Genética y Biotecnología Ambiental

AREA DE GENETICA
FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES
Universidad Pablo de Olavide
GENETICA Y BIOTECNOLOGIA
AMBIENTAL
CURSO 2009-2010
PROFESORES QUE LA IMPARTEN:
FERNANDO ROMERO BALESTRA
IGNACIO FLOR PARRA
ORGANIZACION DEL CURSO
TEORIA Y PROBLEMAS
El curso de Genética y Biotecnología Ambiental estará dividido en cinco partes:
I.-ESTRUCTURA Y REPARTO DEL MATERIAL GENETICO
II.- FUNCION DEL MATERIAL GENETICO. LA GRAMATICA DE LOS GENES.
III.- ORIGEN Y HERENCIA DEL POLIMORFISMO
IV.- BIODIVERSIDAD: ORIGEN Y EVOLUCION
V.- INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA
Cada parte constará de las correspondientes clases teóricas, clases de problemas, exámenes y la
realización de prácticas. Además existen otras actividades de carácter voluntario, como la ayuda en la
realización de estas prácticas, y la realización de un trabajo escrito.
El curso consta de dos parciales. Cada parcial se califica sobre 10 puntos: 8 del examen parcial, 1 de los
exámenes cortos mensuales y 1 de la serie de problemas. Cada mes se realizará un examen que consistirá
en un problema acerca del contenido impartido en las clases correspondientes. Este examen, con una
duración de 45 minutos, se corregirá en los 15 minutos siguientes mediante la elección de un alumno cuya
respuesta sea correcta. La suma de las calificaciones obtenidas en los exámenes de un parcial contribuirá
en 1 punto a la nota de dicho parcial. Si el alumno que ha presentado una solución correcta al problema es
incapaz de razonar la respuesta y los contenidos necesarios para llegar a ella, perderá todos los puntos de
problemas del parcial. Los problemas de las series se entregan al alumno durante las clases de la sección
correspondiente y se entregarán las respuestas el día que se acuerde. La puntuación máxima a conseguir
con la serie de problemas en cada parcial es de 1 punto. La asistencia a la corrección de la serie es
obligatoria para todo aquel que quiera que se le puntúe. Los problemas se resolverán por un alumno
escogido al azar entre los que entregaron las soluciones en horario de prácticas en un día acordado por
profesores y alumnos. Si el alumno elegido es incapaz de razonar la respuesta y los contenidos necesarios
para llegar a ella, perderá el punto de la serie del parcial. El examen de cada parcial constará de
problemas y preguntas tipo test de teoría, puntuado sobre un máximo de 8 puntos.
La nota del parcial es la suma de la puntuación obtenida en exámenes y la obtenida en problemas. La nota
final será el resultado de la media de la nota de los 2 parciales, siendo imprescindible haber aprobado
cada uno por separado. El examen final de Julio se hará para los alumnos que tengan suspenso algún
parcial, o alumnos que habiendo aprobado quieran subir la nota. En este caso el alumno renunciará a la
nota del parcial en cuestión. El examen final constará de dos partes independientes correspondientes a los
dos parciales y no se tendrán en cuenta las notas de exámenes cortos ni de la serie de problemas por lo
que se evaluará sobre 10 puntos. En el examen de Septiembre no se tendrán en cuenta las notas de Junio
de exámenes ni de problemas, de modo que el alumno deberá examinarse de toda la asignatura.
PRACTICAS
A lo largo del curso se organizarán cuatro prácticas obligatorias, con dos sesiones cada una relacionadas
con el temario del curso. Los títulos de estas prácticas son:
1ª) Transformación, minipreparación y digestión de plásmidos.
2ª) Detección de bacterias contaminantes por PCR.
3ª) Análisis genético en levaduras: mutación y reversión
4ª) Polimorfismo genético.
Al final de cada sesión práctica se entregará un pequeño cuestionario acerca de su contenido, y su
corrección determinará el aprobado o no de la práctica. La no superación de tres de las cuatro prácticas
conllevará la no superación de la asignatura.
TRABAJOS ESCRITOS
Cada alumno podrá presentar a lo largo del curso un único trabajo escrito para subir nota (que no será
devuelto) sobre algún tema relacionado con la Genética; para ello podrá usar las revistas científicas
originales, preferentemente las siguientes: Cell, Nature, Science, Bioessays, Trends in Genetics, Trends in
Biochemistry, PNAS y EMBO Journal. En la biblioteca se encuentran números recientes de estas revistas.
En el caso de Trends in Genetics y PNAS además se encuentran on line accesibles a través de la página
web de la Universidad (sólo desde ordenadores de la Universidad), localizadas en la sección de revistas
electrónicas de la biblioteca (http://www.upo.es/serv/bib/revelec.html). También se puede realizar
una búsqueda en muchas revistas a la vez usando la base de datos conocida como medline
(http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html). Para algunos artículos este buscador permite
el acceso completo a todo el texto.
Las revistas anteriores están todas en inglés. Las revistas en español que pueden usarse son Investigación
y Ciencia, y Mundo Científico,
Una vez que el estudiante ha eligido el tema del trabajo y ha seleccionado la bibliografía, consultará con
el profesor que le indicará si estos son adecuados. Las referencias empleadas deberán ser citadas al
final del trabajo.
La extensión recomendada para el trabajo es de cinco a diez páginas mecanografiadas a doble espacio
(referencias aparte). No se considerarán los trabajos que no cumplan estas características.
El trabajo podrá recibir un máximo de 0.5 puntos. La puntuación se añadirá a la nota final y sólo tendrá
validez para aquellos alumnos que aprueben la asignatura en junio.
Se podrán entregar trabajos en otros formatos de tipo "powerpoint" o archivos multimedia
Los trabajos escritos se entregarán a los profesores de Genética; la fecha límite de entrega será el 11 de
MAYO.
La utilización de trabajos entregados en cursos anteriores o en otras asignaturas, así como la copia de
trabajos de internet contará de forma negativa en la calificación final
AYUDA EN LA PREPARACION DE PRÁCTICAS
Los alumnos con particular interés por la Genética pueden colaborar en la preparación de las prácticas
(hasta un máximo de 2 alumnos/grupo de práctica, elegidos por el profesor de prácticas según el
expediente y el interés por la genética de los candidatos). Estos alumnos tienen la posibilidad de contactar
más estrechamente con el laboratorio de investigación.
SESIONES DE VIDEOS CIENTIFICOS
Se dispone, como material didáctico complementario, de varios vídeos describiendo los principales
organismos que se utilizan como modelo en estudios genéticos. Estas sesiones se realizarán en las horas
habituales de clase siempre que sea posible y el desarrollo del temario lo permita.
CONSULTAS
Consulta sobre teoría y problemas (series): Se realizarán los lunes de 10,30-13,30 y de 16,30-19,30
previa cita, en el despacho nº 17, 2ª planta del Edif 24B. Los profesores se pueden localizar en el
teléfono 954-349382 o por email en las direcciones [email protected] (Ramón) y [email protected] (Ignacio)
Consulta sobre exámenes: Una vez realizado cada examen y se publiquen las notas, se convocará en el
tablón de anuncios de la licenciatura una cita para su corrección. Los alumnos que no estén de acuerdo
con su nota, deben acudir a la sesión de corrección para cualquier rectificación. No se admitirán
reclamaciones sobre las notas después del día de corrección.
AYUDA “ON LINE”
Durante el presente curso se empleará una página web accesible para todos los estudiantes matriculados
en la asignatura con material suplementario de consulta y vínculos a otras páginas web con información
sobre Genética. La dirección de esta página es:
http://camelot.upo.es:8900/webct/ticket/ticketLogin?action=print_login&request_uri=/webct/homearea/h
omearea%3F
y cada estudiante tendrá un nombre de usuario y una palabra clave para el acceso. Estos datos serán
facilitados por el CIC.
BIBLIOGRAFIA
No existe un único texto recomendable que cubra todo el programa con la extensión y detalle que
requieren algunos temas. Los textos citados a continuación son textos generales de genética, que pueden
servir de guía orientativa. :
Manuales
Klug W.S. Cummings, M.R. y Spencer C.A. 2006 “Conceptos de Genética”. Prentice Hall
2006. El texto más moderno y recomendable en castellano aunque su estructura es bastante clásica.
También tiene página web aunque está en inglés.
Griffiths y col. “Genética Moderna” Mc Graw Hill 2000. Muy actualizado. Tiene una
página web en inglés muy completa donde encontrar problemas y cuestiones para cada capítulo e
información suplementaria.
Tamarin, R.H. "Principios de Genética". Reverté. 1996. Texto general en español. Puede
estar un poco antiguo en algunos aspectos pero muy puntuales. Bueno en general.
Resto de textos recomendados
Brown T.A. “Genomes 2”. Bios scientific publishers 2002. Por su visión moderna de la
enseñanza de la Genética es probablemente el que más se aproxima al temario del curso sin que se pueda
considerar el texto oficial. En inglés.
Lewin B. Genes VII. Marbán, cop. 2003. Texto muy actualizado dedicado principalmente a
la biología molecular
Gardner, Simmons y Snustad. "Principios de Genética". Limusa Wiley 1998. Similar al
anterior pero sin página web
Russell. "Concepts of Genetics" Adison Wesley Longman. 1999. Muy actual aunque de
estructura clásica. En inglés. También tiene página web con información complementaria y ejercicios.
Jiménez y Jiménez. “Genética Microbiana”. Síntesis 1998. Cubre de forma muy completa y
accesible muchas lagunas presentes en el resto de textos de Genética sobre todo en lo referente a genetica
de microorgansmos y a las causas y consecuencias de las mutaciones.
Ayala y Kiger. “Genética moderna”. Omega, 1984. Aunque con enfoque algo anticuado su
sección de genética de poblaciones es muy buena.
Fontdevilla y Moya. “Introducción a la genética de poblaciones”. Síntesis. 1999. Magnífico
texto sobre genética de poblaciones. Con muchos problemas.
Lacadena. “Genética”. Síntesis 2000. Versión actualizada de un texto clásico de genética en
español.
Frankham, Ballou, Briscoe. “Introduction to conservation genetics”. Cambridge. 2002.
Uno de los mejores libros de genética de la conservación. En inglés
Jacqueline Étienne. “Bioquímica genética, Biología Molecular”. Masson. 2000. Trata de
una forma sencilla los principales temas de la biología molecular. En español.
Lewin “Genes”. Reverté, 1993. Describe muy bién y con gran profundidad los procesos
moleculares. Nivel alto. Para curiosos que quieran ampliar información.
Otros textos que también se pueden consultar son:
Suzuki y col. “Introducción al Análisis Genético”. Ed Interamericana, 1995
Puertas, M.J. "Genética, fundamentos y perspectiva". Interamericana 1992.
Sánchez-Monge y Jouvé “Genética”. Omega, 1989
Fincham. “Genética”. Omega, 1987
Strickberger “Genética”. Omega, 1985
La mayoría de los libros de teoría incluyen problemas al final de cada tema, con frecuencia resueltos.
Los libros dedicados a problemas son:
Benito Jimenez. 360 Problemas de Genética Resueltos Paso a Paso. Síntesis. 1999
Ochando. “Genética (Poblacional, evolutiva, cuantitativa) problemas”. EUDEMA, 1990
Lacadena y col.“Problemas de Genética”, 1988
Aleixandre "Problemas y cuestiones de genética médica". Salvat, 1989
Stanfield “Genética” Mc-Graw-Hill, 1988.
Rubio y col. “Problemas de Genética”. AKAL, 1982
También se pueden encontrar colecciones de problemas en la red, algunos de ellos con soluciones. La
mayor colección está mantenida por la Sociedad Española de Genética y es accesible en el URL:
http://seg.umh.es/index.html
Todas las actividades del curso, convocatorias de exámenes, calificaciones, prácticas, relación de
ayudantes de prácticas, etc, se realizan por escrito en el Tablón de anuncios y en la página web de la
asignatura.
PROGRAMA ABREVIADO DE CLASES TEORICAS
Tema 1.- Introducción a la Genética. De Mendel al Proyecto Genoma Humano
I.-ESTRUCTURA Y REPARTO DEL MATERIAL GENETICO
Tema 2.- Ciclo celular y La herencia del material genético.
Tema 4.- El texto del DNA.
Tema 3.- La replicación como herramienta científica. PCR y secuenciación
II.- FUNCION DEL MATERIAL GENETICO. LA GRAMATICA DE LOS GENES.
Tema 5.- La gramática de los genes (Transcripción)
Tema 6.- La semántica de los genes. Las proteínas, un lenguaje diferente (Traducción)
Tema 7.- Las proteínas como herramientas de la célula.
III.- ORIGEN Y HERENCIA DEL POLIMORFISMO
Tema 8.- Variaciones de un gen: polimorfismo heredable.
Tema 9.- Errores en la división. Mutaciones cromosómicas.
Tema 10.- La herencia de los alelos.
Tema 11.- Proteínas que colaboran.
Tema 12.- Genética cuantitativa.
Tema 13.- Análisis de la variabilidad genética en las poblaciones.
IV.- BIODIVERSIDAD: ORIGEN Y EVOLUCION
Tema 14.- Evolución de los genomas.
Tema 15.- Biodiversidad.
V.- INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA AMBIENTAL
Tema 16. Introducción a la ingeniería genética.
Tema 17. Ingeniería genética de organismos de interés.
Tema 18. Recursos genéticos para la biotecnología del medio ambiente.
Tema 19. Principales acontecimientos de la Genética: una visión histórica.
PROGRAMA COMPLETO DE CLASES TEORICAS
Tema 1.- Introducción a la Genética. De Mendel al Proyecto Genoma Humano. La visión clásica de
la Genética. Genes, genotipos y fenotipos. Diversidad en las poblaciones. Caracteres heredables y
adquiridos. Estabilidad de los caracteres heredables con las generaciones. Aparición de variantes
heredables. Evolución. La nueva Genética. El genomio como libro de recetas. Los proyectos genoma. La
generación de información sobre secuencias. La interpretación de las secuencias o cómo descifrar las
recetas. Genética inversa.
I.- ESTRUCTURA Y REPARTO DEL MATERIAL GENETICO
Tema 2.- La herencia del material genético. El ciclo del DNA. El DNA como material genético.
Organismos unicelulares y pluricelulares. Reproducción asexual y sexual. Mitosis y meiosis El ciclo
celular, copia y reparto del material genético: mitosis. La herencia del material genético: meiosis y
fecundación. Fases de la meiosis. Destino del DNA en la meiosis. Ciclos de vida. El ciclo celular de
bacterias y virus. Transferencia horizontal de información en procariotas. Necesidad de la duplicación del
DNA. Replicación del DNA bicatenario. Iniciación, elongación y terminación. Enzimas implicadas en la
copia de DNA. El problema de la replicación de los extremos en cromosomas lineales: Estructura y
función de los telómeros. Replicación del DNA circular.
Tema 3.- La replicación como herramienta científica. Síntesis artificial (in vitro): reacción de la
polimerasa en cadena (PCR). Lectura del DNA, secuenciación
Tema 4.- El texto del DNA. La información del DNA está escrita en su secuencia de nucleótidos. El
genoma como enciclopedia. Organismos más complejos tienen genomas más grandes. Organismos
modelo para el estudio de genomas. Procedimiento experimental para secuenciar un genoma completo.
Recursos informáticos. Implicaciones del análisis global del genoma de la levadura. El genoma humano.
La información de un genoma está encuadernada en volúmenes (cromosomas). El ciclo de los
cromosomas, niveles de compactación, de la interfase a la metafase Cariotipo. Análisis del cariotipo.
Partes de un cromosoma. Telómeros. Centrómeros. Estructura del cromosoma metafásico. Niveles de
condensación. Proteínas asociadas. Cromosomas artificiales. Estructura de la cromatina. Estructura del
nucleosoma. Eucromatina y heterocromatina. Genomas de bacterias y virus.
II.- FUNCION DEL MATERIAL GENETICO. LA GRAMATICA DE LOS GENES.
Tema 5.- La gramática de los genes. Otros ácidos nucleicos celulares. El RNA, un dialecto en el
lenguaje de los genes. Secuenciación del RNA. Los RNA son copia de zonas del genoma. El mapa físico
de los genes. FISH. En el genoma hay marcas que delimitan genes. Enzimología de la transcripción.
Iniciación, elongación y terrninación. Enzimas implicados. Maduración del RNA. RNA heterogeneo
nuclear. Los intrones y los exones. Mecanismo de escisión de intrones. Poliadenilación de mensajeros.
Precursores de los RNA de transferencia. Maduración de los precursores. Maduración del RNA
ribosómico.
Tema 6.- La semántica de los genes. Las proteínas, un lenguaje diferente. La piedra rosetta de la
célula, del DNA a la proteína. El diccionario genético. El cambio de lenguaje, la traducción. Enzimología
de la traducción, el ribosoma. Estructura y síntesis del aminoacil-RNA de transferencia. Estructura del
ribosoma. Iniciación de la traducción. Interacción codón-anticodón. Formación del enlace peptídico.
Terminación de la traducción. Pautas abiertas de lectura y su aplicación al análisis de genomas.
Tema 7.- Las proteínas como herramientas de la célula. Estructura de las proteínas. Niveles
estructurales. Función de las proteínas. Dominios y motivos funcionales. Relación estructura-función.
Enzimas. Proteínas estructurales. Proteínas reguladoras. Proteínas represoras e inductoras. El operón Lac.
El operón del triptófano. Promotores regulables eucariontes. Regulación de la transcripción. Expresión
integral del genoma, microarrays. Expresión diferencial. Estructura de un promotor regulable. Control
pretranscripsional: estados de condensación del DNA
III.- ORIGEN Y HERENCIA DEL POLIMORFISMO
Tema 8- Variaciones de un gen: polimorfismo heredable. Polimorfismos fenotípicos. Polimorfismo
genético. Polimorfismo molecular. Concepto de alelo. De la secuencia del gen a la función de las
proteínas: una interpretación molecular del fenotipo. Alteraciones hereditarias de los polipéptidos.
Consecuencias fenotípicas de estas alteraciones. Origen de las mutaciones. Mutaciones espontáneas e
inducidas. Mutágenos químicos. Mecanismo molecular de algunos mutágenos. Mutágenos físicos. Efecto
molecular de las radiaciones. Mecanismos de reparación. Fotoreactivación, reparación por escisión,
reparación por recombinación. Sistemas de reparación. Mutágenos biológicos, los transposones. La
mutación como herramienta de análisis biológico. Genómica funcional.
Tema 9.- Errores en la división. Mutaciones cromosómicas. Errores en la recombinación, alteraciones
estructurales. Deleciones. Duplicaciones. Inversiones peri y paracéntricas. Supresión de la recombinación.
Translocaciones. Fusión céntrica y disociación Errores en la disyunción, alteraciones numéricas.
Euplóides y aneuplóides. Segregación de alelos recesivos en aneuplóides. Auto y alopoliplóides.
Cromosomas homeólogos
Tema 10.- La herencia de los alelos. Análisis de pedigrí. Análisis en masa. Líneas puras. Aparición de
nuevas combinaciones de alelos. La recombinación y sus consecuencias. Genes ligados y genes
independientes. Interpretación molecular del mendelismo, herencia de un gen y de dos genes
independientes. Complementación, dominancia, recesividad. Herencia de genes en cromosomas sexuales.
Herencia de genes en cromosomas extranucleares. Ligamiento, recombinación molecular Mecanismo
molecular de la recombinación. Mapas genéticos: marcadores genéticos. Mapas físicos: marcadores de
DNA (RFLP, SSLP, SNP).
Tema 11.- Proteínas que colaboran. Rutas biológicas. Rutas metabólicas. División celular y
morfogénesis. Efecto de las mutaciones en las distintas rutas. Epistasias. Interpretación de las epistasias.
Tema 12.- Genética cuantitativa. Efecto fenotípico del ambiente. Caracteres continuos y discretos.
Distinción entre los componentes genético y ambiental. Selección artificial. Líneas puras. Herencia
poligénica. Número de genes implicados en un carácter continuo. Variación genética y ambiental.
Heredabilidad. Ventajas e inconvenientes de la medida de la heredabilidad. Métodos de estima de la
heredabilidad. Heredabilidad en diferentes poblaciones. Selección artificial en plantas y animales.
Herencia de caracteres continuos en el hombre. Herencia del color de la piel. Herencia de la inteligencia
Tema 13.- Análisis de la variabilidad genética en las poblaciones. Alelos de un gen en una especie. El
polimorfismo genético. Anemia falciforme. Estructura genética de las poblaciones. Ley de HardyWeinberg. Distribución geográfica e historia de los alelos. Factores que cambian las frecuencias alélicas.
Cambios en las frecuencias génicas y genotípicas por azar. Fijación alélica y desaparición de
heterocigotos. El efecto fundador. Consanguinidad y su medida. Autofecundación. Mutaciones
ventajosas, desventajosas y neutras. Mutaciones recurrentes y no recurrentes. Mutaciones reversibles e
irreversibles. Equilíbrio mutacional. Migración. Dinámica de la presión de migración. Tasa de migración.
Concepto y cuantificación de la selección. Selección contra un alelo recesivo. Contra un alelo dominante.
Mantenimiento del polimorfismo. Equilíbrio mutación-selección. Heterosis. Neutralismo y
Seleccionismo.
IV.- BIODIVERSIDAD: ORIGEN Y EVOLUCION
Tema 14.- Evolución de los genomas. El origen de los genomas. El origen de los genes. El origen de las
rutas biológicas. Duplicaciones, reordenaciones y divergencia de genes. El origen de la célula eucarionte.
La especiación. Mecanismos de aislamiento genético. El origen de las especies. El origen de la especie
humana. Reconstrucción de filogenias por análisis de secuencias. El reloj molecular. Arboles
filogenéticos. Interpretación molecular de la especiación.
Tema 15.- Biodiversidad. Interespecífica. Intraespecífica. Medida de biodiversidad. Conservación.
V.- INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA
Tema 16. Introducción a la ingeniería genética. Conceptos básicos e históricos de ingeniería genética.
La herramienta biológica: las bacterias. Métodos y técnicas básicas de ingeniería genética: Enzimas de
restricción, otros enzimas. Vectores de clonación: plásmidos, bacteriófagos, cósmidos, cromosomas
artificiales. Aislamiento y análisis de genes: construcción de genotecas (genotecas genómicas, genotecas
de expresión); clonación (complementación, PCR, hibridación de ácidos nucleicos, detección con
anticuerpos); análisis de expresión (Southern, Northern, Western, RT-PCR, hibridación in situ, proteínas
marcadoras). Análisis sistemático de la función. Genómica funcional. Modificación y expresión de genes
clonados en Escherichia coli : mutagénesis in vitro; sobrexpresión de proteínas o polipéptidos.
Tema 17. Ingeniería genética de organismos de interés. Ingeniería genética de microorganismos.
Transformación de levaduras. Expresión de genes heterólogos en levaduras. Ingeniería cromosómica.
Transferencia de genes en hongos filamentosos. Ingeniería genética de plantas. Cultivo de células
vegetales y plantas in vitro. Vectores de transformación en plantas. Técnicas de transformación y
regeneración de plantas transgénicas. Expresión en plantas de genes heterólogos. Genes de interés en la
biotecnología de plantas. Modificación genética de animales. Ingeniería génica "in vitro". Cultivos
celulares. Métodos de transferencia. Sistemas de selección. Vectores de expresión. Células embrionarias
totipotentes (ES). Modificación génica "in vivo". Transgenia en organismos modelo (ratón, Xenopus,
Caenorhabditis, Drosophila, pez cebra). Diagnóstico y tratamiento de enfermedades hereditarias.
Tema 18. Recursos genéticos para la biotecnología del medio ambiente. Tecnologías basadas en seres
vivos. Plagicidas biológicos. Biosensores. Organismos de interés comercial modificados genéticamente.
Genes de interés medioambiental. Biotransformación. Ingeniería genética de la biodegradación.
Aplicaciones al medioambiente. Implicaciones sociales de la modificación de DNA.
EPILOGO
Tema 19. Principales acontecimientos de la Genética: una visión histórica. Los guisantes de Mendel y
las moscas de Morgan. Las bacterias mutan espontáneamente. El DNA es el material genético. La doble
hélice. Genes que saltan en el maíz. La replicación del DNA es semiconservativa. El código genético. Las
enzimas de restricción. Invención de la PCR.
PROGRAMA DE CLASES PRÁCTICAS
1.- TRANSFORMACION, MINIPREPARACION Y DIGESTION DE PLASMIDOS
El objetivo de esta práctica es relacionar la incorporación de nuevo material genético por parte de
un organismo con la adquisición de nuevas características codificadas por el material genético
incorporado. Además se aprenderán técnicas de biología molecular comúnmente aplicadas en los
laboratorios.
De la misma forma que en la práctica anterior empleamos un termociclador para amplificar “in
vitro” (dentro de un tubo) un fragmento específico de DNA, en esta práctica emplearemos una
bacteria de laboratorio como herramienta biológica para de una forma sencilla, rápida, barata y
eficaz obtener una gran cantidad de copias de una molécula de DNA en un proceso “in vivo”
(dentro de una célula). Para ello, introducimos una molécula de DNA, (plásmido) en una bacteria
mediante un proceso conocido como transformación. Puesto que las bacterias que vamos a usar
no pueden captar moléculas de DNA presentes en una solución en su estado natural, tratamos las
bacterias con unos compuestos que abren poros en la membrana de la bacteria facilitando así la
entrada del plásmido, obteniendo lo que se conoce como bacterias competentes (susceptibles de
ser transformadas). Una vez abiertos estos poros, se provoca en las bacterias un choque térmico
que favorece aun más la entrada del DNA en las bacterias. La presencia en esta molécula de DNA
(plásmido) de un origen de replicación bacteriano (ORI) así como un marcador molecular de
resistencia a antibiótico (ampicilina) nos permite por un lado aumentar la cantidad de plásmido
dentro de la célula y por otro el poder detectar de una forma sencilla que bacteria ha sido
transformada, es decir que bacteria ha captado el plásmido. Seguidamente, un proceso de rotura
de las bacterias y precipitación selectiva de restos celulares nos permite purificar una gran
cantidad del plásmido que inicialmente introdujimos en las bacterias. Para determinar que
realmente el plásmido obtenido es el mismo del que partimos, llevaremos a cabo unos cortes en la
molécula de DNA obtenida, empleando enzimas de restricción (tijeras moleculares muy precisas
que reconocen secuencias especificas en la molécula de DNA y dan lugar a un corte también
específico) que darán lugar a un patrón de bandas con unos tamaños específicos. La comparación
de las bandas obtenidas tras cortar el plásmido purificado con las obtenidas al cortar el plásmido
original determinará la eficacia del sistema.
2.- DETECCIÓN DE BACTERIAS CONTAMINANTES POR PCR
El objetivo de esta práctica detectar la presencia de una bacteria contaminante en una muestra de
agua utilizando la técnica de la PCR(reacción en cadena de la polimerasa).
La técnica de la PCR está basada en el mecanismo de replicación del DNA de los organismos
vivos. Mediante este método se puede realizar decenas de ciclos de replicación in vitro a partir de
una DNA molde con la participación de unos oligonucleótidos que sirven de cebadores,
deoxinucleótidos trifosfato y una DNA polimerasa termoestable denominada Taq polimerasa.
La sensibilidad de esta técnica es tan grande que se puede obtener un alto número de copias de
una secuencia de DNA, partiendo de pocas moléculas.
La amplificación se consigue al realizar una serie de ciclos consistentes en: desnaturalización por
calor del DNA, hibridación de los oligos con sus secuencias complementarias y síntesis a partir de
los oligos con la polimerasa de DNA. Los productos de la extensión son también
complementarios y capaces de hibridar con los oligos en el siguiente ciclo. Así, en cada ciclo se
dobla la cantidad de DNA sintetizado en el ciclo previo. El resultado es una acumulación de
copias del fragmento de DNA en forma exponencial: R⋅2n (siendo R el número inicial de
moléculas de DNA molde y n el número de ciclos.
Esta técnica se aplica tanto en investigación (clonación de genes), como en el diagnóstico de
patologías genéticas en medicina forense y legal, así como en la detección de una amplia variedad
de agentes responsables de enfermedades infecciosas, en especial virus.
3.- ANALISIS GENETICO EN LEVADURAS: MUTACION Y REVERSION
El objetivo de esta práctica es el análisis del fenotipo de las cepas de levaduras silvestre y
cdc25-22 y el cálculo de la frecuencia de mutación espontánea e inducida con luz ultravioleta
de la mutación cdc25-22.
Para ello se realizará una mutagénesis física con luz ultravioleta (radiación no ionizante
comprendida entre 100-400 nm de longitud de onda).
La radiación u.v. induce la formación de dímeros de timina en el DNA, interfiriendo tanto en la
replicación como en la transcripción. Estos dímeros de timina pueden ser eliminados por la
enzima fotorreactivasa, perteneciente a un sistema de reparación del DNA: Sistema de
Fotoreactivación. Esta enzima se activa con luz visible y corrige los errores manteniendo la
secuencia original de nucleótidos.
Cuando estos dímeros de timina no han sido corregidos por el Sistema de Fotorreactivación y
ha comenzado la replicación del DNA la DNA polimerasa es incapaz de replicar un sustrato
que posee dímeros de timina, entonces se dispara el Sistema SOS, que consiste en una DNA
polimerasa que para poder completar la replicación replica las zonas que presentan dímeros
pero colocando nucleótidos al azar (introduciendo mutaciones).
En realidad, no es la luz ultravioleta la que introduce mutaciones, sino que son producidas por
el Sistema SOS de reparación.
A veces las mutaciones no son fácilmente detectables y resulta más fácil calcular la frecuencia
de reversión de una mutación preexistente. Debido a esto, realizaremos la mutagénesis en una
cepa de levadura S. pombe cdc 25-22 (que posee una mutación termosensible en el gen cdc25 y
como consecuencia es incapaz de crecer a 35ºC) y calcularemos la frecuencia a la que esta
mutación revierte.
4.- POLIMORFISMO GENETICO
El objetivo de esta práctica será la caracterización de polimorfismo génetico en poblaciones
humanas para un locus determinado.
Durante el desarrollo de la misma, partiremos de muestras de nuestra propia saliva y gracias a
la técnica de amplificación de la PCR podremos estudiar la presencia de una insercción alu
(secuencia de ADN transponible) en el cromosoma 16 de nuestra especie. Se conoce como el
locus PV92. Las posibilidades son 2, presencia o no de esta insercción, con lo que podremos
encontrar individuos homocigotos para la insercción, homocigotos para la no insercción y
heterocigotos.
El resultado de la amplificación por PCR de DNA de los alumnos será leido mediante una
electroforésis en gel de agorosa, debiendo aparecer bandas de 715 pb o bien 415 pb
dependiendo de la presencia de insercción alu o no.
El objetivo final es hacer un estudio poblacional de las frecuencias alélicas de las diferentes
versiones del locus PV92 dentro del conjunto de alumnos de la Pablo de Olavide que realicen
la práctica. Comprobar si esta población está en equilibrio de Hardy- Weinberg y compararla
con los datos de otros poblaciones del resto del mundo.