factores ambientales que influyen en el desarrollo de sporothrix

FACTORES AMBIENTALES QUE INFLUYEN EN EL DESARROLLO DE
Sporothrix schenckii EN HUAUCHINANGO, PUEBLA, MÉXICO.
Ricardo MUNGUÍA PÉREZ, María del Carmen VELÁZQUEZ ESCOBAR,
Raymundo ROSAS QUIJANO, Lourdes GUERRERO ONTIVEROS, y Alejandra
Paula ESPINOSA TEXIS
Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias,
Posgrado en Ciencias Ambientales. Universidad Autónoma de Puebla.
Apartado Postal # 1622. FAX 2332010 ext 25. [email protected]
Palabras clave: Sporothrix schenckii, esporotricosis, micosis
RESUMEN
La temperatura, humedad relativa, el pH ligeramente ácido y la presencia de
algunos oligoelementos afectan el desarrollo fúngico, sin embargo no existen
estudios en México que apoyen esta hipótesis para Sporothrix schenckii. El
objetivo fue determinar los factores ambientales que permiten el desarrollo de S.
schenckii en el suelo del municipio de Huauchinango, Puebla. Para el aislamiento
del hongo se recolectaron 100 muestras de suelo asociado a rosales, maíz, pino y
plantas silvestres, pesando un gramo para realizar 3 diluciones (1:10, 1:100,
1:1000) con agua estéril, sembrando cada dilución por triplicado en agar mycosel
e incubando a 28ºC por 30 días. Se midió el pH del suelo de cada muestra y se
cuantificó la concentración de Ca2+, Fe3+ y Mg2+, registrando la temperatura y la
precipitación pluvial. Se obtuvieron 3 aislamientos de S. schenckii. El pH del suelo
2+
osciló en el rango de 5.9 a 7.0. La concentración para Ca fue de 9.3 Meq/100g,
para Fe3+ 17.2 mg/kg y para Mg2+ 2.1 Meq/100g. La temperatura promedio fue de
16.4ºC y la precipitación pluvial de 2300 mm3. El pH de las muestras de suelo de
las que se aisló al hongo fue cercano a la neutralidad. El desarrollo de S. schenckii
fue independiente de la concentración de los oligoelementos. La temperatura
templada y la alta precipitación pluvial favorecieron el crecimiento de S. schenckii.
En suelo del municipio de Huauchinango se aisló S. schenckii, sugiriendo que
podría ser la fuente de infección de los casos de esporotricosis.
INTRODUCCIÓN
La mayor parte de las especies fúngicas son cosmopolitas aunque algunas de
ellas tienen una distribución geográfica restringida y específica. Los hongos se
encuentran ampliamente distribuidos, viven en cualquier sitio que presente materia
orgánica, humedad, y temperatura comprendida entre 4 y 60°C. Pueden vivir en
climas ecuatoriales, tropicales, subtropicales, templados y aún en los fríos,
siempre que la temperatura no sea menor a 0° C, desde el nivel del mar hasta
altitudes de más de 4000 metros, en donde se encuentran los últimos vestigios de
vegetación, pueden desarrollarse en lugares húmedos, en sitios semidesérticos y
aún en desérticos en épocas de ligera humedad en los suelos (Herrera, 2004).
1
Los factores ambientales determinan el desarrollo celular fúngico, interviniendo
factores tanto físicos, químicos como biológicos. Entre los factores fisicoquímicos
se encuentran la composición química y naturaleza del substrato, pH, aireación,
luz, humedad, temperatura ambiental, altitud, precipitación pluvial y factores
nutricionales (Szaniszlo, 1985) entre otros (Guzmán, 2004; Rodríguez del Valle,
1983; Betancourt, 1985). Los factores biológicos incluyen las relaciones que se
establecen con otros organismos tales como el antagonismo, parasitismo y
simbiosis. En su nicho ecológico los hongos están en constante lucha para poder
subsistir, desarrollando estrategias y mecanismos adecuados para convivir y/o
competir con otros microorganismos.
Los hongos saprófitos o de vida libre están en constante lucha con las condiciones
del medio ambiente para su sobrevivencia: la humedad, los cambios bruscos de
temperatura, el agotamiento de nutrientes, la contaminación y competencia con
otros microorganismos presentes en su entorno. En los hongos parásitos, las
condiciones ambientales son prácticamente constantes. La disponibilidad de agua,
temperatura adecuada, pH óptimo, oxigenación apropiada, tolerancia al dióxido de
carbono y nutrientes disponibles, son los factores básicos que encuentra el hongo
para establecerse, pero sorteando los mecanismos de defensa del huésped.
Los hongos ya sea de manera natural o inducida por determinadas condiciones
ambientales y nutricionales producen enzimas cuya función primordial es permitir
utilizar los diversos nutrientes del medio. La producción de enzimas, toxinas,
moléculas o mecanismos particulares que alteren el equilibrio celular del
hospedero, les va ha permitir a estos organismos establecerse, invadir y
diseminarse. (Howard 1993)
Varias especies de hongos requieren algunos oligoelementos para su desarrollo
tales como calcio, hierro, boro, zinc magnesio o manganeso, los que generalmente
están asociados a sistemas enzimáticos. (Griffin 1981).
La humedad, medida a través de la precipitación pluvial, es un factor importante
para el desarrollo fúngico (Guzmán 1994).
Algunos hongos son capaces de crecer en un espectro amplio de pH del cual
dependen para tomar caminos alternos de diferenciación morfológica (Stewart,
1989). Los cambios de pH podrían modificar la biosíntesis de la pared celular del
hongo, por la alteración de componentes celulares que podrían estar directamente
involucrados con el citoesqueleto. Rodríguez Del Valle y cols., demostraron el
predominio de estructuras levaduriformes a un pH inicial de 8 y de estructuras
miceliales a valores de pH inferiores a 5, por lo que el pH es un parámetro que
posiblemente regula la expresión génica que muy probablemente determina la
morfología celular.
Los padecimientos micóticos son causados por hongos que normalmente residen
en el medio ambiente y que habitan los suelos o la vegetación de manera
saprófita.
El hongo dimórfico S. schenckii es el agente etiológico de la esporotricosis, que es
una micosis subcutánea, de evolución subaguda o crónica, que generalmente se
adquiere por inoculación traumática con S. schenckii. Ocasionalmente esta
micosis puede ser adquirida por inhalación, en cuyo caso podrá desarrollarse a
nivel pulmonar. La forma clínica más frecuente es la linfangítica, la cual inicia en
una o dos semanas en el sitio de inoculación como una pápula que se transforma
2
en un pequeño nódulo móvil y duro. Este nódulo tiende a reblandecerse y
ulcerarse, formando un chancro. Finalmente ésta lesión tiende a la cicatrización.
Posteriormente los vasos linfáticos se inflaman y aparecen lesiones nodulares
ascendentes a lo largo de la vía linfática. Algunas lesiones pueden secretar
material purulento (Fig. 1). En adultos la localización más común son las
extremidades inferiores, y en niños es más frecuente en cara.
Figura 1. Chancro esporotricósico localizado en pie
La esporotricosis es rara en Europa, frecuente en Asia, África, Oceanía y América.
El Salvador, Uruguay, Colombia, Venezuela, México y Brasil presentan alta
incidencia, y los que reportan menor frecuencia son: Chile, Argentina, Ecuador y
Panamá.
En nuestro país, el reporte de casos clínicos es tan frecuente que es la micosis
subcutánea que ocupa el primer lugar en incidencia, presentándose en forma
esporádica en todo el país o en zonas de endemia bien limitadas y localizadas.
Aunque se presenta en toda la República Mexicana, los estados con mayor
frecuencia son Guanajuato, Jalisco, Puebla, Michoacán, Oaxaca, Nuevo León,
Guerrero, Hidalgo, Veracruz y el Distrito Federal.
S. schenckii generalmente habita en climas templados y húmedos con un promedio
de temperatura de 20 a 25 °C y humedad relativa superior a 90% (Tabla I).
TABLA I. Condiciones favorables para el desarrollo de Sporothrix schenckii.
Temperatura
20-27° C
PH
< 6.0 (ligeramente ácido)
Precipitación pluvial
500-1000 mm3/año
Altitud
1000-1500 msnm
Clima
Templado, húmedo, cálido tropical
msnm: metros sobre el nivel del mar
3
Algunos autores (Lavalle, 1979; rodríguez et al 1983; Rippon 1988) consideran una
temperatura óptima para el desarrollo del hongo de 27-29°C y humedad relativa del
92-100%; y Mackinnon et al (1969) indican una humedad relativa del 90% y una
temperatura de 15 a 20° C.
Este hongo habita suelo y plantas, sin embargo aparentemente es más fácil aislarlo
de suelo. S. schenckii vive en musgo, hojas, ramas de plantas espinosas secas o
frescas, espinas, paja, pasto, madera, juncos, bugambilias, dalias, zacate, claveles,
café, etc. y suelo asociado a estas plantas.
En los campesinos es posible que la enfermedad se inicie por traumatismo, con
instrumentos de labranza como azadones, picos, palas, machetes, etc.
La transmisión zoonótica ha sido descrita, en algunas ocasiones se ha aislado el
hongo de animales a partir de pelo, pezuñas, dientes, uñas, etc. Los animales que
más frecuentemente se han relacionado con la esporotricosis son los roedores:
ratas, ratones, ardillas y armadillos; aunque también se reportan casos que inician
por piquetes de insectos, mordedura de reptiles, etc. En el laboratorio la infección
puede adquirirse de manera accidental.
S. schenckii es un hongo dimórfico que exhibe una fase filamentosa y una fase
levaduriforme; ambas fases pueden ser obtenidas en el laboratorio cuando el
hongo se cultiva a 25° C y 37°C respectivamente (Rippon, 1990).
En fase filamentosa el hongo crece rápidamente en agar dextrosa Sabouraud y
agar dextrosa Sabouraud con antibióticos (mycosel) a 28o C; las colonias
filamentosas del hongo frecuentemente son visibles a partir del tercer día. Al
principio son colonias pequeñas, blancas, carentes de micelio aéreo; después son
húmedas, rugosas, membranosas y con el tiempo se presenta micelio aéreo; el
color del hongo varía de blanco, crema a negro, por sectores o en todo el cultivo.
(Fig. 3a).
La morfología microscópica de los cultivos se caracteriza por filamentos finos,
ramificados, tabicados, hialinos; hifas de 1 a 3 μm de diámetro, portadores de
conidios pirifirmes, ovoides, triangulares o esféricos (3 a 5 micras), algunos
conidios nacen directamente del tallo de la hifa (radulosporas) y otros nacen
agrupados de manera simpodial en el ápice de un conidióforo (Fig. 3b). Cuando
los conidios se desprenden, se hacen más gruesas, de forma triangular y son
agrupaciones de estas a las que le atribuyen la formación de pigmento de la
colonia (melanoide). En algunos medios puede inducirse la formación de estos
conidios triangulares pigmentados de tipo simpodial en agrupación típica de flor de
durazno o flor de margarita.
Cuando Sporothrix schenckii se siembra en medios enriquecidos como agar
infusión cerebro corazón (BHI) y/o gelosa sangre y se incuba a 37°C, puede
estimularse su crecimiento agregándole 5% de CO2, se desarrollan colonias de
crecimiento rápido de 3 a 5 días de aspecto grisáceo, blandas, cremosas, blanco
amarillentas, ligeramente acuminadas, de consistencia suave y cremosa, bastante
similares a las colonias bacterianas, (Fig. 4a).
Al examen microscópico se observan levaduras alargadas o en gemación, las
levaduras pueden ser: simples, ovoides, esféricas, uni o bigemantes, que miden
en promedio de 2 a 4 x 3 a 6 micras. Esta morfología en las levaduras raramente
se observa en los tejidos (Fig. 4b).
4
MATERIALES Y MÉTODOS
Para el aislamiento de S. schenckii a partir de suelo, se tomó la muestra con una
pequeña pala, perfectamente limpia, a partir de la capa superficial de la tierra
eliminando la materia orgánica presente; se colectó aproximadamente 100 g, se
guardó en una bolsa de plástico debidamente etiquetada: fecha, número, lugar de
recolección y tipo de planta al que estaba asociado este suelo. Se pesó 1 g de
suelo y se suspendió en 9 mL de agua estéril, se dejó reposar y se realizaron las
siguientes diluciones 1:10, 1:100, 1:1000; se sembró 0.5 mL de cada dilución en
agar dextrosa Sabouraud (ADS); los cultivos se incubaron por 30 días a 28° C y se
revisaron diariamente. De las colonias sugestivas a ser S. schenckii, se realizaron
resiembras hasta obtener colonias libres de hongos y/o bacterias contaminantes
(Mackinnon, 1969; Espinosa, 2002).
Identificación fenotípica de los aislados: Para estudiar la morfología macroscópica
micelial, los aislados se sembraron en ADS, se incubaron por 7 días a 28o C, y se
registraron las características de las colonias: aspecto, consistencia, pigmentación
de la colonia, crecimiento, bordes. Se realizaron microcultivos observándose y
registrándose las características microscópicas del hongo, como son: forma,
tamaño y disposición de los conidos, presencia o ausencia de agregación micelial.
Para observar la morfología de la fase levaduriforme, se sembró un fragmento de
micelio en agar y caldo BHI; se incubó por 5 días a 37 o C y al final de este periodo
se registraron las características de las colonias; mediante un examen directo se
observó la reversión a levadura.
El pH del suelo se midió directamente con un potenciómetro, de cada muestra
estudiada de cada municipio y se sacó un promedio.
La determinación de calcio, hierro y magnesio se realizó por la metodología de
valoración por E.D.T.A. y Absorción Atómica. (NOM. AS-32-1998, NOM. AS-201998 SEMARNAP)
Figura 2 Municipio de Huauchinango, Puebla.
5
RESULTADOS
De las 100 muestras de suelo estudiadas del municipio de Huauchinango (Fig. 2)
se obtuvieron 3 aislamientos de Sporothrix schenckii: 1 a partir de suelo asociado
a una planta silvestre, 1 de suelo asociado a rosal y 1 de suelo asociado a pino
(Figs. 3 y 4), (Tabla 2). El pH del suelo osciló en el rango de 5.9 a 7.0 (Tabla 3).
2+
La concentración promedio de oligoelementos fue de 9.3 Meq/100g para Ca ,
3+
17.2 mg/kg para Fe y 2.1 Meq/100g para Mg2+(Tabla 4). La temperatura
promedio fue de 16.4ºC, mientras la precipitación pluvial alcanzó el valor de 2300
mm3.
a
b
Figura 3. S. schenckii. a) Colonias plegadas, de color beige con sectores color
café y b) Conidios ovoides en disposición simpodial.
a
b
Figura 4. Morfología de Sporothrix schenckii en Fase Levaduriforme. a) Colonia a
los 7 días de incubación a 37ºC crecida en BHI y b) Levaduras características
formadas en calco BHI.
6
TABLA 2. Aislamiento de Sporothrix schenckii a partir de suelo.
Número de
Número de Suelo asociado Aislamientos
Municipio
Dilución
muestra
a:
de Sporothrix
schenckii
HUAUCHINANGO
13
Pino
1
1:1000
HUAUCHINANGO
33
Rosal
1
1:1000
HUAUCHINANGO
50
Planta
1
1:1000
silvestre
Total de muestras
3
Fuente: Laboratorio de micología médica CICM-ICUAP.
TABLA 3. Valores de pH de las muestras de suelo de donde
aislamientos de Sporothrix schenckii.
Número de
Municipio
Tipo de planta
muestra
asociada al suelo
HUAUCHINANGO
13
Pino
HUAUCHINANGO
33
Rosal
HUAUCHINANGO
50
Planta silvestre
se obtuvo
PH
5.9
7.0
7.0
Fuente: Laboratorio de micología médica CICM-ICUAP.
Tabla 4 Concentración de Ca2+, Fe3+ y Mg2+ obtenida de las muestras de suelo de
los aislados de Sporothrix schenckii.
Ca 2+ Meq/100g
Fe3+mq/Kg
Mg2+ Meq/100g
9.3
17.2
2.1
DISCUSIÓN
Dentro de la diversidad climática del estado de Puebla existen regiones que
cumplen con las condiciones ambientales de temperatura, humedad y altitud,
siendo estas similares a las indicadas por algunos autores (Rippon, 1990), que
favorecen el desarrollo de S. schenckii y probablemente el aislamiento del agente
etiológico de la esporotricosis. Aunque no hay reportes de la enfermedad en el
municipio estudiado, se sabe que S. schenckii ha sido aislado de este (Espinosa et
al. 2002). Sin embargo la presencia del hongo no necesariamente implica la
existencia de infección ya que es necesario entre otros factores, que las cepas
sean patógenas, que el número de partículas infectantes sea elevada y que la
respuesta inmunológica del hospedero sea deficiente (Travassos, 1989).
Se ha observado que el pH ligeramente ácido, el clima templado-húmedo y una
altitud de 1000-1500 msnm permiten el crecimiento del hongo dimórfico S.
schenckii, (Espinosa, 2002). Los resultados obtenidos en este trabajo confirman
que S. schenckii puede ser aislado a pH ligeramente ácido, pero también a pH 7.0
Espinosa, 2002 reporta que temperaturas de 20-25 oC favorecen el crecimiento de
S. schenckii mientras que en este estudio la temperatura promedio fue de 16.4 oC.
Esto podría ser una explicación a la baja frecuencia de aislamientos obtenidos.
7
La mayoría de los autores reportan valores de altitud óptimos para el crecimiento
de Sporothrix en un rango de 1000 a 1500 msnm. Sin embargo, la altitud promedio
de Huauchinango es de 1840 msnm confirmando las afirmaciones hechas por
Herrera y Ulloa, cuyo rango de altitud oscila de cero a 4000 msnm.(Herrera y
Ulloa, 2004).
Respecto a la determinación de calcio, hierro y magnesio los resultados obtenidos
no presentaron diferencia significativa entre el total de las muestras de suelo
analizadas. Dado que in vitro se requieren concentraciones mínimas de estos
oligoelementos, suponemos que la concentración detectada de estos fue
suficiente para permitir el desarrollo de S. schenckii.
En general, las condiciones ambientales de Huauchinango permitieron el
desarrollo de Sporothrix schenckii en suelo, sugiriendo que podría ser la fuente de
infección de los casos de esporotricosis que se presentan en esta región.
AGRADECIMIENTOS
Proyecto No 12/G/NAT/05 financiado por la Vicerrectoría de Investigación y
Estudios de Posgrado de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
REFERENCIAS
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