Tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE COLIMA
Maestría en Ciencias Fisiológicas con
especialidad en Fisiología.
“EFECTO DE LA GLIBENCLAMIDA SOBRE
LA SACUDIDA ÚNICA Y EL TÉTANOS EN LAS FIBRAS
MUSCULARES RÁPIDAS Y LENTAS DE POLLO”
TESIS QUE
PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
PRESENTA:
Q.F.B. ENRIQUE ALEJANDRO SÁNCHEZ PASTOR
ASESORES
DR. MIGUEL HUERTA VIERA
DRA. XÓCHITL A. R. TRUJILLO TRUJILLO
COLIMA, COLIMA, JUNIO DE 2002.
UNIVERSIDAD DE COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
Colima, Colima, a 14 de Junio de 2002,
DR. ALEJANDRO ELIZALDE LOZANO
COORDINADOR ACADÉMICO DE LA
MAESTRÍA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
PRESENTE.
En mi carácter de asesor le comunico que la tesis titulada: “Efecto de la
glibenclamida sobre la sacudida única y el tétanos en las fibras musculares rápidas y lentas
de pollo” que elaboró el Q.F.B. Enrique Sánchez Pastor para la obtención del grado de
Maestro en Ciencias con Especialidad en Fisiología fue leída por los sinodales y sus
comentarios fueron incorporados a la misma. Por lo tanto, se autoriza su impresión final a
fin de que puedan efectuarse los trámites pertinentes para la obtención del grado
académico.
Atentamente,
Asesor de la tesis
:!
CENTRO UNIVERSITARIO
DE
Av. 25 de julio 965, Colima, Colima, México, C.P. 28000, Apartado postal 199,
Tel. 01 (312) 316 ll 29, Ext. 47451, Ext. Fax 47452
UNIVERSIDAD DE COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
Colima, Colima, a 14 de Junio de 2002.
DR. ALEJANDRO ELIZALDE LOZANO
COORDINADOR ACADÉMICO DE LA
MAESTRÍA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
PRESENTE.
En mi carácter de asesor le comunico que la tesis titulada: “Efecto de la
glibenclamida sobre la sacudida única y el tétanos en las fibras musculares rápidas y lentas
de pollo” que elaboró el Q.F.B. Enrique Sánchez Pastor para la obtención del grado de
Maestro en Ciencias con Especialidad en Fisiología fue leída por los sinodales y sus
comentarios fueron incorporados a la misma. Por lo tanto, se autoriza su impresión final a
fin de que puedan efectuarse los trámites pertinentes para la obtención del grado
académico.
Atentamente,
.
Av. 25 de Julio 965, Colima, Colima, México, C.P. 28000, Apartado postal 199
Tel. 01 (312) 316 ll 29, Ext. 47451, Ext. Fax 47452
ÍNDICE
Página
RESUMEN.................................................................................................….........… 1
ABSTRACT………………………………………………………………………………… 2
INTRODUCCIÓN..........................................................................................….........
3
Aspectos Generales.........................................................................…........
3
Clasificación de las Fibras Musculares Esqueléticas...............................
4
Estructura de las Fibras Musculares Esqueléticas...................................
6
Composición de los Filamentos......................................................…....…. 9
Morfología de las fibras musculares esqueléticas lentas y rápidas.....… 12
Teoría de los filamentos deslizantes.......................................................... 12
Contracción muscular......................................................................…....… 13
Acople Excitación-Contracción.......................................…...…………..…. 14
Suma de contracciones...............................................................…............. 15
Fatiga Muscular............................................................................…............. 16
Fosfatos de alta energía..............................................................….........… 18
Canales Iónicos…........................................................................…........… 18
Canales K ATP.................................................................................…......….. 19
Función de los Canales K ATP en músculo..............................................… 22
OBJETIVOS.......................................................................................…..............…. 24
HIPÓTESIS……………........................................................................…................. 24
METODOLOGÍA.................................................................................…..............… 25
Material Biológico...................................................................…................. 25
Disección.........................................................................................…......... 25
Registro Mecánico..........................................................................…......... 25
i
Protocolo de Estimulación…………...……………………………………...… 26
Soluciones..................................................................….........................…. 27
Análisis de los Resultados........…............................................................. 27
RESULTADOS......…............................................................................................... 28
DISCUSIÓN….......................................................................................................... 40
CONCLUSIONES..................................................…............................................... 42
PERSPECTIVAS…………………………………………………………………………. 43
BIBLIOGRAFÍA..............................................................…...................................... 44
ii
RESUMEN
Se estudiaron los efectos de la glibenclamida sobre la sacudida y la tensión tetánica
en fibras musculares esqueléticas rápidas y lentas de pollo. Las sacudidas y los
tétanos fueron inducidos eléctricamente por estimulación única y mediante la
aplicación de trenes (50 Hz y 300 ms de duración) a los fascículos de fibras rápidas
del músculo PLD y a fascículos de fibras lentas del músculo ALD. En los fascículos
inmersos en solución salina, la aplicación de glibenclamida 100 y 150 µM produjo un
incremento en la tensión tetánica máxima en el ALD (6.32±2.10% y 27.32±9.89% vs
control, respectivamente); sin embargo, la tensión total solo incrementó con 150 µM
(10.22±5.74%). De la misma manera, la tensión máxima de la sacudida incrementó
(p<0.05) con ambas concentraciones de glibenclamida (4.32±0.84% y 41.63±0.48%,
respectivamente). En el PLD, la tensión total de las sacudidas incrementa (p<0.05)
con 100 y 150 µM de glibenclamida (11.29±0.65% y 14.09±1.68%), sin embargo, en
este músculo la tensión tetánica y la tensión máxima de las sacudidas no fueron
modificadas
por
la
glibenclamida.
Nuestros
resultados
indican
que
con
concentraciones mayores a 100 µM de glibenclamida aumenta la tensión en los
músculos lento y rápido no fatigados. El incremento en la tensión tetánica y la tensión
de las sacudidas en el músculo ALD y la tensión de las sacudidas en el PLD es
mayor a concentraciones altas de glibenclamida y a bajas frecuencias de
estimulación. La sensibilidad a la glibenclamida varía en los dos tipos de fibras
musculares.
1
ABSTRACT
The effects of glibenclamide on twitch and tetanic tension, in chicken fast and slow
skeletal muscle fibers were studied. Twitch and tetanus were electrically induced by
single stimulation and by applying trains (50 Hz for 300 ms) to fascicles of fast-twitch
fibers from PLD muscle and to fascicles of slow-twitch fibers from ALD muscle. In
fascicles immersed in a saline solution, application (from a stock of 2 mM) of
glibenclamide increased the maximum tetanic tension in ALD at 100 and 150 µM (by
6.32±2.10% and 27.32±9.89% vs control, respectively); however, total tension only
increased with 150 µM (10.22±5.74%). Likewise, maximum twitch tension increased
(p<0.05) with both concentrations (4.32±0.84% and 41.63±0.48%, respectively). In
PLD, twitch total tension was increased (p<0.05) with 100 and 150 µM glibenclamide
(11.29±0.65% and 14.09±1.68%), however, in this muscle, tetanic and maximum
twitch tension were not altered by glibenclamide. Results show that glibenclamide (>
100 µM) increases tension in unfatigued fast and slow muscles. The increase in
tetanic and twitch tension in ALD and the increase in twitch tension in PLD is larger
with high concentrations of glibenclamide and slow stimulation frecuencies.
Glibenclamide sensitivity is different in the two types of muscle fibers.
2
INTRODUCCIÓN
Aspectos Generales.El tejido muscular es el responsable de los movimientos corporales. Este tejido
está constituido por células alargadas (fibras musculares), cuyo origen es
mesodérmico.
Los músculos se dividen, de acuerdo con sus características morfológicas y
funcionales, generalmente en tres tipos: 1) esquelético, 2) cardiaco y 3) liso. El
músculo esquelético comprende a la gran masa de la musculatura somática; tiene
estrías transversales bien desarrolladas, no se contrae normalmente en ausencia de
estímulos nerviosos, carece de conexiones anatómicas y funcionales entre las fibras
individuales, presentan contracción rápida, vigorosa y usualmente se encuentra bajo
el gobierno de la voluntad (Ganong, 1992).
En la mayoría de los músculos cada fibra muscular está unida a una fibra
tendinosa de colágena y el conjunto de fibras tendinosas que unen a todas las fibras
musculares conforman a los tendones, los cuales posibilitan la inserción del músculo
al esqueleto (Figura 1). En un músculo, las fibras musculares están organizadas en
haces, envueltos por una membrana externa de tejido conectivo, llamada epimisio
del cual parten septos muy finos de tejido conectivo llamados perimisios que se
dirigen hacia el interior del músculo dividiéndolo en fascículos. Cada fibra muscular, a
su vez, está envuelta por una capa muy fina de tejido conectivo llamada endomisio.
Esta disposición del tejido conectivo no solo mantiene las fibras musculares unidas,
sino que también permite cierta libertad de movimiento entre ellas. Cada fibra
muscular presenta cerca de su centro una unión neuromuscular (placa motora
terminal).
La función de la mayoría de los músculos esqueléticos es mover una parte del
esqueleto en relación con otra. En un extremo, el músculo se encuentra fijo
frecuentemente por un tendón a un hueso más o menos estacionario. En el otro
extremo del músculo, el tendón de inserción está unido a un hueso vecino que
mueve una articulación existente entre los dos huesos cuando el músculo se acorta.
3
Figura 1.- Organización estructural y funcional del músculo esquelético
http://www.sci.sdsu.edu/Faculty/Paul.Paolini/ppp/lecture18/sld002.htm).
(Modificado
de
Clasificación de las Fibras Musculares Esqueléticas.Las fibras musculares normalmente son estimuladas a través del nervio para
generar un potencial de acción que se transmite a lo largo de su membrana celular. A
diferencia de las neuronas, las fibras musculares contienen proteínas contráctiles y la
contracción es activada por el potencial de acción.
Un solo potencial de acción causa una breve contracción seguida de
relajación, esta respuesta se denomina sacudida muscular (sacudida única). Al ser
estimuladas eléctricamente, las fibras musculares esqueléticas pueden o no
responder con una contracción. Las fibras que presentan sacudida se pueden dividir,
de acuerdo al curso temporal de ésta, en: 1) fibras de sacudida rápida (rápidas) y 2)
fibras de sacudida lenta (lentas). Las fibras de sacudida rápida se activan y relajan
rápidamente, tienen una alta velocidad máxima de acortamiento (V max) y utilizan la
energía rápidamente. Las fibras de sacudida lenta se activan y relajan lentamente,
tienen una baja Vmax y utilizan la energía lentamente (Rome, 1999). El curso temporal
de la sacudida que presentan las fibras lentas es de seis a ocho veces más lenta que
el curso temporal de la sacudida de las fibras rápidas (Page, 1969). Las fibras que no
4
responden a la estimulación eléctrica por no poseer el mecanismo generador del
potencial de acción (canales de Na + activables por voltaje), son llamadas fibras
tónicas, encontradas en los anfibios y en los músculos extraoculares de los
mamíferos (Kuffler y Vaughan-Williams, 1953). Las fibras tónicas son referidas
también como fibras lentas (Huerta, Muñiz, Trujillo y Marín, 1997).
Entre los músculos que generan sacudida rápida se encuentran, entre otros:
el Posterior Latissimus Dorsi de las aves, el Sartorio de los anfibios y el Exterior
Digitorum Longus. Entre los músculos de sacudida lenta: el Anterior Latissimus Dorsi
(ALD) de las aves y el Sóleo de mamíferos. Mientras que las fibras musculares
tónicas se encuentran abundantemente en los músculos extraoculares de los
mamíferos y en los músculos cruralis y piriformis de la rana. El músculo ALD de pollo
está compuesto exclusivamente de fibras lentas, mientras que el Posterior latissimus
dorsi (PLD) está compuesto de aproximadamente 90% de fibras rápidas (Hess, 1961;
Page, 1969).
Por otra parte, las fibras musculares esqueléticas pueden ser clasificadas de
acuerdo a sus propiedades metabólicas en 3 tipos: 1) oxidativas lentas (SO o tipo I),
2) glicolíticas rápidas (FG o IIb) y, 3) oxidativas-glicolíticas intermedias (FOG o tipo
IIA) (Figura 2). Las principales características de las fibras oxidativas lentas son:
diámetro pequeño, alto contenido de mioglobina, capilares y mitocondrias, y una baja
densidad de enzimas glicolíticas. Estas fibras son reclutadas aún durante actividad
de baja intensidad, por lo que son altamente aeróbicas para prevenir la formación de
productos anaeróbicos (ácido láctico), los cuales causan fatiga. Por lo que respecta a
las fibras glicolíticas rápidas, éstas tienen un diámetro mayor que el de las lentas,
tienen baja densidad de mioglobina, capilares y mitocondrias, pero tienen un alto
contenido de enzimas glicolíticas. Estos músculos utilizan energía muy rápido, por lo
que no puede ser mantenida aeróbicamente. Por lo tanto estos músculos utilizan el
metabolismo glucolítico casi exclusivamente, lo cual ocasiona que el músculo se
fatigue con rapidez. Estas fibras son las últimas en ser reclutadas por lo que son
utilizadas ocasionalmente. El tercer tipo de fibras (oxidativas-glicolíticas) presenta
una velocidad de sacudida rápida pero son relativamente resistentes a la fatiga
(Rome, 1999).
5
Figura 2.- Clasificación de las fibras musculares esqueléticas. A) Fibra lenta, intermedia y rápida. Las
fibras rápidas son de mayor diámetro y tienen bajo contenido de mioglobina, capilares y mitocondrias
B) Los tres tipos de fibras muestran diferente resistencia a la fatiga. (Modificado de
http://www.pys.bris.ac.uk/ugteach/ugindexm1_index/med1_nmj/nmj_lect/lecture6/M1_E3_16/sld014.ht
m).
Estructura de las Fibras Musculares Esqueléticas.Morfología:
El músculo esquelético también es llamado músculo estriado debido a que
posee estriaciones transversales que son causadas por las diferencias en los índices
de refracción que presentan los diferentes componentes de las fibras musculares.
Las bandas anisotrópicas (bandas A) poseen un alto índice de refracción con
respecto a las bandas isotrópicas (bandas I). En medio de la banda A hay una zona
más clara que la divide, llamada zona H. En el centro de esta zona se encuentra la
línea M. En medio de la banda I se localiza la línea Z que divide a esta banda en dos
partes que corresponden, cada una, a un sarcómero diferente. Esta línea es la que
limita a los sarcómeros sucesivos, que representan a las unidades estructurales y
funcionales del músculo.
En la regulación de la contracción intervienen cuatro diferentes estructuras
celulares:
1. La unión neuromuscular o placa motora terminal, es una región especializada de la
membrana plasmática (Figura 3).
2. La membrana plasmática o sarcolema, a través de la cual se propagan los
potenciales de acción, es la segunda membrana.
6
3. Pequeñas aberturas del sarcolema conducen a la red de túbulos transversos
(túbulos T), a nivel de la línea Z. Esta red define un espacio extracelular dentro de la
célula. La red de túbulos T rodea virtualmente a cada miofibrilla. Su función es
propagar la excitación eléctrica que viaja por el sarcolema hacia el retículo
sarcoplásmico, de tal manera que se establezca el acople entre la excitación y la
contracción del músculo.
4. El retículo sarcoplásmico, un sistema de membranas que conecta íntimamente con
los túbulos T (ver más adelante).
Figura 3.- Membranas del músculo esquelético. La membrana plasmática separa el espacio
extracelular del intracelular (mioplasma) y posee tres partes especializadas: la placa motora terminal,
el sarcolema y los túbulos transversos. El retículo sarcoplásmico es un sistema de membrana
particular que incluye un compartimiento intracelular que rodea a cada miofibrilla (Berne y Levy, 1992).
Miofibrillas:
Cada fibra muscular esta formada por cientos de miofibrillas que se extienden
a lo largo de la misma, estas estructuras son cilíndricas y presentan un diámetro de 1
a 2 µm. Estas miofibrilllas están constituidas por los sarcómeros, los cuales tienen
una longitud de 1.5 a 3.5 µm. Las miofibrillas están formadas por filamentos gruesos
y delgados. Los primeros están constituidos por miosina y los segundos por actina,
troponina y tropomiosina. Estos filamentos interactúan durante la formación de los
puentes cruzados (véase más adelante).
7
Retículo Sarcoplásmico:
El retículo sarcoplásmico (RS) es un sistema de membranas con
características fisicoquímicas semejantes a las de la membrana plasmática, pero que
no está en continuidad con ella. El RS es continuo en el sentido transversal de la
fibra, pero en el sentido longitudinal habitualmente solo es continuo a lo largo de un
sarcómero.
Se distinguen cuatro porciones en el RS: 1) las cisternas terminales, que
consisten en un ensanchamiento cercano a los túbulos T; 2) las cisternas
intermedias, que son ensanchamientos de menor diámetro que conectan a las
anteriores con el resto del RS; 3) los túbulos longitudinales, que se forman a partir de
las cisternas intermedias, y 4) la región fenestrada, formada por una serie de túbulos
conectados longitudinalmente y transversalmente a nivel de la zona H. Cada túbulo
del sistema T está situado entre dos cisternas del RS formando una estructura típica
llamada Tríada (Figura 4).
Figura 4.- Esquema de la relación del sistema
T y el Retículo Sarcoplásmico con los
elementos del Sarcómero. CT: Cisterna
Terminal; TT: Túbulos Transversos; RF:
Región Fenestrada; FD: Filamento Delgado;
FG: Filamento Grueso; S: Sarcómero; I: Banda
I; A: Banda A; H: Banda H. (Tomado de
Huerta, Muñiz, Trujillo y Marín, 1997).
El RS puede acumular Ca2+ y, a través de este mecanismo, regula la
concentración de Ca2+ del mioplasma. La máxima capacidad del RS para almacenar
Ca2+ en una célula viva está calculada en cerca de 1.5-3.9 mol/ml. De esta forma,
existe una significativa capacidad de reserva para la recaptura y el almacenamiento
de Ca2+. La membrana del RS contiene grandes cantidades de un complejo proteico
que bombea el Ca2+ de nuevo desde el mioplasma hacia el retículo sarcoplásmico,
acompañada por la hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP) (Figura 5). También se
8
ha encontrado una gran concentración de una ATPasa dependiente de Ca2+ y Mg2+
(bomba interna de Ca2+) la cual probablemente está relacionada con la recaptura de
Ca2+. Por otra parte se han descrito otros mecanismos que regulan los niveles de
calcio intracelular, como son los canales de calcio dependientes de voltaje, los que
podrían participar en la liberación de Ca2+, se sabe que estos son independientes de
la bomba de calcio.
2+
Figura 5.- Transducción de la señal y movilización del Ca del músculo esquelético. El paso de un
potencial de acción a través del sarcolema origina una despolarización ligera y gradual de la red de
túbulos T y un cambio momentáneo en la permeabilidad del retículo sarcoplásmico. Se produce un
2+
-7
pulso mioplásmico de Ca a medida que aumentan las concentraciones desde menos de 10 M hasta
-5
más de 10 M, y luego descienden rápidamente a valores de reposo debido al transporte activo de
retorno al RS (Berne y Levy, 1992).
Composición de los Filamentos.Los filamentos gruesos del sarcómero están formados por haces de moléculas
de miosina, que es una proteína capaz de hidrolizar trifosfato de adenosina (ATP).
Por su parte, los filamentos delgados contienen 3 proteínas: actina, tropomiosina y
troponina; estando en mayor proporción la actina. Ninguna de ellas posee actividad
ATPasa pero son capaces de modificar la capacidad enzimática de la miosina
(Huerta, Muñiz, Trujillo y Marín, 1997).
Filamentos Gruesos:
Miosina
Es una molécula proteica muy compleja con un peso molecular aproximado de
460,000 daltones. Tiene forma de bastón, presentando una proyección lateral y
9
globular en una de las extremidades (Figura 6). Cuando es sometida a proteólisis,
puede separarse químicamente por las enzimas tripsina y papaína en dos
fragmentos de meromiosina: uno ligero y otro pesado, que a su vez puede dividirse
enzimáticamente en los fragmentos S1 y S2. La meromiosina ligera está formada por
la mayor parte de la porción en bastón de la molécula y corresponde a las dos αhélices entrelazadas, mientras que la pesada corresponde principalmente a las
porciones globulares. Únicamente los fragmentos S1 conservan la capacidad de
hidrolizar al ATP, puesto que en estos sitios la molécula de miosina posee dos
lugares catalíticos de actividad ATPasa, cuya actividad requiere Ca2+ para su
activación y es inhibida por Mg2+. Las fibras lentas contienen una miosin-isoenzima
lenta de baja actividad ATPasa mientras que las fibras rápidas poseen una miosinisoenzima rápida de alta actividad ATPasa.
Figura 6.- Esquema de los componentes de los Filamentos Gruesos y Delgados. A) Componentes del
Filamento delgado: Troponina, Tropomiosina y monómeros de Actina. B) En los filamentos gruesos las
cabezas de miosina se unen a la actina para formar los puentes cruzados. La meromiosina ligera
corresponde a la cola y la pesada a las porciones globulares (Modificado de
http://www.sci.sdsu.edu/Faculty/Paul.Paolini/ppp/lecture18/sld010.htm).
Filamentos Delgados:
Actina
Son moléculas esféricas con un peso molecular de 43,000 daltones, se
presenta bajo la forma de estructuras largas y fibrosas (actina F), formadas por dos
cadenas de monómeros esféricos o globulares (actina G), doblados uno sobre el otro
(Figura 7). Cada monómero globular de actina G contiene una región donde se
puede unir la cabeza de miosina.
Para polimerizarse y formar largas cadenas de doble tira (actina F) se
requiere, por cada molécula de actina G añadida a la cadena de hidrólisis, de una
10
molécula de ATP, originando difosfato de adenosina (ADP) y fosfato inorgánico (P i).
La interacción entre las dos (actina y miosina) también requiere de la hidrólisis del
ATP, proceso que es efectuado por la ATPasa de la cabeza de miosina que es
activada por Ca2+.
Tropomiosina
Está formada por moléculas largas, que contienen cadenas de polipéptidos en
forma de α-hélice, tiene un peso molecular de 70,000 daltones. Actúa principalmente
como un soporte para las moléculas de actina y miosina. Es uno de los principales
componentes de la línea Z. La unión de la tropomiosina (Tm) a la actina F está
influenciada por interacciones entre la Tm y monómeros de actina, interacciones
entre las regiones de sobrelapamiento de moléculas de Tm a lo largo de la actina y
por otras proteínas como la troponina y la miosina que incrementan la unión.
Troponina
La troponina (Tn) es una proteína globular con una masa molecular de
aproximadamente 86,000 daltones. La Tn está compuesta de 3 subunidades:
troponina C (TnC) que se une al Ca2+, troponina I (TnI) se une a la actina e inhibe la
ATPasa actomiosina en una manera insensible a Ca2+, y la troponina T (TnT) que
une el comple jo Tn a Tm (Gordon, Homsher y Regnier, 2000). La troponina C es la
única proteína receptora al calcio. El complejo troponina-tropomiosina se encuentra
fijo uniformemente a lo largo de toda la longitud de los filamentos de actina F y
desempeña un importante papel en el mecanismo contráctil. La troponina es el único
sitio receptor para la contracción.
Figura 7.- Esquema de la estructura de los Filamentos Delgados. El complejo Troponina2+
Tropomiosina está fijo a lo largo de toda la longitud de la actina. El Ca se une a las moléculas de
troponina C (Gordon, Homsher y Regnier, 2000).
11
Morfología de las Fibras musculares esqueléticas lentas y rápidas.Las fibras musculares lentas difieren morfológicamente de las de sacudida
rápida en su estructura interna y en su inervación. Algunas de estas diferencias son
las siguientes: 1) Las fibras musculares lentas son multiinervadas por axones
motores delgados mientras que las fibras rápidas son inervadas por axones motores
gruesos; 2) las miofibrillas de las fibras rápidas están más o menos regularmente
separadas y son de igual tamaño, mientras que las miofibrillas de las fibras lentas no;
3) el retículo sarcoplásmico en las fibras rápidas es más abundante que en las fibras
lentas; 4) en las fibras lentas la línea Z tiene la forma de zig-zag; 5) ausencia de línea
M en las fibras lentas; 6) el sistema T de las fibras rápidas ocurre regularmente en
cada sarcómera, mientras que en las fibras lentas es virtualmente ausente o consiste
solo de elementos aberrantes; 7) las invaginaciones sarcolemales en las fibras lentas
son menos desarrolladas o ausentes; 8) las fibras lentas son inervadas por fibras
nerviosas motoras pequeñas, mientras que fibras nerviosas motoras grandes inervan
a las rápidas (Hess, 1970).
Teoría de los filamentos deslizantes.La teoría de los filamentos deslizantes propone que un músculo se acorta o
se alarga debido a que los filamentos gruesos y delgados se deslizan entre sí sin
cambiar su longitud. El motor molecular que conduce este proceso de acortamiento
es la acción de los puentes cruzados de miosina, los cuales cíclicamente se unen,
rotan y separan de los filamentos de actina con la energía provista por la hidrólisis de
ATP (Huxley, 1952).
Este deslizamiento ha sido sugerido por los estudios de contractilidad
realizados con el microscopio de contraste de fases y con microscopía de
interferencia, los cuales muestran que durante la contracción del músculo no hay
cambio en el ancho de las bandas A, mientras que la banda I decrece, llegando a
desaparecer en un estado de acortamiento máximo (Figura 8). Estos estudios
llevaron a postular la hipótesis de que durante el acortamiento los filamentos
delgados se deslizan sobre los filamentos gruesos en dirección de la línea M,
12
acercándose entre sí las líneas Z, mientras que la zona H puede desaparecer
cuando los filamentos de actina están en contacto en el centro de la sarcómera. Un
postulado importante de esta hipótesis es que la longitud de los filamentos
permanece constante durante todo el proceso de contracción (Bowman, 1984).
Figura 8.- Teoría de los filamentos deslizantes. Durante la contracción los filamentos delgados se
deslizan sobre los filamentos gruesos sin cambiar su longitud (Modificado de
http://www.med.mun.ca/med/courses/PrysePhillips/pnsnerve/sld007.htm).
Contracción Muscular.Dada la función del músculo de contraerse, la contracción implica un
deslizamiento de los filamentos contráctiles entre sí; pero debido a la presencia de
elementos elásticos y viscosos en serie con el mecanismo contráctil, es posible que
la contracción ocurra sin que la longitud de todo el músculo disminuya
apreciablemente. Tal contracción es llamada Isométrica (“igual medida” o longitud).
La contracción contra una carga constante, aproximación de los extremos del
músculo, es Isotónica (“igual tensión”).
En las contracciones isotónicas, tanto la magnitud del acortamiento como su
velocidad dependen de la carga impuesta a la fibra muscular. La velocidad máxima
de acortamiento está relacionada con la velocidad máxima de deslizamiento de los
miofilamentos y ésta a la vez con la velocidad de hidrólisis del ATP. Las fibras lentas
poseen una velocidad de acortamiento menor que la de las rápidas puesto que
contienen miosina con una actividad ATPásica más lenta.
13
Acople Excitación-Contracción.El acople excitación-contracción (Figura 9) es el mecanismo fisiológico por el
cual un estímulo eléctrico en el músculo inicia los eventos químicos, en la superficie
de la célula, que conducen a la liberación de Ca2+ intracelular y por último causa una
acción muscular (McArdle, 1996).
La despolarización de la membrana es transmitida a todas las fibrillas
presentes en la fibra muscular a través del sistema T. Esta despolarización dispara la
liberación de Ca2+ desde las cisternas terminales del retículo sarcoplásmico. El
incremento de Ca2+ inicia la contracción, mediante el deslizamiento de los filamentos
delgados sobre los filamentos gruesos.
Poco después de la liberación de Ca2+, el RS empieza a reacumularlo en sus
partes longitudinales a través del transporte activo difundiendo hacia las cisternas
terminales, donde es almacenado hasta que lo libera el siguiente potencial de acción.
Al disminuir la concentración de Ca2+ intracelular, la TnC libera los iones Ca2+ y se
separa de la TnI, con lo que la acción química recíproca entre la actina y la miosina
cesa y el músculo se relaja. Si el transporte de Ca2+ hacia el RS se inhibe, la
relajación no ocurre aunque no haya más potenciales de acción, la contracción
sostenida resultante se llama contractura.
De esta manera, el acople E-C es un proceso que en el músculo in vivo se
acompaña de varios eventos, estos incluyen: 1) la liberación de acetilcolina (ACh) de
las vesículas sinápticas, 2) el potencial de acción sarcolemal, 3) el flujo de Ca+2 del
interior del RS hacia el mioplasma, 4) el Ca2+ se une a la troponina, eliminando la
inhibición que previene a la actina de combinarse con la miosina, 5) de esta manera
la actina se combina con la miosina y genera fuerza, 6) el ATP se une a la miosina
rompiendo el complejo actina-miosina, 7) la acción de los puentes cruzados continúa
mientras la concentración de calcio permanece elevada, 8) el calcio mioplásmico es
resecuestrado por el RS a través de un proceso activo que requiere la hidrólisis de
ATP, y 9) de esta mane ra, la recaptura de Ca2+ reestablece la acción inhibitoria de la
troponina-tropomiosina causando la relajación del músculo.
14
Figura 9.- Secuencia esquemática de los principales eventos llevados a cabo durante la acción
muscular y la relajación (Modificado de McArdle, Katch y Katch, 1996).
Suma de contracciones.Durante una contracción fásica aislada (sacudida), el estado activo finaliza
rápidamente por la actividad secuestrante de calcio del RS. Por lo tanto, el estado
activo comienza a descender antes de que los filamentos tengan tiempo de
deslizarse lo suficiente como para estirar el componente elástico hasta un desarrollo
completo de la tensión. Por esta razón, en una sola contracción no se consigue toda
la tensión que el sistema contráctil es capaz de generar. Si llega un segundo
potencial de acción detrás del primero, antes de que el RS haya podido recuperar el
Ca2+ previamente liberado, los niveles de concentración de calcio en el sarcoplasma
se mantendrán elevados y el estado activo continúa (Eckert, 1994). De esta manera,
15
la estimulación repetida provoca una activación adicional de los elementos
contráctiles antes de que ocurra la relajación, y por consiguiente, una respuesta que
se agrega a la contracción ya presente. Este fenómeno es llamado suma de
contracciones. Con la estimulación rápidamente repetida ocurre una activación
iterativa antes de que se presente la relajación, por lo que las respuestas individuales
se fusionan en una contracción continua llamada tétanos o contracción tetánica
(Figura 10). El tétanos puede ser completo cuando no hay relajación entre los
estímulos o incompleto cuando hay periodos de relajación incompleta entre los
intervalos de estimulación (Ganong, 1992).
Figura 10.- Al estimular el músculo a frecuencias altas las contracciones se fusionan formando el
tétanos. PA: Potencial de acción (Berne y Levy, 1992).
Fatiga Muscular.La fatiga muscular ha fascinado a los fisiólogos gran parte del siglo 20. Ha
sido definida de varias maneras, pero quizá la definición más común es la propuesta
por Bigland-Ritchie y cols. (1984), en la cual la fatiga es una disminución en la
máxima capacidad del músculo para generar fuerza.
Otros autores definen a la fatiga como una reducción temporal en la fuerza
máxima durante la actividad muscular sostenida (Allen, Lännergren y Westerblad,
1995; Fitts, 1994; Westerblad, Lee, Lännergren y Allen, 1991). El grado de fatiga
varía considerablemente y está relacionada con el tipo de fibra, el patrón de
activación, la duración de la actividad contráctil y numerosos factores ambientales
(Williams, 1997). Varios factores parecen contribuir a la disminución de fuerza,
siendo los más relevantes: 1) reducción de la liberación de Ca2+ del RS, 2)
disminución en la sensibilidad de las miofibrillas al Ca2+ y 3) reducción en la tensión
máxima activada por Ca2+ (Fitts, 1994; Westerblad y cols., 1991).
16
Con la actividad intermitente repetida, la disminución inicial en la producción
de fuerza es debido a efectos sobre el aparato contráctil, y la posterior disminución
en la fuerza es debido a la reducción en la liberación de Ca2+ del RS, ambos
causados por los cambios metabólicos dentro del músculo (Allen y cols., 1995; Fitts,
1994).
Además de la pérdida de fuerza, la maquinaria contráctil de la fibra muscular
fatigada desarrolla tensión tetánica más lentamente que lo normal y se prolonga la
fase de relajación. Al mismo tiempo, suceden marcados cambios en la composición
química del citoplasma:
1. Acumulación de H+ y lactato por la ruptura del glucógeno muscular.
2. Aumento en fosfato inorgánico (P i ) y en ADP por el desdoblamiento de ATP
por la miosina y ATPasas de la membrana, y un aumento en fosfato diprotonado
debido al amortiguamiento del ácido láctico por el sistema bicarbonato/fosfato.
3. Caída en fosfocreatina, con poco cambio en ATP.
4. Aumento en la concentración de Ca2+, debido a una reducción de su bombeo
hacia el RS.
5. Una ganancia de agua, algo de esta en forma de vacuolas (McComas, 1996).
El pH ácido y las altas concentraciones de Pi por ejemplo, afectan la
producción de fuerza y la recaptura y liberación de Ca2+ por el RS.
Los efectos reductores de fuerza del H+ pueden ser producidos por varias
vías: a) interfiriendo con el ciclo de los puentes cruzados, b) reduciendo la
sensibilidad de la troponina al Ca2+, y c) inhibiendo la enzima fosfofructokinasa y de
esta manera haciendo la glicólisis más lenta.
Por otro lado existen 2 tipos de cambio en la concentración de fosfato en la
fatiga muscular. Primero, hay un aumento de fosfato inorgánico (P i) debido al
desdoblamiento de ATP por la ATPasa de la miosina (1 molécula de ATP es
hidrolizada durante cada ciclo del puente cruzado). Además el Pi proviene del
consumo de ATP por bombas iónicas en la membrana superficial (Na + -K+-ATPasa) y
en el RS (Ca2+-ATPasa). El segundo tipo de cambio en la concentración de fosfato
involucra la reacción buffer: HPO42- + H+
17
H2PO4-. Nosek y cols. (1987)
encontraron que un incremento en fosfato diprotonado a 20 mM reduce la fuerza en
un 50%. Debido a que esta concentración es similar a la observada en la fatiga, es
muy probable que la producción de fosfato diprotonado es un factor importante en la
pérdida de fuerza.
Fosfatos de alta energía.Los músculos rápidos contienen significativamente mayor contenido de ATP y
fosfocreatina (PCr) que los músculos de sacudida lenta. Los músculos rápidos en
promedio contienen 27 y 90 mmol/kg de peso seco de ATP y PCr, mientras que los
músculos lentos contienen 19 y 58 mmol/kg de peso seco, respectivamente. Para
evitar la fatiga deben ser mantenidos los niveles adecuados de ATP en los tejidos,
debido a que este sustrato es la fuente inmediata de energía para la generación de
fuerza por los puentes cruzados de miosina. El ATP también es necesario para el
funcionamiento de la bomba Na +-K+. Además, el ATP es un sustrato de la ATPasa
del RS y por lo tanto es requerido en el proceso de recaptura de Ca2+ por el RS (Fitts,
1994).
Canales Iónicos.Las células musculares, al igual que otros tipos de células excitables, son
capaces de responder a estímulos por medio de cambios eléctricos rápidos
generados en la membrana celular. Esta actividad eléctrica está determinada por el
movimiento de iones que atraviesan la membrana plasmática a través de sus
proteínas integrales con una alta selectividad a cierto tipo de ión, como por ejemplo:
Na+, K+ y Ca2+. Estas proteínas son conocidas como canales iónicos. El paso de
iones a través de los canales abiertos genera las corrientes iónicas, y éstas son las
responsables del potencial de acción.
En las células musculares esqueléticas han sido reportados varios tipos de
canales de K+. El principal canal de K+ en las células excitables (como las
α−motoneuronas y fibras musculares estriadas) que es responsable de la
18
terminación del potencial de acción, es llamado rectificador tardío debido al ligero
retardo para que el canal se abra en respuesta a la despolarización y a la forma de la
relación corriente-voltaje. Este canal permite el paso de iones Rb + y NH4 +, además
del K+. Es bloqueado por cationes como el Cs2+ y el Ba2+, y por el Tetraetilamonio
(TEA) (McComas, 1996).
Otro canal de K+ abierto por voltaje encontrado en músculo estriado tiene las
propiedades de un rectificador entrante, este canal se abre cuando el potencial de
membrana es más grande que el potencial de equilibrio del K+ y permite la entrada
neta de iones K + dentro de las fibras a favor de su gradiente eléctrico.
La mayoría de los otros canales de K+ son, al igual que los canales rápidos,
abiertos por voltaje, pero hay algunos que son activados por mensajeros
intracelulares. Dos de ellos son los canales abiertos por aumento en la [Ca2+] i: IK(Ca).
Uno tiene baja conductancia (SK) y es bloqueado por apamina; el otro (BK) tiene una
conductancia muy grande y es bloqueado por caribdotoxina y TEA. Ambos canales
cuando se abren, tienden a estabilizar la membrana y previenen un mayor influjo de
Ca2+ dentro de la fibra muscular. Otro canal de K+ es normalmente inhibido por ATP
intracelular y se abre cuando la concentración de ATP disminuye. Además existe otro
canal de potasio activado por un aumento en la concentración intracelular de Na +
(McComas, 1996).
Canales K ATP
Los canales de potasio sensibles a ATP (K ATP) fueron descritos primero por
Noma en 1983 en parches de membrana aislados de miocitos ventriculares de
cobayo y fueron caracterizados por inhibición cuando la concentración de ATP en la
superficie citoplásmica fue incrementada a niveles milimolares (Ashcroft, 1988).
Posteriormente estos canales han sido encontrados en una variedad de células y
tejidos incluyendo células β-pancreáticas (Cook y Hales, 1984), músculo esquelético
(Spruce, Standen y Stanfield, 1985) y liso (Standen, Quayle, Davies, Brayden, Huang
y Nelson, 1989), pituitaria (Bernardi, De Weille, Epelbaum, Mourre, Amoroso, Slama,
Fosset y Lazdunski, 1993), neuronas (Ashford, Sturgess, Trout, Gardner y Hales,
1988), riñón (Hunter y Giebisch, 1988) y en mitocondria (Inoue, 1991). Los canales
19
KATP acoplan el estado metabólico de la célula a su actividad eléctrica y juegan un
importante papel en varias funciones celulares como sensores de ATP y ADP
intracelular (Inagaki y Seino, 1998).
Los canales KATP consisten de dos tipos de subunidades: un canal rectificador
entrante (K IR) y un receptor a sulfonilureas (SUR) (Figura 11). Ambas subunidades
son requeridas para formar el canal KATP funcional y se coensamblan en una
estequiometría 4:4 para formar un canal octamérico (Babenko, Aguilar-Bryan y
Bryan, 1998; Clement, Kunjilwar, Gonzalez, Schwanstecher, Panten, Aguilar-Bryan y
Bryan, 1997; Inagaki, Gonoi y Seino, 1997; Seino, 1999). El SUR actúa como
subunidad reguladora y le confiere la sensibilidad al ADP y las características
farmacológicas distintivas de los canales KATP (Seino, 1999; Aguilar-Bryan y Bryan,
1999; Inagaki, Gonoi, Clement, Namba, Inazawa, Gonzalez, Aguilar-Bryan, Seino y
Bryan, 1995; Tucker, Gribble, Zhao, Trapp y Ashcroft, 1997). La subunidad KIR forma
el poro del canal y medía la inhibición dependiente de ATP de estos canales (Tucker
et. al., 1997; Shyng y Nichols, 1997). Posiblemente en músculo esquelético este
canal se encuentra formado por SUR2A y KIR6.2 (Babenko y cols., 1998; Inagaki et.
al., 1998).
Figura 11.- Ensamble de las subunidades SUR y KIR para formar el canal KATP. Arriba: modelo de 17
dominios transmembrana propuesto por Tusnady, Bakos, Varadi y Sarkadi (1997). N y C indican los
grupos amino y carboxilo terminal. Abajo: ilustración esquemática del canal KATP. Los árboles indican
los sitios de glicosilación (modificado de Aguilar-Bryan y Bryan, 1999).
20
El ATP no es el único modulador de estos canales. El ADP, Mg-ATP, H+ y
algunos cationes internos también modulan la actividad de los canales KATP (Findlay,
1988a, b; Woll, Lonnendonker y Neumcke, 1989; Davies, 1990; Vivaudou, Arnoult y
Villaz, 1991; Davies, Standen y Stanfield, 1992). Entre estos moduladores se ha
propuesto que la disminución del pH durante la fatiga es un importante activador de
los canales KATP (Davies y cols., 1992; Standen, Pettit, Davies y Stanfield, 1992).
Además, estos canales son bloqueados por drogas hipoglucemiantes como las
sulfonilureas (Schmid-Antomarchi, De Weille, Fosset y Lazdunski, 1987) y son
activados por abridores de canales K ATP como el pinacidil, cromakalim y diazóxido.
Los efectos de las sulfonilureas han sido estudiados mucho menos en
músculo. Está claro que estas drogas también bloquean los canales de KATP en estas
células, aunque a concentraciones mucho más grandes que en las células secretoras
de insulina. Estudios en canales iónicos han mostrado que la glibenclamida bloquea
los canales KATP en músculo esquelético a concentraciones de inhibición media
desde 190 nM en ratón (Allard y Lazdunski, 1993) hasta 3 µM en rana (Standen y
cols., 1992). Las sulfonilureas bloquean los canales KATP cuando se aplican a
cualquier lado de la membrana y probablemente accesan al canal a través de la
membrana lipídica (Trube, Rorsman y Ohno -Shosaku, 1986; Findlay, 1992).
No existe evidencia de que la glibenclamida afecte otros canales de K+
diferentes a los KATP en músculo esquelético de mamífero (Barrett-Jolley y
McPherson, 1998; Light y French, 1994), aunque se ha encontrado un incremento en
la sensibilidad de los componentes contráctiles de las fibras musculares al Ca2+ (Duty
y Allen, 1995; Matar, Nosek, Wong y Renaud, 2000). De esta manera parece ser que
las sulfonilureas son bloqueadores selectivos de los canales KATP en el sentido de
que no bloquean otros canales de K +.
Existen otros bloqueadores de los canales KATP, como el tetraetilamonio
(TEA), la 4-aminopiridina y algunos cationes como el Ba2+ pero no son selectivos a
estos canales.
21
Función de los Canales K ATP en músculo.Aunque los canales KATP están presentes en una alta densidad en el
sarcolema del músculo esquelético (Spruce y cols., 1985), su función todavía es
desconocida. Estos canales han sido descritos en una variedad de especies incluidas
rana, ratón, humano (Allard y Lazdunski, 1993; Spruce, Standen y Stanfield, 1987;
Vivaudou y cols., 1991). En músculo cardiaco y esquelético estos canales han sido
implicados en la excitabilidad celular, citoprotección y la pérdida celular de K + durante
isquemia, hipoxia, fatiga y otros procesos metabólicos. En 1983 Noma postuló que la
función de los canales KATP es proteger al músculo contra la depleción de energía y
daño irreversible en su función. Para realizar tal función, se ha postulado que el canal
KATP reduce el desarrollo de fuerza debido a que la actividad muscular puede
incrementar la velocidad metabólica en músculo causando la disminución de los
niveles de ATP (Westerblad y cols., 1991).
El mecanismo de acción de los canales KATP involucra un incremento en la
conductancia de K+, la cual contribuye al acortamiento de la duración del potencial de
acción (Gasser y Vaughan-Jones, 1990; Gramolini y Renaud, 1997) y a un aumento
en la concentración extracelular de K+ (Comtois, Sinderby, Comtois, Grassino y
Renaud, 1994; Gasser y Vaughan-Jones, 1990). La concentración de K+e elevada
despolariza la membrana celular (Hodgkin y Horowicz, 1959), lo cual incrementa la
proporción de canales de Na + inactivados (Adrian, Chandler y Hodgkin, 1970).
Ambos, el acortamiento del potencial de acción y la inactivación de los canales de
Na+ reducen la excitabilidad (Figura 12), lo que conduce a una disminución en la
liberación de Ca2+ y en la producción de fuerza (Duty y Allen, 1995). Entonces la
Ca2+-ATPasa y la miosina-ATPasa utilizan menos energía debido a que hay menos
Ca2+ y generación de fuerza.
Figura 12.- Esquema que muestra la posible acción de los canales KATP en las fibras musculares.
(Tomado de Davies, Standen y Stanfie ld, 1991).
22
Estudios en los que utilizaron fármacos abridores de canales KATP
generalmente concuerdan en que estos agentes aceleran la fatiga, especialmente en
condiciones hipóxicas (Gurden y Hart, 1995; Matar y cols., 2000), lo cual es
evidencia de que el canal puede contribuir a la disminución de fuerza. En contraste,
estudios en que se utilizan bloqueadores de estos canales han encontrado efectos
variables sobre la fatiga: algunos estudios no han encontrado efectos significativos
sobre la fatiga (Comtois, Light, Renaud y Kong, 1993; Gong, Miki, Seino y Renaud,
2000; Gurden y Hart, 1995; Light, Comtois y Renaud, 1994; Matar y cols., 2000; Van
Lunteren, Moyer y Torres, 1998), aunque también se ha reportado mejora (Duty y
Allen, 1995; Gutiérrez, Arbeláez, Cabezas y Lee, 1995; Gutiérrez, Lee y Cabezas,
1996) y aceleración en la fatiga (Comtois y cols., 1994).
De esta manera, se ha observado que la glibenclamida bloquea los canales
KATP en músculo, pero su acción sobre la contractilidad del músculo esquelético no
está bien definida ya que existe discordancia en los resultados obtenidos en
diferentes estudios. Además, sabemos que las fibras musculares lentas presentan
resistencia a la fatiga, mientras que las fibras rápidas se fatigan fácilmente. Por lo
tanto, resulta interesante estudiar en músculos con diferente tipo de respuesta
contráctil y resistencia a la fatiga los efectos de la glibenclamida, para lo cual nos
propusimos los siguientes objetivos.
23
OBJETIVO GENERAL
Investigar el efecto de la glibenclamida sobre la sacudida única y la
contracción tetánica desarrollada por las fibras musculares esqueléticas de pollo.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar el efecto dosis-respuesta de la glibenclamida sobre la tensión de
sacudida única y tetánica en el músculo esquelético lento de pollo.
2. Determinar el efecto dosis-respuesta de la glibenclamida sobre la tensión de
sacudida única y tetánica en el músculo esquelético rápido de pollo.
3. Comparar los resultados obtenidos en los dos tipos de músculo y determinar si
existe correlación con la fatiga en las fibras musculares.
HIPÓTESIS
La glibenclamida al unirse a los sitios de unión en los canales KATP modula la
fuerza de la contracción del músculo esquelético, este efecto es dependiente de la
concentración.
24
METODOLOGÍA
Material Biológico:
Para investigar el efecto de la Glibenclamida sobre la sacudida única y la
contracción tetánica se utilizaron fascículos de fibras musculares esqueléticas lentas
del músculo Anterior Latissimus Dorsi (ALD) y fascículos de fibras rápidas del
músculo Posterior Latissimus Dorsi (PLD) de pollos de la variedad Arbor acres, de
entre 1 y 3 semanas de edad.
Disección:
Los pollos se sacrificaron por decapitación y enseguida se disecaron los
músculos ALD y PLD, los cuales fueron colocados en una caja de Petri revestida con
fondo de resina transparente (Sylgard). Se fijaron con alfileres entomológicos al
fondo de la cámara e inmersos en solución Ginsborg (véase soluciones). Bajo el
microscopio estereoscópico se retiró el exceso de tejido conectivo de ambos
músculos y se procedió a obtener fascículos delgados (de 1 -1.5 mm de grosor).
Registro Mecánico:
El fascículo fue montado en una cámara de registro experimental, la cual
consta de dos depósitos, uno con dos placas deslizables donde se coloca el músculo
y puede ajustarse la anchura del canal por el que pasan las soluciones de registro y
otro donde se recogen las soluciones experimentales (Figura 13). El fascículo fue
fijado de su extremo proximal al fondo de la cámara y del extremo distal al ganchito
de un transductor mecanoeléctrico (Grass FT03). El transductor fue conectado a un
amplificador Cyberamp 320 (Axon Instruments, Co.), el cual a su vez estaba
conectado a una Interfase analógico-digital (DMA TL-1 de Axon Instruments, Co.).
Los registros se visualizaron y almacenaron para su posterior análisis en una
computadora (Epson 486D) con un software de adquisición de datos (Axotape de
Axon Instruments, Co.) y en un graficador en papel (Gould 220). El transductor
estaba montado en un micromanipulador lo que permitió ajustar la tensión basal del
fascículo a aproximadamente 1.3 veces su longitud de reposo. El recambio de las
25
soluciones se realizó a través de una llave de tres vías conectada a la base de la
cámara experimental y las soluciones fueron retiradas de la cámara a través de un
sistema de succión. Previo a cada experimento se realizaron contracturas inducidas
por soluciones con alto contenido de K+ (véase soluciones). Este tipo de contracturas
está bien caracterizado en estos dos tipos de músculo y nos permitían determinar el
estado físico de los fascículos.
Figura 13.- Dispositivo experimental. A) y B) Cámara experimental donde se fijó el fascículo. C) El
recambio de las soluciones se realizó a través de una llave de tres vías. D) Transductor
mecanoeléctrico el cual se montó en un micromanipulador (F) con el que se ajustó la tensión inicial del
fascículo. E) Depósito desde el cual se retiraban las solu ciones con el sistema de succión.
Protocolo de Estimulación:
Los fascículos fueron estimulados eléctricamente a través de dos electrodos
de plata clorurada situados en las paredes de las placas deslizables de la cámara, en
lados opuestos del músculo. La estimulación se aplicó con un estimulador (Grass
S48) mediante una unidad aisladora de estímulos (Grass SIU5). Las contracciones
tetánicas fueron provocadas por trenes de 5 segundos de duración para el caso del
ALD y de 3 segundos de duración para el PLD. La duración del pulso fue de 10 mseg
y la frecuencia de estimulación de 50 Hz. Ambos músculos también fueron
estimulados a baja frecuencia (0.2 Hz el ALD y 1 Hz el PLD), en este caso la
duración del pulso fue de 300 mseg para el ALD y 100 mseg para el PLD. A los
fascículos se les dejó reposar por períodos de 20 minutos entre cada protocolo de
estimulación y se incubaron en la solución experimental durante cuatro minutos
26
previos a la estimulación. Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente
(22-25 oC).
Soluciones:
La solución Ginsborg tuvo la siguiente composición (en mM): NaCl, 167; KCl,
5; CaCl2, 5; MgCl2, 2 y Glucosa 2 g/l. El pH de esta solución se ajustó a 7.4 con
Imidazol-Cl.
La solución con alto potasio se preparó sustituyendo equimolarmente el Na +
por K+ de la solución Ginsborg y estaba compuesta por: NaCl, 92; KCl, 80; CaCl2, 5;
MgCl2, 2 y Glucosa 2 g/l. Se ajustó el pH de esta solución a 7.4 con Imidazol-Cl.
Se preparó una solución madre de Glibenclamida (2 mM) disuelta en NaOH
0.05 M, de la cual se tomó el volumen necesario y fue adicionado al baño para
obtener las concentraciones deseadas. En este caso, usamos tres concentraciones
finales de glibenclamida (50, 100 y 150 µM).
En las soluciones de incubación, previo a la estimulación, a
l glucosa fue
sustituida por manitol.
Análisis de los Resultados:
De cada uno de los registros de tensión tetánica obtenidos se midió la tensión
al pico, (reportada como tensión tetánica máxima) y el área total bajo la curva
(reportada como tensión tetánica total) utilizando la subrutina Clampfit del programa
pCLAMP 6.0.4 (Axon Instruments, Co.). El control realizado para cada uno de los
experimentos se tomó como el 100 % y se comparó con el tétano de prueba (en
presencia del fármaco), así como con el tétano post-fármaco. De la misma manera,
se compararon la tensión máxima y la total de las sacudidas en la presencia del
fármaco con respecto al control. Los resultados son expresados como porcentajes
promedios ± error estándar de los promedios de n experimentos realizados. Se
realizó la prueba estadística t de Student para comparar los promedios. Se usó una P
< 0.05 para determinar la significancia de los resultados. Las gráficas fueron
elaboradas empleando el programa Sigmaplot 3.0.
27
RESULTADOS
Los resultados obtenidos en las diferentes series experimentales son
mostrados a continuación. Primero, se presentan los resultados obtenidos del efecto
de la glibenclamida sobre la tensión tetánica del músculo ALD y posteriormente, se
muestran los resultados obtenidos del efecto de la glibenclamida sobre la sacudida
del músculo ALD y finalmente los resultados obtenidos en el músculo PLD. El orden
en que se presentan los resultados es con respecto a las concentraciones de
glibenclamida utilizadas, 50, 100 y 150 µM, respectivamente. El control 1 se refiere al
valor de la tensión registrada antes de la aplicación de la glibenclamida, el cual es
considerado como el 100% en cada uno de los experimentos y los valores control 2,
se refieren a los valores promedio de la tensión obtenida después del lavado de la
glibenclamida. Las barras en las gráficas muestran los valores promedios ± el error
estándar de n experimentos realizados.
1. Tensión tetánica generada por el músculo ALD en la presencia y ausencia de
glibenclamida (50 µ M)
La figura 15 muestra el efecto observado cuando se empleó una
concentración de glibenclamida de 50 µM. En A, se grafica el promedio de los
valores de la tensión tetánica máxima, en la cual no se observa cambio significativo
con respecto al valor control (99.26 ± 1.08; P>0.05; n=4). En B, se muestran los
resultados obtenidos sobre la tensión total, la cual no muestra cambio significativo
con respecto al control (100.55 ± 1.89 %; P>0.05; n=4). En C, se muestran
superpuestos tres registros representativos de los experimentos realizados en la
ausencia, en la presencia de 50 µM de glibenclamida y posterior al lavado de la
droga.
28
A
B
C
Figura 15. Tensión tetánica máxima (A) y tensión tetánica total (B) en presencia y ausencia de
Glibenclamida (50 µM) (n = 4). En C se encuentran superpuestos tres registros representativos de la
tensión tetánica generada antes de la aplicación de la glibenclamida (en negro), durante (en rojo) y
después del lavado de la glibenclamida con solución Ginsborg normal (en azul).
29
2. Efecto de la glibenclamida (100 µ M) sobre la tensión tetánica del músculo
ALD
Cuando se incrementó la concentración de glibenclamida a 100 µM, la tensión
tetánica máxima incrementó en un 6.32 ± 2.10 %, con respecto al control (Figura 16
A), siendo este aumento significativo (P<0.05). Con esta concentración de
glibenclamida también se observó un aumento en la tensión tetánica tota l, aunque
este cambio no fue significativo (106.58 ± 5.87 %; P>0.05; n = 5).). Una vez lavado el
fascículo con la solución normal, la tensión registrada fue similar a la tensión inicial.
En la Figura 16 C se muestran superpuestos tres registros típicos de antes, durante y
después del lavado de 100 µM de glibenclamida sobre la fuerza tetánica.
A
B
C
Figura 16. Efecto de la glibenclamida (100 µM) sobre la tensión tetánica máxima (A), sobre la tensión
tetánica total (B) y en C se encuentran superpuestos tres registros representativos de la tensión
tetánica generada antes de la aplicación de la glibenclamida (en negro), durante (en rojo) y después
del lavado de la glibenclamida con solución Ginsborg normal (en azul). * : cambio significativo (P<0.05;
n = 5).
30
3. Efecto de la glibenclamida (150 µ M) sobre la tensión tetánica del músculo
ALD
Al emplear 150 µM de glibenclamida, la tensión tetánica máxima se
incrementó con respecto al control en un 27.32 ± 9.89 % (Figura 17 A), siendo este
aumento significativo (P<0.05; n = 5). De la misma manera, la tensión tetánica total
aumentó en un 10.22 ± 5.74 % (Figura 17 B), resultando este aumento significativo
con respecto al control (P<0.05). Una vez lavado el fascículo con solución normal,
ambas tensiones, la tensión tetánica total y la tensión tetánica máxima, mostraron
valores similares (101.75 ± 3.60 y 104.81 ± 6.60 %, respectivamente) a las tensiones
controles iniciales. En la figura 17C se muestran superpuestos tres registros
representativos de antes, durante y después del lavado de 150 µM de glibenclamida
sobre la fuerza tetánica.
A
B
C
Figura 17. Efecto de la glibenclamida (150 µM) sobre la tensión tetánica máxima (A), sobre la tensión
tetánica total (B) y en C se encuentran superpuestos tres registros representativos de la tensión
tetánica generada antes de la aplicación de la glibenclamida (en negro), durante (en rojo) y después
del lavado de la glibenclamida con solución Ginsborg normal (en azul). * : cambio significativo (P<0.05;
n = 5).
31
4. Tensión generada durante la sacudida única en el ALD en presencia y
ausencia de glibenclamida (50 µ M)
Cuando se empleó la glibenclamida a concentraciones de 50 µM no se
observó cambio en la tensión máxima (Figura 18 A) ni en la tensión total (Figura 18
B) de las sacudidas únicas con respecto al control (P>0.05; n = 4). Con el protocolo
empleado la tensión total disminuyó un 14.14 % después de 45 segundos y la
tensión máxima disminuyó 4.12 %. En la Figura 18 C se muestra una serie de
registros representativos superpuestos obtenidos antes, al aplicar 50 µM de
glibenclamida y después del lavado.
A
B
C
Figura 18. Tensión de la sacudida en el músculo ALD. En A, se grafican los valores promedios de la
tensión máxima de las sacudidas y en B se grafican los valores promedios de la tensión total de las
sacudidas, en la presencia de 50 µM de glibenclamida (n = 4). En C, se muestran superpuestos tres
registros representativos de la tensión generada antes de la aplicación de la glibenclamida (en negro),
durante (en rojo) y después de lavar la glibenclamida con la solución Ginsborg normal (en azul). Se
muestra la sacudida inicial y las sacudidas generadas a los 20 y 45 segundos de estimulación. Nótese
la ausencia de cambio del efecto con respecto a los controles.
32
5. Efecto de la glibenclamida (100 µ M) sobre la tensión generada durante la
sacudida única en el ALD
Al emplear 100 µM de glibenclamida el aumento observado en la tensión
máxima con respecto al control es significativo después de 10 segundos (P<0.05; n =
4). La figura 19 muestra en A que este incremento fue de 5.74 % a los 10 segundos y
de 4.84 % a los 45 seg. Por su parte, en la tensión total (Figura 19 B) solo hay un
aumento significativo en las cuatro últimas sacudidas (P<0.05), siendo este aumento
de 4.20, 4.61, 4.14 y 4.86 %, respectivamente. En la Figura 19 C, se muestra que la
tensión máxima después del lavado es similar a la tensión control, sin embargo se
observa una disminución en la tensión total sin que este valor sea significativo con
respecto al control inicial.
A
B
C
Figura 19. Efecto de la glibenclamida (100 µM) sobre la tensión de la sacudida en el músculo ALD. En
A, se grafican los valores promedios de la tensión máxima de las sacudidas y en B, se grafican los
valores promedios de la tensión total de las sacudidas, en la presencia de 100 µM de glibenclamida.
En C, se muestran superpuestos tres registros representativos de la tensión generada antes de la
aplicación de la glibenclamida (en negro), durante (en rojo) y después de lavar la glibenclamida con la
solución Ginsborg normal (en azul). Se muestra la sacudida inicial y las sacudidas generadas a los 20
y 45 segundos de estimulación. * : cambio significativo (P<0.05; n = 4).
33
6. Efecto de la glibenclamida (150 µ M) sobre la tensión generada durante la
sacudida única en el ALD
Cuando se usó una concentración mayor de glibenclamida (150 µM), se
observó un incremento en ambos parámetros de la tensión de la sacudida
explorados. En diez sacudidas, la tensión máxima se incrementó hasta en un 44.52
%, mientras que en la tensión total, ese incremento fue de hasta 17.83 % con
respecto al control. Después del lavado con la solución Ginsborg normal la tensión
total fue similar al control. Sin embargo, en la tensión máxima pudo observarse una
ligera disminución que fue desde 4.37 % en la sacudida inicial, hasta 14.66 % en la
sacudida generada a los 45 segundos de estimulación con respecto al control;
aunque este cambio no fue significativo (P>0.05; n=4). En la Figura 20 se muestran
los resultados obtenidos en esta serie de experimentos. En A, se muestran los
resultados obtenidos del efecto de la glibenclamida sobre la tensión máxima de la
sacudida; en B, sobre la tensión total de la sacudida y en C, los registros
superpuestos de antes, durante y después del lavado de la glibenclamida 150 µM
con la solución normal.
A
B
34
C
Figura 20. Efecto de la glibenclamida (150 µM) sobre la tensión de la sacudida en el músculo ALD. En
A, se grafican los valores promedios de la tensión máxima de las sacudidas y en B, se grafican los
valores promedios de la tensión total de las sacudidas, en la presencia de 150 µM de glibenclamida.
En C, se muestran superpuestos tres registros representativos de la tensión generada antes de la
aplicación de la glibenclamida (en negro), durante (en rojo) y después de lavar la glibenclamida con la
solución Ginsborg normal (en azul). Se muestra la sacudida inicial y las sacudidas generadas a los 20
y 45 segundos de estimulación. Nótese el incremento en la tensión de la sacudida cuando se aplicó la
droga. * : cambio significativo (P<0.05; n = 4).
7. Tensión tetánica generada por el músculo PLD en presencia y ausencia de
glibenclamida (100 y 150 µ M)
En el músculo PLD la glibenclamida no causó cambio significativo en la
tensión tetánica total ni en la tensión máxima a las dos concentraciones exploradas
(100 y 150 µM ), con respecto al control (P>0.05; n = 4). Una vez lavado el fascículo
con la solución normal, la tensión continuó desarrollándose de la misma manera que
el control inicial. En la Figura 21 se muestran los resultados de esta serie de
experimentos. En A y C se muestra el efecto de la glibenclamida 100 y 150 µM sobre
la tensión tetánica máxima; en B y D, se muestra el efecto de la glibenclamida 100 y
150 µM sobre la tensión tetánica total y en E se muestra una serie de registros
representativos superpuestos del efecto de 150 µM de glibenclamida sobre la fuerza
tetánica en el músculo PLD. En este experimento la tensión tetánica máxima en la
presencia de glibenclamida fue de 103.92 % y la tensión total 100.97 %. Después del
lavado la tensión máxima disminuyó en un 5.68 % (sin ser este cambio de
significancia estadística con respecto al control, P>0.05), sin embargo, la tensión total
mantiene un valor similar al valor control (99.13 %).
35
A
B
C
D
E
Figura 21. En A y B se muestran las graficas de tensión tetánica máxima y de tensión tetánica total en
la presencia de 100 µM de glibenclamida (n = 4). En C y D las graficas de tensión tetánica máxima y
tensión tetánica total en la presencia de 150 µM de glibenclamida (n = 4). E registro representativo de
la tensión tetánica generada antes de la aplicación de 150 µM glibenclamida (en negro), durante (en
rojo) y después de lavar con solución Ginsborg normal (en azul).
36
8. Tensión generada durante la sacudida única en el músculo PLD en presencia
y ausencia de glibenclamida (50 µ M)
Al estimular el músculo durante 10 segundos, se observó que la tensión
máxima disminuyó en un 20.75 ± 1.11 % y la tensión total se redujo en un 27.73 ±
1.07 %, respecto a la sacudida inicial. Sin embargo, al emplear 50 µM de
glibenclamida no se observó cambio en la tensión total ni en la máxima de las
sacudidas con respecto a las sacudidas controles. La figura 22C muestra resultados
representativos de esta serie experimental.
A
B
C
Figura 22. Tensión de la sacudida en el músculo PLD. En A, se grafican los valores promedios de la
tensión máxima de las sacudidas y en B se grafican los valores promedios de la tensión total de las
sacudidas, en la presencia de 50 µM de glibenclamida (n = 3). C, registros representativos de la
tensión generada antes de la aplicación de la glibenclamida (en negro), durante (en rojo) y después de
lavar con solución Ginsborg normal (en azul). Se muestra la sacudida inicial y las sacudidas
generadas a los 4 y 9 segundos de estimulación.
37
9. Efecto de la glibenclamida (100 µ M) sobre la tensión generada durante la
sacudida única del músculo PLD
Cuando se bañó al músculo con 100 µM de glibenclamida, la tensión máxima
no se modificó de manera significativa con respecto a la tensión control, sin embargo,
después del lavado con la solución Ginsborg normal, se observó una disminución en
la tensión máxima de la sacudida de hasta un 13.07 % con respecto al control, pero
este cambio no fue significativo (P>0.05; n = 4). Con esta misma concentración de
glibenclamida la tensión total aumentó hasta en un 14.36 % con respecto al valor
control, siendo significativo este cambio (P<0.05). Posterior al lavado, la tensión fue
de hasta un 10.02 % menor que la tensión del valor control, pero sin ser este cambio
significativo. La figura 23C ilustra resultados representativos obtenidos en esta serie
experimental.
A
B
C
Figura 23. Efecto de la glibenclamida (100 µM) sobre la tensión de sacudida. En A y B se grafica el
efecto de la glibenclamida sobre la tensión máxima y la tensión total de las sacudidas,
respectivamente. C registros representativos superpuestos de la tensión generada antes de la
aplicación de la glibenclamida (en negro), durante (en rojo) y después de lavar con solución Ginsborg
normal (en azul). Se muestra la sacudida inicial y las sacudidas generadas a los 4 y 9 segundos de
estimulación. * : cambio significativo (P<0.05; n = 4).
38
10. Efecto de la glibenclamida (150 µ M) sobre la tensión generada durante la
sacudida única en el músculo PLD
Cuando el músculo fue bañado en una solución Ginsborg conteniendo 150 µM
de glibenclamida, la tensión máxima aumentó hasta en un 13.88 %, con respecto al
control, pero este aumento no fue significativo (P>0.05); después del lavado el valor
en la tensión es similar al del control inicial. Por otra parte, la tensión total en
presencia de la glibenclamida aumentó en un 9.33 % en la sacudida inicial hasta en
un 26.72 % en la tensión final, siendo este cambio significativo (P<0.05; n = 4 ).
Además, después del lavado se observó una disminución en la tensión total en un
9.05 y 16.18 %, con respecto al control. Esta disminución fue significativa (P<0.05).
La figura 24 muestra resultados representativos de esta serie de experimentos.
A
B
C
Figura 24. Efecto de la glibenclamida (150 µM) sobre la tensión de la sacudida. En A y B se grafica el
efecto de la glibenclamida sobre la tensión máxima y la tensión total de las sacudidas,
respectivamente. C, muestra superpuestos los registros representativos de la tensión generada antes
de la aplicación de la glibenclamida (en negro), durante (en rojo) y después de lavar con solución
Ginsborg normal (en azul). Se muestra la sacudida inicial y las sacudidas generadas a los 4 y 9
segundos de estimulación. * : cambio significativo (P<0.05; n = 4).
39
DISCUSIÓN
En el músculo ALD la tensión tetánica máxima, así como la tensión máxima y
total de las sacudidas aumentó significativamente con 100 y 150 µM de
glibenclamida; mientras que la tensión tetánica total solo aumentó significativamente
con 150 µM de glibenclamida. En ambos protocolos el aumento con 150 µM fue
mucho mayor que con 100 µM.
En músculo no fatigado se ha encontrado que la glibenclamida (100 µM)
prolonga la fase de repolarización del potencial de acción (Comtois y cols., 1993;
Light y cols., 1994), sugiriendo que en este tipo de fibras no fatigadas algunos
canales KATP se activan durante el potencial de acción y contribuyen a la
repolarización. Por su parte, Duty y Allen (1995) encontraron en músculo de ratón no
fatigado que la glibenclamida (50 µM) produce un aumento en la liberación de Ca2+
durante el tétanos y un aumento en la sensibilidad de los componentes contráctiles al
Ca2+. Estos autores llegaron a ésta conclusión después de medir el [Ca2+]i y la
generación de fuerza en presencia y ausencia de glibenclamida y graficar la relación
[Ca2+]i-fuerza. Los valores de Ca50 para las fibras control y las tratadas con
glibenclamida fueron de 298±3 y 262±3 nM, respectivamente. Estos mismos
resultados fueron corroborados por Matar y cols. (2000) en músculo soleo no
fatigado con concentraciones mayores a 10 µM de glibenclamida, sugiriendo que
estos efectos son debidos al bloqueo de los canales KATP por la glibenclamida.
Dentro de los mecanismos celulares que controlan la fuerza en el músculo se
incluyen: 1) la concentración de Ca2+ que rodea a los miofilamentos, 2) la sensibilidad
de los miofilamentos al Ca2+, y 3) la fuerza producida por los puentes cruzados
activada por Ca2+ (Allen y Westerblad, 2001). Por lo tanto, el efecto encontrado con
la glibenclamida en el músculo ALD sugiere que ocurre un aumento en la sensibilidad
de los miofilamentos al Ca2+ y/o la prolongación de la fase de repolarización debida
al bloqueo de los canales de K+ sensibles a ATP, lo cual incrementa el tiempo que
está disponible el Ca2+. Esto se refleja en el incremento en la tensión.
40
Hasta antes de este estudio la mayor concentración de glibenclamida utilizada
en músculo esquelético es de 100 µM, una concentración que no afecta los canales
rectificadores tardíos de K+ (Comtois y cols., 1993). Sin embargo, se desconoce si
150 µM de glibenclamida afecte estos canales. Por lo tanto, se requieren estudios
empleando concentraciones mayores a 100 µM para determinar la especificidad de la
glibenclamida en músculo esquelético.
Por otra parte, en el músculo PLD, ni la tensión tetánica ni la tensión máxima
de las sacudidas fueron modificadas significativamente; sin embargo, en las
sacudidas la tensión total aumentó con 100 y 150 µM de glibenclamida; este aumento
fue significativo, lo cual sugiere que la sensibilidad de los miofilamentos al Ca2+
aumenta y/o ocurre una prolongación en la fase de repolarización del potencial de
acción promovido por el bloqueo de los canales de K+ sensibles al ATP. En este
músculo, se presentó una disminución en la tensión total en las sacudidas posterior
al lavado de la glibenclamida (150 µM), una disminución que pudiera estar
relacionada con daño muscular (Noma, 1983).
Las diferencias observadas en el efecto de la glibenclamida sobre la tensión
generada en ambos músculos (ALD y PLD), pudieran ser debidas a la diferencia en
la densidad de canales entre los diferentes tipos de fibras que componen los
músculos; alternativamente las propiedades de los canales y/o su sensibilidad a la
glibenclamida puede variar en los diferentes tipos de fibras musculares (Duty y Allen,
1995). Otra alternativa de explicación son las diferentes vías metabólicas que
caracterizan a los diferentes tipos de fibras.
Finalmente, la diferencia en el efecto de la glibenclamida sobre las sacudidas
y los tétanos pudiera estar relacionada con la frecuencia de estimulación (Duty y
Allen, 1995; Van Lunteren, Moyer y Torres, 1995; Van Lunteren y Moyer, 1996). La
glibenclamida, al prolongar la fase de repolarización del potencial de acción (Comtois
y cols., 1993; Light y cols., 1994), prolongaría el tiempo en que está disponible el
Ca2+. Además, se ha sugerido que la glibenclamida produce un aumento en la
liberación de Ca2+ durante el tétanos y en la sensibilidad de los componentes
contráctiles al Ca2+ (Duty y Allen, 1995). De esta manera, con bajas frecuencias de
estimulación, una mayor cantidad de Ca2+ estaría disponible y el aumento en la
41
sensibilidad de los componentes contráctiles al Ca2+, resultaría en un mayor
reclutamiento de fibras, causando finalmente un incremento en la fuerza. Sin
embargo, con frecuencias de estimulación altas, ya que la fusión es completa, el
número de fibras musculares disponibles para ser reclutadas es mucho menor y por
lo tanto la fuerza adicional generada en la presencia de la glibenclamida es menor
que con una estimulación a baja frecuencia.
La determinación de la acción de la glibenclamida en la repolarización del
potencial de acción es un punto que queda pendiente de exploración en este tipo de
fibras musculares. Aunque con los protocolos realizados no podemos determinar si
existe correlación entre el canal KATP y la fatiga, no podemos descartar esta
posibilidad.
CONCLUSIONES
La glibenclamida a concentraciones mayores a 100 µM aumenta la tensión en
los músculos lento y rápido no fatigados de pollo.
El incremento en la tensión tetánica y la tensión de las sacudidas en el
músculo ALD y la tensión de las sacudidas en el PLD es mayor a concentraciones
altas y a bajas frecuencias.
La sensibilidad a la glibenclamida varía en los dos tipos de fibras musculares.
42
PERSPECTIVAS
Para discernir si las diferencias observadas del efecto de la glibenclamida en
los dos tipos de músculos son debidas a una diferencia en la densidad de canales
KATP presentes en estos dos tipos de músculo y/o a diferencias en la sensibilidad de
estos canales a la glibenclamida, sería necesario llevar a cabo experimentos de
fijación de voltaje utilizando la técnica de patch-clamp.
Para determinar si existe correlación entre el canal KATP y la fatiga se
requieren experimentos de tensión empleando protocolos que causen fatiga en
ambos músculos, donde se utilicen concentraciones de glibenclamida que no tengan
efecto en músculo no fatigado, además de realizar experimentos donde se emplee
un abridor de estos canales como lo es el pinacidil.
43
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