Clase 7 Secuenciación

3/22/2010
Iván Ferrer Rodríguez, PhD
Catedrático
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Se llevan a cabo en
secuenciadores automáticos
de AND.
No sigue ninguna regla
biológica.
Introduce los nucleótidos
en un orden
preseleccionado.
Tecnología barata, fácil y
rápida.
DeNOVA-5000HT
Figura 5.1
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El método de secuenciación
de Sanger aprovecha la
forma normal de la
replicación del ADN
Para extender la cadena de
ADN, usando la polimerasa
de ADN,
ADN debe haber
presente un grupo hidroxilo
en el carbono 3’ de la
desoxiribosa
La polimerasa usada no
puede tener actividad de la
exonucleasa de corrección
3’ Æ 5’
Fosfato
OH
HO
NH2
O
P
N
O
CH2
5’
4’
N
O
N
N
Base
Azúcar
3’
2’
OH
H
1’
3
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Los fragmentos se generan
al agregar pequeñas
cantidades de 2’ 3’
dideoxinucleótidos a la
reacción de secuanciacion
Ocurre una interrupción en
la polimerización cada vez
que son incorporados en la
cadena de ADN
Fosfato
OH
HO
NH2
O
P
N
O
N
CH2
5’
4’
Los 2’3’ dideoxinucleótidos terminan
la síntesis del ADN
O
N
N
Base
Azúcar
3’
2’
HOH
H
1’
2’3’-dideoxinucleótido
monofosfato
4
Pol.
3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’
Pol.
Pol.
Pol.
5’TTATCG
5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCATGA
5’TTATCGTACCATGACTAGA
5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA
Ya no
puedes!
Otra
vez!
No
De nuevo!
A que la!
5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCA
5’TTATCGTACCATGA
5’TTATCGTACCATGACTA
5’TTATCGTACCATGACTAGA
5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGA
5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA
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Todos los métodos actuales de secuenciación requieren que
en la separación de los fragmentos de ADN detecten
diferencias en longitud de una sola base
Esto se logra por una electroforesis ya sea en geles de
poliacrilamida o en capilares con polímeros líquidos
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Los productos de las 4
reacciones, cada una
conteniendo una pequeña
cantidad de uno de los
cuatro dideoxinucleótidos,
son cargadas en el gel y
sometidas a electroforesis
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddTTP
Como la polimerización es
sólo en dirección 5’Æa 3’,
los fragmentos más cortos
estarán en 5’ y los más
largos que se encontrarán
en la dirección 3’
Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope
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Sistema ABI Prism (ABI) de
terminadores fluorescentes
Big DyeTM y el instrumento
de electroforesis
multicapilar ABI 3730.
Secuencias mayores de
1000 pb por reacción,
dependiendo de la calidad y
la cantidad de muestra.
ABI ha desarrollado
colorantes fluorescentes
más sensibles, mejorado el
método de cargado de la
muestra y la electroforesis.
ABI Prism 3700
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Cuatro tintes que fluoresen a una longitud de onda distinta,
pero con el mismo impacto en la movilidad electroforética,
para marcar ya sea los prímeros o los nucleótidos que
terminan la reacción.
Si se usan los dideoxinucleótidos fluorados, la reacción de
secuenciación completa se realiza en un solo tubo.
tubo
En lugar de los geles de poliacrilamida, se emplea un solo
capilar con un polímero líquido que se remplaza al final de
cada corrida.
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El ABI Prisma 3730XL, representa la última generación de
equipos de secuenciación capilar automática.
El 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases
diarias.
Con
esta
C
t capacidad
id d ell genoma de
d una bacteria
b t i de
d 5,000,000
5 000 000
de pares de bases, puede ser totalmente secuenciado en un
mes.
El desarrollo más reciente es la piro-secuencia, que
incrementa en un orden de magnitud el número de bases
obtenidas por día.
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El ABI Prisma 3730XL es la última generación de equipos de
secuenciación capilar automática.
El 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases
diarias.
Con
C
esta
t capacidad
id d ell genoma de
d una bacteria
b t i de
d 5,000,000
5 000 000
de pares de bases, puede ser totalmente secuenciado en un
mes.
El desarrollo más reciente es la pirosecuenciación, que
incrementa en un orden de magnitud el número de bases
obtenidas por día.
◦ Secuenciación a gran escala – genomas completos
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Genoma
Secuenciación y alineamiento
de los insertos
Fragmentación
ATTCGCTGGCGGT
TTGCTGCAAAATTG
CGGTATTGCGCTTGCTGC
Refinamiento
clonación
ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG
Secuencia final
Plásmido
Genoteca del genoma
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En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran
escala del genoma de organismos eucariotas
Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos
multicelulares son:
◦ 1998 Caenorhabditis elegans - 8 x 107 pb - Nemátodo
◦ 2000 Homo sapiens - 3 x 109 pb - Humano
◦ 2000 Arabidopsis thaliana - 1.15 x 108 pb - Planta
◦ 2000 Drosophila melanogaster - 1.65 x 108 pb - Mosca
◦ 2002 Anopheles gambiae - 2.78 x 108 pb - Mosquito
vector de la malaria
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tcatctggtttgtcttatgcagcaaaaggtggatgtggtggagggaaatgtggataa
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ORF Finder
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/
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>gi|83286696|ref|XP_730274.1| thioredoxin reductase
[Plasmodium yoelii yoelii str. 17XNL]
MNSVLVSYTFIPKKYLKISKRYITRDSKIYGHFNTNKNIYFQRTYKFLNNINSIHSNCAIFFCNCRLLFS
RRFTILPSYSNTITCEKNILKNKSIKTMCNDNKRNPINDNFNVNDKKNNTQTNNIAIKEENMDNSNYDYD
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Blast
◦
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◦
◦
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Built Protein
Blast P
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