icsi - Conicyt

UIVERSIDAD DE LA FROTERA
FACULTAD DE CIECIAS AGROPECUARIAS Y FORESTALES
OPTIMIZACIÓ
DE
LA
TÉCICA
DE
IYECCIÓ
ITRACITOPLASMATICA DE ESPERMATOZOIDES (ICSI) E
BOVIOS Y EVALUACIÓ DE LA CALIDAD DE LOS EMBRIOES
GEERADOS
Tesis presentada a la Dirección Académica de
Postgrado de la Universidad de La Frontera
para obtener el Grado de Doctor en Ciencias
mención Biología Celular y Molecular
Aplicada
MARÍA ELEA ARIAS CEA
PROFESOR GUÍA: DR. RAÚL SÁNCHEZ G.
TEMUCO - CHILE
2013
UIVERSIDAD DE LA FROTERA
FACULTAD DE CIECIAS AGROPECUARIAS Y FORESTALES
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE DOCTORADO
Se informa a la Dirección Académica de Postgrado de La Universidad de La Frontera que la
Tesis de Doctorado presentada por la candidata:
SRA. MARÍA ELEA ARIAS CEA
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para el grado de
Doctor en Ciencias, mención Biología Celular y Molecular Aplicada, en el examen de defensa
de Tesis rendido el 07 de Mayo de 2013.
Profesor Guía
Dr. Raúl Sánchez G.
____________________________
Profesor Evaluador Interno
Dra. Juanita Villegas M.
____________________________
Profesor Evaluador Interno
MSc. Jennie Risopatrón G.
____________________________
Profesor Evaluador Externo
Dr. Marcelo Ratto F.
____________________________
Profesor Evaluador Externo
Dra. Teresa Mogas.
____________________________
2
COMISIO EXAMIADORA
PROFESOR GUÍA:
Dr. Raúl Sánchez G.
Facultad de Medicina.
Universidad de La Frontera.
Temuco. Chile.
PROFESOR EVALUADOR ITERO:
Dra. Juanita Villegas M.
Facultad de Medicina.
Universidad de La Frontera.
Temuco. Chile.
PROFESOR EVALUADOR ITERO:
MSc. Jennie Risopatrón G.
Facultad de Medicina.
Universidad de La Frontera.
Temuco. Chile.
PROFESOR EVALUADOR EXTERO:
Dr. Marcelo Ratto F.
Facultad de Ciencias Veterinarias.
Universidad Austral de Chile.
Valdivia. Chile.
PROFESOR EVALUADOR EXTERO:
Dra. Teresa Mogas.
Departamento de Medicina y Cirugía
Animal.
Universidad Autónoma de Barcelona.
España.
3
FIACIAMIETO DE LA TESIS
Esta tesis fue realizada desde el año 2010 hasta Junio 2011 en el Laboratorio de
Biotecnología Animal del Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA-Carillanca), y a
partir de Julio 2011 en el Laboratorio de Reproducción del Centro de Biotecnología de La
Reproducción (CEBIOR), de La Universidad de La Frontera, y conto con el apoyo de:
Proyectos:
•
FONDECYT Nº 1120241. Intracytoplasmic sperm injection in bovine: Effects of
sperm treatment and oocyte activation on subsequent in vitro and in vivo embryo
development.
•
FONDECYT Nº 1080216. Optimización de las condiciones de activación y cultivo de
embriones bovinos clonados para mejorar la eficiencia de clonación en esta especie.
•
FONDECYT Nº 1100449. Oxidative stress in cryopreserved bovine spermatozoa:
Effect on gene expression and quality of embryos produced in vitro.
Beca:
•
Beca para estudios de Doctorado en Chile, CONICYT. Convocatoria 2009.
4
AGRADECIMIETOS
En estas líneas quiero agradecer a todas aquellas personas que colaboraron en la
finalización de esta etapa de mi vida académica, en especial a mi esposo y padres por su
apoyo incondicional, fortaleza y cariño.
Agradecer al Dr. Ricardo Felmer, por su apoyo y disposición lo cual contribuyó para
el mejoramiento de mi trabajo. Además quiero expresarle mi gratitud por entregarme las
herramientas necesarias para concluir esta nueva etapa.
También quiero agradecer al Dr. Raúl Sánchez, Dra. Juanita Villegas y Dr. Marcelo
Ratto por sus recomendaciones y buena disposición. Agradezco también a mis compañeros de
Laboratorio quienes con su buen humor y disponibilidad hicieron que la labor de algunos días
fuera menos pesada.
5
PUBLICACIOES
La presente tesis de Doctor originó hasta la fecha las siguientes publicaciones ISI:
1. Arias ME, Sánchez R y Felmer R. 2011. Evaluation of different culture systems with low
oxygen tension on the development, quality and oxidative stress-related genes of bovine
embryos produced in vitro. 20 (3): 209-17.
2. Arias ME, Sanchez R, Risopatrón J, Pérez L, Felmer R. 2013. Influence of sperm
pretreatment with NaOH and DTT on the efficiency of intracytoplasmic sperm injection
(ICSI) in bovine. Reproduction, Fertility and Development. (Aceptada).
3. Arias ME, Sánchez R, Risopatrón J, Felmer R. 2013 Comparison of ICSI and IVF on
development, quality and gene expression profile of bovine preimplantation embryos.
Fertility and Sterility. (Enviada).
4. Arias ME, Sánchez R y Felmer R. 2013. A new combined treatment of ionomycin and an
inhibitor protein synthesis allows the development of high quality blastocysts after bovine
ICSI. (Manuscrito en preparación).
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ÍDICE
I.
RESUMEN
II.
ABSTRACT
III. INTRODUCCIÓN
1. Características de la inyección intracitoplasmatica de espermatozoides
en bovinos.
2. Activación.
2.1. Activación natural de ovocitos. Fecundación.
2.2. Activación artificial o partenogénesis de ovocitos.
2.3. Activación artificial de ovocitos inyectados con espermatozoides (ICSI).
3. Especies reactivas del oxígeno y su efecto en la fecundación in vitro.
IV. HIPÓTESIS
V. OBJETIVOS
VI. MATERIALES Y METODOS
1. Recolección de ovarios, selección de ovocitos y maduración in vitro.
2. Fecundación in vitro.
3. Preparación de semen para ICSI.
4. Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
5. Activación de ovocitos (tratamientos).
6. Cultivo de embriones.
7. Evaluación de la fecundación.
8. Sexado de embriones.
9. Análisis de espermatozoides por citometría de flujo (FACS).
10. Extracción del ARN y transcripción reversa.
11. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR).
12. Recuento total y diferencial del número de células en blastocistos de 7 días.
13. Tinción TUNEL.
14. Análisis estadístico para los experimentos.
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN OBJETIVO ESPECÍFICO 1:
- Evaluación del efecto del tratamiento de espermatozoides con DTT y
solución alcalina sobre la eficiencia en la generación de embriones mediante
el procedimiento de ICSI.
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN OBJETIVO ESPECÍFICO 2:
- Evaluación del efecto de 3 protocolos de activación química sobre las
tasas de desarrollo embrionario, ploídia y calidad de los embriones
generados por ICSI.
IX. RESULTADOS Y DISCUSIÓN OBJETIVO ESPECÍFICO 3:
Evaluación del efecto de los sistemas de producción in vitro de embriones
ICSI y FIV, sobre la expresión de genes relacionados al estrés oxidativo y
la calidad de los embriones generados.
X. CONCLUSIONES GENERALES
XI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
XII. ANEXOS:
- Publicaciones.
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I. RESUME
El
incementar la eficiencia de la ICSI en bovinos ha sido intentanda por multiples
investigadores, no obstante la formación de blastocistos sigue siendo inferior a lo observado durante la
FIV Diferentes factores espermáticos y ovocitarios se han señalado pueden influenciar el resultado de
la ICSI en el bovino, adicionalmente, algunos problemas técnicos asociados con la ICSI
particualrmente en esta especie también puede afectar el resultado. De esta manera, se buscó optimizar
un tratamiento para los espermatozoides antes de ICSI con el fin de aumentar la proporción de
ovocitos fecundados y el potencial desarrollo de los embriones, evaluando el efecto sobre el desarrollo
embrionario de la incubación de espermatozoides bovinos con NaOH antes de la ICSI (ICSI-NaOH).
Este estudio describe por primera vez el efecto del NaOH sobre los espermatozoides bovinos y la
efectividad del tratamiento ICSI-NaOH en la producción de embriones bovinos, logrando tasas de
desarrollo y formación de blastocistos, y calidad embrionarias similares a las obtenidas con
tratamientos tradicionales. Adicionalmente, el estudio demostró que el pre-tratamiento clásico de
espermatozoides con DTT antes de la ICSI no es esencial para un apropiado desarrollo embrionario in
vitro. También con el fin de incrementar el potencial de desarrollo de los embriones generados por
ICSI y con esto eventualmente aumentar la tasa de descendencia viable, evaluamos el efecto de 4
compuestos químicos, 6-dimetilaminopurina (DMAP), cicloheximida (CHX), etanol (EtOH) y un
inhibidor de la síntesis de proteínas (INP) sobre el desarrollo y calidad de embriones bovinos
generados por ICSI. Los resultados determinaron que los tratamientos de activación de ovocitos
bovinos con CHX e INP permiten generar una alta tasa de desarrollo y formación de blastocistos, y
embriones de buena calidad mediante ICSI, no así el protocolo que utiliza EtOH y DMAP.
Por otra parte, el desarrollo y sobrevivencia de embriones generados por ICSI y FIV puede
llegar a ser comparable en algunas especies, sin embargo, existen muy pocos estudios donde se hayan
comparado la calidad de los embriones generados en ambos métodos, particularmente en bovinos. De
acuerdo a estos antecedentes, el último objetivo fue evaluar el efecto de los métodos de producción in
vitro de embriones ICSI y FIV, sobre la expresión de genes, desarrollo y calidad embrionaria. Los
resultados mostraron que las tasas de desarrollo y formación de blastocistos son superiores cuando se
utiliza FIV, sin embargo, la calidad de los embriones no se afecta mayormente, excepto la MCI y
proporción MCI: células totales. Además el análisis de expresión génica mostró que los embriones
generados mediante ICSI poseen un perfil de espresión diferente a los producidos mediante FIV.
Aunque esta Tesis permitio optimizar la ICSI en bovinos, los resultados apoyan la necesidad
de futuras investigaciones en ICSI en bovinos con el objetivo de mejorar los factores responsables de
la baja eficiencia de esta técnica en esta especie.
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II. ABSTARCT
Although many researchers have tried to improve the efficiency of ICSI in cattle, the
blastocyst formation remains lower than that seen in IVF. Oocytes and sperm factors have been
identified that can influence the outcome of ICSI in cattle, furthermore some technical problems
particularly associated with bovine ICSI can also affect the outcome. Therefore, we sought to optimize
a treatment for sperm prior to ICSI to increase the proportion of fertilized oocytes and embryo
development potential, assessing the effect of this treatment on the embryo development of bovine
sperm incubated with NaOH prior to ICSI (ICSI-NaOH). This study allowed for the first time to
describe the effects of NaOH on bovine sperm and its effectiveness in the production of bovine
embryos. This treatment allowed to achive development rates, blastocyst formation, and embryo
quality similar to those obtained with traditional treatments. Additionally, the study showed that the
classical pre-treatment of sperm with DTT before ICSI is not essential for proper embryonic
development in vitro. In order to increase the development potential of embryos generated by ICSI and
thereby eventually increase the rate of viable offspring, we evaluated the effect of four chemical
compounds, 6-dimethylaminopurine (DMAP), cycloheximide (CHX), ethanol (EtOH) and an inhibitor
of protein synthesis (INP) on development and quality of bovine embryos generated by ICSI. The
results showed that the activation of bovine oocytes with CHX and INP can generate a high rate of
development and blastocyst formation, and good quality embryos, but the protocol with EtOH and
DMAP were not effective.
Moreover, several studies have shown that the development and survival of embryos
generated by ICSI and IVF can be comparable in some species, however, few studies have compared
the quality of the embryos produced in both methods, particularly in cattle. According to these data,
the last objective of this thesis was to evaluate the effect of in vitro embryo production methods IVF
and ICSI on gene expression, development and embryo quality. The results showed that rates of
development and blastocyst formation are superior when using FIV, however, the embryo quality is
not largely affected except by the ICM and ICM: total cell ratio. Furthermore, the gene expression
analysis also showed that embryos generated by ICSI have a different profile compared to those
produced by IVF.
Although this thesis allowed to optimize an ICSI procedure in cattle, the results support the
need for further research in bovine ICSI in order to improve the factors responsible for the low
efficiency of this technique in this species.
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III. ITRODUCCIÓ
La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI, del inglés Intracytoplasmic sperm
injection) es una técnica de reproducción asistida que involucra la inyección directa de un
espermatozoide
dentro de un ovocito detenido en metafase II, evitando muchos de los pasos
normalmente presentes en la interacción entre gametos durante la fecundación in vivo e in vitro. Esto
incluye la reacción acrosómica, unión del espermatozoide a la zona pelúcida, penetración y fusión con
la membrana plasmática del ovocito (Sutovsky and Schatten 2000, Hewitson et al. 2000).
La técnica ICSI ha potenciado las tecnologías de reproducción asistida en animales y
humanos, ofreciendo una oportunidad para investigar los aspectos fundamentales relacionados con la
fecundación, tales como los mecanismos de interacción entre gametos, la activación de ovocitos
inducida por espermatozoides y el control del ciclo celular (Galli et al. 2003, Palermo et al. 1992).
Desde los primeros estudios de inyección de espermatozoides humanos y de hámster en ovocitos de
hámster en 1976 (Uehara and Yanagimachi 1976), la técnica se ha replicado con éxito en diferentes
especies. Los primeros mamíferos nacidos por ICSI fueron conejos (Hosoi et al. 1988, Iritani and
Hosoi 1989). A partir de entonces, se ha obtenido descendencia viva en humanos (Palermo et al. 1992,
Van Steirteghem et al. 1993b), ovejas (Catt et al. 1996), caballos (Cochran et al. 1998), gatos (Pope et
al. 1998), monos (Hewitson et al. 1999), bovinos (Hamano et al. 1999, Horiuch et al. 2002), cerdos
(Martin 2000, Nakai et al. 2003) y ratones (Hirabayashi et al. 2002, Hirabayashi et al. 2005),
confirmando que los ovocitos fecundados generados por ICSI son biológicamente normales (Cibelli et
al. 2002).
La tecnología ICSI es considerada el método de elección para solucionar problemas de
infertilidad debido a factores masculinos (Palermo et al. 1992, Van Steirteghem et al. 1993a, Van
Steirteghem et al. 1993b), ya que requiere de menos espermatozoides para fertilizar el mismo número
de ovocitos que la inseminación artificial convencional o fecundación in vitro (FIV), proporciona altas
tasas de fecundación y permite el uso de espermátidas en diferentes estados de maduración (Cibelli et
al. 2002). Además, en animales es muy valiosa por la utilización más eficiente de semen sexado y
convencional de alto valor (Horiuch et al. 2002). En bovinos, los primeros terneros nacidos vivos se
obtuvieron por inyección de espermatozoides muertos congelados sin crioprotectores (Goto et al.
1990). Posteriormente, se obtuvieron crías vivas utilizando diferentes preparaciones de semen,
incluido el sexado de espermatozoides y tratamientos químicos de activación (Hamano et al. 1999).
Sin embargo, el éxito de esta técnica ha sido limitado, especialmente en especies domésticos como
bovinos, porcinos y equinos (Bedford et al. 2003, Choi et al. 2004, Suttner et al. 2000), ya que esta
técnica, no ha logrado producir tasas fisiológicas de desarrollo embrionario y fetal en ausencia de
estímulos activadores exógenos como el ionóforo de calcio y/o inhibidores de ciclinas de fase M (o
10
sus respectivas quinasas dependiente de ciclina) (Rho et al. 1998a, Chung et al. 2000, Suttner et al.
2000).
Aunque no muy explotada en bovinos, las aplicaciones de esta técnica son muy diversas
incluyendo: 1) la utilización efectiva de espermatozoides para mejoramiento genético del ganado y
para la multiplicación de animales de elite, 2) como una opción a la fertilización de ovocitos cuando
las tasas de fecundación in vitro son bajas (Horiuchi 2006) y 3) para generar bovinos sexados
(Hamano et al. 1999), de alto valor genético y comercial si se utiliza especialmente semen sexado en
combinación con la aspiración folicular guiada por ultrasonido (OPU; ovum pick-up) (Bols et al. 1998,
Garcia and Salaheddine 1998). Además, esta técnica brinda la posibilidad de utilizar espermatozoides
defectuosos de animales infértiles, si éstos son excelentes en productividad o poseen características
especiales que se deseen conservar (Horiuchi 2006) y puede utilizarse en investigación básica y en
aplicaciones biotecnológicas como en la generación de animales transgénicos, ya que el ADN se
adhiere fácilmente a los espermatozoides, siendo introducido al ovocito luego de su inyección
(Lavitrano et al. 1989, Cibelli et al. 2002, Perry et al. 1999).
1.
CARACTERÍSTICAS
DE
LA
IYECCIÓ
ITRACITOPLASMATICA
DE
ESPERMATOZOIDES E BOVIOS.
En el procedimiento ICSI en especies como humanos, conejos y ratones, el factor activador de
ovocitos transportado por espermatozoides (SOAF, del inglés sperm-borne oocyte activating factor) y
la punción del oolema, son suficientes para activar los ovocitos inyectados (Catt and Rhodes 1995,
Kimura and Yanagimachi 1995, Palermo et al. 1996, Van Steirteghem et al. 1993b, Keefer 1989, Galli
et al. 2002). Sin embargo, en bovinos, la activación de ovocitos y posterior desarrollo embrionario es
menos eficiente, ya que el espermatozoide inyectado es incapaz de iniciar las oscilaciones de calcio
necesarias para el restablecimiento de la meiosis, descondensación del núcleo espermático,
reclutamiento de ARN materno, formación de pronúcleos, sincronización de ambos ciclos celulares,
inicio de la síntesis de ADN y desarrollo embrionario (Malcuit et al. 2006a, Yanagimachi 1994).
Existen diferentes explicaciones para la baja capacidad de desarrollo embrionario después del
procedimiento de ICSI en bovinos. Una de ellas podría ser la activación incompleta del ovocito, para
lo cual, el procedimiento ICSI ha sido combinado con la activación física (Galli et al. 1999) o química
de los ovocitos (Goto et al. 1990, Horiuch et al. 2002, Rho et al. 1998a, Suttner et al. 2000, Galli et al.
2003, Chung et al. 2000). Sin embargo, el efecto de la activación de ovocitos inyectados con
espermatozoides es bastante controversial. La activación de ovocitos bovinos luego del procedimiento
de ICSI es desencadenada por ciertos componentes espermáticos, aún en ausencia de interacciones de
membrana. Sin embargo, existen diferencias en los eventos de activación cuando se comparan con los
descritos en FIV. Una de ellas es el inicio de las oscilaciones de calcio. Aunque normalmente la
11
primera onda de calcio transiente comienza a pocos minutos de ocurrida la fusión espermatozoideovocito, las oscilaciones de calcio luego de procedimientos ICSI en ratón y humanos comienzan con
un retraso de aproximadamente 30 minutos a varias horas (Tesarik et al. 1994, Nakano et al. 1997,
Yanagida et al. 2001). En bovinos, esta situación es más crítica ya que las oscilaciones de calcio no
ocurren, observándose, en muy pocos casos sólo un pico de calcio 1 hora después de la ICSI (Malcuit
et al. 2006). Este resultado es consistente con la observación de que otros eventos como la liberación
del segundo cuerpo polar y la formación pronuclear, son altamente variables y pueden diferir en varias
horas entre los ovocitos sometidos a ICSI en diferentes especies (Nagy et al. 1994).
En los ovocitos bovinos inyectados con espermatozoides los patrones de las oscilaciones de
calcio son anormales (Malcuit et al. 2006b) y la inactivación de MPF (Factor promotor de la mitosis;
Nurse 1990) es transitoria (Fujinami et al. 2004). De esta forma, la liberación y/o activación del factor
activador de ovocitos transportados por espermatozoides (SOAF) está comprometida después de la
ICSI (Abdalla et al. 2009). Esta teoría se sustenta en la baja producción de blastocistos bovinos
después de ICSI, cuando no se utilizan estímulos exógenos de activación (Rho et al. 1998a, Horiuch
et al. 2002, Galli et al. 2003, Ock et al. 2003, Oikawa et al. 2005). Además, los embriones bovinos
generados por ICSI desarrollan el pronúcleo masculino 10 horas más tarde que los embriones
generados por FIV (Li et al. 1993). De esta manera, es probable que en embriones bovinos generados
por ICSI, la asincronía de formación de ambos pronúcleos sea una de las causas de la falla y/o retraso
del desarrollo embrionario (Wei and Fukui 1999). Por otra parte, los ovocitos bovinos inyectados con
espermatozoides no inician la reacción cortical, la cual participa activamente en la remoción de la
membrana plasmática del espermatozoide y teca perinuclear (Sutovsky et al. 1997), evento
posiblemente responsable del mayor tiempo que acontece antes que el factor espermático sea capaz de
iniciar las oscilaciones de calcio. En consecuencia, los ovocitos pueden hacerse más “viejos” (cantidad
de tiempo desde el aumento de LH), al momento del inicio de las oscilaciones de calcio. Las
consecuencias fisiológicas de la activación de ovocitos “viejos” han sido determinadas en modelos de
ratón, e incluyen la disminución de la capacidad reproductiva y longevidad de la descendencia
resultante (Tarin et al. 1999, Tarin et al. 2002).
Alternativamente, la baja capacidad de desarrollo embrionario después de ICSI podría ser la
inadecuada capacitación del semen que impide la liberación de factores espermáticos responsables de
la activación de ovocitos y/o resulta en el bloqueo de la descondensación de la cabeza espermática
(Stricker 1999). Esta posibilidad se presenta particularmente en bovinos, porque el semen es más
estable que el de otras especies. De hecho, en hámster que luego de la inyección de los ovocitos con
espermatozoides bovinos, estos no pueden descondensarse, a menos que sean tratados previamente
con ditiotreitol (DTT, agente reductor específico de los puentes disulfuro) (Perreault et al. 1988). Más
aún, algunos componentes espermáticos tales como enzimas acrosomales y membranas, que durante la
12
fecundación normal no ingresan al citoplasma, podrían también afectar la activación del ovocito
bovino (Horiuch et al. 2002). Por esta razón, se han propuesto diferentes métodos para remover la
membrana plasmática y acrosomal de los espermatozoides, tales como la sonicación, procesos de
congelación -descongelación y liofilización, entre otros (Goto et al. 1990, Kuretake et al. 1996,
Wakayama et al. 1998, Wakayama and Yanagimachi 1998, Liu et al. 2004, Tateno et al. 2000, Kwon
et al. 2004). Los espermatozoides tratados por estos métodos no pierden su factor activador de
ovocitos transportados por espermatozoides (SOAF), por lo que pueden igualmente activar el ovocito
luego de su inyección (Li et al. 2009). Sin embargo, estos tratamientos producen daños en los núcleos
de los espermatozoides, afectando el potencial desarrollo embrionario (Goto et al. 1990, Kuretake et
al. 1996, Wakayama and Yanagimachi 1998, Hoshi et al. 1995). Para evitar este problema, se ha
realizado en ratón la inyección de espermatozoides tratados con un medio alcalino (NaOH 10 mM por
1 hora) previo a la ICSI, que permitiría la disolución de la membrana espermática, remoción del
acrosoma y pérdida de los factores activadores de ovocitos (Li et al. 2009). No obstante, los
espermatozoides expuestos a tales condiciones, no tienen problemas en su integridad nuclear, lo que
quedó demostrado por la alta tasa de nacimiento de crías vivas observada luego del procedimiento
ICSI. Un aspecto gravitante en el éxito de este procedimiento, consistió en la activación exógena de
los ovocitos con SrCl2 (Li et al. 2009, Li et al. 2010). De esta forma, el pre-tratamiento de
espermatozoides bovinos, acoplado a un método de activación exógena, se convirtio en un método
novedoso para evaluar en esta especie, ya que permitiría eventualmente al igual que lo observado en el
ratón, la disolución de la membrana espermática, la remoción del acrosoma y la pérdida de los factores
activadores de ovocitos, evitando el daño en el núcleo de los espermatozoides observado con los
métodos anteriormente descritos.
2. ACTIVACIÓ.
2. 1 ACTIVACIÓ ATURAL DE OVOCITOS. FECUDACIÓ.
Los ovocitos de mamíferos (excepto en el perro) se encuentran detenidos en metafase de la
segunda meiosis (MII) después de la ovulación y completan la meiosis luego de la fecundación. Del
mismo modo, los ovocitos inmaduros que son removidos desde folículos secundarios de ovarios de
matadero (profase I) que son madurados in vitro, permanecen detenidos en MII hasta la fecundación.
El arresto en MII está caracterizado por una alta actividad MPF (Factor promotor de la mitosis) que
controla la liberación del ovocito desde el bloqueo en profase. MPF es un complejo (heterodímero) de
2 proteínas denominadas ciclina B y P34/cdc2, esta última a su vez, es una proteína kinasa cuya
actividad está regulada por fosforilación y desfosforilación específica. Esta actividad está estabilizada
por un factor citostático (CSF) el cual está compuesto de al menos 3 proteínas: Mos (Sagata et al.
1989), MAPk (Haccard et al. 1993) y p90Rsk (Bhatt and Ferrell 1999), las que ayudan a mantener el
13
estatus condensado de la cromatina evitando la replicación del DNA entre MI y MII (Verlhac et al.
1994).
En el proceso de fecundación, la adhesión del espermatozoide a la membrana plasmática del
ovocito induce la liberación de Ca2+ (Lawrence et al. 1997). Esta elevación inicial del Ca2+,
comienza desde el sitio de penetración del espermatozoide y se expande en oleadas a través del
ovocito, en un proceso que puede durar varias horas (Nakada and Mizuno 1998), en el bovino por
ejemplo, alrededor de 22 (Nakada 1995). Las oleadas de Ca2+ inducidas por el espermatozoide,
desencadenan eventos bioquímicos, la mayoría aún no comprendidos, aunque uno de los procesos
claves es el descenso de actividad de la MPF-quinasa, que se produce por degradación de la ciclina B
y fosforilación de cdc2, lo que inhibe a las moléculas bloqueadoras de la metafase II, haciendo que el
núcleo del espermatozoide se descondense y se sincronicen ambos ciclos celulares, ingresando al
mismo tiempo en la fase S de síntesis de ADN. La reacción cortical es otra consecuencia de la
activación del ovocito, bajo condiciones normales cuando la zona pelúcida está intacta es importante
para iniciar el mecanismo de prevención de la polispermia. El hecho que la progresión del desarrollo
de embriones preimplantacionales pueda ser modificado por manipulación artificial de las condiciones
de activación de los ovocitos (Swann and Ozil 1994), sugiere que, además de la inactivación del MPF
y la reacción cortical, muchas otras funciones celulares están influenciadas por los eventos que
ocurren durante la activación de ovocitos (Tesarik et al. 1994).
2.2 ACTIVACIÓ ARTIFICIAL O PARTEOGÉESIS DE OVOCITOS.
El espermatozoide es el estímulo natural responsable de la activación del ovocito maduro. Sin
embargo, algunos estímulos artificiales pueden gatillar la activación del ovocito y su posterior
desarrollo hasta blastocisto. El desarrollo a blastocisto de un gameto hembra sin la contribución de un
gameto masculino se define como partenogénesis (Kaufman et al. 1975). La partenogénesis ha sido
utilizada extensivamente como modelo para estudiar los eventos bioquímicos y morfológicos que
ocurren durante las primeras etapas del desarrollo embrionario (Colas et al. 1993) y recientemente ha
cobrado mayor relevancia para la aplicación de las modernas técnicas biotecnológicas como la ICSI y
la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) o clonación.
Considerando que la liberación transiente del Ca2+ es el elemento clave para gatillar el
restablecimiento de la meiosis durante la fecundación, se han establecido diferentes procedimientos
para inducir una o más oleadas de Ca2+ en el ovocito. Estos procedimientos incluyen estímulos
químicos, físicos y eléctricos (Whittingham and Siracusa 1978, Hwang et al. 2000, Catt and Rhodes
1995, Susko-Parrish et al. 1994, Williams 2002). El perfeccionamiento de métodos para medir el nivel
de calcio intracelular y las respuestas intracelulares al mismo ha permitido saber que los pulsos
eléctricos pueden causar incrementos transientes en el Ca2+ intracelular induciendo poros en la
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membrana, lo que permite que el Ca2+ fluya hacia la célula desde el medio extracelular (Collas et al.
1993, Fissore and Robl 1992). Por otro lado, la inyección de segundos mensajeros intracelulares como
IP3 o su análogo GTP o incluso calcio,
pueden inducir incrementos en los niveles de Ca2+
intracelular similares a los producidos por el espermatozoide. Otros compuestos que causan un
incremento del calcio, aunque menos fisiológicos, son el etanol y los ionóforos de calcio (Fissore et al.
1995, Fissore and Robl 1993, Collas and Poccia 1995).
La segunda parte del proceso de activación artificial del ovocito requiere de la disminución de
la kinasa reguladora del ciclo celular MPF, la cual se encuentra elevada durante la maduración del
ovocito. La disminución de MPF se puede lograr a diferentes niveles. Ya que la concentración de
ciclina B oscila durante el ciclo celular, el nivel de las moléculas de MPF depende directamente de la
síntesis y degradación de esta molécula (Kubiak et al. 1993). Por otro lado, la actividad kinasa de MPF
está regulada específicamente por la fosforilación de sus constituyentes (principalmente cdc2 que se
mantiene constante durante el ciclo celular), fosforilación que está regulada a su vez por kinasas
específicas tales como kinasas activadoras de ciclina y otras kinasas como Myt-1 y Wee-1 (Motlik et
al. 1998). En este punto es clave la participación de la fosfatasa cdc 25 que activa MPF mediante
desfosforilación de los sitios tirosina 15 y treonina 14 de cdc2. De esta forma, los principales
mecanismos actualmente utilizados para disminuir MPF consisten precisamente en incubar los
ovocitos maduros en inhibidores de amplio espectro, ya sea de la síntesis y/o fosforilación
de
proteínas. Dos de los principales inhibidores de la síntesis de proteínas empleados son la
cicloheximida (CHX) y la puromicina, los cuales inducen la activación de ovocitos murinos y
humanos después de períodos prolongados de incubación, aunque en ratas y cerdos, estos inhibidores
no fueron suficientes para inducir la activación de ovocitos (Balakier and Casper 1993, Moses and
Kline 1995). En ovejas y bovinos en cambio, ha sido necesario el tratamiento combinado de CHX con
ionóforos de calcio para lograr una adecuada activación del ovocito (Presicce and Yang 1994,
Hagemann et al. 1995). Una inhibición más específica de MPF se puede lograr inhibiendo la
fosforilación de proteínas. Uno de los compuestos más utilizados para tal propósito es 6dimetilaminopurina (6-DMAP). Cuando los ovocitos de Xenopus laevis son expuestos a 6-DMAP, se
observa el restablecimiento de la meiosis sin liberación de Ca2+ (Zhang and Masui 1992). De la
misma forma, los ovocitos de cerdo tratados con estaurosporina y H7 (ambos también inhibidores de
la fosforilación de proteínas) restablecen la meiosis sin liberación de Ca2+ (Wang et al. 1997). Sin
embargo, ovocitos de bovinos y ratones requieren de la liberación de Ca2+ para la activación con 6DMAP, por lo que también es necesario para una efectiva activación, la combinación con ionóforos de
calcio. Esta combinación induce una alta tasa de activación, formación pronuclear y desarrollo a
blastocisto en ovinos (Loi et al. 1998b) y bovinos (Liu et al. 1998). Otros compuestos menos
empleados para la activación son los denominados inhibidores de kinasas dependientes de ciclinas
15
(CDKI). El primer compuesto identificado como CDKI es 6-DMAP. Sin embargo, este compuesto
tiene una muy baja selectividad, no obstante se han desarrollado varios compuestos sintéticos con la
función de las CDKIs, debido a que ciertas enfermedades humanas pueden ser tratadas con estos
compuestos. Butirolactona I, aislada de Aspergillus cepa 25799, inhibe selectivamente cdk2 y cdc2,
arrestando el ciclo celular en G2/M y G1/S (Gray et al. 1999) otros con una alta selectividad son la
olomucina, roscovitina y bohemina (Hajduch et al. 1999, Cibelli U.S. Patent WO 01/30970 A2).
2.3
ACTIVACIÓ
ARTIFICIAL
DE
OVOCITOS
IYECTADOS
CO
ESPERMATOZOIDES (ICSI).
Es importante destacar que en bovinos, el incremento de calcio inducido por ionóforos de
calcio o etanol es insuficiente para inactivar completamente MPF (Hoth and Penner 1992, Shiina et al.
1993), debido a la re-acumulación de ciclina B (Liu and Yang 1999) y conducción de los ovocitos a un
nueva detención en estado de metafase III (Chung et al. 2000, Rho et al. 1998b, Liu and Yang 1999).
Para evitar este fenómeno, estos estímulos son acompañados por otros compuestos químicos que
pueden disminuir la actividad de MPF que se encuentra elevada en ovocito en metafase II (Galli et al.
2003, Chung et al. 2000, Rho et al. 1998a, Suttner et al. 2000, Horiuch et al. 2002, Vichera et al. 2009,
Tateno and Kamiguchi 1999, Bevacqua et al. 2010).
En bovinos, el protocolo más utilizado en la activación de ovocitos inyectados con
espermatozoides (ICSI) es el descrito por Rho y col (1998a). Este protocolo en general comprende las
siguientes etapas:
i) incremento del nivel de calcio intracelular del ovocito mediante la introducción de cationes
divalentes hacia el citoplasma del ovocito.
ii) periodo ventana para permitir la liberación del segundo cuerpo polar.
iii) reducción de la fosforilación de proteínas celulares en el ovocito mediante la adición de 6-DMAP,
un inhibidor de la serin-treonina kinasa en cantidades que efectivamente bloquee la fosforilación en el
ovocito.
Sin embargo, a pesar que 6-DMAP induce altas tasas de activación, formación pronuclear y
desarrollo al estado de blastocisto en ovejas y bovinos (Liu et al. 1998, Loi et al. 1998a), su mayor
problema es la poca selectividad y/o amplio espectro de acción, lo que implica que no interfiere
específicamente con una kinasa, sino que puede también afectar otras kinasas involucradas en
procesos celulares, cuyo efecto puede ser deletéreo en subsecuentes eventos celulares después de la
activación (Susko-Parrish et al. 1994). Más aún, este compuesto causa daños en el ADN, reflejados en
el patrón anormal de carioquinesis en el primer ciclo celular, y además incrementa la incidencia de
anormalidades cromosómicas en partenotes y embriones clonados (De La Fuente and King 1998, Bhak
et al. 2006). Específicamente, la activación de ovocitos con Ionomicina y 6-DMAP ha mostrado una
16
alta tasa de anormalidades cromosómicas en embriones generados por partenogénesis, lo que se debió
principalmente a alteraciones durante el primer ciclo celular causando una falla en la extrusión del
segundo corpúsculo polar y re-entrada en fase S de algunos núcleos, sin pasar por metafase (De La
Fuente and King 1998). A su vez, la ploidía de los embriones tiene un efecto directo en la alta tasa de
pérdida embrionaria y fetal en humanos (Chandley 1984), así como también en especies domésticas
(King et al. 1990), generando una baja tasa de preñez y alta tasa de anormalidades congénitas entre la
descendencia. Los pocos estudios comparativos del efecto de 6-DMAP y CHX en los tratamientos de
activación de embriones clonados de ovejas y bovinos, confirman estas observaciones (Bhak et al.
2006, Alexander et al. 2006). Sin embargo, no existen suficientes estudios en embriones generados por
ICSI, que determinen los efectos de estos tratamientos de activación sobre la ploidía o las tasas de
preñez. Aunque los datos de desarrollo embrionario para embriones bovinos generados por ICSI,
confirman que la activación con 6-DMAP, potencia las tasas de formación de blastocisto comparado
con CHX (Keskintepe et al. 2002, Galli et al. 2003, Rho et al. 1998a, Abdalla et al. 2009, Oikawa et
al. 2005), también hay una mayor incidencia de anormalidades cromosómicas en embriones activados
por DMAP respecto a embriones activados por CHX (Rho et al. 1998b, Suttner et al. 2000). Estos
resultados resaltan la necesidad de determinar en más detalle y en un mismo experimento, los efectos
que estos agentes químicos tienen en los tratamientos de activación de ovocitos, y la necesidad de
buscar mejores sistemas de activación disponibles para ICSI, que permitan por una parte aumentar las
tasas de desarrollo a blastocistos y por otro, disminuir la incidencia de anormalidades cromosómicas
en los embriones generados, todo lo cual contribuirá a aumentar la eficiencia global del proceso. Estos
antecedentes dan lugar al segundo objetivo específico de este proyecto, en el cual se evaluaron 3
compuestos químicos para activar ovocitos. Uno de estos compuestos corresponde a un inhibidor de
kinasas dependientes de ciclinas (CDKsI), que no ha sido evaluado previamente en la activación de
ovocitos generados por ICSI en ninguna especie.
3. ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGEO Y SU EFECTO E LA FECUDACIÓ I
VITRO.
No obstante, los importantes avances logrados en los procedimientos de producción in vitro de
embriones bovinos (Takahashi et al. 2000), la evidencia morfológica, fisiológica y bioquímica
demuestran que la producción de embriones in vivo es muy superior, lo que se explica entre otros a la
excesiva producción de especies reactivas del oxigeno (ROS), altas concentraciones de oxígeno (O2),
radiaciones ultravioletas y concentraciones inadecuadas de metabolitos a los que son sometidos los
gametos y embriones durante el proceso de fecundación in vitro (Brenneisen et al. 1998, Guerin et al.
2001, Lonergan et al. 2001). Si bien se ha aceptado que la calidad del ovocito cumple un rol
fundamental en el potencial de desarrollo de los embriones producidos in vitro (Sirard et al. 2003), la
17
contribución del espermatozoide y los factores ambientales, particularmente aquellos relacionados con
las condiciones de cultivo a las que los embriones son expuestos, pueden afectar dramáticamente su
calidad y potencial de desarrollo (Muratori et al. 2000, Lonergan et al. 2001, Rizos et al. 2003, Yuan et
al. 2003).
El estrés oxidativo es otro importante factor a considerar en el éxito de las técnicas de
reproducción asistida (TRAs). Durante estos procedimientos, los gametos y embriones son expuestos a
condiciones diferentes a las encontradas in vivo, tales como una alta atmósfera de oxígeno (20% en
lugar de 7% del oviducto), luz y trazas de metales pesados presentes en el medio de cultivo. Estos
factores son responsables del incremento de ROS y pueden causar efectos dañinos en los embriones,
desde el mismo momento de la maduración y fecundación del ovocito, hasta completar su cultivo en la
etapa de blastocisto (Guerin et al. 2001, Luvoni et al. 1996).
El mecanismo de acción de las moléculas ROS se puede dividir en alteraciones intracelulares
del estado redox y modificaciones oxidativas de las proteínas (Thannickal and Fanburg 2000), siendo
este último, uno de los procesos potencialmente más dañinos para la función de la célula (Halliwell
1994). La cantidad de daño al sistema celular producido por ROS es dependiente del balance entre su
producción y velocidad de remoción (Guille 1991), produciendo un efecto perjudicial sobre el
desarrollo embrionario in vitro en distintas especies (Olson and Seidel 2000). En concentraciones
fisiológicas mínimas, las especies reactivas del oxígeno son indispensables en muchos procesos
biológicos, tales como en el sistema de señales intracelulares, apoptosis, inmunidad y defensa contra
microorganismos y cuerpos extraños (Hancock et al. 2001). Además, durante la capacitación
espermática, las ROS actúan fosforilando los residuos de tirosina de los espermatozoides, lo que
depende parcialmente de la capacidad del H2O2 de suprimir la actividad de la tirosina fosfatasa y de la
habilidad de estas moléculas para estimular la generación de AMPc, que estimula la fosforilación de
tirosina a través de un mecanismo dependiente de PKA (Aitken et al. 1998, Rivlin et al. 2004,
Baumber et al. 2003, Ecroyd et al. 2003, Lewis and Aitken 2001). El equilibrio oxido-reducción que
conduce la capacitación, involucra niveles estables y mínimos de producción de ROS. Sin embargo, si
las tasas fisiológicas de generación de ROS incrementan o los espermatozoides se exponen a ROS
exógeno, se puede inducir rápidamente el estado de estrés oxidativo (Baker and Aitken 2005).
El estrés oxidativo durante la maduración in vitro, puede inducir errores cromosómicos que
son indetectables en la vida del ovocito y cuya consecuencia puede manifestarse después de la
fecundación, durante el desarrollo embrionario o incluso durante la implantación (Tarin et al. 1996).
Las ROS retardan o detienen el desarrollo de embriones debido a que afectan los principales orgánulos
celulares necesarios para la adecuada división celular. Además, pueden formar agregados de
componentes del citoesqueleto, producir condensación del retículo endoplasmático y la pérdida de
fluidez de la membrana (Catt and Henman 2000). En la FIV convencional, las ROS generadas en el
18
medio de fecundación pueden causar efectos perjudiciales sobre las mitocondrias, ADN, ARN, fusión
de gametos, descondensación espermática y formación del pronúcleo masculino (Agarwal et al. 2006).
En este procedimiento, una fuente importante de ROS, son los mismos espermatozoides que pueden
generar un efecto nocivo. Además, el tiempo de incubación in vitro de ovocitos con los
espermatozoides que permanecen fuera de este, también pueden conducir a daño oxidativo de ovocitos
o embriones (Alvarez et al. 1996, Enkhmaa et al. 2009). Es importante destacar que los
espermatozoides seleccionados para programas de FIV, se originan en un ambiente que, en general,
experimenta un alto nivel de estrés oxidativo debido a que los espermatozoides utilizados provienen de
un proceso previo de criopreservación que estimula la producción de ROS intracelular, por lo que un
elevado porcentaje de estos pueden presentar daños en su ADN (Agarwal et al. 2006, Kodama et al.
1997, Twigg et al. 1998). Lo anterior, contribuye a que el origen celular de ROS sea diferente en la
FIV convencional al de la ICSI. En la FIV convencional, las ROS en el medio de cultivo pueden
originarse a partir de las células del cúmulo del ovocito, de los múltiples ovocitos fecundados y de los
mismos espermatozoides utilizados para la fecundación. En la ICSI en cambio, los ovocitos están
desprovistos de las células del cúmulo y no se realiza el proceso de co-incubación con
espermatozoides, por lo que se previene la exposición de los ovocitos a espermatozoides defectuosos
productores de ROS y al daño celular inducido por estos (du Plessis et al. 2008).
En la FIV convencional (al igual que en la inseminación intrauterina), el daño al ADN de los
espermatozoides inducidos por ROS puede no representar un problema, ya que el daño peroxidativo
colateral de la membrana plasmática hace que disminuya la posibilidad de fecundación (Aitken 1999,
Twigg et al. 1998, Ng et al. 1991, Palermo et al. 1995). No obstante, en la ICSI no existe esta barrera
de selección natural y un espermatozoide con daños en el ADN podría ser inyectado en el ovocito
(Aitken 1999, Twigg et al. 1998, Ng et al. 1991, Palermo et al. 1995). Esto ha permitido que
espermatozoides humanos sometidos a estrés oxidativo y con quiebres en su ADN sean capaces de
fecundar efectivamente a los ovocitos luego del procedimiento de ICSI (Twigg et al. 1998), y producir
igual tasa de descondensación nuclear y formación pronuclear que espermatozoides no dañados. Sin
embargo, en estos casos se produciría una mayor tasa de aborto, posiblemente como resultado del uso
de espermatozoides genéticamente comprometidos (Twigg et al. 1998). Para evitar este problema, se
ha sugerido la combinación de un método adecuado de selección de espermatozoides previo al
procedimiento de ICSI (Sanchez et al. 1996, Yang et al. 2006). Este tratamiento debería disminuir el
estrés oxidativo y el daño en el ADN de los espermatozoides utilizados para la fecundación, lo cual
debería repercutir en una mayor calidad de los embriones generados por este procedimiento. Para
confirmar esta hipótesis, en el tercer objetivo de este proyecto se estudió en embriones generados por
ambos sistemas de producción in vitro (FIV v/s ICSI), el efecto de estos procedimientos sobre los
19
niveles de expresión de genes relacionados con estrés oxidativo y la calidad de los embriones
generados.
20
IV. HIPÓTESIS
1. En bovinos, la activación de ovocitos y desarrollo embrionario luego de la ICSI es ineficiente ya
que el espermatozoide inyectado es incapaz de iniciar apropiadamente las oscilaciones de calcio
necesarias para el restablecimiento de la meiosis en el ovocito y posterior desarrollo embrionario. La
selección de espermatozoides vivos junto a un adecuado tratamiento, antes de la inyección, podrían
mejorar el nivel de activación de ovocitos y la tasa de embriones que alcanzan el estadío de
blastocisto.
2. 6-DMAP, uno de los principales inhibidores de la fosforilación de proteínas empleados en la
activación de ovocitos bovinos, puede inducir alteraciones cromosómicas en los embriones generados
por ICSI. En tal sentido, compuestos alternativos como cicloheximida (CHX) o un inhibidor de MPF,
podrían constituir mejores alternativas para la activación de ovocitos, disminuyendo la incidencia de
alteraciones cromosómicas, mejorando la calidad de los embriones generados y aumentando la
eficiencia de esta técnica.
3. En la ICSI, los factores y etapas que promueven la generación y exposición de los gametos y
embriones a ROS, son menores que en la FIV convencional. En consecuencia, los embriones
generados por esta técnica podrían ser de mejor o igual calidad, en términos de producción/protección
a ROS que los embriones generados mediante FIV.
21
V. OBJETIVOS
Objetivo General:
Estudiar algunos factores que limitan el éxito de la ICSI en bovinos con el fin de optimizar un
protocolo eficiente para la generación de embriones en esta especie.
Objetivos Específicos:
1. Evaluar el efecto del tratamiento de espermatozoides con DTT y solución alcalina sobre la
eficiencia en la generación de embriones mediante el procedimiento de ICSI.
2. Evaluar el efecto de 3 protocolos de activación química sobre las tasas de desarrollo embrionario,
ploídia y calidad de los embriones generados por ICSI.
3. Evaluar el efecto de los sistemas de producción in vitro de embriones ICSI y FIV, sobre la
expresión de genes relacionados al estrés oxidativo y la calidad de los embriones generados.
22
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Recolección de ovarios, selección de ovocitos y maduración in vitro.
Se recolectaron ovarios desde el Frigorífico Temuco. Los complejos cúmulo-ovocito (CCO) fueron
aspirados a partir de los folículos de 2-7 milímetros usando una aguja de 18-gauge y una bomba de
vacío con 60-70 mm Hg. Se seleccionaron los ovocitos de buena calidad, esto es, aquellos que
presentaron una corona de células de al menos 4 capas y con citoplasma uniformemente granulado, y
se maduraron in vitro en grupos de 50 en 400 ul de medio TCM-199 suplementado con suero
(10%SBF, Hyclone) y 6 ug/ml LH (Sioux Biochem), 6 ug/ml FSH (Sioux Biochem) y 1 ug/ml
Estradiol (Sigma) durante 22 horas a 38.5ºC, en 5% CO2 y humedad a saturación.
Para la activación química, los ovocitos fueron vortexeados en la presencia de 1 mg/ml hialuronidasa
(Sigma), para retirar las células del cúmulo y seleccionados aquellos que liberaron el primer cuerpo
polar. Para la maduración y cultivo se utilizaron placas de 4 pocillos (Nunc).
2. Fecundación in vitro.
Se utilizo semen congelado de un toro con fertilidad probada. Se seleccionaron espermatozoides
móviles mediante gradientes de Percoll (Parrish et al. 1995). A las 22 horas de maduración (hpm), se
co-incubaron los ovocitos con el semen (106 espermatozoides/ml) en medio de fertilización IVF-TALP
en presencia de heparina y PHE. La fecundación in vitro se realizo a 38,5°C en 5% CO2 con humedad
a saturación por 18 horas. Los presuntos cigotos fueron vortexeados en medio HECM-Hepes por 3
minutos para separar las células del cúmulo y cultivados.
3. Preparación de semen para ICSI.
Se utilizó semen congelado convencional (Alta Genetics, Chile) y sexado (ABS, Chile), el cual se
seleccionó mediante gradiente de Percoll (Parrish et al. 1995). Los espermatozoides fueron lavados en
medio sp-TALP y concentrados. Para ICSI con espermatozoides tratados con NaOH se procedió de
acuerdo a Li et al., 2009, brevemente, los espermatozoides seleccionados fueron mezclados con NaOH
(0.1, 10, 20 y 50 mM) durante 20 minutos a temperatura ambiente y la suspensión fue neutralizada con
HCl para un pH final 7,3. Para ICSI con espermatozoides tratados con DTT se precedió de acuerdo a
Rho et al., (1998). Brevemente, los espermatozoides seleccionados se expusieron a 5 mM de DTT
durante 20 minutos, posteriormente se lavaron dos veces para eliminar trazas de DTT. Para ICSI sin
pre-tratamiento los espermatozoides se dejaron a 38.5ºC en medio sp-TALP hasta su uso (aprox. 1-2
horas).
23
4. Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
La ICSI se desarrolló en microgotas de sp-TALP bajo aceite mineral. Se utilizó un sistema de
micromanipulación hidráulico NARISHIGE, montado sobre un microscopio invertido NIKON eclipse
TS100. Los espermatozoides fueron seleccionados de acuerdo a su morfología normal, desde gotas de
10% PVP (Fisher Scientific). Cada espermatozoide fue sometido al quiebre de su cola y aspirado
dentro de una micropipeta de 8 um de diámetro interno. Los ovocitos en metafase II fueron ubicados
con su cuerpo polar en la posición 6 o 12 horas, para realizar la microinyección en la posición de las 3
horas. Para ello, se a atravesó la zona pelúcida y sólo luego de la ruptura por aspiración del oolema, el
espermatozoide y el citoplasma aspirado fueron introducidos en el ovocito correspondiente. A menos
que se señale lo contrario, los ovocitos inyectados se incubaron con 5 uM de Ionomicina (Calbiochem)
durante 5 minutos, posteriormente se lavaron repetidas veces en medio HECM-Hepes y fueron
sometidos a 5 ug/ml Cicloheximida (Sigma) durante 5 horas. Finalmente, se lavaron en medio HECMHepes y cultivaron.
5. Activación de ovocitos (tratamientos).
Los ovocitos-MII se incubaron con
5 uM de Ionomicina (Calbiochem) durante 5 minutos,
posteriormente se lavaron repetidas veces en medio HECM-Hepes y fueron expuestos a 5 ug/ml
Cicloheximida durante 5 horas (Grupo: Io/CHX); 3 horas ventana + Io+ 1.9mM
6-
Dimetilaminopurina durante 4 horas (Grupo: 2Io/DMAP); 2.5ug/ml de inhibidor de la síntesis de
proteínas durante 5 horas (Grupo: Io/ISP) o
3 horas ventana + 7% Etanol (Grupo: Io/ETOH).
Finalmente, todos los ovocitos se lavaron en medio HECM-Hepes y cultivaron.
6. Cultivo de embriones.
Los presuntos cigotos fueron cultivados durante las primeras 72 hpa en gotas de 50 ul de medio
KSOM/0.4% BSA-(FAF) (Millipore) cubierto con aceite mineral y luego suplementado con 5% SBF.
El cultivo se realizo con atmósfera de baja tensión de O2 (5% O2, 5% CO2, y 90% N2) a 38,5ºC y
humedad a saturación.
7. Evaluación de la fecundación.
Para confirmar la fecundación del ovocito se examinó la formación pronuclear. Para esto, a las 16
horas de exposición inicial a Ionomicima, los ovocitos fueron fijados con 4% paraformaldehído y
teñidos con 1mg/ml de Hoechst 33342 durante 4 minutos. Posteriormente, se examinaron en un
microscopio NIKON eclipse TS100, Mercury Lamp Illuminator con accesorios de fluorescencia.
24
8. Sexado de embriones.
Los embriones generados por ICSI fueron sexados para confirmar la fecundación efectiva por el
espermatozoide. Brevemente, se tomo una biopsia de cada embrión y se digirió con Proteinasa K.
Posteriormente se realizo una reacción de PCR utilizando 1 set de partidores específicos para una
secuencia del cromosoma “Y” de 301 pares de bases (forward 5’-CTCAGCAAAGCACACCAGAC3’ y reverse 5’-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3’) y otro para una secuencia satélite bovina de
216
pares
de
bases
(forward
5’-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3’
y
reverse
5`-
TCGTGAGAAACCGCACACTG-3’), el producto de la reacción se analizo en geles de 2% agarosa.
9. Análisis de espermatozoides por citometría de flujo (FACS).
La integridad de la membrana plasmática y acrosoma, fue analizada por citometría de flujo en un
“FACS Canto II” (BD Biosciences), utilizando 100 nM SYBR-14/12 uM PI (Live/Dead Sperm
Viability Kit; Molecular Probes Inc.) y 50 ug/ul FITC-PSA/12 uM PI (Sigma-Aldrich),
respectivamente. La integridad del ADN fue evaluada de acuerdo al ensayo TUNEL (FITC-in situ cell
death detection kit, Roche), de acuerdo a las instrucciones el fabricante.
10. Extracción del AR y transcripción reversa.
El ARN fue extraído desde grupos de 5 blastocistos empleando el Kit PicoPureTM (Arcturus), según
las instrucciones del fabricante. Para la transcripción inversa se empleo el “Kit RevertAidTM H
Minus Firts” (Fermentas, Life Sciences). Finalizada la reacción de transcripción inversa, el ADNc fue
diluido en 10 mM Tris HCl pH 8.0.
11. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR).
Todas las reacciones de PCR fueron realizadas en un volumen de reacción de 20 ul utilizando el
sistema de PCR en tiempo real MX3000P (Stratagene) y “Brilliant® II SYBR® Green QPCR Master
Mix” (Stratagene) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y 0.3 uM de cada partidor. El programa
de PCR consistió de una denaturación iniacial de 95ºC por 10 min, seguido por 40 ciclos de
denaturación (95ºC; 20 seg), hibridación (58ºC; 20 seg), extensión (72ºC; 20 seg) y denaturación a
(95ºC; 20 seg ) respectivamente, para terminar con un ciclo a 58ºC por 5 minutos. Al término de la
reacción, se realizó el análisis de la curva de disociación para establecer la especificidad de los
productos generados. La secuencia de los partidores para los genes constitutivos y relacionados con
estrés oxidativo y calidad embrionaria se muestran en la Tabla 1.
De manera previa, se determinó para cada gen la eficiencia de la amplificación, la cual se utilizó para
cuantificar la expresión relativa la que se midió por medio del programa “Relative Expression
Software 2008” (Goossens et al. 2007) incluyendo como controles los genes YWHA2, GSS y PPIA
25
que resultaron los más estables de acuerdo a un análisis llevado a cabo con el programa GeNorm
(Goossens et al. 2005). La hipótesis de no diferencia entre los grupos se consideró nula (H0) y las
diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando la probabilidad de la hipótesis
alternativa [P(H1)] era inferior 0,05.
12. Recuento total y diferencial del número de células en blastocistos de 7 días.
El recuento total y diferencial de células se realizó de acuerdo al método descrito previamente por
Fouladi-Nashta y colaboradores (Fouladi-Nashta et al. 2005). Brevemente, blastocistos expandidos
fueron permeabilizados parcialmente con 0.2% de Tritón durante 20 segundos. Seguidamente, se
lavaron dos veces con PBS/BSA y se incubaron con 10 ug/ml yoduro de propidio (Sigma) por 5
minutos a 37ºC para teñir las células del trofoectodermo. Luego, para fijar y teñir todas las células, los
embriones se lavaron en PBS/BSA y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en 4%
paraformaldehído conteniendo 10 ug/ml de Hoechst (Sigma). Finalmente, los embriones fueron
transferidos a portaobjetos sobre gotas de 10 ul de una mezcla 1:1 glicerol/PBS y examinados bajo
microscopio de epifluorescencia (NIKON eclipse TS100, Mercury Lamp Illuminator) equipado con
filtros UV.
13. Tinción TUEL.
El ensayo TUNEL se realizó de acuerdo a Fouladi-Nashta y colaboradores (2005). Brevemente, luego
de la tinción total y diferencial, los embriones se permeabilizaron por 5 minutos con 0.1% de citrato de
sodio conteniendo 0.1% Tritón. Se lavaron con PBS/BSA y se incubaron con reactivo de marcaje de
acuerdo a las instrucciones del fabricante “Kit de detección de muerte celular in situ, fluoresceína” de
Roche. Finalmente, los embriones se montaron en portaobjetos sobre gotas de 10 ul de antifade y se
examinaron bajo microscopio de epifluorescencia (NIKON eclipse TS100, Mercury Lamp
Illuminator) equipado con filtros UV. Los controles positivos se realizaron tratando previamente los
embriones con 75.4 U DNAsa I durante 15 minutos a 37ºC antes del ensayo TUNEL y negativo
incubando los embriones con el reactivo de marcaje fluorescente en ausencia de la enzima dUTP
terminal transferasa.
14. Análisis estadístico para los experimentos.
Se efectuó estadística descriptiva en base a promedio y desviación estándar calculados para cada una
de las variables analizadas. En caso de comparaciones solo con dos grupos se utilizo la prueba t para
muestras independientes para establecer la significancia estadística entre variables continuas, los datos
cualitativos se analizaronn con la prueba de chi-cuadrado (formación pronuclear y ploidía). Las tasas
de división y blastocistos de los datos correspondientes a la evaluación de mas de dos tratamientos
26
fueron analizadas utilizando ANOVA de una vía. La transformación arcoseno fue aplicada a los datos
obtenidos por citometría de flujo (pretratamientos de espermatozoides), previo análisis ANOVA. El
análisis de comparación múltiple para identificar las diferencias se realizo mediante el test de Scheffe.
El nivel de significancia fijado para todas las pruebas estadísticas fue P<0.05. Todos los análisis se
realizaron utilizando el programa estadístico o Statgraphics® Plus 5.1.
27
Tabla 1. Partidores usados en PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR).
Gen
Genebank
Secuencia 5´-3
Eficiencia de
amplificación (%)
Tamaño (pb)
93.3
176
95.1
125
100.0
215
99.8
108
86.5
314
81.8
312
96.5
293
91.3
196
93.5
260
96.4
192
100.0
115
100.0
138
89.7
103
96.0
123
93.3
176
90.2
223
81.0
185
86.8
120
GCCATCCTGGCGTACCTCAC
PPIA
NM_178320.2
TGGATGTGTGGAATGACACC
GCGGGAGGAAGAAGTAGGAG
SF3A1
XM_878187.1
TCAGCAAGAGGGACACAAA
CCCAGGTGTTCGGCCTGGAC
GLUT1
M60448.1
TGCAGGTCGCGGGTCACGTC
TGGCCCTGGTGCTGGTCAGC
IF&t
XM_001250591.1
TCATTCGGGCCAGGAGCCTG
GGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC
OCT4
AF022987
ACACTCGGACCACGTCTTTC
CGCATGGGCTACCAGTGCACCTT
DMT1
X63692
GGGCTCCCCGTTGTATGAAATCT
CGCCTACAGCGAGAAGGGGTTAGTC
IGF2
J03527
AGAAAAGCGTGCACGTGCGCTTGTC
GCTGTACCAGTGCAGGTC
SOD1
XM_584414.4
CATGGACCACCATCGTGC
ACCTCAACGTCGCCGAGG
SOD2
L22092.1
CCAACCGGAGCCTTGGAC
ACCCTCGTGGCTTTGCAG
CAT
NM_001035386.1
ACTCAGGACGCAGGCTCC
ACCTCACAGGCACCCAGC
GSS
NM_001015630.1
TGAAGTCCGCCTGCACAG
TGCCATCCAGTTGGGCATGC
PRDX6
NM_174643.1
TTCCTGCCAGTGGTAGCTGG
GGCTCTGACTCCTTGTCTGG
HDAC1
AY504948
GCATAGGCAGGTTGAAGCTC
TCCTTCGAGAGCGGCTGC
BAX
U92569.1
AGGCGGTGAGCACTCCAG
GCCATCCTGGCGTACCTCAC
H2A
NM_174809
TGGATGTGTGGAATGACACC
GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC
GPDH
XM_583628
GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT
GCAGAACCTGATGCTTTGTG
SDHA
NM_174178
GCAAAGACAATGACAGACCA
GCATCCCACAGACTATTTCC
YWHAZ
BM446307
GCAAAGACAATGACAGACCA
28
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓ OBJETIVO ESPECÍFICO 1:
EVALUACIÓ DEL EFECTO DEL TRATAMIETO DE ESPERMATOZOIDES
CO DTT Y SOLUCIÓ ALCALIA SOBRE LA EFICIECIA E LA
GEERACIÓ DE EMBRIOES MEDIATE EL PROCEDIMIETO DE ICSI.
29
Efecto del pretratamiento de espermatozoides sobre la viabilidad, integridad de la membrana
plasmática, integridad membrana acrosomal y fragmentación del AD.
Los espermatozoides bovinos pretratados con DTT y baja concentración de alkali (0.1mM
NaOH) mostraron menos espermatozoides vivos y reaccionados (44 y 33%, respectivamente)
comparado con el grupo control no tratado (ST x 120 min; 82%; Tabla 1). Los espermatozoides
sometidos a mayores concentraciones de alkali (1-50 mM), se observaron en su mayoría muertos y
reaccionados (Tabal 1). La integridad del ADN, fue evaluada por ensayo TUNEL, mostrando en
general una baja tasa de fragmentación en todos los tratamientos (rango 4 a 5%), con la excepción de
los tratamientos con las concentraciones mayores (20 y 50 mM) de NaOH (9 y 47%, respectivamente)
(Tabla 1).
30
Tabla 1. Efecto del pretratamiento de espermatozoides sobre la viabilidad, integridad de la membrana
plasmática y acrosómica, y fragmentación del ADN.
% Espermatozoides (x ± SD)
Tratamientos
Vivos
(SYBR14+/PI-)
Reaccionados
(FITC/PSA)+
Vivos
Muertos
(PI)(PI)+
o reaccionados
(FITC/PSA)Vivos
Muertos
(PI)(PI)+
Tunel+
%
ST x 30 min
90.7 ± 2.1a
33.4 ± 2╬, a
13.0 ± 3.2*, a
52.2 ± 5.9┼, a
1.5 ± 0.4╫, ab
4.3a
ST x 120 min
83.6 ± 0.6b
82.0 ± 2.4╬, b
16.0 ± 2.2*, a
1.82 ± 0.2┼, bc
0.14 ± 0.1╫, a
4.3a
DTT
50.4 ± 2.2c
44.0 ± 5.6╬, c
47.7 ± 6.1╬, b
4.70 ± 1.4 ╫, c
3.57 ± 0.7╫, bc
4.9a
0.1mM NaOH
35.0 ± 0.1d
33.6 ± 4.2╬, a
65.3 ± 4.1 ┼, c 1.03 ± 0.8╫, bd
0.12 ± 0.1╫, a
4.0a
1mM NaOH
0e
0.24 ± 0.05╫, d 89.8 ± 4.7┼, d
1.7 ± 0.2╫, bc
8.4 ± 2.8╫, c
4.4a
10mM NaOH
0e
0.07 ± 0.1╫, d
99.8 ± 0.2┼, d
0.07 ± 0.1╫, d
0.04 ± 0.03╫, a
5.1a
20mM NaOH
0e
0.09 ± 0.03╫, d 99.8 ± 0.1┼, d
0.09 ± 0.1╫, d
0.02 ± 0.03╫, a
9.1b
50mM NaOH
0e
0.01 ± 0.02╫, d 99.7 ± 0.2┼, d
0.13 ± 0.1╫, d
0.13 ± 0.1╫, a
46.7c
Análisis por citometría de flujo de muestras de espermatozoides. Reaccionados: acrosoma dañado.
Tunel+: ADN dañado; ST: Sperm TALP.
Los datos seguidos por letras diferentes en la misma columna y los datos seguidos por símbolos
diferentes entre las columnas (vivos/muertos/reaccionados y vivos/muertos/no reaccionados) son
significativamente diferentes (P<0.05).
31
Desarrollo in vitro de embriones bovinos generados por ICSI: Efecto del pretratamiento de
espermatozoides con diferentes concentraciones de aOH.
Los ovocitos inyectados con espermatozoides pretratados con diferentes concentraciones de
NaOH seguido por activación química (Io+CHX) después de la ICSI, mostraron diferencias
significativas en la tasa de división a las 72 horas de cultivo (42, 74, 63, 52 y 52% para 0.1, 1, 10, 20 y
50 mM, respectivamente) (Tabla 2). Aunque no se observaron diferencias en la tasa de blastocistos en
el día 7, diferencias fueron observadas en el día 9 de cultivo (P<0.05). Una mayor proporción de
embriones alcanzaron el estado de blastocisto cuando los espermatozoides fueron pretratados con 1.0
mM de NaOH (18%), comparado con 0.1 (12%), 10 (12%), 20 (7%) y 50 mM de NaOH (2%),
respectivamente (Tabla 2).
32
Tabla 2. Efecto del pretratamientos de espermatozoides con diferentes concentraciones de NaOH
sobre el desarrollo in vitro de embriones bovinos generados por ICSI.
Tratamiento
Io + CHX
n
Blastocistos n (%)
División
n (%)
Día 7
Día 9
0.1mM NaOH
+
90
38 (42)a
9 (10)a
11 (12)ab
1.0 mM NaOH
+
89
66 (74)b
13 (15)a
16 (18)b
10 mM NaOH
+
76
48 (63)ab
8 (11)a
9 (12)ab
20 mM NaOH
+
85
44 (52)ab
2 (2)ab
6 (7)ac
50 mM NaOH
+
93
48 (52)ab
2 (2)ab
2 (2)ac
Sham injected
+
115
67 (58)ab
10 (9)a
12 (10)a
0.1mM NaOH
-
85
0d
0b
0c
1 mM NaOH
-
68
4 (6)d
0b
0c
10 mM NaOH
-
70
9 (13)d
0b
0c
20 mM NaOH
-
71
4 (6)d
0b
0c
50 mM NaOH
-
67
0d
0b
0c
Las tasa de división y blastocistos fueron registradas a las 72, 168 y 216 hpa, respectivamente (6
replicas). Tratamiento de activación: ionomicina 5 minutos seguido por 5 h de cicloheximida. Sham
injected: ovocitos inyectados sólo con 5% PVP. Los datos seguidos de letras diferentes en la misma
columna son significativos (P<0,05).
33
Desarrollo in vitro y calidad de los embriones generados por ICSI después de diferente
pretratamientos.
El resultado de 8 replicas con un total de 708 ovocitos inyectados con espermatozoides
pretratados con DTT (ICSI-DTT), NaOH (ICSI-NaOH 1 mM, mejor potencial de desarrollo según lo
establecido arriba), sp-TALP (ICSI-ST, incubación extendida por 120 min para facilitar la reacción
acrosomica según lo establecidos arriba) y ovocitos inyectados sólo con PVP (Sham injected), todos
activados con Io+CHX, y un control (ICSI) inyectado con espermatozoides pero sin activación, no
mostro diferencias en la tasa de división a las 72 h de cultivo en ningún grupo pretratado (69, 71 y
69%, para ICSI-ST, ICSI-DTT e ICSI-NaOH, respectivamente) (Tabla 3, Figura 1). Sin embargo,
estos grupos mostraron una alta tasa de división comparado con los controles ICSI (7%) y Sham
injected (53%), respectivamente (Tabla 3). Similares resultados fueron observados en la tasa de
blastocistos en el día 7 de cultivo. Todos los grupos pretratados mostraron alta tasa de blastocistos (24,
19 y 17% para ICSI-ST, ICSI-DTT e ICSI-NaOH, respectivamente), en relación a los controles ICSI
(0%) y Sham injected (10%), pero nuevamente no se observaron diferencias entre los grupo
pretratados (Tabla 3, Figura 1). La apariencia morfológica de los embriones a las 72 horas post
activación no fue diferente entre los tratamientos y el grupos Sham injected, todos mostraron
embriones principalmente con 4-16 células. En el día 8, sin embargo, en el grupo Sham injected sólo
se observaron blastocistos tempranos, en comparación a todos los tratamientos que obtuvieron
blastocistos y blastocistos expandidos en proporciones similares, aunque blastocistos eclosionados
fueron menos frecuentes en esta etapa del desarrollo.
La calidad embrionaria medida por el número total de células, masa celular interna (MCI),
trofoectodermo (TE) y relación MCI: células totales, no mostro diferencias en el número total de
células (157.7 ± 47.9, 129.3 ± 15.2, y 172.3 ± 33.6 para ICSI-ST, ICSI-DTT e ICSI-NaOH,
respectivamente), células del TE (124.0 ± 45.6, 95.3 ± 10.8 y 127.0 ± 34.5 para ICSI-ST, ICSI-DTT e
ICSI-NaOH, respectivamente) y/o las células de la MCI y MCI: células totales (Tabla 4, Figura 2).
34
Tabla 3. Efecto de diferentes pretratamientos
pretratamientos de espermatozoides sobre el desarrollo in vitro de
embriones bovinos generados por ICSI.
Tratamiento
Io + CHX
n
División n (%)
a
Blastocistos n (%)
Día 7
38 (24)
Día 9
a
46 (29)a
ICSI-ST
+
160
111 (69)
ICSI-DTT
+
161
114 (71) a
31 (19)ab
35 (22)ab
ICSI- NaOH
+
134
92 (69) a
23 (17)ab
27 (20)ab
ICSI-ST
-
118
8 (7)b
0c
0c
Sham injected
+
135
71 (53)c
13 (10)b
16 (12)b
Las tasa de división fueron registradas a las 72 h y la tasa de blastocistos fue registrada a las 168 y 216
hpa, respectivamente (8 replicas). ICSI-ST: tratamiento sólo con Sperm TALP; ICSI
ICSI-DTT: tratamiento
con 5 mM de dithiothreitol;
eitol; ICSIICSI NaOH: tratamiento con 1mM de hidróxido de sodio. Los ddatos
seguidos de letras diferentes en la misma columna
col
son diferentes significativamente (P<
(P<0.05).
Figura 1. Embriones bovinos generados por ICSI.
Embriones
mbriones divididos a las 72 hpa generados por los tratamientos ICSI-ST (a),, ICSI
ICSI-DTT (c), ICSINaOH (e). Mag 200x. Blastocistos
lastocistos de 9 días generados por ICSI
ICSI-ST (b), ICSI-DTT
DTT (d) e ICSI-NaOH
(f). Mag. 100x
35
Tabla 4. Efecto del pretratamiento
tratamiento de espermatozoides en la ICSI sobre el número total de células,
masa celular interna (MCI) y trofoectodermo (TE).
Tratamiento
X número de células (± DS)
Io+CHX
MCI
TE
Total
MCI:Total
:Total (%)
ICSI-ST
+
33.7 ± 3.0a
124.0 ± 45.6a
157.7 ± 47.9a
21.4 ± 7.4a
ICSI-DTT
+
34.0 ± 11.8a
95.3 ± 10.8a
129.3 ± 15.2a
26.3 ± 10.2a
ICSI-NaOH
+
42.0 ± 20.5a
127.0 ± 34.5a
172.3 ± 33.6a
24.9 ± 12.0a
El recuento fue registrado en blastocistos expandidos a las 168 h (10 blastocistos por tratamiento).
tratamiento)
Los datos seguidos de letras diferentes en la misma columna
columna son significativos (P<0,05
(P<0,05).
Figura 2. Tinción diferencial de blastocistos bovinos producidos por ICSI. Blastocitos de 7 días
obtenidos por ICSI-ST
ST (a y b), ICSI-DTT
ICSI
(c y d) e ICSI-NaOH
NaOH (e y f); (a, c y e) tinción Hoechst
(células totales) y (b, d y f) tinción yoduro de propidio (células del trofoectodermo). Mag. 400x.
36
Sexaje de embriones generados por ICSI-ST
ICSI
empleando espermatozoides sexados macho.
El sexaje de los embriones se realizó por PCR utilizando ADN obtenido de biopsias
correspondientes a 13 blastocistos diferentes generados por ICSI-ST
ICSI ST utilizando espermatozoides
sexados macho. Los resultados de la PCR mostraron que 69% de los embriones amplificaron la
secuencia de 301pb correspondiente a una secuencia del cromosoma “Y” y 31% de los embriones
analizados no amplificaron la secuencia, por lo tanto corresponden a embriones genotipo “XX”.
Figura 3. Electroforesis de agarosa al 2% representativo de la PCR para la determinación de sexo en
biopsias correspondientes a diferentes blastocistos bovinos generados por ICSI
ICSI-ST utilizando
espermatozoides sexados macho. a) Detección de secuencia satélite de ADN bovino de 216 pb, (St)
estándar de tamaño molecular,
cular, ((-) control negativo, (+) control positivo, (1-13)
13) ADN de biopsias de
blastocsitos. b) Detección de secuencia específica cromosoma “Y” bovino de 301 pb, (St) estándar de
tamaño molecular, (H) ADN hembra, (M) ADN macho, (1-13)
(1 13) ADN biopsias de blasto
blastocistos.
37
Formación pronuclear después de la ICSI con diferentes pretratamientos.
La formación pronuclear fue evaluada a las 16-18 horas post activación (hpa) (Tabla 5). La
tasa de fecundación según la evaluación de la presencia del pronúcleo masculino (o cabeza
espermática descondensada) y pronúcleo femenino fue 77, 77 y 67% para ICSI-ST, ICSI-DTT e ICSINaOH, respectivamente (Tabla 5). Los cigotos con configuración nuclear anormal (1PN/1PB/cabeza
espermática condensada, 1PN/2PB/cabeza espermática condensada) fueron considerados en el análisis
como “otros” (Tabla 5).
Tabla 5. Observaciones citológicas en los embriones generados por ICSI.
Formación Pronuclear
Tratamiento
Io+CHX
1MP (or DSH)+1FP+2PB
Otros
n (%)
n ( %)
ICSI-ST
+
37 (77.1)a
11 (22.9)a
ICSI-DTT
+
34 (77.3)a
10 (22.7)a
ICSI-NaOH
+
31 (67.4)a
15 (32.6)a
MPN: pronúcleo masculino, FPN: pronúcleo femenino, DSH: cabeza espermática descondensada, PB:
cuerpo polar, Otros: 1PN/1PB/cabeza de espermatozoide condensada y/o 1PN/2PB/ cabeza de
espermatozoide condensada. Los datos seguidos de letras diferentes en la misma columna son
significativos (P<0.05).
38
DISCUSIÓ
Desde los primeros reportes de la ICSI en bovinos, aún persisten dos importantes problemas la
inadecuada descondensación espermática y activación de ovocitos luego de la ICSI (Keefer et al.
1990; Goto 1993). Los espermatozoides bovinos necesitan ser químicamente pretratados para inducir
la formación del pronúcleo masculino y lograr un adecuado potencial de desarrollo (Wei and Fukui
1999). Uno de los protocolos más frecuentemente utilizado para inducir la formación del pronúcleo
masculino es tratar los espermatozoides con DTT, un agente reductor de los puentes disulfuro, que ha
mostrado incrementar la tasa de descondensación y desarrollo embrionario hasta el estadío de
blastocistos en diferentes especies (Qian et al. 1996; Rho et al. 1998a; Ock et al. 2003; Watanabe and
Fukui 2006; Watanabe et al. 2009). En el presente estudio, sin embargo, no se encontro diferencias en
el potencial de desarrollo de embriones bovinos generados por el pretratamiento de los
espermatozoides con DTT (ICSI-DTT), en relación al control sin pretratamiento espermático (ICSIST). Los datos de desarrollo in vitro muestran que el tratamiento con DTT no tuvo efectos positivos
sobre la tasa de fecundación y división (77 y 71%, respectivamente), comparado al grupo control no
tratado (77 y 69%, respectivamente). Además, el porcentaje de ovocitos inyectados que desarrollaron
hasta el estadío de blastocisto fue incluso menor con este tratamiento (19 vs. 24%, respectivamente),
aunque estas diferencias no fueron significativas. Este resultado es similar a estudios previos
realizados por Galli et al. (2003), quienes no encontraron diferencias en la tasa de división y
blastocistos al día 8 entre embriones generados por el pretratamiento de espermatozoides con DTT y el
grupo control no tratado. Sin embargo, estos autores observaron una significativamente alta tasa de
blastocistos al día 7 de cultivo en el grupo tratado con DTT; aunque estas diferencias desaparecieron
un día después, sugiriendo que la baja tasa de formación de blastocistos sin pretratamiento de
espermatozoides se debe a la retraso y/o inadecuada descondensación del núcleo espermático (Galli et
al. 2003). Aunque los resultados del presente trabajo son similares al estudio de Galli et al. (2003) en
términos de desarrollo embrionario, no observamos el mismo efecto al día 7. De hecho, se observó una
baja tasa de blastocistos al día 7 en el grupo tratado con DTT (19%) comparado al grupo control no
tratado (24%), y esta diferencia se mantuvo a lo largo del periodo de cultivo hasta los 9 días (22 y
29%, respectivamente). Contrario a estos resultados, otros estudios han mostrado mejorar
significativamente el potencial de desarrollo de embriones con este tratamiento, obteniendo una alta
proporción de ovocitos inyectados que desarrollaron al estadío de blastocsito en el grupo tratado con
DTT, comparado al grupo control no tratado (24 vs 10%, respectivamente) (Rho et al. 1998a).
Resultados contradictorios se han observado en cerdos, donde el tratamiento de espermatozoides con
DTT no tienen efectos positivos sobre la tasa de división y formación de blastocistos de embriones
fecundados por ICSI (Yong et al. 2005; Tian et al. 2006; Cheng et al. 2009), mientras otros describen
39
que este tratamiento favorece la fecundación y desarrollo al estadio de blastocisto (Watanabe and
Fukui 2006; Watanabe et al. 2009). En este caso, el mayor tiempo de incubación con DTT podría ser
responsable de estas diferencias ya que 30 min de incubación genero alta tasa de blastocistos
comparado con tiempos de incubación mayor (60 min) o menor (10 min) (Watanabe and Fukui 2006).
De este modo, tiempos de incubación más cortos podrían ser insuficientes para promover la
descondensación de la cabeza espermática, mientras tiempos de incubación más prolongados podrían
generar daño en los cromosomas paternos y subsecuente desarrollo embrionario (Chen et al. col
2009). De hecho, la exposición de espermatozoides de ratón a DTT por 60 minutos genera daños
cromosómicos significativos que, aunque no interfieren con el potencial de desarrollo in vitro al
estadío de blastocisto, disminuye el potencial post-implantación (Szczygiel and Ward 2002).
Interesantemente, los datos de fragmentación del ADN muestran que la incubación de
espermatozoides bovinos con DTT por 20 min no tiene mayor efecto sobre la integridad del ADN. Sin
embargo, este tratamiento generó una significativamente alta tasa de espermatozoides muertos
comparada con el grupo control no tratado (49.6 vs. 16%, respectivamente). Aunque, numerosos
reportes describen el efecto dañino sobre la división y desarrollo de embriones generados por ICSI
utilizando cabezas de espermatozoides muertos (Goto et al. 1990; Horiuchi and Numabe 1999), esto es
poco probable en el caso de los experimentos realizados con DTT, porque solamente fueron utilizados
espermatozoides móviles/vivos durante el procedimiento ICSI, los cuales fueron inmovilizados por
fractura de cola antes de la inyección. Por lo tanto, una posible explicación para el relativamente bajo
potencial de desarrollo de los embriones generados con este tratamiento podría estar relacionado con
el estado del acrosoma en el momento de la inyección. De hecho, los datos de citometría de flujo
muestran un significativamente bajo número de espermatozoides con el acrosoma reaccionado y vivos
en el grupo tratado con DTT (44%), comparado al grupo control no tratado (82%). Es interesante notar
que en este grupo control, el tiempo de incubación de 120 min en medio sperm-TALP también mostro
una alta población de espermatozoides con el acrosoma reaccionado y vivos, comparado con el tiempo
de incubación por sólo 30 min (82 y 32%, respectivamente). En este caso, los espermatozoides
reaccionados artificialmente generados después del tiempo de incubación extendido podrían ser
responsables de la alta tasa de desarrollo observada en este grupo, lo cual sugiere que el tratamiento de
espermatozoides bovinos con DTT podría no ser necesario para la ICSI en bovinos.
Durante la fecundación en mamíferos los espermatozoides se someten a una serie de
transformaciones bioquímicas incluyendo la capacitación, donde el colesterol se disocia de la
membrana plasmática que cubre la región del acrosoma, y la reacción acrosómica, un paso importante
que libera enzimas hidrolíticas (hialuronidasa y acrosina, entre otras) que facilitan el paso por la zona
pelúcida (Yanagimachi 1994). Durante la ICSI, sin embargo, espermatozoides no capacitados con
acrosoma intacto son normalmente usados para generar embriones, por lo tanto la membrana
40
plasmática y enzimas acrosómicas, que normalmente no entran al ovoplasma durante la FIV o
fecundación natural, son inyectados dentro el ovocito, lo cual puede tener un efecto dañino sobre el
desarrollo embrionario (Horiuch et al. 2002). En ratones que la remoción de la membrana plasmática
del espermatozoides y la vesícula acrosómica, mejoran la activación de los ovocitos y desarrollo
embrionario luego de la ICSI (Morozumi et al. 2006). Más recientemente en ratas, la remoción de la
membrana acrosómica también mejoro el potencial de desarrollo in vitro e in vivo (Seita et al. 2009).
La remoción de las enzimas acrosomicas se ha logrado previamente por diferentes
desestabilizantes de la membrana espermática incluyendo Pronasa, Lisolecitina y Triton X-100
(Morozumi and Yanagimachi 2005; Morozumi et al. 2006; Yan et al. 2008; Seita et al. 2009;
Watanabe et al. 2010). En ratones se evaluó la inyección de ovocitos con espermatozoides pretratados
con álcali (Li et al. 2009), siendo efectivo en la generación de una alta tasa de blastocistos y
descendencia normal después de la ICSI, y fue también eficiente en la generación de ratones
transgénicos por ICSI-SMGT (transferencia génica mediada por espermatozoides) (Li et al. 2010).
Estos resultados mostraron que un adecuado alto pH destruye la membrana plasmática y acrosoma sin
efectos sobre el núcleo espermático, como fue evidenciado por el nacimiento de la descendencia,
sugiriendo que la membrana plasmática y acrosoma no son esenciales para soportar el desarrollo
embrionario normal después de la ICSI (Li et al. 2009; Li et al. 2010).
En el presente trabajo nosotros evaluamos por primera vez el efecto del tratamiento álcali sobre
espermatozoides bovinos y sobre el subsecuente desarrollo de embriones generados por ICSI. Los
datos de desarrollo de embriones in vitro mostraron que el pretratamiento de espermatozoides bovinos
con diferentes concentraciones de NaOH (0.1-10 mM) permite la generación de blastocistos bovinos
aunque las condiciones alcalinas más altas (20 y 50 mM) generaron a una disminución del potencial de
desarrollo embrionario en una manera dosis dependiente. Adicionalmente, el potencial de desarrollo
de embriones generados con espermatozoides pretratados con 1.0 mM de NaOH comparado con DTT
y el grupo control no tratado, no mostraron diferencias en la tasa de división y blastocitos,
confirmando que los datos obtenidos en el modelo ratón pueden no ser adecuados para otras especies
como la bovina. Sin embargo, este tratamiento podría resultar efectivo en la generación de bovinos
transgénicos por SMGT, como fue demostrado recientemente en ratones (Li et al. 2010).
El ensayo de viabilidad espermática vivo/muerto mostro que todos los espermatozoides estaban
biológicamente muertos después del tratamiento alcalino con la excepción de las concentraciones más
bajas (0.1 mM) que mostraron un 35% de espermatozoides vivos. En adición, la mayoría de los
espermatozoides presentaban daño en las membranas plasmática y acrosómica, sin embargo, la
disociación de los espermatozoides en colas y cabezas no fue observada durante el procedimiento de
inyección como fue descrita previamente en espermatozoides de ratón (Li et al. 2009), aunque se
observó un acortamiento de la cola espermática con la concentración mas alata de álcali (50 mM).
41
Estos resultados son muy similares a los observados por Li et al. (2009), quien observo que
espermatozoides de ratón tratados con diferentes concentraciones de NaOH, pierden su movilidad,
membrana plasmática y acrosómica, mientras que con concentraciones alcalinas más altas (>10 mM),
estos también pierden su potencial de activación de ovocitos, el cual puede ser restaurado por la
activación artificial.
En el presente estudio, los espermatozoides tratados con baja concentración de NaOH (0.1-10
mM) mostraron una tasa de fragmentación de ADN similar al grupo control no tratado (4-5%), Sin
embargo, concentraciones mas altas de NaOH (20 y 50 mM, respectivamente) incrementan
significativamente la fragmentación del ADN (9 y 47%, respectivamente), lo que podría explicar el
bajo potencial de desarrollo embrionario observado con estas concentraciones. Estos resultados
confirman que un adecuando tratamiento alcalino de espermatozoides bovinos puede destruir la
membrana plasmática y acrosoma sin afectar la integridad del ADN, la cual es necesaria para el
subsecuente desarrollo embrionario. En estudios previos realizados por Li et al. 2009, el ensayo
TUNEL realizado, no mostro fragmentación del ADN en ninguna de las concentraciones de NaOH
usadas para tratar los espermatozoides de ratón. Sin embargo, rupturas de ADN de hebra simple y
doble fueron observadas por estos autores, particularmente con las concentraciones alcalinas más altas,
confirmando un efecto dependiente de la concentración que fue correlacionado con el potencial de
desarrollo in vivo.
Previamente, fue reportado en cerdos que concentraciones de 100 mM de NaOH destruyen la
membrana plasmática de espermatozoides, previniendo la subsecuente activación de ovocitos después
de la ICSI (Kim et al. 1999). Este efecto también fue observado por Kurokawa et al. (2005), quien
reporto que altas condiciones alcalinas (pH=11.5) son capaces de eliminar el factor responsable de
iniciar las oscilaciones de calcio en ovocitos fecundados, previniendo su activación (Kurokawa et al.
2005) y que el tratamiento con pH elevado presumiblemente inhibe PLCz, resultando en la supresión
de las oscilaciones de calcio en ovocitos (Kurokawa et al. 2005). En los estudios de Li et al. (2009),
los espermatozoides tratados débilmente con álcali (1 mM de NaOH) retienen el potencial de fecundar
después de la ICSI, sin embargo, bajo condiciones alcalinas fuertes pierden su potencial de activación,
el cual puede ser restaurado por activación artificial. Es ampliamente aceptado que la ICSI en bovinos
requiere estímulos de activación externa de los ovocitos para iniciar el desarrollo embrionario (Rho et
al. 1998b; Li et al. 1999; Chung et al. 2000). Los datos del presente trabajo de desarrollo in vitro
confirman esta observación ya que no se observó desarrollo al estadío de blastocisto sin activación
química. La activación química tiene la desventaja de incrementar la posibilidad de desarrollo
partenogenético. Por lo tanto, para confirmar la fecundación exitosa después de la ICSI, la evaluación
de la formación pronuclear fue de gran significancia. Nuestros resultados confirman que la mayoría de
los ovocitos (>70%) en todos los grupo de pretratamientos fueron efectivamente fecundados por
42
espermatozoides. Para evaluar la fecundación por ICSI también se realizó el sexaje de las biopsias
correspondientes a blastocistos generados por ICSI-ST empleando espermatozoides sexados macho,
demostrándose que al menos un 69% de los blastocistos obtenidos por ICSI-ST son resultado de la
fecundación exitosa por un espermatozoide luego de la ICSI, ya que exhibieron genotipo XY, mientras
que en el 31% se observó el genotipo XX, esto último podría ser consecuencia de la imprecisión de la
técnica de sexado para la separación de los espermatozoides, la que está descrita tendría al menos un
10% de error (Seidel, 2009). Por lo tanto, parte de estos blastocistos también podrían ser resultado de
la fecundación exitosa por un espermatozoide hembra o posiblemente a consecuencia de la activación
partenogenética.
Es también importante resaltar que, la alta tasa de desarrollo embrionario y formación de
blastocistos obtenida con todos los tratamientos evaluados en este estudio fueron resultado de un
procedimiento ICSI que no emplea en el sistema de inyección un “piezo-electric actuator”, que
induciría menos daño al ovocito durante la microinyección, favoreciendo el subsecuente desarrollo
embrionario (Katayose et al. 1999; Horiuch et al. 2002; Galli et al. 2003).
La calidad de los embriones generados por ICSI, evaluado por la apariencia morfológica a las
72 horas post activación no fue diferente entre los tratamientos y el grupo control, aunque algunas
diferencias fueron observadas en el día 8, particularmente con el grupo SHAM mostrando menos
desarrollo de blastocistos. Finalmente, el número y distribución celular en los diferentes
compartimentos de los embriones fue similar en todos los grupo de tratamientos y comparable a la
calidad embrionaria descrita previamente para embriones bovinos generados por FIV e ICSI (Koo et
al. 2002; Rho et al. 2004).
En conclusión, el presente trabajo describe por primera vez el efecto del tratamiento con NaOH
sobre espermatozoides bovinos y sobre el subsecuente desarrollo embrionario in vitro después de la
ICSI. Los resultados descritos en este estudio confirman que espermatozoides bovinos tratados con
baja concentración alcalina pueden ser efectivamente utilizados para la generación de embriones
bovinos después de la ICSI, aunque este método no mejora la eficiencia de esta técnica comparado al
grupo control no tratado. Adicionalmente, se demostró que el pretratamiento clásico de
espermatozoides con DTT antes de la ICSI no es esencial para un apropiado desarrollo embrionario in
vitro en la especie bovina.
43
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓ OBJETIVO ESPECÍFICO 2:
EVALUAR EL EFECTO DE 3 PROTOCOLOS DE ACTIVACIÓ QUÍMICA SOBRE
LAS TASAS DE DESARROLLO EMBRIOARIO, PLOÍDIA Y CALIDAD DE LOS
EMBRIOES GEERADOS POR ICSI.
44
Desarrollo in vitro de ovocitos-MII bovinos activados con diferentes concentraciones de
Bohemina.
El resultado de los ovocitos sometidos a 8 condiciones diferentes de activación química,
mostraron una tasa de división a las 72 hpa, para las concentraciones de Bohemina 0,1, 2, 10, 25, 50,
200 uM, de 0%, mientras que las concentraciones de 75 y 200 uM mostraron una tasa de división de 7
y 8%, respectivamente, ninguno de los embriones divididos alcanzó el estadío de blastocsitos (Tabla
1). Debido a la baja eficiencia observada en la activación de ovocitos utilizando Bohemina, se decidió
no utilizar este compuesto en la activación de los embriones ICSI. Por lo tanto, se incorporaron 2
nuevos tratamientos de activación, INP y EtOH.
Tabla 1. Desarrollo in vitro de embriones generados por partenogénesis haploide, utilizando
Ionomicina en combinación con Bohemina.
Tratamiento
Bohemina
Repeticiones
n
División (%)
Blastocistos (%)
0.1 µM
3
69
0
0
2 µM
3
69
0
0
10 µM
3
75
0
0
25 µM
3
75
0
0
50 µM
3
75
0
0
75 µM
3
69
5 (7)
0
100 µM
9
183
15 (8)
0
200 µM
3
69
0
0
Las tasa de división y blastocistos fueron registradas a las 72 y 168 hpa, respectivamente.
ota. El mayor número de repeticiones realizadas con la concentración 100 µM, fue debido a que se
utilizo anteriormente en algunos trabajos de activación de ovocitos bovinos y de ratón (Alberi et al.
2010 y Webb et al. 2010).
45
Desarrollo in vitro y morfología de embriones bovinos generados por ICSI, activados por
distintos tratamientos de activación química.
El resultado de 4 replicas con un total de de 431 ovocitos inyectados con espermatozoides y
activados con ionomicina en combinación con INP (Io/INP), CHX (Io/CHX), DMAP (2Io/DMAP) y
EtOH (Io-EtOH) mostro diferencias (P<0.05) en la tasa de división a las 72 hrs (78, 72, 86 y 12% y
para INP, CHX, DMAP y EtOH, respectivamente) y en la tasa de blastocistos (32, 20, 41 y 4% para
INP, CHX, DMAP y EtOH, respectivamente) (Tabla 2, Figura 1).
Los controles realizados con ovocitos inyectados sólo con PVP (partenotes) activados con
ionomicina en combinación con INP y DMAP mostraron similar tasa de desarrollo (78 y 67%,
respectivamente) y blastcositos (19 y 32%, respectivamente), mientras la tasa de desarrollo y
formación de blastocistos fue menor en los grupos activados con CHX (43 y 11%, respectivamente) y
EtOH (12 y 5%, respectivamente) (Tabla 2).
La apariencia morfológica de los blastocistos generados por ICSI y activados con los
diferentes tratamientos fue evaluada al día 8 de cultivo, observándose 41, 38, 34 y 0% de blastocistos
tempranos,
41, 57, 32 y 100% de blastocistos expandidos y
18, 5, 34 y 0% de blastocistos
eclosionados en los tratamientos INP, CHX, DMAP y EtOH, respectivamente.
46
Tabla 2. Desarrollo in vitro de embriones generados por inyección intracitoplasmática de
espermatozoides (ICSI) y activados con diferentes compuestos químicos.
Tratamiento
ICSI
n
División (%)
Blastocistos (%)
Io/INP
+
101
79 (78)a
32 (32)a
Io/CHX
+
104
75 (72)a
21 (20)ab
2Io/DMAP
+
114
98 (86)a
47 (41)a
Io/EtOH
+
112
13 (12)b
4 (4)c
Io/INP
-
77
60 (78)a
15 (19)ab
Io/CHX
-
61
26 (43)b
7 (11)b
2Io/DMAP
-
85
57 (67)a
27 (32)ab
Io/EtOH
-
98
12 (12)b
5(5)c
Las tasa de división y blastocistos fueron registradas a las 72 y 192 hpa (4 réplicas), respectivamente.
Io/CHX: Ionomicina y Cicloheximida; Io/INP: Ionomicina e Inhibidor de la síntesis de proteínas;
2Io/DMAP: 2 pulsos de Ionomicina, 3 horas ventana, Ionomicina y 6-dimetilaminopurina; Io/ETOH:
Ionomicina, 3 horas ventana y ETOH. Controles: ovocitos inyectados sólo con 5% PVP. Los datos
seguidos por letras diferentes en la misma columna son significativamente diferentes (P<0.05).
Figura 1. Embriones bovinos generados por ICSI y activados con diferentes compuestos químicos.
Blastocistos de 8 días generados por ICSI-CHX (a), ICSI-INP (b) e ICSI-DMAP (c). Mag. 100x.
47
Efecto de los tratamientos de activación (IP, CHX y DMAP) sobre la calidad embrionaria.
La calidad evaluada en blastocistos expandidos mostro que de los diferentes tratamientos de
activación en la ICSI no afectaron el número de células totales (141.7 ± 23.2, 157.2 ± 51.4 y 143.5 ±
24.6 para INP, CHX y DMAP, respectivamente), MCI (54.7 ± 5.7, 63.9 ± 16.4, 53.0 ± 14.9 para
INP,CHX y DMAP, respectivamente), TE (87 ± 26.9, 93.3 ± 43.8 y 97.6 ± 31.3 para INP,CHX y
DMAP, respectivamente) y proporción de MCI: células totales (39.5 ± 8.5, 42.7 ± 10.5, 36.0 ± 10.5)
(Tabla 4, Figura 2).
El ensayo TUNEL realizado en blastocistos generados por ICSI y activados con diferentes
compuestos químicos, no mostro diferencias en el porcentaje de núcleos con daños en el ADN entre
los tratamientos evaluados, con una proporción de TUNEL: células totales (%) de 1.9 ± 1.0, 2.7 ± 1.5
y 2.5 ± 1.6 para INP, CHX y DMAP, respectivamente) (Tabla 4).
Tabla 4. Efecto de los tratamientos de activación (INP, CHX y DMAP) sobre el número total de
células, masa celular interna (MCI), trofoectodermo (TE) y TUNEL.
X número de células (±SD)
Tinción TUEL
Tratamiento
Total
TE
MCI
MCI:Total
(%)
TUEL:Total
(%)
TUEL:MCI
(%)
TUEL:TE
(%)
INP
141.7 ± 23.2a
87 ± 26.9a
54.7 ± 5.7a
39.5 ± 8.5a
1.9 ± 1.0a
1.8 ± 1.7a
2.1 ± 1.2a
CHX
157.2 ± 51.4a
93.3 ± 43.8a
63.9 ± 16.4a
42.7 ± 10.5a
2.7 ± 1.5a
3.7 ± 3.3a
2.6 ± 2.1a
DMAP
143.5 ± 24.6a
97.6 ± 31.3a
53.0 ± 14.9a
36.0 ± 10.5a
2.5 ± 1.6a
3.4 ± 2.6a
3.1 ± 2.1a
El conteo de células se registro en blastocistos expandidos a las 192 hpa (10 blastocistos por
tratamiento). Los datos seguidos por letras diferentes en la misma columna son significativamente
diferentes (P<0.05).
48
Figura 2. Tinción diferencial de blastocistos bovinos producidos por ICSI y activados con diferentes
compuestos químicos.
Blastocistos de 8 días generados por ICSI- INP (a y d), ICSI- CHX (b y c) e ICSI-DMAP (c y f); (a, b
y c) tinción Hoechst (células totales) y (d, e y f) tinción yoduro de propidio (células del
trofoectodermo). Mag. 400x.
49
Formación pronuclear después de la ICSI con diferentes pretratamientos y activados con
diferentes compuestos químicos.
Los resultados preliminares de la formación pronuclear, evaluada a las 16-18 horas post
activación (hpa), mostraron que la tasa de fecundación según la evaluación de la presencia del
pronúcleo masculino o cabeza espermática descondensada y pronúcleo femenino fue 75, 87 y 33 %
para los ovocitos-ICSI activados con INP, CHX y DMAP, respectivamente (Tabla 5). Los cigotos con
configuración nuclear anormal (1PN/1PB/cabeza espermática condensada, 1PN/2PB/cabeza
espermática condensada) fueron considerados en el análisis como “otros” (Tabla 5).
Tabla 5. Observaciones citológicas en los embriones generados por ICSI y activados con diferentes
compuestos químicos.
Formación Pronuclear
Tratamiento
n
1MP+1FP+2 PB
DSH+1FP+2 PB
Otros
n (%)
n (%)
n ( %)
a
3 (19)
4 (25)
ICSI-INP
16
9 (56)
ICSI-CHX
16
9 (56)a
5 (31)
2 (13)
ICSI-DMAP
15
4 (27)b
1 (6)
10 (67)
MPN: pronúcleo masculino, FPN: pronúcleo femenino, DSH: cabeza espermática descondensada, PB:
cuerpo polar, Otros: 1PN/1PB/cabeza de espermatozoide condensada y/o 1PN/2PB/ cabeza de
espermatozoide condensada. Los datos seguidos de letras diferentes en la misma columna son
significativos (P<0,05).
50
Efecto de los tratamientos de activación (IP, CHX y DMAP) sobre la ploidía de embriones
generados por ICSI.
Los resultados preliminares del análisis cromosomico de embriones generados por ICSI y
activados por INP, CHX y DMAP mostro un 60, 67 y 57% de embriones con ploidía normal,
respectivamente.
Tabla 6. Composición cromosomica de embriones de 8 células generados por ICSI y activados por
diferentes tratamientos.
Embriones
Tratamiento
informativos
Mixoploide
2n
3n
4n
(2n/4n)
Total
Other
Anormal
Io/INP
5
3 (60%)
0
0
0
2 (40%)
2 (40%)
Io/CHX
3
2 (67%)
0
0
0
1 (33%)
1 (33%)
2Io/DMAP
7
4 (57%)
0
1 (14%)
1 (14%)
1 (14%)
3 (43%)
Total
15
Un total de 45 metafases fueron evaluadas (3 por embrión informativo).
51
DISCUSIÓ.
La activación con DMAP potencia las tasas de formación de blastocistos luego de la ICSI,
comparado con CHX (Keskintepe et al. 2002; Rho et al. 1998a; Abdalla et al. 2009; Oikawa et al.
2005). Sin embargo, en nuestros resultados no existen diferencias estadísticas en el desarrollo
embrionario y formación de blastocistos cuando se emplea en la activación DMAP y CHX. La alta
tasa de desarrollo y formación de blastocistos obtenidas luego de la ICSI activada con 2 pulsos de Io y
DMAP (86 y 41%, respectivamente) fue muy similar a la descrita por Oikawa et al. (2005) y
Keskintepe et al. (2002), quienes emplearon DMAP con un pulso de Io. El protocolo de activación
2Io/DMAP utilizado en el presente estudio fue descrito por Bevaqua et al. (2010), sin embargo, la tasa
de desarrollo y formación de blastocistos obtenida luego de la ICSI fue mayor a la descrita por ellos y
a la descrita en otros trabajos que utilizan DMAP en la activación de ovocitos luego de la ICSI en
bovinos (Abdalla et al. 2009; Bevaqua et al. 2010; Rho et al. 1998, Lee et al. 2006). En relación con el
empleo de CHX luego de la ICSI, la tasa de desarrollo embrionario y formación de blastocistos
observada (72 y 20%, respectivamente) es similar a la descrita por Abdalla et al. (2009), sin embargo,
contrasta con los resultados de Galli et al. (2003) y Suttner et al. (2000), quienes describieron menor
tasa de formación de blastocistos luego del empleo de CHX en la ICSI. Las diferencias en el desarrollo
embrionario luego de la ICSI con DMAP o CHX, pueden ser atribuidas a los diferentes
procedimientos de trabajo (ej. medios de manipulación y cultivo) y a pequeñas modificaciones en el
protocolo de activación, particularmente la inclusión de un pulso adicional de Io cuando se utilizó
DMAP.
Por otras parte, la ICSI seguida por el tratamiento de activación que utiliza ionomicina en
combinación con EtOH que fue utilizado por Bevacqua et al. (2010) y Abdalla et al. (2009) con 65 y
67% para tasa de desarrollo y 15 y 26%, para tasa de formación de blastocistos, respectivamente, no
fue exitoso para activar los ovocitos luego de la ICSI bajo las condiciones experimentales utilizadas en
el presente trabajo. Los resultados mostraron una tasa de desarrollo y blastocistos muy inferior a la
descrita por estos autores (12 y 4% para tasa de desarrollo y formación de blastocistos,
respectivamente) y al resto de los tratamientos evaluados (INP, CHX y DMAP). En cuanto al
inhibidor de la síntesis de proteínas (INP), no existe información en la literatura con respecto a su
empleo en la activación de ovocitos en ninguna especie, sin embargo, la alta tasa de desarrollo y
formación de blastocistos (78 y 32%, respectivamente) observada luego de la ICSI-INP es consistente
con resultados previos aún no publicados que describen a este compuesto como altamente eficiente
para la producción de embriones por transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) (Felmer et al.
2013).
Por otra parte, el estudio del efecto de los diferentes compuestos químicos utilizados en la
52
activación sobre la ploidía de embriones generados por ICSI mostro que INP, CHX y DMAP
producen similar tasa de ploidía normal (>57%). Estos datos son novedosos, ya que, no existen
trabajos que evalúen en conjunto la ploidía de embriones generados por ICSI activados con estos
compuestos.
La activación de ovocitos con Bohemina un inhibidor específicos de las quinasas dependientes
de ciclina (CDK) parecía un tratamiento prometedor para activar los ovocitos luego de la ICSI, ya que
se presentó como un eficiente método para la activación de ovocitos bovinos (Alberio et al. 2000), sin
embargo, en el estudio mencionado sólo evaluaron la formación pronuclear, configuración nuclear,
síntesis del ADN y actividad de kinasas de embriones generados por partenogénesis (Alberio et al.
2000), mientras, en ratones se evaluó la activación de los ovocitos y la formación de blastocistos,
mostrando una tasa de activación de aproximadamente 51%, mientras la tasa de formación de
blastocistos fue <2% (Webb et al. 2010). No obstante, los resultados del presente estudio indican que
la activación de ovocitos bovinos con el compuesto Bohemina bajo las condiciones experimentales
utilizadas es inviable.
Es ampliamente aceptado que la ICSI en bovinos requiere estímulos de activación externa de
los ovocitos para iniciar el desarrollo embrionario (Rho et al. 1998b; Li et al. 1999; Chung et al. 2000).
Sin embargo, la activación química tiene la desventaja de incrementar la posibilidad de desarrollo
partenogenético. Por lo tanto, para confirmar la fecundación exitosa después de la ICSI, la evaluación
de la formación pronuclear y/o descondensación de cabeza espermática fue de gran significancia. Los
datos preliminares señalan que la mayoría de los ovocitos (>75%) sometidos a ICSI y activados con
INP y CHX fueron efectivamente fecundados por espermatozoides, mientras una menor proporción
(33%) de los ovocitos-ICSI activados con DMAP fueron fecundados exitosamente. Por lo que, es
posible que un mayor número de los embriones generados por ICSI-DMAP sea mayoritariamente
producto de la activación partenogénica y no de la fecundación por ICSI, sin embargo, para confirmar
esto último un mayor número de ovoictos-ICSI deben ser analizados.
La calidad de los embriones producidos in vitro tiene relación con su capacidad de desarrollo
post-implantación luego de su transferencia a hembras receptoras, sin embargo, la evaluación del
número total de células, distribución TE, MCI y proporción MCI: células totales son frecuentemente
utilizados para evaluar la calidad de blastocistos bovinos producidos in vitro (Van Soom et al. 1997).
La evaluación de calidad realizada a los embriones generados por ICSI y activados por los diferentes
tratamientos (INP, CHX y DMAP) medida por el número total de células, TE, MCI y proporción MCI:
células totales
fue igual en todos los tratamientos evaluados, por lo tanto, los tratamientos de
activación que emplean INP, CHX y DMAP, no afectan el desarrollo in vitro y diferenciación celular
de los embriones generados por ICSI. La evaluación de la apoptosis también es importante, ya que el
potencial desarrollo post-implantacional o calidad embrionaria es probable se afecte por la incidencia
53
de apoptosis en el estado pre-implantacional (Kumar et al. 2007). El análisis del ensayo TUNEL de los
embriones producidos por ICSI con los diferentes tratamientos de (INP, CHX y DMAP) no mostro
diferencias en el grado de células en apoptosis, en concordancia con lo observado en otras especies
animales (Grad-Mandryk I et al. 2012, Jimenez-Macedo et al. 2007).
En conclusión, los resultados generados permiten confirmar el adecuado funcionamiento de 2
diferentes protocolos de activación (INP y CHX) luego de la ICSI en bovinos que podrían permitir
mejorar su potencial de desarrollo post-implantación, ya que mostraron desarrollo in vitro y calidad
adecuados.
54
IX. RESULTADOS Y DISCUSIÓ OBJETIVO ESPECÍFICO 3:
EVALUACIÓ DEL EFECTO DE LOS SISTEMAS DE PRODUCCIÓ I VITRO DE
EMBRIOES ICSI Y FIV, SOBRE LA EXPRESIÓ DE GEES RELACIOADOS
AL ESTRÉS OXIDATIVO Y LA CALIDAD DE LOS EMBRIOES GEERADOS.
55
Efecto del método de producción in vitro de embriones (ICSI vs. FIV) sobre el desarrollo
embrionario.
Los resultados de 9 replicas con un total de 244 ovocitos fecundados in vitro y 256 ovocitos
inyectados con espermatozoides, mostraron diferencias (P<0.05) en la tasa de división a las 72 h de
cultivo (88.5 y 64.1% para FIV e ICSI, respectivamente), y en la tasa de blastocistos a las 168 h y 192
h para FIV e ICSI, respectivamente. Una mayor proporción de embriones (P<0.05) alcanzaron el
estadío de blastocistos cuando los embriones fueron generados por FIV (36.1%), comparados a los
embriones producidos por ICSI (22.3%) (Tabla 3). También se observo que la FIV generó un mayor
porcentaje (P<0.05) de blastocistos expandidos y menor porcentaje (P<0.05) de blastcsoitos
eclosionados, en relación a la ICSI, mientras, no se observaron diferencias en el porcentaje de
blastocistos tempranos producidos por ambas técnicas (Tabla 3). Los ovocitos inyectados sólo con
PVP (control) mostraron una tasa de división (43%) y formación de blastocistos (11%) menor
(P<0.05) que los embriones ICSI y FIV, respectivamente.
La evaluación de la formación del pronúcleo masculino (MPN) y femenino (FPN) en los
ovocitos-ICSI mostro que 56% de ellos poseían el segundo cuerpo polar y ambos pronúcleos; 31% con
cabeza de espermática descondensada y FPN; y 13% presentaron otras configuraciones nucleares.
Tabla 3. Desarrollo in vitro de embriones bovinos generados por fecundación in vitro (FIV) e
inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
n
División (%)
Blastocistos
tempranos (%)
Blastocistos
expandidos (%)
Blastocistos
eclosionados (%)
BLASTOCISTOS
TOTALES (%)
FIV
244
216 (88.5)a
36 (41)a
47 (53)a
5 (6)a
88 (36.1)a
ICSI
256
164 (64.1)b
26 (46)a
18 (31)b
13 (23)b
57 (22.3)b
Tratamiento
La tasa de división fue registrada a las 72 h y blastocistos a las 168 y 192 hpa para FIV e ICSI,
respectivamente. (9 réplicas). Los datos seguidos por letras diferentes en la misma columna son
significativamente diferentes (P<0.05).
56
Efecto del método de producción in vitro de embriones (ICSI vs. FIV) sobre la calidad
embrionaria.
Aunque no se observaron diferencias en el número total de células de blastocistos expandidos
generados por los dos sistemas de producción in vitro de embriones (159.3 ± 28.5 y 161.2 ± 56.16 para
FIV e ICSI, respectivamente) o en las células del TE (113.2 ± 27.9 y 100.5 ± 44.3 para FIV e ICSI,
respectivamente), las células de la MCI y la proporción MCI: células totales, fueron significativamente
afectadas por la técnica de producción de embriones (Tabla 4). Los embriones generados por ICSI
mostraron un alto número de células MCI (60.7 ± 18.4) y proporción de MCI: células totales (39.2%
± 8.2%), en comparación con los embriones producidos por FIV (46.1 ± 9.0 y 29.5% ± 6.7% para MCI
y proporción MCI: células totales, respectivamente) (Tabla 4).
El ensayo TUNEL realizado en blastocistos expandidos generados por ambos sistemas de
producción in vitro, no mostro diferencias significativas en el número de núcleos en apoptosis en
embriones producidos por FIV e ICSI, con una proporción de TUNEL: células totales (%) de 2.12 ±
1.54 y 2.64 ± 1.70 para FIV e ICSI, respectivamente) (Table 4).
Tabla 4. Efecto de la técnica de producción in vitro de embriones (FIV e ICSI) sobre el número total
de células, masa celular interna (MCI), trofoectodermo (TE) y TUNEL.
X número de células (±DE)
Tinción TUEL
Tratamiento
Total
TE
MCI
MCI:Total
(%)
TUEL:Total
(%)
TUEL:MCI
(%)
TUEL:TE
(%)
FIV
159.3 ± 28.5a
113.2 ± 27.9a
46.1 ± 9.0a
29.5 ± 6.7a
2.12 ± 1.54a
5.19 ± 5.08a
1.11 ± 1.11a
ICSI
161.2 ± 56.16a
100.5 ± 44.3a
60.7 ± 18.4b
39.2 ± 8.2b
2.64 ± 1.70a
4.49 ± 4.50a
1.9 ± 1.22a
El conteo de células se registro a las 168 y 192 hpa para FIV e ICSI, respectivamente, en blastocistos
expandidos (10 blastocistos por tratamiento). Los datos seguidos por letras diferentes en la misma
columna son significativamente diferentes (P<0.05).
57
Efecto del método de producción in vitro de embriones (ICSI vs. FIV) sobre la expresión génica.
El análisis de expresión génica realizado en blastocistos expandidos por FIV e ICSI,
respectivamente, mostró una disminución en la expresión de IGF2 (P<0.001) y elevada expresión
(P<0.05) de, SOD2, BAX, OCT4 y IF&t en embriones generados mediante ICSI, en relación a
embriones producidos por FIV (Tabla 5).
58
Tabla 5. Análisis de expresión génica en blastocistos utilizando el programa REST con el promedio
geométrico de tres genes de referencia (YWHAZ, PPIA y GSS).
Método de producción in vitro comparados
FIV -ICSI
95% I.C
P(H1)
Gen
Expresión
GSS
1.22
Gen de Referencia
YWHAZ
1.122
Gen de Referencia
PPIA
0.731
Gen de Referencia
SF3A1
0.69
0.407 - 1.002
0.102
BAX
11.24
4.551 - 40.476
0.036 (up)
D&MT1
2.909
1.205 - 8.499
0.1
GLUT1
3.287
0.297 - 31.345
0.237
IGF2
0.53
0.372 - 0.652
0 (down)
OCT4
3.983
2.180 - 9.041
0.036 (up)
GADPH
0.91
0.365 - 2.217
0.627
HDAC1
1.034
0.252 - 2.827
0.993
I&Ft
17.63
4.239 - 94.427
0.036 (up)
H2A
0.772
0.144 - 3.097
0.612
CAT
4.645
1.132 - 22.193
0.107
PRDX6
5.937
0.712 - 40.695
0.202
SOD1
0.723
0.291 - 1.791
0.516
SOD2
2.323
1.163 - 4.308
0.036 (up)
SDHA
0.956
0.379 - 2.191
0.928
Los análisis de expresión génica se realizaron mediante la comparación de los métodos de producción
de embriones ICSI y FIV. Los genes de referencia (YWHAZ, PPIA y GSS) fueron seleccionados
basados en el análisis de pares de acuerdo a su estabilidad de expresión, utilizando el programa
geNorm.
Expresión: Indicadores de expresión obtenido mediante el uso de la randomización y bootstrapping
incluidos en el programa REST; 95% IC: rango de intervalo de confianza (95%) de los indicadores de
expresión, P (H1): probabilidad de la hipótesis alterna, que la diferencia entre la ICSI y los FIV se
debe sólo al azar. Se resalta en color negro los genes que se encuentran sobre-expresados (UP) y subexpresados (DOWN) en los embriones producidos por ICSI, en relación a los producidos por FIV.
59
DISCUSIÓ
El desarrollo de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) ha sido de gran
ayuda para el tratamiento de la infertilidad en humanos, en animales para conservar especies en
peligro de extinción y empleo más eficiente de semen de alto valor genético y/o comercial, entre otros,
y también para investigar aspectos importantes de la fecundación que incluyen interacción entre
gametos, activación de ovocitos y regulación del ciclo celular. Aunque los efectos de la ICSI en
humanos han sido ampliamente debatidos (Bridges et al. 2011, Kohda et al. 2011), no existe
actualmente un consenso global con respecto a la seguridad de esta técnica, con un incremento del
número de consecuencias no deseadas para la madre y/o su descendencia (revisado por Bridges y col
2011). En adición, estudios en ratón señalan que blastocistos generados mediante ICSI poseen
diferencias en los perfiles globales de expresión génica, en relación a los producidos mediante FIV,
por lo que el método de fecundación tendría una gran influencia sobre el transcriptoma de embriones
preimplantacionales alterando genes relacionados con la función celular, desarrollo y metabolismo, e
impulsaría consecuencias no deseadas asociadas con las técnicas de reproducción asistida (Bridges et
al. 2011, Giritharan y col 2010). Sin embargo, los cambios producidos en el transcriptoma de los
neonatos generados por ICSI no tienen efecto de por vida o transgeneracional, ya que, desaparecen en
la 8 semana desde el nacimiento (Kohda et al. col 2011). También se ha sugerido que la activación
química empleada luego de la ICSI podría tener efectos negativos, sin embargo, estudios recientes en
ratones indican que los embriones generados por ICSI seguido de activación química poseen un perfil
de expresión génica más similar al de embriones FIV, en comparación con embriones generados
mediante ICSI sin activación (Bridges et al. 2011).
Este estudio muestra por primera vez que embriones bovinos generados mediante ICSI
también poseen un patrón de expresión diferencial, en relación a los FIV y aunque la calidad de los
embriones evaluada por el número total de células y células TUNEL positiva no fue diferentes entre
estos dos métodos de producción de embriones, diferencias fueron observada en la MCI y proporción
MCI: células totales. Las células de la MCI contribuyen a todos los tejidos embrionarios y en parte a
las membranas extraembrionarias, mientras que las células del TE contribuyen principalmente a la
formación de la placenta, por lo que ambos tipos celulares son necesarios para la sobrevivencia
embrionaria y fetal (Gardner 1989, Hardy et al. 1989). Por lo tanto, en base a la importancia de estas
células, cualquier alteración en su distribución, podría afectar el potencial de desarrollo
postimplantación de estos embriones. Adicionalmente, el potencial desarrollo postimplantacional o
calidad embrionaria es probable se afecte por la incidencia de apoptosis en el estado preimplantacional
(Kumar et al. 2007). El análisis del ensayo TUNEL de los embriones producidos por ICSI y FIV no
mostro diferencias en el grado de células en apoptosis, en concordancia con lo observado en otras
especies animales (Grad-Mandryk I et al. 2012, Jimenez-Macedo et al.l 2007) y de hecho, el
60
porcentaje de células TUNEL positivas en los embriones producidos por ambas técnicas fue bajo,
indicando en general una buena calidad para estos embriones.
Los embriones bovinos generados por ICSI alcanzan mayoritariamente el estadío de
blastocistos el día 8, a diferencia de los generados por FIV donde habitualmente la tasa de blastocistos
se registra en el día 7, esto como consecuencia del retraso en la descondensación del núcleo
espermático y formación del pronúcleo masculino luego de la ICSI que puede tardar hasta 10 horas,
comparado con la FIV (Galii et al. 2003, Rho et al. 1998, Wei and Fukui et al. 1999, Li et al 1993).
La tasa de clivaje y formación de blastocistos observada en la ICSI fue menor que la
observada en la FIV, lo cual contrasta con lo descrito en bovinos por Li et al. (2004), quienes no
observaron diferencia entre FIV e ICSI. No obstante, los procedimientos diferentes entre ambos
trabajos pueden ayudar a explicar las diferencias observadas, incluyendo el medio de cultivo (KSOM
vs. CDM, respectivamente) y otro compuesto químico en la activación (CHX vs. DMAP,
respectivamente).
La expresión génica varía de acuerdo con el sistema de producción in vitro empleado
(Niemann and Wrenzycki 2000; Niemann et al. 2002; Lonergan et al. 2003a), y que los genes
impresos serían mas susceptibles a alteraciones epigeneticas (Moore et al. 2001), particularmente
luego del cultivo in vitro de embriones de especies domésticas (Blondin et al. 2000, Young et al.
2001). IGF2 (insulin-like growth factor 2), es un gen impreso que codifica para un factor de
crecimiento involucrado en el desarrollo fetal y placental, esencial para el desarrollo normal (Perecin
et al. 2009). Estudios señalan que blastocistos de 7 días producidos por FIV poseen significativamente
menos expresión de IGF2 y de otros componentes de los IGFs (IGF1r, IGF2r), en relación a los
producidos in vivo, y que este efecto podría reflejar una reducción de la viabilidad de los embriones
producidos in vitro (Bertolini et al 2002). Por otra parte, el análisis de embriones de estadíos más
avanzados (33-36 días) muestra una menor expresión de IGF2 en embriones producidos por
transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), en relación a los producidos por FIV e in vivo. La
alteración en el nivel de IGF2 en los embriones SCNT podría indicar que la expresión anormal de
genes improntados es una de las causas de la baja eficiencia de la clonación en bovino (Perecin et al.
2009). De acuerdo, con estos antecedentes la baja expresión de IGF2 observada en los embriones
bovinos producidos por ICSI, podría ser responsable del bajo potencial de desarrollo pre-implantación
observado en comparación con la FIV. Este baja expresión de IGF2 podría también afectar el
desarrollo post-implantación o en el crecimiento de la descendencia, ya que, en ratón se ha observado
que la sobreexpresión de IGF2 promueve el crecimiento fetal, mientras la baja expresión se asociado
con retraso del crecimiento (Eggenschwiler et al. 1997, DeChiara et al. 1990). Futuros experimentos
deberán evaluar el desarrollo post-implantacional de estos embriones en orden de confirmar estas
observaciones descritas en el modelo ratón y embriones SCNT bovinos.
61
OCT4 (octamer-binding transcription factor), es un factor de transcripción temprano
expresado durante el desarrollo y tiene un rol crucial en la regulación de los eventos iniciales del
desarrollos (Kirchhof et al. 2000). Aunque, no existe información sobre la expresión de OCT4 en
embriones bovinos producidos por ICSI, un bajo nivel de expresión fue descrito en embriones
producidos por SCNT, en comparación a los FIV (Aston et al. 2010). Una expresión variable de OCT4
ha sido observada en embriones de ratón y bovinos cultivados en diferentes medios de cultivo (Felmer
et al. 2011, Purpera et al. 2009, Li et al. 2005). En nuestro estudio, el incremento de expresión de
OCT4 en embriones generados por ICSI podría estar relacionado con el mayor número de células en la
MCI también observada en estos embriones, aunque no podemos descartar la posibilidad que el
método de producción de embriones (ej. activación química de los embriones ICSI) también pueda
tener un efecto. Considerando la función clave de este gen en la regulación de la embriogénesis en
mamíferos, es claro que su patrón y nivel preciso de expresión son indispensables en los embriones
ICSI para el correcto desarrollo embrionario.
Los embriones generados por ICSI también mostraron una alta expresión de BAX, un gen proapoptotico miembro de la familia de proteínas BCL-2, aunque su alta expresión no se correlaciono
con un alto número de células en apoptosis en estos embriones. Previamente, se ha descrito que la
expresión de ARNm de BAX fue más alta en los embriones producidos in vitro comparado a los
producidos in vivo (Rizos et al. 2002; Lonergan et al. 2003). Recientemente, sin embargo, Vandaele et
al. (2008), mostraron que luego de exponer embriones a estaurosporina, un inihibidor de la proteína
quinasa, que induce apoptosis en blastocistos bovinos (Gjorret et al. 2007), los mRNA de BAX, BCL-2
y caspasas 3 y 7 no fueron afectados, concluyendo que estos genes no pueden ser utilizados como
método de detección fiable de apoptosis (Vandaele et al. 2008). De igual manera, aunque se ha
observado que diferentes tejidos expresan altos niveles de BAX, estos no exhiben características
propias de apoptosis (Krajewski et al. 1994; Olive and Ferrer 1999; Penault-Llorca et al. 1998). Por lo
tanto, el incremento de BAX observado en los embrions ICSI puede ser atribuido a la participación de
este gen en otras funciones celulares diferentes a la apoptosis como la regulación de la velocidad del
ciclo celular como previamente suguirio Aiba-Masago et al. (2002) y Brady et al. (1996). En orden de
clarificar esta mayor expresion de BAX, estudios futuros deberán también incluir el análisis de otros
genes importantes relacionados con apoptosis como el gen anti-apoptosis BCL2, ya que se ha
observado que el efecto antiapoptosis de BCL2 es influenciado por BAX y la relación BCL2/BAX es un
factor clave para la determinación de la apoptosis (Duan et al. 2005).
Análisis de RT-PCR semi-cuantitativo señalan que los niveles expresión de IF&t (Interferontau), a tipo de IFN-I que limita su expresión al TE de rumiantes y que actúa como señal inicial en el
reconocimiento materno-fetal y mantención de la preñez (Takahshi et al. 2003), no difieren
significativamente entre embriones de 7 días producidos por partenogénesis, FIV y SCNT (Yao et al.
62
2009). De igual manera, estudios de qRT-PCR indican que la expresión de IF&t no es diferente entre
embriones de 17 días generados por FIV, SCNT e inseminación artificial (Arnol et al. 2006). Sin
embargo, en el presente estudio los embriones ICSI mostraron una expresión diferencial de IF&t con
respecto a los embriones generados por FIV. Esto podría ser atribuido a factores ambientales
(manipulación in vitro, activación química, etc) y/ factores genéticos. De hecho, estudios previos
indican que la expresión y secreción de I&Ft en embriones bovinos pueden influenciarse
significativamente por
factores genéticos y medioambientales, y pueden ser el
origen de las
diferencias en la tasa de preñez luego de la transferencia de dichos embriones (Kubisch et al. 2003;
Larson et al. 2001; Kimura et al. 2004, Stojkovic et al. 1995, 1999).
En bovinos, aunque se han conseguido importantes avances en la maduración, fecundación y
cultivo in vitro de embriones, la tasa de formación de blastocistos luego de procedimientos in vitro aún
es insatisfactoria (revisado por Correa et al. 2002). Las ROS se indican como uno de los principales
factores responsables de la menor producción y pobre calidad de los embriones producidos in vitro
(Takahashi et al. 2000). Sin embargo, también se ha observado que niveles fisiológicos de ROS son
necesarios para procesos normales en la regulación del crecimiento y desarrollo celular (Hancock et al.
2001). SOD2 (Superóxido dismutasa-Mn, que se encuentra en la mitocondria) es una importante
enzima implicada en la protección contra las especies reactivas de oxígeno (ROS), asociándose
elevados niveles de expresión de SOD2 con una mejor calidad embrionaria (Rizos et al. 2002,
Lonergan et al. 2003a). De igual forma, experimentos in vivo en células de la granulosa de ovarios de
ratas relacionan un incremento de SOD2 con la supresión de apoptosis mediada por gonadotrofinas
(Tilly and Tilly 1995). En nuestros datos, el incremento en la expresión de SOD2 en embriones
generados por ICSI puede ser indicativo de embriones de buena calidad en términos actividad
mitocondrial y protección contra ROS. Por lo tanto, a pesar del bajo potencial de desarrollo de estos
embriones, en relación a FIV, esto posiblemente sugiere que estos embriones son de buena calidad
como fue confirmado por la evaluación morfologíca, celular y apoptosis, que mostro diferencia solo en
el número de células MCI y relación MCI: células totales, con respecto a FIV
En conclusión, bajo las condiciones experimentales utilizadas en este estudio, en bovinos la
técnica ICSI es menos eficiente en términos de tasa de division y blastocistoss que la técnica de FIV,
y afecta la expresión de genes importantes en el desarrollo embrionario lo que explicaría el menor
potencial de desarrollo normalmente observado en estos embriones. Estos resultados apoyan la
necesidad de futuras investigaciones en ICSI en bovinos, con el objetivo de mejorar los factores
responsables de la baja eficiencia de esta técnica en la especie bovina.
63
X. COCLUSIOES GEERALES
1. Los espermatozoides bovinos tratados con baja concentración alcalina puede ser efectivamente
utilizado para la generación de embriones bovinos después de la ICSI.
2. El pretratamiento clásico de espermatozoides con DTT antes de la ICSI no es esencial para un
apropiado desarrollo embrionario in vitro en la especie bovina.
3. Los protocolos de activación que utilizan ionomicina en combinación con INP y CHX luego de
la ICSI en bovinos podrían permitir mejorar el potencial de desarrollo embrionario postimplantación, ya que mostraron desarrollo embrionario in vitro y calidad adecuados.
4. Bajo nuestras condiciones experimenteales los compuestos qúimico Bohemina y Etanol no activan
adecuadamente los ovocitos bovinos, por lo tanto, no pueden ser utilizados en la activación de los
ovocitos luego de la ICSI.
5. En bovinos la técnica ICSI es menos eficiente en términos de tasa de division y blastocistos que la
técnica de FIV, y afecta la expresión de genes importantes en el desarrollo embrionario lo que
explicaría el menor potencial de desarrollo normalemnte observado en estos embriones.
6. Los resultados de esta Tesis apoyan la necesidad de futuras investigaciones en ICSI en bovinos
con el objetivo de mejorar los factores responsables de la baja eficiencia de esta técnica en esta
especie.
64
XI. BIBLIOGRAFÍA
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