vi;
while Tini>233 & cont<20% el protocolo como maximo tendrá 20 etapas
%y tendrá menos si alcanza los -40ºC antes.
[Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[])
;
[Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]);
%calculamos las temperaturas de la curva de equilibrio asociadas a
%los volúmenes que son numericamente iguales a los proporcionados por
%la funcion Tramo_Tcte.
t0p=interp1(y0,t0,Vol);
%calculo el subenfriamento en la etapa a temperatura cte
subenfr2=t0p-Tspan(dim1);
%Calculo el vector de tiempos de la etapa de enfriamiento a partir del
%vector de temperaturas.
tm=(To-Tspan)/(-B);
subplot(num(1,2),1,conta),plot(tm0+tm,subenfr,'r',tm0+tm(dim1)+time,subenfr2,'g')
hold on;
axis([0 20 0 6]);
clear subenfr;
Tini=Tspan(dim1);
Vini=Vol(dim2);
tm0=tm0+time(dim2)+tm(dim1);
To=Tspan(dim1);
%Por pantalla mostramos:
%1)el número de la etapa
%2)tiempo en segundos necesarios en la etapa de enfriamiento lineal
%3)tiempo en segundos necesarios en la etapa de temperatura cte
%4)temperatura al final del la etapa enfriamiento+Tcte
%5)tiempo acumulado en minutos
[cont+1,tm(dim1)*60,time(dim2)*60,Tspan(dim1)-273,tm0]
388
ANEXO
PROGRAMAS
cont=cont+1;
end
%Calculamos también la evolución del subenfriamiento cuando no tenemos
%en cuenta las etapas a temperatura constante.
Tspan1=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan1,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
%Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden
%con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración
%de las ecuaciones de deshidratación.
s1=interp1(y0,t0,y1);
%Calculamos los subenfriamientos.
subenfr1=s1-t1;
%calculamos el vector de tiempos a partir del vector de temperaturas
tm2=(273-t1)/(-B);
plot(tm2,subenfr1,'b')
hold on;
end%fin del bucle de velocidad
end%fin del buble de subenfriamiento max
conta=conta+1;
end%fin del bucle de crioprotector
clear all;
Los subprogramas subenfr_limite_X y Tcte_id son los mismos que los
del apartado 11.
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
389
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 15
PROGRAMA PRINCIPAL
%***************************************************************************************
*
% Programa que permite comparar la deshidratación con respecto a la temperatura para
% el caso ideal y no ideal, para un perfil de enfriamiento lineal en espermatozoides
% de ratón.
%***************************************************************************************
*
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti_id=interp1(V0,t0,1);
options00=odeset('Events','on','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t00,y00,TE,YE,IE]=ode15s('enfr_NOid_integrado',[],Vi,options00,.00001,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V00=y00/Vi;
Ti_NOid=min(TE);
plot(t0-273,V0,'g',t00-273,V00,'r')
hold on;
for B=[-5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 -45 -50 -55 -60]
Tspan_id=[Ti_id 190];
Tspan_NOid=[Ti_NOid 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_integrado',Tspan_id,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
[t2,y2]=ode15s('enfr_NOid_integrado',Tspan_NOid,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,
[]);
V1=y1./Vi;
V2=y2./Vi;
w1=interp1(t1,y1,t2);
V1p=w1./Vi;
plot(t1-273,V1,'b',t2-273,V2,'ko','LineWidth',1,'MarkerSize',4)
axis([-55 0 0 1]);
hold on;
Z=abs(100*(V1p-V2)./V2);
s=size(y2);
dim=s(1,1);
[Ymax I]=max(Z);
[Ymax t2(I)-273]
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
390
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA enfr_NOid_lineal
function varargout=enfr_NOid_lineal(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
%********************************************************************************
% Subprograma que modela la ecuación diferencial no ideal que muestra la deshidratación
% celular cuando el sistema es sometido a un perfil de enfriamiento lineal
%********************************************************************************
if nargin<12 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL.
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[273 190];
y0=[3.1629*1e-17];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
MA=18;
R=8.3143;
SLf=integralLf(t);
Lg=(Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5));
VmA=18*1e-6;
v2=2;
Vm2=2.69611*1e-5;
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);
roA=1000;
a=276*1e-12;
alfa=6057.3147;
beta=56.81071417*1e9;
AT=alfa*t^(-1.5);
BT=beta*t^(-.5);
m2=n2/(roA*(y-Vsol));
mcpa=ncpa/(roA*(y-Vsol));
aux=(1+a*BT*sqrt(m2));
aux0=(Lg*A*R*t/(VmA*B));
sum1=(-AT*m2*sqrt(m2)/aux);
sum2=(2*AT/(a^3*BT^3))*(.5*(aux-1)^2+log(aux)-aux);
CTE=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa);
dydt=[aux0*(SLf+.001*MA*v2*(sum1+sum2+m2+mcpa/v2)-CTE)];
391
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA CTEintegrar
function y=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa)
%***************************************************************************************
% Subprograma que permite calcular la constante de integración de la ecuación
diferencial
% de deshidratación no ideal
%***************************************************************************************
if nargin<8 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL.
end
if nargin<7 | isempty(ncpa)
ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector
end
VmA=18*1e-6;roA=1000;MA=18;
v2=2;
Vm2=2.69611*1e-5;
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);
a=276*1e-12;
alfa=6057.3147;
beta=56.81071417*1e9;
Vref=Vi;
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa,Vmcpa);
V0=y0./Vi;
Tref=interp1(V0,t0,1);
xAref=(Vref-Vsol)/(Vref-Vsol+VmA*(v2*n2+ncpa));
SLfref=integralLf(Tref);
gammaref=1/xAref*exp(SLfref);
aAref=xAref*gammaref;
m2ref=n2/(roA*(Vref-Vsol));
mcparef=ncpa/(roA*(Vref-Vsol));
ATref=alfa*Tref^(-1.5);
BTref=beta*Tref^(-.5);
auxref=(1+a*BTref*sqrt(m2ref));
sum1ref=(-ATref*m2ref*sqrt(m2ref)/auxref);
sum2ref=(2*ATref/(a^3*BTref^3))*(.5*(auxref-1)^2+log(auxref)-auxref);
y=log(aAref)+.001*MA*v2*(sum1ref+sum2ref+m2ref+mcparef/v2);
392
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 16
PROGRAMA PRINCIPAL
%***************************************************************************************
*
% Programa que permite comparar la deshidratación con respecto a la temperatura para
% el caso ideal y no ideal, para un perfil de enfriamiento exponencial en
espermatozoides
% de ratón.
%***************************************************************************************
*
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma raton
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma raton
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma raton
CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma raton
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma raton
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma raton
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma raton
end
Tgo=273.15;%DATO esperma raton
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti_id=interp1(V0,t0,1);
options00=odeset('Events','on','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t00,y00,TE,YE,IE]=ode15s('enfr_NOid_exponencial',[],Vi,options00,.00001,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V00=y00/Vi;
Ti_NOid=min(TE);
plot(t0-273,V0,'g',t00-273,V00,'r')
hold on;
for B=[-5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 -45 -50 -55 -60]
Tspan_id=[Ti_id 190];
Tspan_NOid=[Ti_NOid 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_exponencial',Tspan_id,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]
);
[t2,y2]=ode15s('enfr_NOid_exponencial',Tspan_NOid,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncp
a,[]);
V1=y1./Vi;
V2=y2./Vi;
w1=interp1(t1,y1,t2);
V1p=w1./Vi;
if ncpa==0
plot(t1-273,V1,'b',t2-273,V2,'ko','LineWidth',1,'MarkerSize',4)
else
plot(t1-273,V1,'b',t2-273,V2,'ko','LineWidth',1,'MarkerSize',4)
end
axis([-55 0 0 1]);
hold on;
Z=abs(100*(V1p-V2)./V2);
s=size(y2);
dim=s(1,1);
[Ymax I]=max(Z);
[Ymax t2(I)-273]
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TEMPERATURA/ºC');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
393
ANEXO
PROGRAMAS
El subprograma enfr_id_exponencial es el mismo que el del apartado 3.
394
ANEXO
PROGRAMAS
Subprograma enfr_Noid_exponencial
function varargout=enfr_NOid_exponencial(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
if nargin<12 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL.
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[273 190];
y0=[3.1629*1e-17];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa)
MA=18;
R=8.3143;
SLf=integralLf(t);
Lg=(Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5));
VmA=18*1e-6;
v2=2;
Vm2=2.69611*1e-5;
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);
roA=1000;
a=276*1e-12;
alfa=6057.3147;
beta=56.81071417*1e9;
AT=alfa*t^(-1.5);
BT=beta*t^(-.5);
m2=n2/(roA*(y-Vsol));
mcpa=ncpa/(roA*(y-Vsol));
aux=(1+a*BT*sqrt(m2));
aux0=(Lg*A*R*t/(VmA*B*t/273));
sum1=(-AT*m2*sqrt(m2)/aux);
sum2=(2*AT/(a^3*BT^3))*(.5*(aux-1)^2+log(aux)-aux);
CTE=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa);
dydt=[aux0*(SLf+.001*MA*v2*(sum1+sum2+m2+mcpa/v2)-CTE)];
El subprograma CTEintegrar es el mismo que el del apartado 15.
395
ANEXO
PROGRAMAS
SECCIÓN 1.02 PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 5. LOS
CRIOPROTECTORES
APARTADO 17
PROGRAMA PRINCIPAL
%*****************************************************************************
% Programa que permite calcular las dos etapas, primero la de deshidratación,
% y luego la rehidratación con respecto al tiempo al añadir crioprotector.
%*****************************************************************************
Vi=1.87752*1e-13;% DATO óvulo de ratón no fertilizado
A=184*1e-10;% DATO óvulo de ratón no fertilizado
CM2=0.188;%DATO óvulo de ratón no fertilizado
for CMcpap=[3]
for CMcpanp=[0.3]
Vmcpanp=2.15412*1e-4;%sacarosa
MA=18;VmA=18*1e-6;
v2=2;Vm2=1.66*1e-5;
Vmcpap=7.28523*1e-5;%glicerol
%PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA AL AGUA EN PRESENCIA DE GLICEROL
if CMcpap==0
Lgo=0.43*1e-6;%DATO óvulo de ratón no fertilizado
E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO óvulo de ratón no fertilizado
else
Lgo=.215*1e-6;%DATO óvulo de ratón no fertilizado
E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO óvulo de ratón no fertilizado
end
Tgo=293;%DATO óvulo de ratón no fertilizado
%PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA AL GLICEROL
P=6*1e-6;%DATO óvulo de ratón no fertilizado
%FUNCIÓN QUE CALCULA LAS MOLALIDADES Y FRACCIONES MOLARES DE LOS SOLUTOS
[mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CMcpap,CMcpanp,Vmcpap,Vmcpanp);
XA=1-XB-Xcpap-Xcpanp;
%FUNCIÓN QUE CALCULA LA DESHIDRATACIÓN INICIAL
T=293;%temperatura a la que se añade el crioprotector
tspan=[0 30];%intervalo de tiempo en minutos
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t,y]=ode45('deshid_inicial',tspan,Vi,options,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA);
V=y./Vi;
z=size(y);
i=1;
%dibujo la deshidratación hasta que alcanza el 99.5% del volumen final, pues
%la evolución es asintótica.
while V(i)>1.005*V(z(1,1))
i=i+1;
if i==z(1,1);
break;
end
end
for j=1:1:i
tp1(j)=t(j);
Vp1(j)=V(j);
end
plot(tp1,Vp1,'b')
hold on;
plot(t(i),V(i),'*r')
hold on;
[t(i)*60 V(i)]
%FUNCIÓN QUE CALCULA LA REHIDRATACIÓN CELULAR
tspan1=[t(i) 40];
y0=0;
n2=v2*CM2*Vi*1000;
396
ANEXO
PROGRAMAS
Smex=mB+mcpap+mcpanp;
[t1 y1]=ode45('rehidrata',tspan1,y0,options,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap);
V1=(n2+y1)/(MA/(1000*VmA)*Smex)+n2*Vm2+y1*Vmcpap;
dim=size(V1);
V1(dim(1,1))/Vi
plot(t1,V1/Vi,'r')
hold on;
clear tp1;
clear Vp1;
end
end
clear all;
397
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA ConversionConc
function
[mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CMcpap,CMcpanp,Vmcpap,Vmcpanp)
%***************************************************************************************
*
% Subprograma que permite pasar valores de concentración dados en concentraciones
molares
% a molalidades, y fracciones molares
%***************************************************************************************
*
if nargin<5 | isempty(Vmcpanp)
Vmcpanp=2.15412*1e-4;%CASO SACAROSA
end
if nargin<4 | isempty(Vmcpap)
Vmncpap=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
Vm2=1.66*1e-5;
v2=2;
VmA=18*1e-6;
MA=18;
nA=(1e-3-v2*CM2*Vm2-CMcpap*Vmcpap-CMcpanp*Vmcpanp)/VmA;
%MOLALIDADES
masaA=nA*MA/1000;
mB=v2*CM2/masaA;
mcpap=CMcpap/masaA;
mcpanp=CMcpanp/masaA;
%FRACCIONES MOLARES
ntot=CM2*v2+CMcpap+CMcpanp+nA;
XB=CM2*v2/ntot;
Xcpap=CMcpap/ntot;
Xcpanp=CMcpanp/ntot;
398
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA deshid_inicial
function varargout=deshid_inicial(t,y,flag,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA)
%**************************************************************************
% Subprograma que modela la ecuación diferencial que describe
% la deshidratación celular en el instante justamente posterior de añadir
% crioprotector tanto permeable, como no permeable al medio extracelular
%**************************************************************************
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function dydt=f(t,y,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA)
R=8.3143;
Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/T-1/Tgo))/(1.01325*1e5);
VmA=18*1e-6;MA=18;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
n2=CM2*Vi*1000;
nsol=n2*v2;% moles de sal
Vsol=n2*Vm2;% volumen de sal
aux=(Lg*A*R*T/VmA);
dydt=[aux*(log(XA)-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))];
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[0 60];
y0=[1.87752*1e-13];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
399
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA rehidrata
function varargout=rehidrata(t,y,flag,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap)
%
%
%
%
%
**********************************************************************************
Subprograma que modela la ecuación diferencial que describe
la rehidratación celular al añadir crioprotector permeable cuando aplicamos un
perfil de enfriamiento lineal
**********************************************************************************
if nargin<8 | isempty(Vmcpap)
Vmcpap=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,flag,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function dydt=f(t,y,flag,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap)
R=8.3143;
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;
dydt=[1000*P*A*(mcpap-Smex*y/(n2+y))];
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[0 180];
y0=[0];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
400
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 18
PROGRAMA PRINCIPAL
%********************************************************************************
% Programa que permite calcular el protocolo de adición de crioprotector,
% calculando primeramente la deshidratación con respecto al tiempo al añadir
% crioprotector, en varias etapas, y posteriormente calcular la rehidratación
% también en varias etapas, ambas fijadas por nosotros a priori.
%*********************************************************************************
%DATOS NUMÉRICOS
Vi=1.87752*1e-13;% DATO óvulos de ratón no fertilizados
A=184*1e-10;% DATO óvulos de ratón no fertilizados
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;v2=2;
Vmcpap=7.28523*1e-5;%glicerol
Vmcpanp=2.15412*1e-4;%sacarosa
T=293;%temperatura a la que añadimos los crioprotectores
CM2=0.188;%DATO óvulos de ratón no fertilizados
CMcpap=3;
CMcpanp=.3;
etapasCPAnp=3;
pasoCPAnp=CMcpanp/etapasCPAnp;
etapasCPAp=10;
pasoCPAp=CMcpap/etapasCPAp;
if CMcpanp>0
[Vfinal1,tfinal1]=ProtoAdicCPAnp(Vi,A,CM2,CMcpanp,pasoCPAnp,T,Vmcpap,Vmcpanp);
end
if CMcpap>0
if CMcpanp==0
V0=Vi;
t0=0;
else
V0=Vfinal1;
t0=tfinal1;
end
[Vfinal2,tfinal2]=ProtoAdicCPAp(Vi,A,V0,t0,CM2,CMcpanp,CMcpap,pasoCPAp,T,Vmcpap,Vmcpanp)
;
end
%********************************************
%FUNCIÓN QUE CALCULA LA REHIDRATACIÓN CELULAR
%********************************************
%PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA AL GLICEROL
P=6*1e-6; óvulos de ratón no fertilizados
%FUNCIÓN QUE CALCULA LAS MOLALIDADES Y FRACCIONES MOLARES DE LOS SOLUTOS
[mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CMcpap,CMcpanp,Vmcpap,Vmcpanp);
Smex=mB+mcpap+mcpanp;
%INTERVALO DE INTEGRACIÓN
if CMcpap==0
tspan1=[tfinal1 30];
else
tspan1=[tfinal2 30];
end
%CONDICIÓN INICIAL:no hay glicerol en el interior de la célula
y0=0;
n2=v2*CM2*Vi*1000;
%INTEGRACIÓN PARA CALCULAR LA REHIDRATACIÓN
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1 y1]=ode45('rehidrata',tspan1,y0,options,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap);
V1=(n2+y1)/(MA/(1000*VmA)*Smex)+n2*Vm2+y1*Vmcpap;
plot(t1,V1/Vi,'r')
hold on;
%*******************************************
%* DESHIDRATACIÓN-REHIDRATACIÓN SIN ETAPAS *
401
ANEXO
PROGRAMAS
%*******************************************
XA=1-XB-Xcpap-Xcpanp;
if CMcpap==0
Lgo=0.43*1e-6;%DATO óvulos de ratón no fertilizados
E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO óvulos de ratón no fertilizados
else
Lgo=.215*1e-6;%DATO óvulos de ratón no fertilizados
E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO óvulos de ratón no fertilizados
end
Tgo=293;%DATO óvulos de ratón no fertilizados
%ETAPA DE DESHIDRATACIÓN
tspan=[0 30];%intervalo de tiempo en minutos
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t,y]=ode45('deshid_inicial',tspan,Vi,options,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA);
V=y./Vi;
%dibujo la deshidratación hasta que alcanza el 99.5% del volumen final, pues
%la evolución es asintótica.
z=size(y);
i=1;
while V(i)>1.005*V(z(1,1))
i=i+1;
if i==z(1,1);
break;
end
end
for j=1:1:i
tp1(j)=t(j);
Vp1(j)=V(j);
end
plot(tp1,Vp1,'b')
hold on;
%ETAPA DE REHIDRATACIÓN
tspan=[t(i) 30];
y0=0;
n2=v2*CM2*Vi*1000;
[t1 y1]=ode45('rehidrata',tspan,y0,options,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap);
V1=(n2+y1)/(MA/(1000*VmA)*Smex)+n2*Vm2+y1*Vmcpap;
plot(t1,V1/Vi,'r')
hold on;
%FIN DEL PROGRAMA
clear all;
Los subprogramas ConversionConc, deshid_inicial, y rehidrata son
los mismos que los del apartado 17.
402
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA ProtoAdicCPAnp
%**************************************************************
%PROTOCOLO ESCALONADO DE ADICIÓN DEL CRIOPROTECTOR NO PERMEABLE
%**************************************************************
function [Vfinal,tfinal]=ProtoAdicCPAnp(Vi,A,CM2,CMcpanp,paso,T,Vmcpap,Vmcpanp)
CMcpap=0;
CM=paso;
ti=0;
Vini=Vi;
while CM<=CMcpanp
%FUNCIÓN QUE CALCULA LAS MOLALIDADES Y FRACCIONES MOLARES DE LOS SOLUTOS
[mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CMcpap,CM,Vmcpap,Vmcpanp);
XA=1-XB-Xcpap-Xcpanp;
%FUNCIÓN QUE CALCULA LA DESHIDRATACIÓN POR ADICION DEL CRIOPROTECTOR NO PERMEABLE
tspan=[ti 30];%intervalo de tiempo en minutos
%permeabilidad de la membrana al agua sin presencia de CPA permeable
Lgo=0.43*1e-6;%DATO
E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO
Tgo=293;%DATO
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t,y]=ode45('deshid_inicial',tspan,Vini,options,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA);
V=y./Vi;
z=size(y);
i=1;
%dibujo la deshidratación hasta que alcanza el 95% del volumen final, pues
%la evolución es asintótica.
while V(i)>1.005*V(z(1,1))
i=i+1;
if i==z(1,1);
break;
end
end
for j=1:1:i
tp1(j)=t(j);
Vp1(j)=V(j);
end
[t(i) V(i)]
plot(tp1,Vp1,'g')
hold on;
plot(t(i),V(i),'*r')
CM=CM+paso;
ti=t(i);
Vini=V(i)*Vi;
clear tp1;
clear Vp1;
end
Vfinal=Vini;
tfinal=ti;
403
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA ProtoAdicCPAp
%**************************************************************
%PROTOCOLO ESCALONADO DE ADICIÓN DEL CRIOPROTECTOR PERMEABLE
%**************************************************************
function
[Vfinal,tfinal]=ProtoAdicCPAp(Vi,A,V0,t0,CM2,CMcpanp,CMcpap,paso,T,Vmcpap,Vmcpanp)
CM=paso;
ti=t0;
Vini=V0;
while CM<=CMcpap
%FUNCIÓN QUE CALCULA LAS MOLALIDADES Y FRACCIONES MOLARES DE LOS SOLUTOS
[mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CM,CMcpanp,Vmcpap,Vmcpanp);
XA=1-XB-Xcpap-Xcpanp;
%FUNCIÓN QUE CALCULA LA DESHIDRATACIÓN POR ADICION DEL CRIOPROTECTOR PERMEABLE
tspan=[ti 30];%intervalo de tiempo en minutos
%PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA AL AGUA EN PRESENCIA DE GLICEROL
Lgo=.215*1e-6;%DATO
E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO
Tgo=293;%DATO
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t,y]=ode45('deshid_inicial',tspan,Vini,options,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA);
V=y./Vi;
z=size(y);
i=1;
%dibujo la deshidratación hasta que alcanza el 99.5% del volumen final, pues
%la evolución es asintótica.
while V(i)>1.005*V(z(1,1))
i=i+1;
if i==z(1,1);
break;
end
end
for j=1:1:i
tp1(j)=t(j);
Vp1(j)=V(j);
end
[t(i) V(i)]
plot(tp1,Vp1,'c')
hold on;
plot(t(i),V(i),'or')
hold on;
CM=CM+paso;
ti=t(i);
Vini=V(i)*Vi;
clear tp1;
clear Vp1;
end
Vfinal=Vini;
tfinal=ti;
404
ANEXO
PROGRAMAS
APARATADO 19
PROGRAMA PRINCIPAL
%*****************************************************************************
% Programa que permite calcular la deshidratación celular con respecto al tiempo
% en una etapa de temperatura constante
%*****************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
Tcte=263;%TEMPERATURA A LA QUE SE LLEVA A CABO LA DESHIDRATACIÓN.
tiempoTcte=3;%DURACIÓN DE ETAPA A T CTE EN MINUTOS.
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
CMcpa=[0 0.5 1 2];
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
Veq=interp1(t0,y0,Tcte);
for B=[-30]
Tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
Vo=interp1(t1,y1,Tcte);
[t2,y2]=ode45('Tcte_id',[],Vo,options,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,tiempoTcte,[],ncpa,[]);
V2=y2./Vi;
if ncpa==0
plot(t2,V2,'b','LineWidth',1)
else
plot(t2,V2,'g','LineWidth',1)
end
hold on;
n=size(t2);
Vfinal=y2(n(1,1));
plot(t2,t2.*Veq./(Vi*t2),'r:')
hold on;
end
end
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TIEMPO/MIN');
ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');
Veq/Vi
clear all;
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
El subprograma Tcte_id es el mismo que el del apartado 11.
405
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 20
PROGRAMA PRINCIPAL
%*********************************************************************************
%Programa que permite calcular la evolución de
%la deshidratación con el tiempo para un protocolo lineal a trozos. El número
%de etapas del protocolo no es fija, sino las necesarias para llegar a los -40ºC
%siempre que el número de etapas necesarias sea inferior a 20.
%*********************************************************************************
Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón
n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón
CMcpa=[0 1 2 5];
aux=CMcpa*Vi*1000;
for ncpa=aux
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Tini=interp1(V0,t0,1);
Ti=Tini;
Vini=Vi;
for B=[-30]%perfil lineal a 30ºC/min
tm0=0;
To=273;
cont=0;
while Tini>233 & cont<20% el protocolo como maximo tendrá 20 etapas y tendrá
%menos si alcanza los -40ºC antes.
X=5;%subenfriamiento limite
[Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[]);
[Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]);
tm=(To-Tspan)/(-B);
plot(tm0+tm,V/Vi,'r',tm0+tm(dim1)+time,Vol/Vi,'g')
title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN');
xlabel('TIEMPO/min');
ylabel('FRACCION VOLUMEN INICIAL');
hold on;
Tini=Tspan(dim1);
Vini=Vol(dim2);
tm0=tm0+time(dim2)+tm(dim1);
To=Tspan(dim1);
%Por pantalla mostramos:
%1)el número de la etapa
%2)tiempo en segundos necesarios en la etapa de enfriamiento lineal
%3)tiempo en segundos necesarios en la etapa de temperatura cte
%4)temperatura al final del la etapa enfriamiento+Tcte
%5)tiempo acumulado en minutos
[cont+1,tm(dim1)*60,time(dim2)*60,Tspan(dim1)-273,tm0]
%actualizamos el contador de etapas
cont=cont+1;
end
%tambien dibujamos la evolución temporal de la deshidratacion sin incluir
%ninguna etapa a temperatura constante.
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
406
ANEXO
PROGRAMAS
tm1=(273-t1)/(-B);
plot(tm1,V1,':m','LineWidth',1)
end
end
clear all;
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
El subprograma Tcte_id es el mismo que el del apartado 11, salvo que ahora
dejamos que el sistema evolucione a temperatura constante hasta que
alcanzamos el 99.5% del volumen de equilibrio, mientras que en apartado 11
recordamos llegábamos al 99%.
El subprograma subenfr_limite_X es el mismo que el del apartado 11.
407
ANEXO
PROGRAMAS
SECCIÓN 1.03 PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 6. EL LÍMITE DE
SOLUBILIDAD
APARTADO 21
PROGRAMA PRINCIPAL
%***********************************************************************************
% Programa que permite calcular la curva de descenso crioscópico y
% la curva de solubilidad para una disolución acuosa de cloruro sódico
%************************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
R=8.3143;
for ncpa=[0]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
[t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
XB=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA);
ysol=0.225*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/251.8));
Z=size(t0);
%CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
%Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD
i=1;
A=XB(i)-ysol(i);
B=XB(i+1)-ysol(i+1);
while sign(B)==sign(A)
i=i+1;
if i>=Z(1,2)
break;
end
A=XB(i)-ysol(i);
B=XB(i+1)-ysol(i+1);
end
X1=1/(ysol(i)-ysol(i+1));
X2=1/(XB(i)-XB(i+1));
fracmasat=(ysol(i)*X1-XB(i)*X2)/(X1-X2);
Tsat=t0(i)+(t0(i)-t0(i+1))*X2*(fracmasat-XB(i));
[fracmasat*100 Tsat-273]
%escogemos la parte de las curvas que están por encima de el punto de intersección
for j=2:1:Z(1,2)-i+1
XBp(j)=XB(j-1+i);
ysolp(j)=ysol(j-1+i);
t0p(j)=t0(j-1+i);
end
%Añadimos el punto de intersección calculado, a las curvas de solubilidad y de
%descenso crioscópico.
ZZ=size(XBp);
XBp(1)=fracmasat;
ysolp(1)=fracmasat;
t0p(1)=Tsat;
%Dibujamos las curvas
if ncpa==0
plot(XBp*100,t0p-273,'r',ysolp*100,t0p-273,'b',XB*100,t0-273,'r:',ysol*100,t0273,'b:')
axis([0 80 -40 0]);
hold on;
else
plot(XBp*100,t0p-273,'r:',ysolp*100,t0p-273,'b:')
axis([0 80 -40 0]);
hold on;
end
end
408
ANEXO
PROGRAMAS
clear all;
409
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Descrio_id_integra1
function [t,y]=DescCrio_integra1(Vi,n2,ncpa,Vmcpa)
%*******************************************************************************
% Programa que describe la curva de descenso crioscópico de una solución acuosa
%*******************************************************************************
if nargin<4 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;
end
if nargin<3 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
R=8.3143;
v2=2;
Vm2=1.66*1e-5;
VmA=18*1e-6;
Vsol=n2*Vm2+ncpa*Vmcpa;
nsol=(v2*n2+ncpa);
a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273;
fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R;
fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R;
fact3=(c+3*d*z)/R;
fact4=d/(2*R);
T=[190:1:274];
To=273;
integralLf=fact1*(1/To-1./T)+fact2*log(T./To)-fact3*(T-To)+fact4*(T.^2-To^2);
Q=exp(integralLf);
V_eq=Vsol+(Q./(1-Q))*nsol*VmA;
t=T;
y=V_eq;
410
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 22
PROGRAMA PRINCIPAL
%**************************************************************************
% Programa que permite calcular la evolución de la deshidratación celular
% sin que alcancemos el límite de solubilidad del cloruro sódico
%**************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
R=8.3143;
for ncpa=[0 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa);
XB=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA);
ysol=0.225*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/251.8));%curva de solubilidad
if ncpa==0
plot(XB*100,t0-273,'r',ysol*100,t0-273,'b')
axis([0 35 -30 0]);
hold on;
else
plot(XB*100,t0-273,'r:',ysol*100,t0-273,'b:')
axis([0 35 -30 0]);
hold on;
end
%CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
%Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD
i=1;
Z=size(t0);
a=XB(i)-ysol(i);
b=XB(i+1)-ysol(i+1);
while sign(a)==sign(b)
i=i+1;
if i>=Z(1,2)
break;
end
a=XB(i)-ysol(i);
b=XB(i+1)-ysol(i+1);
end
X1=1/(ysol(i)-ysol(i+1));
X2=1/(XB(i)-XB(i+1));
fracmasat=(ysol(i)*X1-XB(i)*X2)/(X1-X2);
Tsat=t0(i)+(t0(i)-t0(i+1))*X2*(fracmasat-XB(i));
[fracmasat*100 Tsat-273]
[t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V00=y00./Vi;
Ti=interp1(V00,t00,1);
for B=[-30]% velocidades de enfriamiento
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
tspan=[Ti 190]
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
X=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA);
Xsat=interp1(t1,X,Tsat);
dim=size(X);
j=1;
while X(j)<Xsat
411
ANEXO
PROGRAMAS
j=j+1;
if j>dim(1,1)
break;
end
end
[X(j-1) Xsat X(j)]
for k=1:1:j-1
Xp(k)=X(k);
t1p(k)=t1(k);
end
Xp(k+1)=Xsat;
t1p(k+1)=Tsat;
if ncpa==0
plot(Xp*100,t1p-273,'k',Xsat*100,Tsat-273,'r*',X*100,t1-273,'k:')
axis([0 35 -30 0]);
hold on;
else
plot(X*100,t1-273,'k:')
axis([0 35 -30 0]);
hold on;
end
clear Xp;
clear t1p;
end
end
clear all;
El subprograma DescCrio_id_integra1 es el mismo que el del apartado
21.
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
412
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 23
PROGRAMA PRINCIPAL
%**********************************************************************************
% Programa que permite calcular la evolución del subenfriamiento del medio
% intracelular cuando el crecimiento de cristales de hielo es lento
%**********************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
R=8.3143;
for ncpa=[0 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón
%CALCULAMOS EL PUNTO EUTÉCTICO Y LA TEMPERATURA INICIAL DE CAMBIO DE
%FASE Ti
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
X0=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA);
[Xeut Teut]=intersec_solub(t0,X0);
for B=[-30]
[Tp1,Xp1,Xp1f]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Teut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]);
t00=interp1(X0,t0,Xp1);
subenfr1=t00-Tp1;
dim=size(Tp1)
Tp1f=Teut;
Tspan=[Tp1f:-1:190]
tam=size(Tspan);
subenfr(1)=0;
for i=[2:1:tam(1,2)]
subenfr(i)=subenfr(i-1)+abs(Tspan(i)-Tspan(i-1));
end
plot(Tp1-273,subenfr1,'k',Tspan-273,subenfr)
axis([-55 0 0 30]);
hold on;
Tespan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tespan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
t=interp1(y0,t0,y1);%Calculo una nueva curva de descenso crioscópico
subenfr=t-t1;
plot(t1-273,subenfr,'k:')
axis([-55 0 0 30]);
clear Xp1;
clear Tp1;
clear subenfr;
end
end
clear all;
413
ANEXO
PROGRAMAS
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
414
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Desh_Etapa_1
function [t1p,Xp,Xsat]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Tsat,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa)
%**********************************************************************************
% Programa que permite calcular la evolución de la fracción másica de sal con
% respecto a la temperatura cuando aún no se han alcanzado las condiciones de saturación
%***********************************************************************************
if nargin<12 | isempty(Mcpa)
Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<10 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
tspan=[Ti 190];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
X=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA);
%plot(X*100,t1-273,'k:');
hold on;
Xsat=interp1(t1,X,Tsat);
dim=size(X);
j=1;
while X(j)<Xsat
j=j+1;
if j>dim(1,1)
break;
end
end
[X(j-1) Xsat X(j)];
for k=1:1:j-1
Xp(k)=X(k);
t1p(k)=t1(k);
end
Xp(k+1)=Xsat;
t1p(k+1)=Tsat;
415
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 24
PROGRAMA PRINCIPAL
%*********************************************************************************
% Programa que permite calcular la evolución de la deshidratación cuando la
% velocidad de formación de hielo es instantánea
%*********************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
R=8.3143;
for ncpa=[0 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón
[t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa);
XB=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA);
ysol=0.225*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/251.8));%curva de solubilidad
if ncpa==0
plot(XB*100,t0-273,'r',ysol*100,t0-273,'b')
axis([0 35 -30 0]);
hold on;
else
plot(XB*100,t0-273,'r:',ysol*100,t0-273,'b:')
axis([0 35 -30 0]);
hold on;
end
%CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
%Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD
[Xeut Teut]=intersec_solub(t0,XB);
%CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN
[t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V00=y00./Vi;
Ti=interp1(V00,t00,1);
for B=[ -30]
[Tp1,Xp1,Xp1f]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Teut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]);
Tp1f=Teut;
[Tp2,Xp2,dim2]=Desh_Etapa_2(B,Tp1f,Xp1f,Xeut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]);
if ncpa==0
plot(Xp1*100,Tp1-273,'k',Xp1f*100,Teut-273,'r*')
hold on;
plot(Xp2*100,Tp2-273,'g',Xp2(dim2)*100,Tp2(dim2)-273,'r*',Xp2(dim2)*100,190273,'c')
axis([0 35 -30 0]);
hold on;
else
plot(Xp1*100,Tp1-273,'k:')
axis([0 35 -30 0]);
hold on;
end
[Xp1f*100 Teut-273 Xp2(dim2)*100 Tp2(dim2)-273]%punto de interseccion
clear Xp1,Xp2;
clear Tp1,Tp2;
end
end
416
ANEXO
PROGRAMAS
clear all;
El subprograma DescCrio_id_integrado es el mismo que el del apartado
1.
El subprograma DescCrio_id_integra1 es el mismo que el del apartado
21.
El subprograma Desh_Etapa_1 es el mismo que el del apartado 23.
417
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Desh_Etapa_2
function
[Tp2,Xp2,dim2]=Desh_Etapa_2(B,Tp1f,Xp1f,Xeut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa)
%*********************************************************************************
% Programa que permite calcular la deshidratación cuando la formación
% de hielo es instantánea y estamos con temperatura impuesta constante
%*********************************************************************************
if nargin<13 | isempty(Mcpa)
Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
end
if nargin<12 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN
nsol=(v2*n2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% masa de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
Ti=Tp1f;tspan=[Ti 190];
Vo=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(Xp1f*MA);%volumen inicial para comenzar a integrar
Veut=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(Xeut*MA);
Xext=v2*n2*VmA/(Veut-Vsol+nsol*VmA);
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1
y1]=ode15s('enfr_id_lineal_sat',tspan,Vo,options,Veut,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa
);
%pasamos los datos de volumen celular a fraccion masica de sal
XB=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA);
plot(XB*100,t1-273,'g:');
hold on;
%calculo la intersección de esta curva con la de solubilidad
[Xinter Tinter]=intersec_solub(t1,XB);
%calculo los puntos de la curva de deshidratación que están por encima de la curva
%de solubilidad
dim=size(XB);
j=1;
while XB(j)<Xinter
j=j+1;
if j>dim(1,1)
break;
end
end
[XB(j-1) Xinter XB(j)];
for k=1:1:j-1
Xp2(k)=XB(k);
Tp2(k)=t1(k);
end
W=size(Xp2);
Xp2(W(1,2)+1)=Xinter;
Tp2(W(1,2)+1)=Tinter;
WW=size(Xp2);
dim2=WW(1,2);
418
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA intersec_solub
function [Xinter,Tinter]=intersec_solub(t,y)
%*********************************************************************************
% Programa que permite calcular el punto de intersección de una curva (t,y)
% de deshidratación con la curva de solubilidad
%**********************************************************************************
R=8.3143;
ysol=0.225*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t-1/251.8));%curva de solubilidad
hold on;
i=1;
Z=size(t)
if Z(1,1)==1
dimen=Z(1,2);
else
dimen=Z(1,1);
end
a=y(i)-ysol(i);
b=y(i+1)-ysol(i+1);
while sign(a)==sign(b)
i=i+1;
if i>=dimen
break;
end
a=y(i)-ysol(i);
b=y(i+1)-ysol(i+1);
end
X1=1/(ysol(i)-ysol(i+1));
X2=1/(y(i)-y(i+1));
Xinter=(ysol(i)*X1-y(i)*X2)/(X1-X2);
Tinter=t(i)+(t(i)-t(i+1))*X2*(Xinter-y(i));
419
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 25
PROGRAMA PRINCIPAL
%***********************************************************************************
% Programa que permite calcular la evolución del subenfriamiento con la temperatura
% cuando la formación de hielo es instantánea.
%***********************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
R=8.3143;
for ncpa=[0 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón
%CALCULAMOS EL PUNTO EUTÉCTICO Y LA TEMPERATURA INICIAL DE CAMBIO DE
%FASE Ti
[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V0=y0./Vi;
Ti=interp1(V0,t0,1);
X0=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA);
[Xeut Teut]=intersec_solub(t0,X0);
for B=[-30]
[Tp1,Xp1,Xp1f]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Teut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]);
t00=interp1(X0,t0,Xp1);
subenfr1=t00-Tp1;
Tp1f=Teut;
[Tp2,Xp2,dim2]=Desh_Etapa_2(B,Tp1f,Xp1f,Xeut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]);
t000=interp1(X0,t0,Xp2);
subenfr2=t000-Tp2;
Tspan=[Tp2(dim2):-1:190]
tam=size(Tspan);
subenfr(1)=subenfr2(dim2);
for i=[2:1:tam(1,2)]
subenfr(i)=subenfr(i-1)+abs(Tspan(i)-Tspan(i-1));
end
plot(Tp1-273,subenfr1,'k',Tp2-273,subenfr2,'r',Tspan-273,subenfr)
axis([-55 0 0 30]);
hold on;
Tespan=[Ti 190];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tespan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);
V1=y1./Vi;
t=interp1(y0,t0,y1);%Calculo una nueva curva de descenso crioscópico
subenfr=t-t1;
plot(t1-273,subenfr,'k:')
axis([-55 0 0 30]);
clear Xp1,Xp2;
clear Tp1,Tp2;
clear subenfr;
end
end
420
ANEXO
PROGRAMAS
clear all;
Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los
mismos que los del apartado 1.
El subprograma Desh_Etapa_1 es el mismo que el del apartado 23.
El subprograma Desh_Etapa_2 es el mismo que el del apartado 24.
421
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 26
PROGRAMA PRINCIPAL
%***************************************************************************************
% Programa que permite dibujar las curvas de descenso crioscópico y las curvas de
% solubilidad del cloruro sódico y del crioprotector.
%***************************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
R=8.3143;
CMcpa=[0.4];%molaridad inicial del crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000%moles iniciales de crioprotector
for ncpa=aux
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma ratón
%Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las
%distintas etapas de deshidratación.
[Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcp
a);
end
422
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Curva_Crioscopica
function
[Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2,Xtot1,t0,Xtot2,t1]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,
ncpa,Vmcpa,Mcpa)
%***********************************************************************************
% Subprograma que permite calcular y dibujar las curvas de solubilidad,
% la curva de descenso crioscópico, así como sus puntos de intersección.
%***********************************************************************************
if nargin<5 | isempty(Mcpa)
Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
end
if nargin<4 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
VmA=18*1e-6;MA=18;%AGUA
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN
R=8.3143;
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% masa de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
%CALCULAMOS DESCENSO CRIOSCÓPICO SIN ESTAR LA SOLUCIÓN SATURADA
[t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa);
XB1=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA);
Xcpa1=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA);
Xtot1=XB1+Xcpa1
%CALCULAMOS LEYES DE SOLUBILIDAD DE LA SAL INICIALES
ysol0=0.15*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(cálculo)
%CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
%Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL INICIAL
[XBeut01 Teut01]=intersec_solub(t0,XB1,ysol0);
Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBeut01)
Xcpaeut01=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA);%concentracion de CPA cuando
%estamos saturados en
sal.
Xtoteut01=XBeut01+Xcpaeut01;
%CALCULAMOS LEYES DEFINITIVAS DE SOLUBILIDAD DE LA SAL
ysol=XBeut01*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(cálculo)
ysol1=Xtoteut01*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(dibujar)
%CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
%Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL DEFINITIVO
[XBeut1 Teut1]=intersec_solub(t0,XB1,ysol);
Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBeut1)
Xcpaeut1=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA);%concentracion de CPA cuando
%estamos saturados en
sal.
Xtoteut1=XBeut1+Xcpaeut1;
%CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO QUE QUEDA POR ENCIMA
%DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL
dim=size(Xtot1);
j=dim(1,2);
while Xtot1(j)<Xtoteut1
j=j-1;
if j==1
break;
end
end
for k=1:1:dim(1,2)-j
Xtot1p(k)=Xtot1(dim(1,2)+1-k);
t0p(k)=t0(dim(1,2)+1-k);
end
Xtot1p(k+1)=Xtoteut1;
t0p(k+1)=Teut1;
%CALCULAMOS NUEVA LEY DE DESCENSO CRIOSCÓPICO PARA CUANDO LA SOLUCIÓN
%EXTRACELULAR ESTÁ SATURADA EN SAL.
423
ANEXO
PROGRAMAS
[t1,y1]=Desc_Crios_SatClNa(Vi,n2,ncpa,Teut1,XBeut1,Vmcpa,Mcpa);
XB2=XBeut1;
nB=(y1-ncpa*(Vmcpa/MA*VmA))./(Vm2+M2/MA*VmA*(1-XBeut1)/XBeut1);
Vsol2=nB*Vm2+ncpa*Vmcpa;
msol2=nB*M2+ncpa*Mcpa;
Xcpa2=(ncpa*Mcpa/MA*VmA)./(y1-Vsol2+msol2*VmA/MA);
Xtot2=XB2+Xcpa2;
%CALCULAMOS LEYES DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR
zsol=.63*exp((-18.3*1e3/R)*(1./t1-1/193));%SOLUBILIDAD DEL GLICEROL(cálculo)
zsol1=(.63+XBeut1)*exp((-18.3*1e3/R)*(1./t1-1/193));%SOLUBILIDAD DEL GLICEROL(dibujar)
%CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA NUEVA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
%Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR
[Xcpaeut2 Teut2]=intersec_solub(t1,Xcpa2,zsol);
XBeut2=XBeut1;
Xtoteut2=XBeut1+Xcpaeut2;
%CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO QUE QUEDA POR ENCIMA
%DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR
dim=size(Xtot2);
j=1;
[Xtot2(1) Xtot2(j)]
while Xtot2(j)<Xtoteut2
j=j+1;
if j==dim(1,2)
break;
end
end
for k=1:1:j-1
Xtot2p(k)=Xtot2(k);
t1p(k)=t1(k);
end
Xtot2p(k+1)=Xtoteut2;
t1p(k+1)=Teut2;
[Xtot2p t1p]
%DIBUJAMOS LAS CURVAS DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
plot(Xtot1p*100,t0p-273,'r',Xtot1*100,t0-273,'r:')
hold on;
plot(ysol1*100,t0-273,'b',zsol1*100,t1-273,'g')
hold on;
plot(Xtoteut1*100,Teut1-273,'*k')
hold on;
plot(Xtot2p*100,t1p-273,'c',Xtot2*100,t1-273,'c:')
hold on;
plot(Xtoteut2*100,Teut2-273,'*k')
axis([0 100 -100 0]);
hold on;
El subprograma DescCrio_id_integra1 es el mismo que el del apartado
21.
El subprograma intersec_solub es el mismo que el del apartado 24.
424
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Desc_Crios_satClNa
function [t,y]=Desc_Crios_SatClNa(Vi,n2,ncpa,Tsat,XBsat,Vmcpa,Mcpa)
%********************************************************************************
% Subprograma que permite calcular los puntos de la curva de descenso crioscópico
% cuando la solución está saturada en cloruro sódico.
%********************************************************************************
if nargin<7 | isempty(Mcpa)
Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
end
if nargin<6 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
VmA=18*1e-6;MA=18;%AGUA
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN
R=8.3143;
a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273;
fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R;
fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R;
fact3=(c+3*d*z)/R;
fact4=d/(2*R);
T=[Tsat:-1:170];%RANGO DE TEMPERATURAS DE LA CURVA
To=273;
integralLf=fact1*(1/To-1./T)+fact2*log(T./To)-fact3*(T-To)+fact4*(T.^2-To^2);
XAin=exp(integralLf);
K1=(ncpa*(Vmcpa-Mcpa/MA*VmA));
K2=(1+M2/MA*VmA/Vm2*(1-XBsat)/XBsat);
num=((ncpa-K1/K2*v2/Vm2)*XAin*VmA+(ncpa-K1/K2*1/Vmcpa)*(1-XAin)*Vmcpa);
den=((K2-1)/K2*(1-XAin)-(v2*XAin*VmA)/(Vm2*K2));
V_eq=num./den;
t=T;
y=V_eq;
425
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 27
PROGRAMA PRINCIPAL
%********************************************************************************
% Programa que permirte calcular la evolución de la deshidratación celular
% en presencia de crioprotectores sin que la solución esté saturada ni en ClNa
% ni en crioprotector.
%********************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
R=8.3143;
CMcpa=[0.4];%molaridad inicial del crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000%moles iniciales de crioprotector
for ncpa=aux
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón
%Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las
%distintas etapas de deshidratación.
[Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcp
a);
%CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN
[t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V00=y00./Vi;
Ti=interp1(V00,t00,1);
for B=[ -30]
[Tp1,Xp1]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Teut1,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa);
Tp1f=Teut1;
plot(Xp1*100,Tp1-273,'k')
axis([0 100 -100 0]);
hold on;
clear Xp1;
clear Tp1;
end
end
clear all;
El subprograma DescCrio_id_integrado es el mismo que el del apartado
1.
El subprograma Curva_Crioscopica es el mismo que el del apartado 26.
426
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Desh_Etapa_1_ternario
function [t1p,Xtotp]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Tsat,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa)
%************************************************************************************
% Subprograma que permite calcular la evolución de la fracción másica de soluto
% cuando la solución aún no está saturada ni en ClNa ni en crioprotector
%************************************************************************************
if nargin<12 | isempty(Mcpa)
Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<10 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
%CALCULO LA EVOLUCIÓN DEL VOLUMEN CELULAR SIN TENER EN CUENTA FACTORES DE
%LÍMITES DE SOLUBILIDAD
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
tspan=[Ti 170];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa);
XB=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA);
Xcpa=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA);
Xtot=XB+Xcpa;
plot(Xtot*100,t1-273,'k:');
hold on;
%CALCULO LA COMPOSICIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR CUANDO SE ALCANZA LA TEMPERATURA
%A LA CUAL EL MEDIO EXTRACELULAR QUEDA SATURADO EN SAL
XBsat=interp1(t1,XB,Tsat);
Xcpasat=interp1(t1,Xcpa,Tsat);
Xtotsat=XBsat+Xcpasat;
plot(Xtotsat*100,Tsat-273,'*k');
hold on;
%CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA QUE QUEDA POR ENCIMA DE LA TEMPERATURA
%A LA CUAL QUEDA SATURADA EN SAL LA SOLUCIÓN EXTRACELULAR
dim=size(Xtot);
dim(1,1)
j=1;
while Xtot(j)<Xtotsat
j=j+1;
if j>dim(1,1)
break;
end
end
[Xtot(j-1) Xtotsat Xtot(j)];
for k=1:1:j-1
Xtotp(k)=Xtot(k);
t1p(k)=t1(k);
end
Xtotp(k+1)=Xtotsat;
t1p(k+1)=Tsat;
427
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 28
PROGRAMA PRINCIPAL
%********************************************************************************
% Programa que permite calcular la deshidratación celular hasta la segunda etapa
% en presencia de crioprotectores.
%********************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
R=8.3143;
CMcpa=[0.4];%molaridad inicial del crioprotector
aux=CMcpa*Vi*1000%moles iniciales de crioprotector
for ncpa=aux
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón
%Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las
%distintas etapas de deshidratación.
[Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcp
a);
%CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN
[t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V00=y00./Vi;
Ti=interp1(V00,t00,1);
for B=[ -30]
[Tp1,Xp1]=Desh_Etapa_1_ternario(B,Ti,Teut1,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]);
clear dim;
[Tp2,Xp2,XBsat2,Xcpasat2,Tsat2]=Desh_Etapa_2_ternario(B,Ti,Vi,XBeut1,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,
ncpa,[],[]);
plot(Xp1*100,Tp1-273,'k')
hold on;
plot(Xp2*100,Tp2-273,'k:')
axis([0 100 -100 0]);
hold on;
clear Xp1,Xp2;
clear Tp1,Tp2;
end
end
clear all;
El subprograma Curva_Crioscopica es el mismo que el del apartado 26.
El subprograma Desh_Etapa_1_ternario es el mismo que el del apartado
27.
428
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Desh_Etapa_2_ternario
function
[t1p,Xtotp,XBsat,Xcpasat,Tsat]=Desh_Etapa_2(B,Ti,Vi,XBeut1,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa
,Mcpa)
%*********************************************************************************
% Subprograma que me permite calcular la evolución de la fracción másica de soluto
% durante la segunda etapa de deshidratación ante la presencia de crioprotectores.
%*********************************************************************************
if nargin<12 | isempty(Mcpa)
Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<10 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
%CALCULAMOS LA EVOLUCIÓN DE LA COMPOSICIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR SUPONIENDO
%QUE EXISTE SOLUBILIDAD INFINITA DE LOS SOLUTOS
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);
tspan=[Ti 170];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa);
XB=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA);
Xcpa=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA);
Xtot=XB+Xcpa;
plot(Xtot*100,t1-273,'k:');
hold on;
%CALCULAMOS LA INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN CELULAR CON LA CURVA DE
%SOLUBILIDAD DE LA SAL
R=8.3143;
ysol=XBeut1*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t1-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL
[XBsat Tsat]=intersec_solub(t1,XB,ysol);
Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBsat);
Xcpasat=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA);
Xtotsat=XBsat+Xcpasat;
plot(Xtotsat*100,Tsat-273,'*k')
%CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA QUE QUEDA POR ENCIMA DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN
%CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL
dim=size(Xtot);
j=1;
while Xtot(j)<Xtotsat
j=j+1;
if j>dim(1,1)
break;
end
end
[Xtot(j-1) Xtotsat Xtot(j)];
for k=1:1:j-1
Xtotp(k)=Xtot(k);
t1p(k)=t1(k);
end
Xtotp(k+1)=Xtotsat;
t1p(k+1)=Tsat;
El subprograma enfr_id_lineal es el mismo que el del apartado 1.
El subprograma interec_solub es el mismo que el del apartado 24.
429
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 29
PROGRAMA PRINCIPAL
%********************************************************************************
% Programa que permite calcular la deshidratación celular HASTA la tercera etapa
% en presencia de crioprotectores.
%********************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
for ncpa=[1.26516*1e-14 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón
%Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las
%distintas etapas de deshidratación.
[Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcp
a);
%CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN
[t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V00=y00./Vi;
Ti=interp1(V00,t00,1)
for B=[-30]% velocidad de enfriamiento lineal
%Deshidratación celular hasta que alcanzamos la temperatura a la cual el medio
%extracelular queda saturado en sal:Teut1
[Tp1,Xp1]=Desh_Etapa_1_ternario(B,Ti,Teut1,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]);
%Deshidratación celular hasta que el medio intracelular queda saturado en sal
[Tp2,Xp2,XBsat2,Xcpasat2,Tsat2]=Desh_Etapa_2_ternario(B,Ti,Vi,XBeut1,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,
ncpa,[],[]);
%Deshidratación celular hasta que alcanzamos la temperatura a la cual el medio
%extracelular queda saturado en crioprotector
[Tp3,Xp3,Xcpa3]=Desh_Etapa_3_ternario(B,Tsat2,XBsat2,Teut2,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]
,[]);
plot(Xp1*100,Tp1-273,'k')
hold on;
plot(Xp2*100,Tp2-273,'k')
hold on;
plot(Xp3*100,Tp3-273,'g')
axis([0 100 -100 0]);
hold on;
clear Xp1,Xp2,Xp3;
clear Tp1,Tp2,Tp3;
end
end
clear all;
El subprograma Curva_Crioscopica es el mismo que el del apartado 26.
El subprograma Desh_Etapa_1_ternario es el mismo que el del apartado
27.
430
ANEXO
PROGRAMAS
El subprograma Desh_Etapa_2_ternario es el mismo que el del apartado
28.
431
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Desh_Etapa_3_ternario
function
[t1p,Xtotp,Xcpa3]=Desh_Etapa_3_ternario(B,Tsat,XBsat,Teut2,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vm
cpa,Mcpa)
%*********************************************************************************
% Subprograma que me permite calcular la evolución de la fracción másica de soluto
% durante la tercera etapa de deshidratación ante la presencia de crioprotectores.
%*********************************************************************************
if nargin<12 | isempty(Mcpa)
Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
end
if nargin<11 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
if nargin<10 | isempty(ncpa)
ncpa=0;
end
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN
nsol=(v2*n2+ncpa);%moles de soluto
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% masa de soluto:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
%CALCULAMOS EL VOLUMEN INTRACELULAR INICIALDE LA 3ª ETAPA DE DESHIDRATACIÓN
Vini=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBsat);
%CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN CELULAR
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-26,'RelTol',1e-4);
tspan=[Tsat 170];
[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal_satClNa',tspan,Vini,options,XBsat,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo
,ncpa,[],[]);
XB=XBsat;
nB=(y1-ncpa*(Vmcpa/MA*VmA))./(Vm2+M2/MA*VmA*(1-XBsat)/XBsat);
Vsol2=nB*Vm2+ncpa*Vmcpa;
msol2=nB*M2+ncpa*Mcpa;
Xcpa=(ncpa*Mcpa/MA*VmA)./(y1-Vsol2+msol2*VmA/MA);
Xtot=XB+Xcpa;
plot(Xtot*100,t1-273,'g:');
hold on;
%CALCULAMOS LA COMPOSICIÓN DE LA SOLUCIÓN INTRACELULAR CUANDO LA TEMPERATURA ES
%IGUAL A LA QUE LA SOLUCIÓN EXTRACELULAR QUEDA SATURADA EN CRIOPROTECTOR
Xcpa3=interp1(t1,Xcpa,Teut2);
Xtot3=XB+Xcpa3;
plot(Xtot3*100,Teut2-273,'*k');
hold on;
%CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA QUE QUEDA POR ENCIMA DE LA TEMPERATURA
%A LA CUAL LA SOLUCIÓN EXTRACELULAR QUEDA SATURADA EN CRIOPROTECTOR.
dim=size(Xtot);
j=1;
while Xtot(j)<Xtot3
j=j+1;
if j>dim(1,1)
break;
end
end
for k=1:1:j-1
Xtotp(k)=Xtot(k);
t1p(k)=t1(k);
end
Xtotp(k+1)=Xtot3;
t1p(k+1)=Teut2;
432
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA enfr_id_lineal_satClNa
function
varargout=enfr_id_lineal_satClNa(t,y,flag,XBsat,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa)
%*********************************************************************************
% Programa que modela la ecuación diferencial que muestra la deshidratación
% celular cuando el sistema es sometido a un perfil de enfriamiento lineal
% en un medio intracelular saturado en cloruro sódico.
%*********************************************************************************
if nargin<14 | isempty(Mcpa)
Mcpa=92.09;
end
if nargin<13 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
switch flag
case ''
varargout{1}=f(t,y,XBsat,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa);
case 'init'
[varargout{1:3}]=init;
otherwise
error(['Unknown flag']);
end
function dydt=f(t,y,XBsat,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa)
R=8.3143;
SLf=integralLf(t);
Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5);
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;v2=2;M2=58.455;
nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
F=B;%perfil de enfriamiento lineal
aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F));
nB=(y-ncpa*(Vmcpa-Mcpa/MA*VmA))/(Vm2+M2/MA*VmA*(1-XBsat)/XBsat);
XAin=(y-nB*Vm2-ncpa*Vmcpa)/(y-nB*(Vm2-v2*VmA)-ncpa*(Vmcpa-VmA));
dydt=[aux*(SLf-log(XAin))];
function [tspan,y0,options]=init
tspan=[273 190];
y0=[3.1629*1e-17];
options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);
433
ANEXO
PROGRAMAS
APARTADO 30
PROGRAMA PRINCIPAL
%************************************************************************************
% Programa que permite calcular y dibujar la evolución del subenfriamiento a lo
% largo de todo el proceso de deshidratación celular cuando hay presente
crioprotectores.
%*************************************************************************************
n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón
Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón
A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón
VmA=18*1e-6;MA=18;
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN
Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
for ncpa=[1.26516*1e-14 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector
if ncpa==0
Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón
else
Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón
E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón
end
Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón
%Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las
%distintas etapas de deshidratación.
[Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2,Xtot1,t0,Xtot2,t1]=Curva_Crioscopica2(V
i,n2,ncpa,Vmcpa,Mcpa);
%CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN
[t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);
V00=y00./Vi;
Ti=interp1(V00,t00,1);
for B=[-30]
%Deshidratación celular hasta que alcanzamos la temperatura a la cual el medio
%extracelular queda saturado en sal:Teut1
[Tp1,Xp1]=Desh_Etapa_1_ternario(B,Ti,Teut1,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]);
t01=interp1(Xtot1,t0,Xp1);
subenfr1=t01-Tp1;
dim1=size(subenfr1);
%Deshidratación celular hasta que el medio intracelular queda saturado en sal
[Tp2,Xp2,XBsat2,Xcpasat2,Tsat2]=Desh_Etapa_2_ternario(B,Ti,Vi,XBeut1,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,
ncpa,[],[]);
t02=interp1(Xtot1,t0,Xp2);
subenfr2=t02-Tp2;
dim2=size(subenfr2);
%Deshidratación celular hasta que alcanzamos la temperatura a la cual el medio
%extracelular queda saturado en crioprotector
[Tp3,Xp3,Xcpa3]=Desh_Etapa_3_ternario(B,Tsat2,XBsat2,Teut2,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]
,[]);
dim3=size(Tp3);
j=1;
Xtoteut1=XBeut1+Xcpaeut1;
while Xp3(j)<Xtoteut1
j=j+1;
if j==dim3(1,2)
break;
end
end
%CASO EN EL QUE NUNCA ALCANZAMOS EN EL MEDIO INTRACELULAR LA COMPOSICIÓN DE
%SATURACIÓN EN SAL DEL MEDIO EXTERIOR
if j==dim3(1,2)
t03=interp1(Xtot1,t0,Xp3);
434
ANEXO
PROGRAMAS
subenfr3=t03-Tp3;
plot(Tp3-273,subenfr3,'g')
axis([-80 0 0 50]);
hold on;
end
if j==1
t03=interp1(Xtot2,t1,Xp3);
subenfr3=t03-Tp3;
plot(Tp3-273,subenfr3,'g')
axis([-80 0 0 50]);
hold on;
end
%CASO EN EL QUE SI ALCANZAMOS EN EL MEDIO INTRACELULAR LA COMPOSICIÓN DE
%SATURACIÓN EN SAL DEL MEDIO EXTERIOR
if j<dim3(1,2)& j>1
for m=1:1:j-1
Xp3izq(m)=Xp3(m);
Tp3izq(m)=Tp3(m);
end
for k=1:1:dim3(1,2)-j+1
Xp3der(k)=Xp3(j-1+k);
Tp3der(k)=Tp3(j-1+k);
end
t03izq=interp1(Xtot1,t0,Xp3izq);
subenfr3izq=t03izq-Tp3izq;
t03der=interp1(Xtot2,t1,Xp3der);
subenfr3der=t03der-Tp3der;
plot(Tp3izq-273,subenfr3izq,'g',Tp3der-273,subenfr3der,'g')
axis([-80 0 0 50]);
hold on;
clear Xp3izq,Xp3der;
end
%Dibujamos las curvas de subenfriamiento
plot(Tp1-273,subenfr1,'k',Tp1(dim1)-273,subenfr1(dim1),'*r')
hold on;
plot(Tp2-273,subenfr2,'k:',Tp2(dim2)-273,subenfr2(dim2),'*r')
hold on;
clear Xp1,Xp2,Xp3;
clear Tp1,Tp2,Tp3;
end
end
clear all;
El subprograma Desh_Etapa_1_ternario es el mismo que el del apartado
27.
El subprograma Desh_Etapa_2_ternario es el mismo que el del apartado
28.
El subprograma Desh_Etapa_3_ternario es el mismo que el del apartado
29.
435
ANEXO
PROGRAMAS
SUBPROGRAMA Curva_Crioscopica2
function
[Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2,Xtot1p,t0p,Xtot2p,t1p]=Curva_Crioscopica(Vi
,n2,ncpa,Vmcpa,Mcpa)
if nargin<5 | isempty(Mcpa)
Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL
end
if nargin<4 | isempty(Vmcpa)
Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL
end
VmA=18*1e-6;MA=18;%AGUA
Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN
R=8.3143;
msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% masa de solutos:sales y crioprotectores.
Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos.
%CALCULAMOS DESCENSO CRIOSCÓPICO SIN ESTAR LA SOLUCIÓN SATURADA
[t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa);
XB1=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA);
Xcpa1=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA);
Xtot1=XB1+Xcpa1;
%CALCULAMOS LEYES DE SOLUBILIDAD DE LA SAL INICIALES
ysol0=0.15*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(cálculo)
%CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
%Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL INICIAL
[XBeut01 Teut01]=intersec_solub(t0,XB1,ysol0);
Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBeut01);
Xcpaeut01=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA);%concentracion de CPA cuando
%estamos saturados en
sal.
Xtoteut01=XBeut01+Xcpaeut01;
%CALCULAMOS LEYES DEFINITIVAS DE SOLUBILIDAD DE LA SAL
ysol=XBeut01*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(cálculo)
ysol1=Xtoteut01*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(dibujar)
%CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
%Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL DEFINITIVO
[XBeut1 Teut1]=intersec_solub(t0,XB1,ysol);
Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBeut1);
Xcpaeut1=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA);%concentracion de CPA cuando
%estamos saturados en
sal.
Xtoteut1=XBeut1+Xcpaeut1;
%CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO QUE QUEDA POR ENCIMA
%DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL
dim=size(Xtot1);
j=dim(1,2);
while Xtot1(j)<Xtoteut1
j=j-1;
if j==1
break;
end
end
for k=1:1:dim(1,2)-j
Xtot1p(k)=Xtot1(dim(1,2)+1-k);
t0p(k)=t0(dim(1,2)+1-k);
end
Xtot1p(k+1)=Xtoteut1;
t0p(k+1)=Teut1;
%CALCULAMOS NUEVA LEY DE DESCENSO CRIOSCÓPICO PARA CUANDO LA SOLUCIÓN
%EXTRACELULAR ESTÁ SATURADA EN SAL.
[t1,y1]=Desc_Crios_SatClNa(Vi,n2,ncpa,Teut1,XBeut1,Vmcpa,Mcpa);
XB2=XBeut1;
nB=(y1-ncpa*(Vmcpa/MA*VmA))./(Vm2+M2/MA*VmA*(1-XBeut1)/XBeut1);
Vsol2=nB*Vm2+ncpa*Vmcpa;
msol2=nB*M2+ncpa*Mcpa;
Xcpa2=(ncpa*Mcpa/MA*VmA)./(y1-Vsol2+msol2*VmA/MA);
436
ANEXO
PROGRAMAS
Xtot2=XB2+Xcpa2;
%CALCULAMOS LEYES DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR
zsol=.63*exp((-18.3*1e3/R)*(1./t1-1/193));%SOLUBILIDAD DEL GLICEROL(cálculo)
zsol1=(.63+XBeut1)*exp((-18.3*1e3/R)*(1./t1-1/193));%SOLUBILIDAD DEL GLICEROL(dibujar)
%CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA NUEVA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO
%Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR
[Xcpaeut2 Teut2]=intersec_solub(t1,Xcpa2,zsol);
XBeut2=XBeut1;
Xtoteut2=XBeut1+Xcpaeut2;
%CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO QUE QUEDA POR ENCIMA
%DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR
dim=size(Xtot2);
j=1;
while Xtot2(j)<Xtoteut2
j=j+1;
if j==dim(1,2)
break;
end
end
for k=1:1:j-1
Xtot2p(k)=Xtot2(k);
t1p(k)=t1(k);
end
Xtot2p(k+1)=Xtoteut2;
t1p(k+1)=Teut2;
El subprograma DescCrio_id_integra1 es el mismo que el del apartado
21.
El subprograma intersec_solub es el mismo que el del apartado 24.
437
BIBLIOGRAFÍA
438
BIBLIOGRAFÍA
VIII. BIBLIOGRAFÍA
(1) Armand M. Karow, Ph.D. ,2001,”Cryobiology 2001 for mammakian
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biophysical response during freezing in tissues”, Annu. Rev. Biomed Eng.
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cryopreservation: critical tissues”, Biomaterials 17, 243-256.
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(27) Levine I.N., Fisicoquímica.
(28) M. Diaz Peña, A. Roig Muntaner, Química Física.
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440