PRÁCTICA N°2 2012 Biotecnología Farmacéutica

PRÁCTICA N°3
COMPROBACIÓN DEL EFECTO INHIBITORIO DE LOS ACEITES ESENCIALES
DE LAS HOJAS DE Origanum vulgare L. (orégano) En Sporothrix schenckii
In Vitro.
I. INTRODUCCIÓN
Entre los fitoconstituyentes, tenemos a los aceites esenciales (AE), productos naturales
de gran valor e importancia económica. Los aceites esenciales han sido empleados por
el hombre desde la antigüedad. Hacia el año 4500 antes de Cristo ya hay reportes de su
empleo por parte de los chinos con fines terapéuticos. En Grecia grandes médicos
como Hipócrates y Galeno empleaban hierbas aromáticas y aceites esenciales para
tratar a sus pacientes; en las comunidades indígenas el uso de aceites esenciales ha
llegado hasta nuestros días como un legado que pasa de generación en generación
desde épocas ancestrales, por tanto es importante que la comunidad científica recopile
este conocimiento y profundice en el mismo generando desarrollos que puedan
beneficiar a la humanidad y a su entorno.
Según la octava Edición de la farmacopea francesa de 1965, los aceites esenciales son
“productos de composición general muy complejas que contienen los principios
volátiles que se encuentran en los vegetales más o menos modificados durante su
preparación”. Los aceites esenciales no se encuentran prácticamente más que en
vegetales superiores.
Una de las alternativas vegetales para poder obtener aceites esenciales, es el orégano
que cuenta con una variedad de propiedades; contiene cuatro grupos químicos
principales que contribuyen con su potente poder curativo, están los fenoles como el
carvacrol y el timol que actúan como antisépticos, antifúngicos y antioxidantes, los
terpenos que poseen actividades antisépticas, antivirales
antiinflamatorias y
anestésicas; también están presentes el linalol y el vonrreol que poseen actividad
antiviral, antisépticas y también son potentes agentes anti fúngicos. La actividad de los
aceites esenciales del orégano se debe a la sinergia de todos estos compuestos y el
componente que se ha demostrado con diversos estudios, que posee mayor actividad
y potencia es el carvacrol; timol también es un compuesto químico del orégano
poseedor de efectos medicinales poderosos, pero en menor proporción; siendo estos
dos últimos los componentes de mayor importancia a los que se les atribuye el efecto
anti fúngico de Origanum vulgare L. “orégano”.
La capacidad de inhibición de los aceites esenciales del
orégano sobre diversos
microorganismos patógenos se ha atribuido a estos compuestos fenólicos con
estructuras presentes en el aceite.
La esporotricosis es una micosis subcutánea de evolución subaguda o crónica que por
lo general se adquiere por inoculación traumática de Sporothrix schenckii, pero
ocasionalmente puede ser adquirida por inhalación, en cuyo caso podría desarrollarse
a nivel pulmonar. Este es un hongo dimórfico, es decir existe en dos formas,
dependiendo de la temperatura en que se encuentre el organismo. A 25°C, la colonia
crece en su forma de moho, mientras que a temperaturas cercanas a los 37°C las
colonias crecen en su forma de levadura.
Para ello se han empleado las técnicas in vitro, dada la sencillez y reproducibilidad de
las mismas, para poder determinar algunas propiedades medicinales de los vegetales,
por lo que en la presente práctica comprobaremos el efecto del orégano sobre las dos
formas de Sporothrix schenckii.
II. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL
Comprobar el efecto inhibitorio de los aceites esenciales de las hojas de
Origanum vulgare L. “orégano”, contra Sporothrix schenckii in vitro.

OBJETIVO ESPECÍFICO
Comprobar el efecto inhibitorio de los aceites esenciales de las hojas de
Origanum vulgare L. “orégano”, a diferentes concentraciones, en la forma
levaduriforme y filamentosa de Sporothrix schenckii.
III. MATERIAL Y MÉTODO
3.1. MATERIAL
3.1.1. Material biológico:
3.1.1.1. Vegetal:
Se emplearán 400 g de hojas frescas de Origanum vulgare L.
3.1.1.2. Cepas de experimentación:
Se emplearán cepas de Sporothrix schenckii, tipificadas, obtenidas en
Laboratorio de Referencia de Salud Pública de la DIRESA - Cajamarca
de pacientes contaminados con el hongo.
3.1.2. Material de vidrio y otros:

Se utilizará material de vidrio de uso común en el laboratorio.

Asas de siembra.

mecheros de bunsen.

Algodón, guantes descartables, franelas, tijeras, mascarillas,
gorros quirúrgicos, papel kraft, alcohol de 96°.
3.1.3. Medio de cultivo

Agar Sabouraud Dextrosa.
3.1.4. Reactivos y otros

Carbonato de magnesio

Agua destilada
3.1.5. Equipos.

Estufa MEMMERT

Incubadora

Balanza eléctrica METTLER TOLEDO

Equipo CLEVENGER

Autoclave ALLAMERICAN

Horno HERAEUS

Refrigerador GENERAL ELECTRIC

Cocinas eléctricas

Microscopio óptico
3.2 MÉTODO
3.2.1. Obtención y preparación de la especie vegetal
3.2.1.1.
Recolección
y
secado
de
la
especie
vegetal:
seleccionaremos las hojas, descartando aquellas que presentan
picaduras de insectos o plagas y luego se lavará con agua potable.
3.2.1.2. Obtención de los aceites esenciales de Origanum vulgare L.
“orégano”:
Se pesarán 200 g de orégano y se colocarán en el balón de arrastre
del equipo CLEVENGER previamente armado, e incorporaremos
500ml de agua destilada. Colocaremos el balón en la placa
calefactora
a
80°C
de temperatura y acoplaremos el equipo
clevenger. Antes de poner a funcionar el equipo se rellenará de
agua destilada el tubo inferior, sin que el nivel del agua en el tubo
vertical llegue al refrigerante y calentaremos por cuatro horas. Una
vez obtenido el aceite se dejará caer por la bureta y se recibirá en
un frasco de color ámbar.
3.2.2. Diseño Experimental
Comprobaremos el efecto antimicótico de los aceites esenciales de las
hojas de Origanum vulgare L. “orégano” en cepas levaduriformes y
filamentosas de Sporothrix schenckii, respectivamente, obtenidas por
cultivo (agar Sabouraud Dextrosa), en el Laboratorio de Referencia de
Salud Pública de la DIRESA - Cajamarca, de pacientes contaminados con
el hongo.
Los grupos serán distribuidos en un Control y dos Problemas a
diferentes concentraciones de los aceites esenciales del material en
estudio.

Grupo Control:
En las placas, servidas con Agar Sabouraud Dextrosa se sembrarán las
cepas de Sporothrix schenckii, tanto para la forma filamentosa como
para la levaduriforme para la comparación correspondiente con los
grupos problema.

Grupo Problema I:
Se colocará 1 µL/ml de los aceites esenciales de “orégano” a cada una
de las placas previamente esterilizadas, luego se agregará agar
sabouraud y se uniformizará el medio hasta su solidificación, luego se
procederá a sembrar las cepas de Sporothrix schenckii; en placas,
procediéndose luego a incubar de la siguiente manera: las placas
serán incubadas a 37°C (crecimiento Levaduriforme) y a 25°C
(crecimiento filamentosos). Las lecturas se realizarán a las 24 a 48
horas para el caso de placas incubadas a 37°C y a partir de las 24 horas
hasta los 15 días para las placas incubadas a 25°C. Un resultado de
cultivo es negativo cuando no se observa crecimiento micótico al cabo
de los 15 días, no antes.

Grupo Problema II:
Se colocarán 3 µL/ml de los aceites esenciales de “orégano” en las
placas previamente esterilizadas, luego se agregará agar sabouraud y
se uniformizará el medio hasta su solidificación, luego se procederá a
sembrar las cepas de Sporothrix schenckii; en placas, procediéndose
luego a incubar de la siguiente manera: las placas serán incubadas a
37°C (crecimiento Levaduriforme) y a 25°C (crecimiento filamentosos).
Las lecturas se realizarán a las 24 a 48 horas para el caso de placas
incubadas a 37°C y a partir de las 24 horas hasta los 15 días para las
placas incubadas a 25°C. Un resultado de cultivo es negativo cuando
no se observa crecimiento micótico al cabo de los 15 días, no antes.

Grupo Problema II:
Se colocarán 5 µL/ml de los aceites esenciales de “orégano” en las
placas previamente esterilizadas, luego se agregará agar sabouraud y
se uniformizará el medio hasta su solidificación, luego se procederá a
sembrar las cepas de Sporothrix schenckii; en placas, procediéndose
luego a incubar de la siguiente manera: las placas serán incubadas a
37°C (crecimiento Levaduriforme) y a 25°C (crecimiento filamentosos).
Las lecturas se realizarán a las 24 a 48 horas para el caso de placas
incubadas a 37°C y a partir de las 24 horas hasta los 15 días para las
placas incubadas a 25°C. Un resultado de cultivo es negativo cuando
no se observa crecimiento micótico al cabo de los 15 días, no antes.
IV. Resultado
En los resultados obtenidos, se deberá observar la inhibición del crecimiento del
hongo en estudio sembrado en agar sabouraud con aceites esenciales del orégano.
Los estudiantes deberán representar aquí a través de esquemas, el procedimiento
y los resultados de la práctica.
V. Discusión de los resultados
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VI. Recomendaciones
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