titulo del proyecto: vectores adenovirales para la terapia génica en

PROYECTO FONDEF DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
INFORME FINAL
TITULO DEL PROYECTO: VECTORES ADENOVIRALES PARA LA TERAPIA GÉNICA EN EL
TRATAMIENTO DEL ALCOHOLISMO
CÓDIGO DEL PROYECTO: D08I1051
FECHA DE EMISION: 28/04/2014
FIRMA DEL (DE LA) DIRECTOR(A) DEL PROYECTO
JUAN ALFONSO ASENJO DE LEUZE
I. Acta De Término Del Proyecto
1.1 Identificación del proyecto
TITULO DEL PROYECTO
CÓDIGO FONDEF
DIRECTOR(A) DEL
PROYECTO
INSTITUCIÓN(ES)
BENEFICIARIA(S)
EMPRESA Y OTRAS
ENTIDADES ASOCIADAS
VECTORES ADENOVIRALES PARA LA TERAPIA GÉNICA EN EL
TRATAMIENTO DEL ALCOHOLISMO
D08I1051
JUAN ALFONSO ASENJO DE LEUZE
UNIVERSIDAD DE CHILE
LABORATORIO RECALCINE S.A.
IGLOO ZONE CHILE S.A.
1.2 Ejecución del proyecto
FECHA DE TOMA DE RAZON
POR LA CONTRALORÍA
GENERAL DE LA REPÚBLICA
DURACIÓN CONTRACTUAL
FECHA EFECTIVA DE INICIO
FECHA EFECTIVA DE
TÉRMINO
DURACIÓN EFECTIVA
15/12/2009
36
29/12/2009
29/06/2013
42
1.3 Plan de Continuidad
Nombre Institución Beneficiaria
UNIVERSIDAD DE CHILE
Nombre Representante Legal
SERGIO ALEJANDRO
LAVANDERO GONZÁLEZ
Firma
Firma Electrónica
1.4 Tabla de Conformidad
Nombre Institución Empresa u Otra
Nombre Representante Legal
Entidad Socia
ALEJANDRO WEINSTEIN
LABORATORIO RECALCINE S.A.
CERENOVICH
IGLOO ZONE CHILE S.A.
Documento conformidad
Si
Si
II. Informe Ejecutivo
2.1 Resumen Ejecutivo
Versión en Castellano
El alcoholismo es una patología que causa alrededor del 5% de las enfermedades a nivel mundial, teniendo
un gran impacto a nivel social y económico. Solamente en Chile, se calcula que el 30% de la población sufre
algún problema asociado con la ingesta de alcohol, siendo los tratamientos para este problema altamente
insatisfactorios y sin resultados efectivos. Sin embargo, este proyecto plantea una alternativa muy atractiva
que consiste en un tratamiento genético que ha sido exitoso en distintos modelos de estudio como células in
vitro y ratas y que naturalmente está presente en el 20% de la población asiática que posee una mutación
enzimática involucrada en el metabolismo del alcohol. El alcohol es inicialmente metabolizado a
acetaldehído por la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) y este es luego oxidado a acetato por la enzima
aldehído deshidrogenasa (ALDH2). Una mutación genética que inhiba esta enzima produce una
acumulación de acetaldehído generando una fuerte reacción adversa (dolor de cabeza, nausea, vómitos,
taquicardia, hipotensión y/o rubor facial), que imposibilita el consumo de alcohol incluso en cantidades
ínfimas. Mediante el uso de vectores virales que codifican un RNA antisentido anti-ALDH2 se puede inhibir la
expresión génica de la enzima ALDH2, resultando en una terapia que ha sido efectiva y exitosa en modelos
in vitro y ratas. Esto permitió la investigación y el desarrollo de una terapia enfocada en crear un tratamiento
génico para su uso en humanos para inhibir el consumo de etanol por un largo período. A través de
investigación de vanguardia, se encontraron distintos sistemas de producción, parámetros de escalamiento,
purificación y optimización de la producción de vectores virales. Con esta información, se estableció que el
mejor vector viral es un serotipo de adenovirus con una baja respuesta inmunológica en la población chilena
y el mejor sistema de producción son células HEK-293 cultivadas en un medio libre de suero fetal bovino.
Una vez obtenidos estos parámetros, se realizó la transferencia tecnológica y del know-how desde nuestro
laboratorio al National Research Council de Canadá, en donde se realizó en conjunto el escalamiento y la
producción en escala piloto de adenovirus en condiciones GLP para posteriormente poder realizar las
pruebas preclínicas en India. Al ser un proyecto pionero a nivel mundial, se realizaron numerosas reuniones
con el Instituto de Salud Pública para comprender el estado actual de la legislación sobre terapia génica a
nivel nacional y concluir en la necesidad de realizar la producción de adenovirus en escala piloto en
condiciones GLP en un laboratorio internacional. A su vez, las pruebas preclínicas se llevaron a cabo en
orden con las regulaciones del Comité de ética del Servicio Metropolitano Norte y del Servicio Metropolitano
Central y bajo las directrices de la Food and Drug Administration (FDA). Estas pruebas fueron desarrolladas
en Sa-Ford, obteniéndose información primordial para continuar con la Fase I en pacientes humanos. La
contribución de la empresa Recalcine, que participó en el proyecto en forma activa y además con una
experiencia empresarial sólida en el área, tuvo un efecto fundamental que aseguró la culminación exitosa del
proyecto. Finalmente, el proyecto cumplió con éxito todos los objetivos propuestos y generó un gran avance
en el desarrollo de una terapia para el tratamiento del alcoholismo.
Versión en Ingles
Alcoholism is a pathology that causes about 5% of worldwide diseases, having a great social and economic
impact. Only in Chile, it is estimated that 30% of the population suffers some kind of problem associated with
alcohol intake, with the methods to address this problem highly unsatisfactory and without effective results.
However, this project presents a very attractive alternative consisting of a genetic treatment that has been
successful in different models such as in vitro cells, rats and naturally present in 20% of the Asian population
that has an enzymatic mutation involved in the metabolism of alcohol. Initially, alcohol is metabolized to
acetaldehyde by alcohol dehydrogenase (ADH) and this is then oxidized to acetate by the enzyme aldehyde
dehydrogenase (ALDH2). A genetic mutation that inhibits this enzyme results in an accumulation of
acetaldehyde generating a strong adverse reaction (headache, nausea, vomiting, tachycardia, hypotension
and/or flushing), which prevents alcohol intake even in small amounts. Using viral vectors encoding
anti-ALDH2 antisense RNA it is possible to inhibit ALDH2 gene expression, resulting in a therapy that has
been successful and effective in vitro and in rats. This made possible the research and development of a
therapy aimed at creating a genetic treatment for humans to inhibit ethanol consumption for a long period.
Through cutting edge research, different production systems and scaling and purification parameters of viral
vectors production were found. With this information, it was established that the best viral vector is a serotype
of adenovirus with low immune response in the Chilean population and the best production system are
HEK-293 cells grown in a free-serum media. Once these parameters were obtained, the technology and
know–how transfer was performed from our laboratory to the National Research Council of Canada, where
scaling and pilot scale production of adenovirus in GLP conditions were performed jointly to subsequently
initiate preclinical testing in India. Numerous meetings were held with the Institute of Public Health to
understand the current state of the law on national gene therapy and to conclude on the need for adenovirus
production at pilot scale under GLP conditions in an international laboratory. In addition, preclinical tests were
carried out in order with the regulations of the Ethics Committee of the North Metropolitan Service and
Central Metropolitan Service and under the guidelines of the Food and Drug Administration (FDA). These
tests were developed in SA-Ford, obtaining vital information to continue with Phase I in human patients. The
contribution of Recalcine, which participated in the project actively with solid business experience in the area,
had a crucial effect which ensured the successful completion of the project. Finally, the project successfully
met all objectives and created a breakthrough in the development of a therapy for the treatment of
alcoholism.
2.2 Cuadro De Sintesis de Resultados y Objetivos
Objetivos Generales
Nombre Objetivo
Descripción
Objetivos Específicos
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Investigar el desarrollo y la producción eficiente de la tecnología de
producción de vectores para terapia génica en general y de vectores para la
terapia génica del tratamiento del alcoholismo.
El alcoholismo es una adicción que causa problemas sociales y
económicos muy serios. En humanos, más del 90% del etanol ingerido es
eliminado en el hígado. El etanol es inicialmente metabolizado a
acetaldehído principalmente por la deshidrogenasa alcohólica (ALDH) y el
acetaldehído producido es luego oxidado a acetato por la deshidrogenasa
aldehídica (ALDH2). Una mutación del gen que codifica para la aldehído
deshidrogenasa mitocondrial (ALDH2) puede producir la protección contra
el abuso del alcohol y el alcoholismo. Personas que poseen esta mutación
y por lo tanto no pueden degradar el acetaldehído a acetato, muestran un
marcado aumento en la concentración de acetaldehído en la sangre cuando
consumen etanol, lo que lleva a una fuerte reacción (dolor de cabeza,
nausea, vómitos, taquicardia, hipotensión, rubor facial) que impide el
consumo de alcohol en forma dramática. Una alternativa muy atractiva
consiste en un tratamiento genético con objetivos similares. Esta alternativa
consiste en una inhibición de largo plazo del consumo de etanol reduciendo
los niveles de la ALDH2 mediante la administración de vectores que
codifiquen la molécula anti-aldh2 RNA antisentido que inhiben la expresión
génica del gen aldh2. Es posible obtener una inhibición del consumo de
etanol por un largo período mediante la administración “in vivo” del sistema
del adenovirus (AdV) con el gen antisentido anti-aldh2.
Obtener sistemas celulares para la producción de vectores Adenovirales
Evaluar distintos sistemas celulares para la síntesis y producción de
vectores Adenovirales
Desarrollar Vectores y las composiciones y funciones más eficientes para
terapia génica
Evaluar el tipo de vectores y las composiciones y funciones más eficientes
para realizar la infección de células y la transferencia de información
genética.
Optimizar la producción de virus (vectores), escalamiento
Optimizar la producción de virus (vectores) en los sistemas seleccionados,
escalamiento.
Construcción de un laboratorio tipo GMP
Construcción (adaptación) de un laboratorio (facility) tipo GMP
Escalamiento y fabricación de vectores en laboratorio GMP
Escalamiento y fabricación de vectores en laboratorio GMP para pruebas
Fase I
Obtener Sistemas para tratamiento con vectores, aprobaciòn del Protocolo
Formulación de sistemas para tratamiento con Vectores Diseño de
protocolos. Evaluación y aprobación del protocolo.
Realizar Pruebas (iniciales) Fase I en pacientes
Pruebas (iniciales) Fase I en pacientes
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Tipo
Nombre
Descripción
Descripción del Logro
Evaluar métodos alternativos para realizar la transferencia de información
genética
Evaluación e investigación de métodos alternativos para realizar la
transferencia de información genética a las células objetivo.
Diseñar Unidad Transferencia y Negocios
Diseño Unidad de Transferencia y Negocios
RESULTADO
Resultado de Producción
Formulacion de sistemas para tratamiento con vectores adenovirales. Diseno de
pr
Formulación de los sistemas a ser utilizados para tratamiento de pacientes.
Protocolos adecuados para ser utilizados en pacientes en Fase I. Tener estos
protocolos aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Chile.
Los estudios para la realización de un estudio pre-clínico para la terapia génica
contra el alcoholismo estan encargados al Instituto Butantán, Sao Paulo, Brasil.
Estos estudios se enmarcan dentro de regulaciones internacionales y serán
llevados a cabo en colaboración con la Dra. Luciana Leite en el Instituto
Butantán, de vasta experiencia en este tipo de experimentos. Con la
colaboración del Instituto de Salud Pública, se espera llevar a cabo un análisis de
estos estudios con el fin de obtener resultados de relevancia para proponer los
primeros estudios en pacientes a futuro. Debido a que las pruebas preclínicas se
realizarán en el Instituto Butantan en Brasil, la aprobación de protocolo se
efectuará con el Comité de Bioética de este Instituto y no será necesaria la
aprobación por parte del Comité de Bioética de la Universidad de Chile.
Referencia Bibliográfica
Tipo
Nombre
Descripción
Descripción del Logro
RESULTADO
Resultado de Producción
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Una estrategia del crecimiento de las células y la producción de los vectores
adenovirales seleccionados con características óptimas para la transferencia
genética a pacientes incluyendo el diseñar del medio de cultivo y las condiciones
optimas para la producción de células y luego de adenovirus y maximización de
su producción, la lisis celular, la separación de las células mediante
centrifugación y finalmente la purificación de los adenovirus mediante
cromatografía. /n
Le estrategia de crecimiento celular y producción de vectores virales resultó en
un proceso que posee considerables ventajas sobre los métodos actualmente
utilizados. La purificación a través de cromatografía continua de intercambio
iónico utilizando la resina Q-Sepharose XL, se tradujo en un proceso rápido,
replicable y escalable. Esto resulta una ventaja si se compara con los métodos
tradicionales de purificación de virus a nivel laboratorio, que son sumamente
caros y complejos.
Referencia Bibliográfica
Tipo
Nombre
Descripción
Descripción del Logro
RESULTADO
Resultado de Producción
Fabricacion de vectores en el laboratorio GMP para pruebas en Fase I.
Fabricación de vectores (adenovirus) en el laboratorio GMP para producir los
vectores a ser utilizados primero en las pruebas en ratas alcohólicas y luego en
pacientes en las pruebas clínicas Fase I.
Se realizó la transferencia del know-how desde nuestro laboratorio al National
Research Council de Canada con la colaboracion del equipo del laboratorio del
Dr Amine Kamen. De esta forma se realizó la producción de adenovirus en
condiciones GLP. La concentracion final, despues de la purificacion es de
2x10^12 vp/ml.
Referencia Bibliográfica
Tipo
Nombre
Descripción
RESULTADO
Resultado de Producción
realizacion pruebas preclinicas
Ejecutar pruebas de toxicidad en ratas para evaluar la dosis a utilizar en
pacientes en las pruebas de fase 1.
Descripción del Logro
En base a los hallazgos de la prueba “Single Dose Intravenous Toxicity Study of
Adenovirus Type 5 in Wistar Rats” con 14 días de observación, se encontró que
la dosis máxima tolerada de adenovirus tipo 5 en ratas Wistar es mayor que 1,2
10e12 partículas de virus en ratas macho y mayor a 1,0 e12 partículas de virus
en ratas hembra. En base a los hallazgos de la prueba “28 Days Repeated Dose
Intravenous Toxicity Study of Adenovirus Type 5 in Wistar Rats” se pudo concluir
que el adenovirus se tolera bien en el sitio de la inyección.
Referencia Bibliográfica
RESULTADO
Tipo
Resultado de Protección
Nombre
Patentes
Descripción
Tener una o más patentes internacionales en proceso de
patentamiento.
Resultados de Producción Fabricacion de vectores en el laboratorio GMP para pruebas en Fase
Asociados
I.
Descripción del Logro
No hay ninguna patente en proceso de patentamiento.
RESULTADO
Tipo
Nombre
Descripción
Resultado de Transferencia y Negocios
Unidad de Negocios y Transferencia de Tecnologia funcionando.
Tener una Unidad de Negocios y Transferencia de Tecnología funcionando
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Resultados de Producción
Fabricacion de vectores en el laboratorio GMP para pruebas en Fase I.
Asociados
Descripción del Logro
Tipo
Nombre
Descripción
La Unidad de Negocios se creo en la Universidad de Chile y esta ubicada en el
Centro de Ingenieria Bioquimica y Biotecnologia del Departamento de Ingenieria
Quimica y Biotecnologia, FCFM con fecha 30 de marzo, 2012. Esta Unidad esta
compuesta por el Director y la Directora Alterna del proyecto, la asesora ejecutiva
Paz Zañartu y por la doctora Araya, Sres Camhi y Vallejos de Recalcine, el vive
rector de I y D, U de Chile y el ejectuivo de FONDEF, Sr Norman.
RESULTADO
Resultado de Producción Científica (Ex "Otros")
Vectores con las composiciones y funciones apropiadas para realizar la infecc
Obtención de los vectores adenovirales mas atractivos para llevar a cabo la
transferencia de información genética dirigida a las células hepáticas humanas
(células objetivo) con el objetivo de realizar esta transferencia de la forma
optimizada, por un periodo de tiempo extendido (meses) y alterando al mínimo
otras células del organismo con el objetivo de producir el mínimo de efectos
colaterales en los pacientes.
Resultados de Producción
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Asociados
Descripción del Logro
Se selecionaron dos tipos de vectores virales: Adenovirus (Ad) y Adenoasociado
(AAV). Como vector adenoviral se escogió el Adenovirus serotipo 5, y como
vectores Adenoasociados se escogieron los serotipos 2, 7 y 8. Huesped
seleccionado: celulas HEK293F, HEK 293 T y HEK3F6 Para producir adenovirus
se utilizará el método de amplificación del vector viral mediante infección por el
mismo virus. Para producción de adenoasociados se utilizará el método de
tripletransfección de plasmidios para la formación de adenoasociados.
Referencia Bibliográfica
No existen referencias.
Tipo
Nombre
Descripción
RESULTADO
Resultado de Producción Científica (Ex "Otros")
Sistema celular optimo para la sintesis y produccion de vectores adenovirales
Sistemas celulares para el cultivo y producción de los mejores vectores
adenovirales a ser utilizados en la terapia génica. Células adaptadas a medio sin
suero y también a crecimiento en suspensión obteniendo densidades celulares
altas. Soluciones stock de virus estables almacenados a -80 ° C, obteniendo la
máxima consistencia en la producción a escala de los mismos.
Resultados de Producción
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Asociados
Descripción del Logro
Como primer resultado del proyecto, se realizó la adaptación de células HEK293
(líneas celulares 293-F, 293-T y 293-3F6) a un crecimiento en ausencia de suero
fetal bovino (SFB). La estrategia consistió básicamente en disminuir
gradualmente la concentración de SFB utilizando distintas formulaciones de
medios de cultivo (Excel, SFM4, CDM4, CD293 y formulaciones propias),
realizando 3-4 pasajes a las células en cada fase. De esta manera, fue posible
alcanzar una adaptación de las células creciendo en adherencia a un crecimiento
libre de suero, alcanzando una concentración de 0.9x106 cel/ml. Como paso
siguiente se realizó la adaptación a un crecimiento en suspensión, utilizando un
shaker con agitación orbital de 125 rpm. La metodología utilizada consistió en
dejar crecer las células por 3-4 días en matraces Erlenmeyer con 20 ml de medio
de cultivo. Transcurrido el tiempo de cultivo, las células fueron pasadas,
cambiando solamente la mitad del medio de cultivo. Finalmente, se obtuvo una
concentración de 1.3x106 cel/ml en células en suspensión. A través de la
información obtenida de las curvas de crecimiento de las células en adherencia y
suspensión en presencia/ausencia de suero, se utilizó el análisis de flujos
metabólicos (MFA) para entender el comportamiento de las células en cada fase
de cultivo. Se obtuvo valiosa información sobre la carga metabólica que
mantienen las células cuando no existe suero en el medio de cultivo, permitiendo
reducir al mínimo la producción de metabolitos que pueden tener un efecto
inhibidor sobre el crecimiento celular. Los resultados del MFA permitieron
determinar cómo los cambios en la composición de las células afecta la manera
de distribuir sus recursos de nutrientes durante el crecimiento celular y la
producción de virus. Por último, la optimización del medio de cultivo se realizó
utilizando distintas composiciones de medios y comparándolas con el caso base
DMEM/F12 con 10% de SFB. Utilizando cultivos fed-batch, se pudo aumentar en
un 300% la concentración celular llegando alrededor de 3x106 cel/ml.
Finalmente, se obtuvo una disminución considerable en los niveles de lactato,
metabolito inhibitorio del crecimiento.
Referencia Bibliográfica
No existen referencias.
Tipo
Nombre
Descripción
RESULTADO
Resultado de Producción Científica (Ex "Otros")
Evaluacion e Investigacion de metodos alternativos.
Valorización de los alternativos existentes para llevar a cabo la transferencia de
información genética a las células objetivo.
Resultados de Producción
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Asociados
Descripción del Logro
Como primera etapa del proyecto mediante una estrategia simple utilizando
herramientas de biología molecular se construyó el vector pscAAV-ALDHas, el
cual porta el gen para generar el RNA antisentido de la enzima ALDH, en un
vector del tipo scAAV, para su uso en terapia génica. Las etapas siguientes
consideraron realizar mejoras al vector pscAAV-ALDHas, con el fin de disminuir
su inmunogenicidad y aumentar la eficacia de la terapia. Luego se produjo en
células HEK293 el virus scAAV y se comparo con la terapia tradicional con
vectores AAV.
Referencia Bibliográfica
No existen referencias.
RESULTADO DE PRODUCCIóN
Categoría
Cantidad Lograda
4
Proceso
RESULTADO DE PROTECCIóN
Categoría
Patente
Cantidad Lograda
1
RESULTADO DE TRANSFERENCIA Y NEGOCIOS
Categoría
Cantidad Lograda
Unidad de Negocios en la Institución
1
RESULTADO DE PRODUCCIóN CIENTíFICA (EX "OTROS")
Categoría
Cantidad Lograda
Publicación
2
Tesis o Proyecto de título
1
2.3 Informe financiero a la fecha de término
Montos
Comprometidos
según Convenio
por fuente de
financiamiento
Monto Girado
por Fondef
Gastos
financiados por
%
fuente de
financiamiento
356.400.000
350.353.319
350.085.874
UNIVERSIDAD DE CHILE
373.496.000
No Aplica
405.840.933
Empresas y otras Entidades Asociadas
285.940.000
No Aplica
Totales
1.015.836.000
350.353.319
FONDEF
33,41
%
Institución(es) Beneficiaria(s)
Monto por Reintegrar
Monto Reintegrado a FONDEF
Costo Final del Proyecto
(267.445)
1.047.566.235
38,73
%
27.86
291.906.873
%
1.047.833.680 100 %
2.4 Autoevaluación de la Ejecución del Proyecto
El(la) Representante Institucional de cada Institución Beneficiara
UNIVERSIDAD DE CHILE
Una vez ejecutado el proyecto podemos decir que resultados obtenidos han confirmado que su desarrollo
tecnológico es pionero en temas de terapia génica contra alcoholismo.
El(la) Director(a) del proyecto
Todos los objetivos del proyecto fueron cumplidos a cabalidad. Esto incluye la manufactura nivel GLP de la
vacuna adenovirus con el gen antisentido totalmente pionero en Chile, que se realizó vía “outsourcing” en el
National Research Council en Canadá, con tecnología desarrollada totalmente en Chile y las pruebas
preclínicas (hechas en cientos de ratas). Aunque se tenía originalmente planeado hacer estas dos
actividades en Latinoamérica (en el Instituto Butantán en Sao Paulo) y se hicieron múltiples esfuerzos por
transferir esta tecnología desde los laboratorios de nuestro Centro al Instituto Butantán, finalmente esto no
fue posible. Las pruebas preclínicas se realizarán en un Centro de Alta Tecnología denominado SA - Ford,
en Mumbai. La transferencia de los viales con las dosis de vacuna a menos 80° C entre Montreal y Mumbai
se llevó a cabo en forma satisfactoria.
2.5 Propuesta de Continuidad de la(s) Institucion(es) Beneficiaria(s)
El proyecto ha tenido gran impacto ya que todos los resultados tanto de la manufactura de la vacuna a gran
escala, como las pruebas preclínicas realizadas fueron totalmente exitosas. Las acciones para materializar
los impactos y garantizar la continuidad de las líneas de investigación y consolidación del desarrollo de la
vacunas consisten en la presentación de una propuesta de proyecto en la Línea 2 de I+D Aplicada de Innova
Corfo para la realización de la manufactura de la vacuna a nivel GMP, la realización de la fase inicial de la
fase I, que sería hecha por primera vez en Chile (Hospital San Borja Arriaran) y el desarrollo de nuevos
vectores alternativos que pudieran ser más efectivos (y patentables). La infraestructura del know-how
generadas en el proyecto son únicos en el país y de gran valor para la Universidad de Chile lo que incluye al
consultor Dr. Mario Barro, originalmente con formación doctoral asociada a nuestro centro y hoy experto
mundial en USA en llevar a cabo la aprobación de la metodología a realizarse en la próxima fase I en la FDA
(Food and Drug Administration en USA). Claramente esto tiene y tendrá un impacto cuántico en la
valorización y posterior comercialización del proyecto y maximizará su impacto mundial. Esperamos que
éstas acciones tengan beneficios importantes tanto para la Universidad de Chile como para la empresa
Recalcine y los investigadores involucrados, todos altamente comprometidos con el proyecto como se ha
demostrado hasta ahora.
III. Informe De Gestión
3.1 Objetivos
3.1.1 Objetivo(s) General(es)
Nombre Objetivo
Descripción
3.1.2 Objetivos Específicos
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Investigar el desarrollo y la producción eficiente de la tecnología de
producción de vectores para terapia génica en general y de vectores para la
terapia génica del tratamiento del alcoholismo.
El alcoholismo es una adicción que causa problemas sociales y
económicos muy serios. En humanos, más del 90% del etanol ingerido es
eliminado en el hígado. El etanol es inicialmente metabolizado a
acetaldehído principalmente por la deshidrogenasa alcohólica (ALDH) y el
acetaldehído producido es luego oxidado a acetato por la deshidrogenasa
aldehídica (ALDH2). Una mutación del gen que codifica para la aldehído
deshidrogenasa mitocondrial (ALDH2) puede producir la protección contra
el abuso del alcohol y el alcoholismo. Personas que poseen esta mutación
y por lo tanto no pueden degradar el acetaldehído a acetato, muestran un
marcado aumento en la concentración de acetaldehído en la sangre cuando
consumen etanol, lo que lleva a una fuerte reacción (dolor de cabeza,
nausea, vómitos, taquicardia, hipotensión, rubor facial) que impide el
consumo de alcohol en forma dramática. Una alternativa muy atractiva
consiste en un tratamiento genético con objetivos similares. Esta alternativa
consiste en una inhibición de largo plazo del consumo de etanol reduciendo
los niveles de la ALDH2 mediante la administración de vectores que
codifiquen la molécula anti-aldh2 RNA antisentido que inhiben la expresión
génica del gen aldh2. Es posible obtener una inhibición del consumo de
etanol por un largo período mediante la administración “in vivo” del sistema
del adenovirus (AdV) con el gen antisentido anti-aldh2.
Obtener sistemas celulares para la producción de vectores Adenovirales
Evaluar distintos sistemas celulares para la síntesis y producción de
vectores Adenovirales
Desarrollar Vectores y las composiciones y funciones más eficientes para
terapia génica
Evaluar el tipo de vectores y las composiciones y funciones más eficientes
para realizar la infección de células y la transferencia de información
genética.
Optimizar la producción de virus (vectores), escalamiento
Optimizar la producción de virus (vectores) en los sistemas seleccionados,
escalamiento.
Construcción de un laboratorio tipo GMP
Construcción (adaptación) de un laboratorio (facility) tipo GMP
Escalamiento y fabricación de vectores en laboratorio GMP
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Nombre Objetivo
Descripción
Escalamiento y fabricación de vectores en laboratorio GMP para pruebas
Fase I
Obtener Sistemas para tratamiento con vectores, aprobaciòn del Protocolo
Formulación de sistemas para tratamiento con Vectores Diseño de
protocolos. Evaluación y aprobación del protocolo.
Realizar Pruebas (iniciales) Fase I en pacientes
Pruebas (iniciales) Fase I en pacientes
Evaluar métodos alternativos para realizar la transferencia de información
genética
Evaluación e investigación de métodos alternativos para realizar la
transferencia de información genética a las células objetivo.
Diseñar Unidad Transferencia y Negocios
Diseño Unidad de Transferencia y Negocios
3.2 Resultados
Tipo
Nombre
Descripción
Descripción del Logro
Tipo
Nombre
Descripción
RESULTADO
Resultado de Producción
Formulacion de sistemas para tratamiento con vectores adenovirales. Diseno de
pr
Formulación de los sistemas a ser utilizados para tratamiento de pacientes.
Protocolos adecuados para ser utilizados en pacientes en Fase I. Tener estos
protocolos aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Chile.
Los estudios para la realización de un estudio pre-clínico para la terapia génica
contra el alcoholismo estan encargados al Instituto Butantán, Sao Paulo, Brasil.
Estos estudios se enmarcan dentro de regulaciones internacionales y serán
llevados a cabo en colaboración con la Dra. Luciana Leite en el Instituto
Butantán, de vasta experiencia en este tipo de experimentos. Con la
colaboración del Instituto de Salud Pública, se espera llevar a cabo un análisis de
estos estudios con el fin de obtener resultados de relevancia para proponer los
primeros estudios en pacientes a futuro. Debido a que las pruebas preclínicas se
realizarán en el Instituto Butantan en Brasil, la aprobación de protocolo se
efectuará con el Comité de Bioética de este Instituto y no será necesaria la
aprobación por parte del Comité de Bioética de la Universidad de Chile.
RESULTADO
Resultado de Producción
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Una estrategia del crecimiento de las células y la producción de los vectores
adenovirales seleccionados con características óptimas para la transferencia
genética a pacientes incluyendo el diseñar del medio de cultivo y las condiciones
optimas para la producción de células y luego de adenovirus y maximización de
su producción, la lisis celular, la separación de las células mediante
centrifugación y finalmente la purificación de los adenovirus mediante
cromatografía. /n
Descripción del Logro
Tipo
Nombre
Descripción
Le estrategia de crecimiento celular y producción de vectores virales resultó en
un proceso que posee considerables ventajas sobre los métodos actualmente
utilizados. La purificación a través de cromatografía continua de intercambio
iónico utilizando la resina Q-Sepharose XL, se tradujo en un proceso rápido,
replicable y escalable. Esto resulta una ventaja si se compara con los métodos
tradicionales de purificación de virus a nivel laboratorio, que son sumamente
caros y complejos.
RESULTADO
Resultado de Producción
Fabricacion de vectores en el laboratorio GMP para pruebas en Fase I.
Fabricación de vectores (adenovirus) en el laboratorio GMP para producir los
vectores a ser utilizados primero en las pruebas en ratas alcohólicas y luego en
pacientes en las pruebas clínicas Fase I.
Descripción del Logro
Se realizó la transferencia del know-how desde nuestro laboratorio al National
Research Council de Canada con la colaboracion del equipo del laboratorio del
Dr Amine Kamen. De esta forma se realizó la producción de adenovirus en
condiciones GLP. La concentracion final, despues de la purificacion es de
2x10^12 vp/ml.
Tipo
Nombre
Descripción
RESULTADO
Resultado de Producción
realizacion pruebas preclinicas
Ejecutar pruebas de toxicidad en ratas para evaluar la dosis a utilizar en
pacientes en las pruebas de fase 1.
Descripción del Logro
En base a los hallazgos de la prueba “Single Dose Intravenous Toxicity Study of
Adenovirus Type 5 in Wistar Rats” con 14 días de observación, se encontró que
la dosis máxima tolerada de adenovirus tipo 5 en ratas Wistar es mayor que 1,2
10e12 partículas de virus en ratas macho y mayor a 1,0 e12 partículas de virus
en ratas hembra. En base a los hallazgos de la prueba “28 Days Repeated Dose
Intravenous Toxicity Study of Adenovirus Type 5 in Wistar Rats” se pudo concluir
que el adenovirus se tolera bien en el sitio de la inyección.
RESULTADO
Tipo
Resultado de Protección
Nombre
Patentes
Descripción
Tener una o más patentes internacionales en proceso de
patentamiento.
Resultados de Producción Fabricacion de vectores en el laboratorio GMP para pruebas en Fase
Asociados
I.
Descripción del Logro
No hay patentes en proceso de patentamieto.
RESULTADO
Tipo
Resultado de Transferencia y Negocios
Nombre
Unidad de Negocios y Transferencia de Tecnologia funcionando.
Descripción
Tener una Unidad de Negocios y Transferencia de Tecnología funcionando
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Resultados de Producción
Fabricacion de vectores en el laboratorio GMP para pruebas en Fase I.
Asociados
Descripción del Logro
Tipo
Nombre
Descripción
La Unidad de Negocios se creo en la Universidad de Chile y esta ubicada en el
Centro de Ingenieria Bioquimica y Biotecnologia del Departamento de Ingenieria
Quimica y Biotecnologia, FCFM con fecha 30 de marzo, 2012. Esta Unidad esta
compuesta por el Director y la Directora Alterna del proyecto, la asesora ejecutiva
Paz Zañartu y por la doctora Araya, Sres Camhi y Vallejos de Recalcine, el vive
rector de I y D, U de Chile y el ejectuivo de FONDEF, Sr Norman.
RESULTADO
Resultado de Producción Científica (Ex "Otros")
Vectores con las composiciones y funciones apropiadas para realizar la infecc
Obtención de los vectores adenovirales mas atractivos para llevar a cabo la
transferencia de información genética dirigida a las células hepáticas humanas
(células objetivo) con el objetivo de realizar esta transferencia de la forma
optimizada, por un periodo de tiempo extendido (meses) y alterando al mínimo
otras células del organismo con el objetivo de producir el mínimo de efectos
colaterales en los pacientes.
Resultados de Producción
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Asociados
Descripción del Logro
Tipo
Nombre
Descripción
Se selecionaron dos tipos de vectores virales: Adenovirus (Ad) y Adenoasociado
(AAV). Como vector adenoviral se escogió el Adenovirus serotipo 5, y como
vectores Adenoasociados se escogieron los serotipos 2, 7 y 8. Huesped
seleccionado: celulas HEK293F, HEK 293 T y HEK3F6 Para producir adenovirus
se utilizará el método de amplificación del vector viral mediante infección por el
mismo virus. Para producción de adenoasociados se utilizará el método de
tripletransfección de plasmidios para la formación de adenoasociados.
RESULTADO
Resultado de Producción Científica (Ex "Otros")
Sistema celular optimo para la sintesis y produccion de vectores adenovirales
Sistemas celulares para el cultivo y producción de los mejores vectores
adenovirales a ser utilizados en la terapia génica. Células adaptadas a medio sin
suero y también a crecimiento en suspensión obteniendo densidades celulares
altas. Soluciones stock de virus estables almacenados a -80 ° C, obteniendo la
máxima consistencia en la producción a escala de los mismos.
Resultados de Producción
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Asociados
Descripción del Logro
Como primer resultado del proyecto, se realizó la adaptación de células HEK293
(líneas celulares 293-F, 293-T y 293-3F6) a un crecimiento en ausencia de suero
fetal bovino (SFB). La estrategia consistió básicamente en disminuir
gradualmente la concentración de SFB utilizando distintas formulaciones de
medios de cultivo (Excel, SFM4, CDM4, CD293 y formulaciones propias),
realizando 3-4 pasajes a las células en cada fase. De esta manera, fue posible
alcanzar una adaptación de las células creciendo en adherencia a un crecimiento
libre de suero, alcanzando una concentración de 0.9x106 cel/ml. Como paso
siguiente se realizó la adaptación a un crecimiento en suspensión, utilizando un
shaker con agitación orbital de 125 rpm. La metodología utilizada consistió en
dejar crecer las células por 3-4 días en matraces Erlenmeyer con 20 ml de medio
de cultivo. Transcurrido el tiempo de cultivo, las células fueron pasadas,
cambiando solamente la mitad del medio de cultivo. Finalmente, se obtuvo una
concentración de 1.3x106 cel/ml en células en suspensión. A través de la
información obtenida de las curvas de crecimiento de las células en adherencia y
suspensión en presencia/ausencia de suero, se utilizó el análisis de flujos
metabólicos (MFA) para entender el comportamiento de las células en cada fase
de cultivo. Se obtuvo valiosa información sobre la carga metabólica que
mantienen las células cuando no existe suero en el medio de cultivo, permitiendo
reducir al mínimo la producción de metabolitos que pueden tener un efecto
inhibidor sobre el crecimiento celular. Los resultados del MFA permitieron
determinar cómo los cambios en la composición de las células afecta la manera
de distribuir sus recursos de nutrientes durante el crecimiento celular y la
producción de virus. Por último, la optimización del medio de cultivo se realizó
utilizando distintas composiciones de medios y comparándolas con el caso base
DMEM/F12 con 10% de SFB. Utilizando cultivos fed-batch, se pudo aumentar en
un 300% la concentración celular llegando alrededor de 3x106 cel/ml.
Finalmente, se obtuvo una disminución considerable en los niveles de lactato,
metabolito inhibitorio del crecimiento.
Tipo
Nombre
Descripción
RESULTADO
Resultado de Producción Científica (Ex "Otros")
Evaluacion e Investigacion de metodos alternativos.
Valorización de los alternativos existentes para llevar a cabo la transferencia de
información genética a las células objetivo.
Resultados de Producción
Sistemas de produccion y escalamiento de vectores virales optimizados.
Asociados
Descripción del Logro
Como primera etapa del proyecto mediante una estrategia simple utilizando
herramientas de biología molecular se construyó el vector pscAAV-ALDHas, el
cual porta el gen para generar el RNA antisentido de la enzima ALDH, en un
vector del tipo scAAV, para su uso en terapia génica. Las etapas siguientes
consideraron realizar mejoras al vector pscAAV-ALDHas, con el fin de disminuir
su inmunogenicidad y aumentar la eficacia de la terapia. Luego se produjo en
células HEK293 el virus scAAV y se comparo con la terapia tradicional con
vectores AAV.
3.3 Gestión del Proyecto
3.3.1 Plazos efectivamente utilizados v/s plazos considerados inicialmente
El proyecto se inició con fecha 29/12/2009 con un plazo de 36 meses debiendo terminar con fecha
29/12/2012, ejecutandose finalmente en 42 meses terminando el 29 de Junio de 2013. Se solicitó una
primera prórroga de cuatro meses hasta el 29 de abril de 2013. El objetivo central de la extensión de plazo
fue la necesidad de completar las pruebas pre clínicas, ya que éstas sólo podrán comenzar a realizarse a
principios del mes de enero de 2013 siendo ejecutadas por la empresa Ciallyx en Brasil. Posteriormete se
solicitó una nueva prórroga por 2 meses. Esto fue debido a que lamentablemente la empresa Ciallyx no tuvo
sus laboratorios listos para poder comenzar estas pruebas durante el mes de Enero 2013. Aunque esto
estaba programado en detalle, a ellos no les fue posible cumplir con los plazos. A raíz de este contratiempo
y, utilizando al agente internacional de Recalcine Philip Foster, nos fue posible contactar a una conocida
empresa en Mumbai, India, con capacidad de realizar estos estudios; Sa-Ford, Sanctuary for Research and
Development. A comienzos de Marzo DE 2013, logramos coordinar el envío de las muestras que fueron
fabricadas en Canadá bajo condiciones GLP, a Sa-Ford en Mumbai.
3.3.2 Gastos Ejecutados vs. Presupuesto inicial
EL MONTO COMPROMETIDO POR FONDEF FUE DE $356.400.000.- Y SE EJECUTARON $350.085.874.LA DIFERENCIA NO EJECUTADA ASCENDIO A $6.309.057.-CORRESPONDIENDO $4.769.057.- A
GASTOS COMUNES QUE NO SE UTILIZARON POR LA VICERRECTORIA DE INVESTIGACION, PARA
QUIEN ESTABAN DESTINADOS SIN POSIBILIDAD DE SER REITEMIZADOS. LA SUMA DE $1.540.000.CORRESPONDIENTES AL ITEM PROP. INTELECTUAL, MONTO QUE NO SE UTILIZO DEBIDO A QUE
NO SE INICIO PROCEDIMIENTO DE PATENTAMIENTO. Y 2 PEQUEÑOS SALDOS DE $3.000.- Y
$2.069.- CRRESPONDIENTES A FUNGIBLES Y GASTOS GENERALES. EN CONCLUSION PODEMOS
DECIR QUE SE MAXIMIZARON LOS RECURSOS DE FONDEF. EN RELACION A LOS RECURSOS
COMPROMETIDOS POR LAS ENTIDADES ASOCIADAS, RECALCINE E IGLOO ZONE, ASCENDENTES
A $279.940.000.- Y $6.000.000.- RESPECTIVAMENTE, PODEMOS DECIR QUE RECALCINE NOS AYUDÓ
CON UN APORTE EXTRAORDINARIO DE $5.966.873.- EL CUAL FUE IMPRESCINDIBLE PARA PAGAR
LAS PRUEBAS DE TOXICIDAD PUESTO QUE EL MONTO PRESUPUESTADO PARA ESTOS EFECTOS
SE INCREMENTÓ DEBIDO A LA ALZA DEL DOLAR Y A GASTOS DE TRASLADO DE LAS MUESTRAS
DESDE CANADA LO QUE NO STABA CONSIDERADO INICIALMENTE.
3.3.3 Participación de las instituciones y Empresas
En relación con la institución ejecutora, la Universidad de Chile, podriamos decir que su principal aporte fue
el apoyo de la unidad de proyectos de la facultad de ciencias fisicas y matemáticas en el aspecto contable
administrativo. Especial mención a la Jefa de la unidad que siempre estuvo dispuesta a colaborar y a la
analista designada al proyecto quien colaboró activamete y con iniciativa para resolver problemas de índole
contable y administrativo. En relación a las empresas asociadas, Laboratorios Recalcine e Igloo Zone, estas
tuvieron un rol clave en las pruebas preclinicas (en ratas) que fueron realizadas en India en la empresa
SA-Ford, a la cual se contactó por medio de un agente de Recalcine. Además del contacto, esta empresa
realizó un aporte extraordinario al cmprometido de $6.000.000.- para obtener las pruebas de toxicidad cuyo
monto fue mayor que e presupuestado, y las cuales fueron imprescindibles para complementar los
resultados obtenidos.
3.3.5 Participación de las instituciones y Empresas
El(la) Representante Institucional de cada Institución Beneficiara
UNIVERSIDAD DE CHILE
Podemos decir que todos los objetivos iniciales del proyecto fueron cumplidos a cabalidad.
El(la) Director(a) del proyecto
Todos los objetivos del proyecto fueron cumplidos. Esto incluye la manufactura nivel GLP de la vacuna
adenovirus con el gen antisentido totalmente pionero en Chile, que se realizó vía “outsourcing” en el National
Research Council en Canadá, con tecnología desarrollada totalmente en Chile y las pruebas preclínicas
(hechas en cientos de ratas). Aunque se tenía originalmente planeado hacer estas dos actividades en
Latinoamérica (en el Instituto Butantán en Sao Paulo) y se hicieron múltiples esfuerzos por transferir esta
tecnología desde los laboratorios de nuestro Centro al Instituto Butantán, finalmente esto no fue posible. Las
pruebas preclínicas se realizarán en un Centro de Alta Tecnología denominado SA - Ford, en Mumbai. La
transferencia de los viales con las dosis de vacuna a menos 80° C entre Montreal y Mumbai se llevó a cabo
en forma satisfactoria.
IV. Informe CT y Económico Social
4.1 Negocios Tecnológicos y Productivos
4.2.1 Síntesis de las actividades realizadas en Transferencia Se creó la Unidad de Negocios en el Centro de
Ingeniería Bioquímica y Biotecnología del Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología, Facultad de
Ciencias Físicas y Matemáticas de la Universidad de Chile con fecha 30 de marzo, 2012. Se realizaron
varias reuniones de la unidad en las cuales participaron tanto el Jefe de Investigación y Desarrollo como el
Coordinador de Propiedad Industrial de Laboratorios Recalcine S.A. El perito en propiedad industrial informó
a la unidad que no era factible iniciar un procedimiento de patentamiento al menos hasta que no se
obtuvieran los resultados de las pruebas preclínicas en animales (ratas wistar). Cuando se obtuvieron los
resultados de las pruebas en animales, el proyecto ya había llegado a su término.
4.3 Impactos Producidos Y Esperados
4.3.1 Impactos económicos-sociales
El Estado y los particulares, se verían beneficiarios directamente, ya que los costos que ocasiona el
alcoholismo son muy altos siendo los principales los gastos en salud, policía, accidentes, destrucción de
activos y también la menor productividad del trabajador ya que cuando es un bebedor se producen
problemas, entre ellos la muerte prematura y ausentismo.
4.3.2 Impactos científicos-tecnológicos
La solución tecnológica resuelve el problema que existe actualmente por la falta de un tratamiento eficaz
para el alcoholismo. Los fármacos actualmente aprobados no son efectivos, el principal tratamiento en uso
hoy en día, es la droga Disulfiram, la cual no es efectiva por varios problemas: no es específica al hígado,
causa hipertensión, neuropatías motoras y es de administración diaria teniendo bajo cumplimiento por parte
del paciente. Esta solución tecnológica tiene como ventaja frente a los tratamientos actuales, que actúa
específicamente limitando posibles efectos secundarios, además se propone como un tratamiento de larga
duración, debido a que con la administración de sólo una dosis, es posible mantener el efecto por un periodo
de alrededor de 6 meses a un año.
4.3.3 Impactos Institucionales
Principalmente e impacto se concentra en la posibilidad de obtener la primera vacuna producida en Chile y
con un gran impacto mundial.
4.3.4 Impactos Ambientales
Esta tecnología tiene impactos ambientales positivos como disminuir los accidentes con resultado de muerte
o lesiones graves a personas, así como también evitar la destrucción de activos que se producen por actos y
delitos cometidos bajo lainfluencia del alcohol.
4.3.5 Impactos Regionales
El proyecto se desarrollara principalmente en la Región Metropolitana, en donde se llevaran a cabo los
estudios e investigaciones clínicas necesarias. Sin embargo, los beneficios tendrán carácter nacional debido
a que la nueva vacuna será aplicada a lo largo de todo el país. Más aun, el alcance de este proyecto
trasciende las fronteras nacionales, ya que el nuevo tratamiento será vendido y comercializado en otros
países. Produce impacto en toda las regiones del país de igua forma, benificiando a las regiones que tienen
una mayor incidencia en altos índices de alcoholización dela población sobretodo en los grupos de riesgo
como menores de edad y adolescentes.
V. Anexos