12/2/2009
INGENIERíA BIOFARMACÉUTICA
Mario Moisés Álvarez
Centro de Biotecnología FEMSA
TECNOLÓGICO DE MONTERREY
Grupo Ingeniería de Bioreacción y Biotecnología Farmacéutica.
DIA. 2nd Latin American Regulatory Conference (LARC)
Ciudad de México, México. Noviembre 2009
1
12/2/2009
INGENIERÍA BIOFARMACÉUTICA
¿Qué es un Biofármaco?
¿Qué es un Biofármaco?
•Proteína ó Ácido Nucleico • Fines terapéuticos
• Obtenidos por vía biotecnológica
• No obtenidos directamente por extracción de fuentes No obtenidos directamente por extracción de fuentes
naturales (“non‐engineered”)… entonces, generalmente hay una célula recombinante de por medio…
Walsh G. (2003). Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology. Second Editions. Wiley. 551 pp.
EJEMPLOS DE BIOFARMACOS
• Insulina recombinante
• Eritropoyetina
• Interferón • Hormona del Crecimiento Humana Recombinante
• Anticuerpos Monoclonales
•Terapias basadas en suministro de RNAi
T
i b d
i i t d RNAi
2
12/2/2009
HISTORIA Y NÚMEROS
• Industria Farmacéutica: apenas 65 años de historia
• Valor “total” en 1980: 100 billones de dlls= 100,000,000,000 dlls
• Industria Biofarmacéutica: comenzó a principios de los 80
• Grandes nombres: Genentech, Amgen, Centocor, Chiron, G d
b
G
t h A
C t
Chi
Wyeth, Serono, Roche, Cytogen, Eli Lily.
•Farma migrando a biofarma: Merck, BMS, Abbott, Novartis.
According to:
Biotech 2007. Life Sciences: A global Transformation.
21st Annual Report On the Industry.
Burrill&Company. STEVE Burrill.
VALOR SOLO BIOFARMA… SOLO LAS 10 PRIMERAS
SOLO LAS 10 PRIMERAS:
Billon
nes dlls
$491
$441
$52
$39
$15
1986
1991
1996
2001
2006
3
12/2/2009
Billones dlls
$491
$441
•Genentech
•Cetus
•ALZA
ALZA
•Applied
Biosystems
•Centocor
•Amgen
•Nova
•Chiron
•Genetics Institute
•Biogen
Biogen
Genentech
Amgen
Gilead Sciences
Celgene
Biogen Idec
Genzyme
Serono
Shire
Quest Diagnostics
MedImmune
Amgen
Genentech
Chiron
ALZA
Biogen
G
Genzyme
Genetics
Institute
Centocor
IDEXX
Immunex
$52
$39
$15
1986
1991
1996
2001
2006
The Cancer Stem Cell Hypothesis Red= CSC; less than 1% of tumor cells
90% will not develop
tumors
90% will develop
tumors
4
12/2/2009
PC3 (Prostate Cancer)
CD 133 +
PC3 (Prostate Cancer)
5
12/2/2009
N
IgG, Inmunoglobulina G
OPTIMIZACIÓN
¿Quién sintetiza el gen?
6
12/2/2009
Recodificación de codones
Fragmento de la región constante de la cadena ligera
En menos de 350 En menos de 350 pb
pb hay 7 vs 3 codones con < 15% de uso
VERSIONES IRES 1
• IRES 1 (
IRES 1 (LL‐P)
–
Versión 1: Bicistrónico fluorescente ((L‐P + + G
G)
–
Versión 2: Tricistrónico (
Versión 2:
Tricistrónico (L‐P‐D)
7
12/2/2009
Aumento en la eficiencia de transfección
(Co‐transfeccion no requerida)
José Manuel Aguilar Yáñez
Sergio García Echauri
Gonzalo Mendoza Ochoa
Roberto Portillo Lara
David Bulnes Abundis
Ernesto José Aguirre Ezkauriatza
Johari Salgado
Mario Moisés Álvarez
Vacuna InfA H1N1
Grupo M.M. Álvarez Escuela de Biotecnología y Salud
8
12/2/2009
El virus Inf A H1N1
Introducción
http://gamapserver.who.int/h1n1/atlas.html
?select=ZZZ&filter=filter4,confirmed
El virus Inf A H1N1
Introducción
A.
HA
MP
MP
NA
MP
B.
9
12/2/2009
Una nueva vacuna
Concepto
Inactivación
Purificación
El virus Inf
El virus Inf A H1N1
HA
NA
NP
M1
M2
NS1
NS2
PB1, PB2, PA
10
12/2/2009
Una nueva vacuna
Concepto
NA
HA
CATCATCAT
CATCATCAT
NA
HA
Purificación
VACUNA
Una nueva vacuna
Concepto
HA de la Influenza A H1N1, 1918
11
12/2/2009
•
•
•
•
•
•
Retiene inmunogenicidad
Vacuna sin virus
Se expresa en cantidades superiores a 1 g/L
Bajo costo de producción
Corto tiempo de proceso (24 horas cada lote)
No es intuitivo el diseño de la molécula y
del proceso
Producción controlada
Proceso
Fermentación I, reactores Infors 250 ml
37 KDa
cTorHA-H1N1
cTorHA26 KDa
25 KDa
M = marcador de peso molecular BIORAD
Precision Plus Kaleidoscope (Cat.No. 161-0375)
G41
A
G41
B
G41
C
41 CC-
T41
B
T41C
TRB
TRC
M
12
12/2/2009
Producción controlada
Proceso
G41A
G41B
T41 B
G41C
T41 C
TR B
TR C
WESTERN BLOT DEL GEL
ANTERIOR
Anticuerpo antianti-6HIS peroxidado
Proceso de bioreacción
Reacción biológica (5 L)
1.8
6
X (absorbance units)
1.6
5
y = 1.6291x + 0.102
R² = 0.9862
1.4
R² = 0.9971
1.2
4
5 L Bioreactor 1
3
0.8
T41 C
0.6
Ln T41C
2
Linear (región exponencial)
1
0.4
0.2
0
0
0
2
4
6
8
10
Time (h)
13
12/2/2009
Producción controlada
Proceso
Fracción Fracción Región
soluble insoluble no unida
REACTOR
5L
37 KDa
Cuerpos de inclusión
cTorHA‐
H1N1
25 KDa
cTorHA‐
H1N1
Marcador
1
2
3
4
5
6
7
8
Producción controlada
Proceso
Gel electroforético 2D al 11%, pH 3-11.
Fracción insoluble de lisado celular.
14
12/2/2009
Producción controlada
Proceso de purificación
Método de purificación desarrollado
Proteína cTorHA-H1N1 99.5% pura
Marcador de
peso molecular
cuerpos
de
inclusión
Lavados del
Lisado celular
retenido
en resina
Eluído de columna
de afinidad
Producción controlada
Proceso de purificación
637 mg/L
63.7 mg/L
Considerando reacción y purificación
100% pureza
15
12/2/2009
Producción controlada
Proceso de purificación
63.7 mg/L
considerando reacción y purificación
4000 dosis/L
400,000 dosis/100 L
Por día
Planta piloto de producción
Planta GMP Centro de Biotecnología
400,000 dosis/100 L/día
16
12/2/2009
Proceso completo
Reacción más purificación
1
A
Cromatografía de
afinidad
B
Lisis celular
Solubilización de
Cuerpos de
inclusión
C
D
E
3
Cultivo
Microfiltración
o centrifugación
2
4
N
IgG, Inmunoglobulina G
17
12/2/2009
18
12/2/2009
Modelación tridimensional vista anterior
19
12/2/2009
Modelación tridimensional, vista posterior
Curva Estándar de IgG anti-TNFα
Abs 450 nm
1.2
1
0.8
0.6
y = 0.043x + 0.0029
R² = 0.999
Y
0.4
0.2
Predicted Y
0
Más concentración
-0.2 0
5
10
15
20
25
30
[IgG ng/mL]
3 repeticiones
Menos concentración
Muestras
20
12/2/2009
Técnica de ELISA Indirecta
(Enzyme Linked Immuno‐Sorbent Assay)
Fundamento: formación de inmunocomplejos
Ventajas:
Alta sensibilidad
Especificidad
Reproducibilidad
Masiva
Bajo costo $$$
5ta MTX (1 uM):
3ra MTX (250 nM):
(250 nM):
0.4 pg/cel*día
6ta MTX
(2 uM):
9 pg/cel*día
2 pg/cel*día
DHFR: L‐P, P‐L
GFP:
L‐P, P‐L
UCOE:
L‐P, P‐L
21
12/2/2009
Cuantificación de IgG anti‐TNFα,
de un Biorreactor APLICON 1 L
Curva Están
ndar
Muestras
Día 1
Día 2
Día 3
Día 4
Día 5
Técnica de ELISA Indirecta
Curva Estándar de IgG anti-TNFα
Abs 450 nm
1.2
1
0.8
0.6
y = 0.043x + 0.0029
R² = 0.999
Y
0.4
0.2
Predicted Y
0
-0.2 0
5
10
15
20
25
[IgG ng/mL]
30
Producción de IgG anti‐TNFα
(9 pg/ cel*día )(5x106 cel/ml)(7 días batch)= 0.315 mg/ml
En reactor 50L = 15.75 g x batch
DHFR: L‐P, P‐L
GFP:
L‐P, P‐L
UCOE:
L‐P, P‐L
22
12/2/2009
INGENIERÍA DE BIOREACCIÓN
CULTIVO DE CÉLULAS CHO EN REACTORES
CHO‐DG44 en Medio FreeStyle CHO
6 00E 06
6.00E+06
100 00
100.00
90.00
5.00E+06
80.00
70.00
Densidad celular
4.00E+06
60.00
3.00E+06
50.00
Vivas
Muertas
40.00
2.00E+06
30.00
Viabilidad
Anticuerpo Total
20.00
1.00E+06
10.00
0.00E+00
0.00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Días
23
12/2/2009
INGENIERÍA DE BIOREACCIÓN
(“Screening de condiciones”)
• 4 Reactores de Screening Independientes
• Completamente instrumentados
•Flujo de gases controlado: O2, CO2, N2, aire
Sistema DASGIP®
INGENIERÍA DE BIOREACCIÓN
(Screening de condiciones)
Sistema Infors
24
Re
eactor NB 50
0 L
12/2/2009
Biotecnología en equipo:
nuestra planta piloto
25
12/2/2009
INGENIERÍA DE BIOSEPARACIONES
Afinidad…es la palabra
High affinity‐low cost cromathography particles for purification of recombinant proteins
26
12/2/2009
High affinity‐low cost cromathography particles for purification of recombinant proteins
La Topografía de una partícula
Fragmentos de anticuerpo en células de planta
Células NT (tabaco) cultivadas en un reactor agitado (prueba de viabilidad)
27
12/2/2009
José Manuel Aguilar‐ Yáñez
Leydi Maribel Carrillo Cocom
Alfonso García Ullóa
David Bulnes Abundis
Felipe López
28
0
