HPLC

HPLC
CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA CLÁSICA
8
8
„
„
„
„
„
HPLC
HPLC
Lentitutd
Operación manual
Columnas reutilizables pequeño diámetro.
Disminución tamaño partícula f.e.
Desarrollo nuevas f.e.
Introducción de muestra precisa en
pequeñas cantidades.
Detectores contínuos, sensible y que
trabajan a caudales bajos.
Instrumentación
fase móvil
inyector
bomba
„
columna
(fase estacionaria)
sistema de
adquisición
de datos
Instrumentación
„
„
„
„
„
„
HPLC
detector
Eluyentes
Sistema de impulsión
Sistema de inyección de muestra
Columna
Detector
Sistema de (control y) adquisición de datos
Fase móvil
„
Fases móviles
„
Tipos de eluyentes
Agua (con o sin sales disueltas)
„ Disolventes
La utilización de unos u otros depende del tipo
de cromatografía (fase normal, fase inversa,
intercambio iónico, etc.)
„
„
Tipo de elución
„
„
„
Eliminación de partículas
„
„
„
„
Ultrasonidos
Burbujeo de helio
Vacío (desgasificadores en serie)
Algunas recomendaciones:
„
„
„
HPLC
Filtración a través de 0.45 µm
Desgasificación
„
„
Isocrática
Gradiente (precaución precipitaciones!!)
Cambio diario de tampones
No dejar las líneas tiempos largos en agua
Tampón-Agua-Disolvente orgánico
Fase móvil
„
Sistema de impulsión de los eluyentes
„
Exigencias:
„
„
„
„
„
„
Presión 0-400 atm
Salida libre de pulsos
Caudales entre 0.1 y 10 mL/min
Reproducibilidad de caudales
Resistencia a la corrosión por los disolventes
Bombas:
„
Bomba tipo jeringa impulsada por un tornillo
„
„
„
HPLC
Flujo libre de pulsos
Baja capacidad
(aprox. 250 ml)
No adecuada para
cambios de disolvente
Fase móvil
„
Sistema de impulsión de los eluyentes
„
Bombas:
„
HPLC
Bomba aspirante-impelente con doble pistón
en serie
Fase móvil
„
Sistema de impulsión de los eluyentes
(cont.)
„
Forma de mezclar los eluyentes:
„
„
HPLC
Mezclado a alta presión (dos bomba de alta
presión + programador)
Mezclado a baja presión (dos bombas de baja
presión o válvula proporcional + programador
+ una bomba de alta presión)
Inyección
„
Sistema de inyección
„
Exigencias:
„
„
„
„
„
„
„
inyección en línea de alta presión
baja dispersión de la muestra
precisión
volúmenes variables
automatizable
sin memoria
Inyector manual con bucle:
posición de “carga”
HPLC
posición de “inyección”
Inyección
„
Sistema de inyección
„
Algunas recomendaciones:
„
„
„
„
Realizar el cambio “carga”-”inyección” con
decisión.
Mantener la jeringa en la puerta de inyección
para evitar succiones involuntarias de la
muestra al extraer la jeringa.
Mantener la válvula en posición inject durante
el análisis.
Emplear jeringas adecuadas: punta cuadrada
HPLC
„
HPLC
GC
Es preferible inyectar volúmenes pequeños.
Mejor 10 µl de una concentración que 20 µl del
doble de concentración
Muestra
„
Muestra
„
Disolución libre de partículas (filtración) y
miscible con la fase móvil
Disolvente soluble en F.M.
solución
inyección
Dilución en F.M.
Separación productos insolubles en F.M.
Solubles en F.M.
Eliminación de posibles interferencias
sólido
inyección
Algunos productos insolubles en F.M.:
extracción, eliminación de interferencias,
preparación de derivados, etc.
„
Volumen de inyección
„
„
„
Concentración
„
HPLC
20 µl HPLC analítica
100 µl HPSEC o semipreparativa
0.05-1 mg/ml
Muestra
„
Disolvente para la muestra
„
„
„
HPLC
Idealmente disuelta en fase
móvil
Si se trata de un gradiente,
composición inicial
Si no es posible, que tenga la
máxima proporción de eluyente
acuoso (en fase inversa) posible
Fase estacionaria
„
Columnas
CROMATOGRAFÍA ULTRARRÁPIDA
„
Longitud: 3-6 cm
„
Diámetro: 0.45 mm
„
Tamaño de partícula: 5-3 µm
„
Caudal: 2 mL/min
Tiempos de análisis menores
Ahorro de disolventes
Mejora cantidad detectable
DISMINUIR LONGITUD Y
TAMAÑO DE PARTÍCULA
CROMATOGRAFÍA CONVENCIONAL
„
Longitud: 15-25 cm
„
Diámetro: 0.45 mm
„
Tamaño de partícula: 5-10 µm
„
Caudal: 1-2 mL/min
DISMINUIR DIÁMETRO
Ahorro de disolventes
Mejora cantidad detectable
HPLC
CROMATOGRAFÍA MICRO-BORE
„
Longitud: 10-25 cm
„
Diámetro: 0.21-0.1 mm
„
Tamaño de partícula: 5 µm
„
Caudal: 0.1-0.4 mL/min
Fase estacionaria
„
Columnas
„
HPLC
Narrow-bore
Fase estacionaria
„
Columnas
„
HPLC
Ultrarrápidas
Detectores
„
Detectores
„
Absorción UV-VIS
„
Longitud de onda fija (lámpara de Hg)
lámpara
muestra
referencia
volumen muerto: 4-12 µl
camino óptico: aprox. 1 cm
fotodiodos
„
Longitud de onda variable (lampara de D2 o W)
lámpara
Red de
difracción
HPLC
Detectores
„
Detectores
„
Absorción UV-VIS
„
HPLC
Red de fotodiodos (DAD-UV):
Detectores
„
Detectores
„
Absorción UV-VIS
„
HPLC
Red de fotodiodos (DAD-UV):selección de λ
Detectores
„
Detectores
„
Absorción UV-VIS
„
Red de fotodiodos (DAD-UV):pureza de pico
absorbancia
cromatograma
tiempo
absorbancia
espectro
HPLC
longitud de onda
Detectores
„
Detectores
„
„
„
„
„
„
Índice de refracción
Fluorescencia: sensibilidad/selectividad
Conductimétrico
Electroquímico
Másico (dispersión de luz)
Espectrómetro de masas
Detector
Estabilidad
Selectividad
Gradiente?
Sensibilidad
Absorción UV-VIS
Índice de refracción
Fluorescencia
Conductimétrico
Electroquímico
Másico
Alta
Baja
Alta
Baja
Baja
Media
Media
No
Sí
Sí
Sí
No
Sí
No
Sí
No
Sí?
Sí
Variable (alta)
500 ng
Variable (0.1 ng)
5 ng
0.01 ng
50 ng
HPLC
HPLC - Fase normal
„
Fase estacionaria: Polar
„
„
Fase móvil: Apolar (inferior a la del analito)
„
„
HPLC
gel de sílice, alúmina, gel de sílice modificado
con grupos amino, diol, ciano
pentano, ciclohexano, CCl4, tolueno, CHCl3,
CH2Cl2, THF, dioxano…
poder elutrópico se incrementa con la
polaridad
HPLC - Fase normal
„
Interacciones analito-FE:
„
„
„
Interacciones dipolo-dipolo (permanente o
inducido)
Interacciones ácido-base
Interacciones puente de hidrógeno
Compuestos
menos polares
Compuestos
más polares
Tiempo de retención
„
Aplicaciones:
„
„
„
Inconvenientes:
„
„
HPLC
Compuestos muy apolares
Mezclas de productos de polaridad muy
diferente
Fácil desactivación gel de sílice
Adsorciones irreversibles (compuestos básicos)
HPLC - Fase inversa
„
Fase estacionaria: No-polar
„
„
„
HPLC
Sílica modificada con grupos C2, C8, C18
Sílica modificada con grupos fenilo
Polímeros orgánicos poco polares (estirenodivinilbenceno) funcionalizados o no
HPLC - Fase inversa
„
Fase móvil: Polar
„
„
Agua, metanol, acetonitrilo, THF
Mecanismo principal de reparto
Compuestos
más polares
(Mismo tamaño
molecular)
Compuestos
menos polares
Menor tamaño
(Misma polaridad)
Mayor tamaño
Tiempo de retención
„
Aplicaciones:
„
„
Productos de polaridad media-baja
Gran versatilidad
HPLC-FASE INVERSA: LA MÁS UTILIZADA ACTUALMENTE
HPLC
HPLC - Fase inversa
„
Compuestos básicos en fase inversa
carbendazim
thiabendazole
Columna C18 no desactivada
(150x3.9 mm; 4 µm)
Columna C18 desactivada
(150x4 mm; 5 µm)
silanol libre
desactivado
Desactivación o “end-capping”
HPLC
HPLC - Fase inversa
Separación de naftaleno, bifenilo, fluoreno, fenantreno y antraceno
100% AcN
90% AcN
10% agua
80% AcN
20% agua
70% AcN
30% agua
Columna: Licrospher 100 (Merck) RP-18 (125 x 4 mm, 5 µm)
HPLC
Intercambio iónico
„
Fase estacionaria: Sílica o polímeros orgánicos
funcionalizados con restos iónicos
„
„
HPLC
Intercambiadores catiónicos:RE-SO3-, RE-COOIntercambiadores aniónicos: RE-N+R3, RE-NR2
„
Fase móvil: Disoluciones acuosas de
tampones (influye pH, fuerza iónica…)
„
Interacción iónica
Intercambio iónico
Monovalentes
Divalentes
Menor radio
Mayor radio
Tiempo de retención
HPLC
Trivalentes
Exclusión molecular
„
Fase estacionaria: Polímeros de estirenodivinilbenceno en forma de gel
„
Fase móvil: Orgánica (THF) o acuosa (agua)
„
Interacción: No hay
Separación: Se debe a que las móleculas de
menor volumen puedn penetrar en un mayor
número de poros que las moléculas de mayor
tamaño.
„
HPLC
Exclusión molecular
Mayor peso
molecular
Menor peso
molecular
Tiempo de retención
HPLC