XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y

XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
efectuando centenares a miles de lecturas repetidas de cada una de las
bases en estudio y dando información exhaustiva de las moléculas analizadas8. Esto ha aumentado considerablemente el rendimiento dado que
los secuenciadores tradicionales resolvían pocas kilobases al día y ahora
pueden estudiar cientos de megabases en el mismo tiempo. Asimismo, es
posible estudiar más genes a la vez así como la totalidad de las regiones
exónicas e intrónicas de estos genes. Dependiendo del tipo de aparato
de que se disponga y de la información que se quiera obtener se analizan
genomas completos, exomas, paneles de genes o genes completos o
regiones génicas que se quieran caracterizar.
Para definir la estrategia de análisis a seguir es importante preguntarse qué otros sitios del gen pueden tener mutaciones. Por ejemplo, así
como hay inversiones que afectan los dos grandes intrones 22 y 1, el
gen del FVIII posee otros intrones de gran tamaño como el 6, 13, 14 y
25, y es posible plantear la hipótesis de que algún paciente pudiera presentar una alteración rara que involucre alguno de ellos u otros grandes
rearreglos aislados9. Recientemente se ha confirmado la existencia de
cambios mutacionales en zonas internas de los intrones que afectan
el proceso de splicing generando un sitio de unión no convencional
(sitio de unión críptico)10,11. Finalmente, como los estudios de mutación se aplican al ADN procedente de leucocitos de sangre periférica
y el gen del FVIII actúa en el hígado, que es el lugar de síntesis más
importante, sería posible que existiera una línea celular mutada en el
hígado pero casi ausente en sangre periférica. Esto se conoce como
mosaicismo somático de baja frecuencia y fue demostrado en algunas
madres de casos esporádicos de hemofilia A con mutación identificada
y que habían sido diagnosticadas, erróneamente, como no portadoras12.
La metodología de secuenciación de Sanger puede llegar a detectar
casos de mosaicismo pero casi nunca cuando es menor del 15%13. La
secuenciación masiva permitiría estudiar en profundidad estos casos
para determinar la presencia de un alelo mutado aun con muy bajo porcentaje (alrededor del 1%) de representación en el ADN de linfocitos.
Cabe insistir en el hecho de que un gen puede estar indemne en su
estructura pero albergar una alteración en sus zonas reguladoras y, por
lo tanto, no transcribirse ni funcionar. La zona promotora del FVIII
abarca unas 2 kb y pocos cambios descritos como posiblemente patológicos en el promotor o zona 3’UTR en pacientes con hemofilia A14,15.
Se ha descrito también la ausencia o disminución del ARNm del gen
del FVIII en sangre periférica de un paciente con hemofilia A grave.
Este hallazgo es compatible con el concepto de gen no funcionante, ya
sea por mutaciones en zonas reguladoras o por otros factores epigenéticos como la metilación de zonas promotoras que actúan silenciando los
genes16. El estudio del ARNm para detectar alteraciones en su tamaño
y/o cantidad es esencial para descubrir estos hallazgos de la patología
molecular del gen del FVIII.
Por último, hay que señalar que en el diagnóstico diferencial de
la hemofilia A se deben descartar la enfermedad de von Willebrand,
particularmente los casos con niveles de factor VIII moderados o leves
(2N), y el déficit combinado de FV y FVIII. Este último ocurre por
mutaciones en los genes que codifican las proteínas LMAN1 (antes
ERGIC-53) y MCFD2, localizados en los cromosomas 18 y 2, respectivamente, que transportan el FV y el FVIII desde el retículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi. Las mutaciones encontradas predicen
la falta de función de estas proteínas y provocan un déficit moderado
a leve de FV y FVIII. Este trastorno constituye un ejemplo de enfermedad por déficit de proteínas cuyos genes están intactos y subraya la
importancia de los procesos postraduccionales.
Tabla 2. Mutaciones que podrían ser causa de hemofilia A y que no
son detectadas mediante los métodos rutinarios de secuenciación
en ADN genómico
Mutaciones en
el gen del FVIII
• Alteraciones splicing por mutaciones intrónicas
• Mosaicismo somático de baja frecuencia
• Posibles inversiones en intrones 6, 13, 14 y 25 u
otros rearreglos
Regulación de la
expresión del gen
del FVIII
• Mutaciones en zonas promotoras o región 3’ no
traducida (UTR)
• Factores epigenéticos no conocidos
Mutaciones en
otros genes
• Genes de las proteínas de transporte del FVIII
• Genes que actúan en la modificación
postraduccional de la proteína
Figura 1. Algoritmo de diagnóstico molecular en la hemofilia A. A partir del ADN
de un paciente hemofílico se inicia el estudio con las inversiones de los intrones
22 y 1. A continuación el método de secuenciación automática de Sanger permite
obtener resultados fiables de los exones y las zonas de unión intrón-exón y
promotor. Si es negativo es posible detectar deleciones o duplicaciones exónicas
con métodos cuantitativos, ya sea con la amplificación selectiva de exones o
estudiando la totalidad de los exones en un solo experimento como la Multiplex
Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). Si todo es negativo y la hemofilia
es leve o moderada es necesario descartar enfermedad de von Willebrand 2N (que
cursa con niveles bajos de FVIII) y el más raro déficit combinado de FV y FVIII por
alteración del transportador común de ambos factores. Estudios más complejos
incluyen el análisis de ARN mensajero para determinar alteraciones raras del
splicing, estudios de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) y CGH (Comparative
Genome Hybridization) para detectar grandes rearreglos estructurales, y la
secuenciación masiva (NGS) para descubrir mutaciones intrónicas o en regiones
menos estudiadas del gen. La confirmación genética del paciente permite
el estudio de portadoras y el adecuado asesoramiento genético de la familia
incluyendo las opciones reproductivas. Siempre es aconsejable realizar el estudio
indirecto con marcadores polimórficos intragénicos que permiten identificar el
cromosoma X de riesgo en la familia en caso de no encontrar la mutación o de
ser necesario un diagnóstico de portadoras con rapidez. Los marcadores también
son necesarios para definir el haplotipo de riesgo en los estudios prenatales y
preimplantatorios. En la hemofilia B puede seguirse un razonamiento similar pero
no hay inversiones, por lo que el diagnóstico empezaría por la secuenciación y
los estudios cuantitativos.
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