EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD IN VITRO DE CEPAS DE

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE VETERINARIA
MÁSTER:
INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS VETERINARIAS
Trabajo de Investigación
EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD IN VITRO
DE CEPAS DE Lactococcus lactis AISLADAS
DE TRUCHA ARCOÍRIS (Oncorhynchus
mykiss) Y SU AMBIENTE ACUÍCOLA PARA
SU APLICACIÓN COMO PROBIÓTICOS EN
LA ACUICULTURA
Martha Isabel Ramírez Peinado
TUTOR: Luis M. Cintas Izarra
CO-TUTOR: Carmen Herranz Sorribes
Madrid, junio de 2013
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE NUTRICIÓN, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE
LOS ALIMENTOS
EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD IN VITRO
DE CEPAS DE Lactococcus lactis AISLADAS
DE TRUCHA ARCOÍRIS (Oncorhynchus
mykiss) Y SU AMBIENTE ACUÍCOLA PARA
SU APLICACIÓN COMO PROBIÓTICOS EN
LA ACUICULTURA
Memoria que, para optar al título de Máster Universitario de Investigación en
Ciencias Veterinarias, del Programa Oficial de Posgrado “Ciencias Veterinarias”,
presenta la Licenciada Martha Isabel Ramírez peinado
Madrid, junio de 2013
DEPARTAMENTO DE NUTRICIÓN, BROMATOLOGÍA Y
TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
FACULTAD DE VETERINARIA
Ciudad Universitaria, s/n. 28040 Madrid
Teléfono: 91 394 3751. Fax: 91 394 37 43
LUIS M. CINTAS IZARRA, PROFESOR CONTRATADO DOCTOR DE NUTRICIÓN Y
BROMATOLOGÍA DEL DEPARTAMENTO DE NUTRICIÓN, BROMATOLOGÍA Y
TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID,
CERTIFICA
Que el trabajo de Fin de Máster titulado “Evaluación de la seguridad in vitro de cepas de
lactococcus lactis aisladas de trucha arcoíris (oncorhynchus mykiss) y su ambiente acuícola
para su aplicación como probióticos en la acuicultura”, del que es autora la Licenciada en
Veterinaria Dña Martha Isabel Ramírez Peinado, ha sido realizado bajo su dirección en el
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos de la Facultad de
Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid y cumple con las condiciones exigidas
para optar al título de Máster Universitario de Investigación en Ciencias Veterinarias, del
Programa Oficial de Posgrado “Ciencias Veterinarias”.
Madrid, Junio de 2013
Luis M. Cintas Izarra
ÍNDICE……………………………………………………………………………………….....1
RESUMEN/ABSTRACT.............................................................................................................4
I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN…………6
II. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………….16
II.1 EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE LA PRESENCIA DE FACTORES DE
VIRULENCIA DE LAS CEPAS DE Lactococcus lactis AISLADAS DE LA TRUCHA
ARCOIRIS Y SU AMBIENTE ACUÍCOLA……………………………………………16
II.1.1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA……………………..16
II.1.2 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA…………………..16
II.1.3 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD MUCINOLÍTICA……………..……18
II.2. EVALUACIÓN
FENOTÍPICA Y
GENOTÍTPICA
DE
LA
SENSIBILIDAD/RESISTENCIA DE Lactococcus lactis A
LOS PRINCIPALES
ANTIBIÓTICOS EMPLEADOS EN ACUICULTURA, MEDICINA HUMANA Y
VETERINARIA…………………………………………………………………………...18
II.2.1.DETERMINACIÓN MEDIANTE EL MÉTODO DE MICRODILUCIÓN
EN PLACA DE LAS CONCENTRACIONES MÍNIMAS INHIBIDORAS (CMI)
DE LOS ANTIBIÓTICOS……………………………………………………………18
II.2.2.DETECCIÓN MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
(PCR)
DE
GENES
DE
RESISTENCIA
A
ANTIBIÓTICOS………………………………………………………………………19
II.3. EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE DIVERSAS ACTIVIDADES ENZIMATICAS
PERJUDICIALES EN LAS CEPAS DE Lactococcus lactis…………………………...20
II.3.1.EVALUACIÓN DE LA DESCONJUGACIÓN DE LAS SALES
BILIARES…………………………………………………………………………….20
3
Beneficiario COLFUTURO 2011
II.3.2.EVALUACIÓN
DE
LA
PRODUCCIÓN
DE
AMINAS
BIÓGENAS…………………………………………………………………………...22
II.3.2.1.Detección de la producción de aminas biógenas en medios de cultivo
diferenciales………………………………………………………………………..22
II.3.2.2.Determinación mediante PCR de la presencia de los genes involucrados
en la síntesis de aminas biógenas…………………………………………………23
II.3.2.2.1. Detección de la presencia del gen que codifica la histidina
descarboxilasa (HDC)…………………………………………………………..23
II.3.2.2.2. Detección de la presencia del gen que codifica la tirosina
descarboxilasa (TDC)…………………………………………………………..24
II.3.2.2.3. Detección de la presencia del gen que codifica la ornitina
descarboxilasa (ODC)…………………………………………………………..24
II.3.2.2.4. Detección de la presencia del gen que codifica la lisina
descarboxilasa (LDC)…………………………………………………………...24
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………………..25
III.1. EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE LA PRESENCIA DE FACTORES DE
VIRULENCIA EN LAS CEPAS DE L. lactis AISLADAS DE TRUCHA ARCOÍRIS Y
SU AMBIENTE ACUÍCOLA…………………………………………………………….26
III.1.1. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA………………...26
III.1.2. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA……………...27
III.1.3. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD MUCINOLÍTICA……………...28
III.2. EVALUACIÓN FENOTÍPICA Y GENOTÍPICA DE LA SENSIBILIDAD/
RESISTENCIA DE L. lactis A LOS PRINCIPALES ANTIBIÓTICOS EMPLEADOS
EN
ACUICULTURA
Y
MEDICINA
HUMANA
Y
VETERINARIA……………………………………………………………………….………………...29
III.2.1.DETERMINACIÓN MEDIANTE EL MÉTODO DE MICRODILUCIÓN
EN PLACA DE LAS CMI DE LOS ANTIBIÓTICOS……………………………...29
4
Beneficiario COLFUTURO 2011
III.2.2.DETECCIÓN MEDIANTE PCR DE GENES DE RESISTENCIA A
ANTIBIÓTICOS………………………………………………………………………33
III.3.EVALUACIÓN
FENOTÍPICA
DE
DIVERSAS
ACTIVIDADES
ENZIMATICAS PERJUDICIALES EN LAS CEPAS DE Lactococcus lactis………38
III.3.1.EVALUACIÓN
DE
LA DESCONJUGACIÓN
DE
SALES
BILIARES…………………………………………………………………………38
III.3.2.EVALUACIÓN
DE
LA
PRODUCCIÓN
DE
AMINAS
BIÓGENAS………………………………………………………………………...40
III.4. SELECCIÓN DE LAS CEPAS DE Lactococcus lactis AISLADAS DE
TRUCHA ARCOIRIS Y DE SU AMBIENTE ACUICOLA POTENCIALMENTE
SEGURAS
PARA
SU
POSTERIOR
CARACTERIZACIÓN
COMO
PROBIÓTICOS PARA EL DESARROLLO DE UNA ACUICULTURA
SOSTENIBLE…………………………………………………………………………...43
IV. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………45
V. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………..47
VI. APÉNDICES………………………………………………………………………………61
VI.1 LISTADO DE TABLAS…………………..…………………………………...61
VI.2 LISTADO DE FIGURAS………………………..…………………………….62
5
Beneficiario COLFUTURO 2011
RESUMEN
La prevención y el control de las enfermedades de los peces, especialmente las de etiología
bacteriana que se producen durante las etapas larvaria y de alevinaje, representan uno de los
principales retos para la moderna acuicultura. Tradicionalmente se han utilizado antibióticos como
agentes terapéuticos, muchas veces de forma indiscriminada; sin embargo, cada vez existe una
mayor reticencia a su empleo por sus posibles efectos perjudiciales para la salud animal y humana,
la seguridad alimentaria y el medio ambiente, entre los que destaca la aparición y transferencia de
(multi)resistencias a antibióticos, lo que conlleva un aumento del riesgo de epizootías. Aunque la
vacunación constituye, en principio, el método ideal de control de las ictiopatologías, su aplicación
está dificultada por factores como su disponibilidad, efectividad, grado de protección, estrés animal,
coste económico y la problemática de su aplicación en las etapas larvarias. En consecuencia, cada
vez es mayor el interés por la investigación y desarrollo de metodologías alternativas o
complementarias a la quimioterapia y la vacunación que resulten eficaces, seguras, respetuosas con
el medio ambiente, de aplicación sencilla y rentable económicamente. En este contexto, este trabajo
se enmarca en una línea de investigación que propone, como estrategia para una acuicultura
sostenible, el empleo de bacterias lácticas productoras de bacteriocinas (bacteriocinogénicas) de
origen acuático como probióticos para el biocontrol de las ictiopatologías. A este respecto, el
objetivo de este trabajo de investigación fue la evaluación de la seguridad in vitro de una colección
de 75 cepas de Lactococcus lactis aisladas de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y su ambiente
acuícola, durante todo su ciclo biológico, y seleccionadas por su actividad antimicrobiana frente a
Lactococcus garvieae y otros ictiopatógenos de relevancia para la acuicultura. Para ello, se empleó
un protocolo más exhaustivo que el propuesto por la EFSA para evaluar la seguridad de las cepas
de la especie L. lactis, que goza del estatus QPS (Qualified Presumption of Safety), que incluye: (i)
evaluación fenotípica de la presencia de factores de virulencia (actividad hemolítica, proteolítica y
mucinolítica); (ii) evaluación fenotípica y genotípica de la susceptibilidad a antibióticos empleados
en acuicultura y medicina humana y veterinaria, y (iii) evaluación fenotípica y/o genotípica de
actividades enzimáticas perjudiciales (desconjugación de sales biliares y producción de aminas
biógenas). Los resultados obtenidos demuestran la utilidad del protocolo propuesto en este trabajo,
ya que ha permitido establecer que, a pesar del estatus QPS de L. lactis, de las 75 cepas de origen
acuático de esta especie evaluadas, 60 cepas (80%) deben excluirse como probióticos potenciales
para la acuicultura ya que no son seguras para el hombre, los peces y/o el medio ambiente.
Palabras clave: acuicultura, probióticos, Lactococcus lactis, seguridad in vitro
6
Beneficiario COLFUTURO 2011
ABSTRACT
Prevention and control of fish pathologies, mainly those arising during the larval and
alevine stages, represents one of the main challenges for the modern aquaculture industry.
Traditionally, antibiotics have been thoroughly used as therapeutic compounds, very often
indiscriminately; however, there is an overgrowing reticence for their use, due to their harmful
effects for the human and animal health, the food safety and the environment, including the
generation and transference of antibiotic bacterial (multi)resistances, which lead to an increased
risk of epizooties. Although vaccination constitutes, in principle, the ideal control method, its
application may be hampered by several factors such as availability, effectiveness, level of
protection, animal stress, economic cost and problems associated to their application at the
larval stages, because of the immaturity of their immune system and the handling difficulties.
Therefore, there is an increasing interest of research and develop of alternative or
complementary strategies to chemotherapy and vaccination not only effective but also safe,
environmentally friendly, easy to apply and economically efficient. In this respect, this work is
framed in a research topic dealing with the use of probiotics as bacteriocin producers
(bacteriocinogenic) Lactic Acid Bacteria of aquatic origin as a strategy for the biocontrol of the
most relevant icthiopathologies in a sustainable aquaculture context. With regard to this, the
aim of this research work was to evaluate the in vitro safety of a collection of 75 Lactococcus
lactis strains previously isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and their aquatic
environment, during the whole fish lyfe-cycle, and selected for their antimicrobial activity
against Lactococcus garvieae and other fish pathogens of relevance for the aquaculture. To
achieve this goal, a more exhaustive procedure proposed by EFSA for the safety assessment of
L. lactis strains, a species recognized with the QPS status (Qualified Presumpion of Safety), was
carried out, including: (i) phenotypic evaluation of the presence of virulence factors (hemolytic,
proteolytic and mucinolytic activities); (ii) phenotypic and genetic evaluation of bacterial
susceptibility to several antibiotics used in aquaculture and human and veterinary medicine, and
(iii) phenotypic and genetic evaluation of detrimental activities (deconjugation of bile salts and
production of biogenic amines). The obtained results demonstrate the effectiveness of the safety
assessment protocol used in this work, since, despite the QPS status of L. lactis, 60 out of the
tested 75 L. lactis strains of aquatic origin (80%) should be excluded as potential probiotics for
aquaculture since they are not safe for humans, fishes and/or the environment.
Keywords: aquaculture, probiotics, Lactococcus lactis, in vitro safety
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Beneficiario COLFUTURO 2011
I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
La Unión Europea (UE) entiende la Acuicultura como la cría o cultivo de organismos
acuáticos con técnicas encaminadas a aumentar su producción por encima de las capacidades
naturales del medio. Debido a la sobreexplotación de los recursos pesqueros, la creciente
demanda mundial de pescado es cubierta con dificultad por la pesca extractiva, por lo que la
acuicultura se perfila como la única posibilidad de que pueda cubrirse esta demanda en un
futuro próximo. A este respecto, según el informe de la FAO, Estado Mundial de la Pesca y la
Acuicultura: 2012 (FAO, 2012), la acuicultura es una actividad con un alto potencial para
satisfacer la creciente demanda de alimentos acuáticos, ya que es probablemente el sector
productivo de más rápido ascenso, generando actualmente alrededor del 50% de la producción
de pesca en el mundo. Sin embargo, para ello, la moderna acuicultura requiere disponer de
metodologías eficaces y seguras que permitan incrementar la productividad animal y la calidad
y seguridad de los productos que se comercializan, por lo que resulta de gran importancia la
aplicación de nuevas tecnologías que, entre otros aspectos, permitan reducir el deterioro
medioambiental del medio acuático y la incidencia de las enfermedades de los peces,
principalmente las de etiología bacteriana que tienen lugar durante las etapas larvaria y de
alevinaje, que suponen en la actualidad un importante lastre para el desarrollo de esta actividad
que cada vez está adquiriendo una mayor relevancia en el sector productivo internacional. A
este respecto, entre las ictiopatologías de etiología bacteriana que afectan a especies acuícolas
marinas o continentales destacan las producidas por los siguientes grupos de microorganismos:
(i) bacilos Gram-negativos aerobios y anaerobios facultativos, entre los que se incluyen
Enterobacteriáceas como Yersinia spp. (Y. ruckeri), Vibrionáceas como Vibrio spp. (V.
anguillarum, V. harvey y V. campbellii) y Photobacterium spp. (P. damselae), Aeromonadáceas
como Aeromonas spp. (A. salmonicida y A. hydrophila) y Pseudomonadáceas como
Pseudomonas spp. (P. fluorescens y P. anguilliseptica); (ii) cocos y bacilos Gram-positivos
como Streptococcus spp., Lactococcus spp. y Renibacterium spp.; (iii) Micobacteriáceas y
Nocardiáceas; y (iv) Flavobacterias (F. psychrophilum) (Padrós y Furones, 2002; Ghittino et al.,
2003). Hasta hace unos años, las infecciones bacterianas en acuicultura eran debidas en su
mayoría a microorganismos Gram-negativos y, en menor medida, a microorganismos Grampositivos, concretamente Renibacterium spp. y bacterias lácticas como Streptococcus spp.; sin
embargo, en los últimos años se ha registrado un importante incremento de las infecciones
debidas a patógenos oportunistas Gram-positivos, principalmente del género Lactococcus (L.
8
Beneficiario COLFUTURO 2011
garvieae), y, en la actualidad, estos microorganismos constituyen uno de los principales
problemas para la acuicultura (Padrós y Furones, 2002; Vendrell et al., 2006). En este sentido,
Renibacterium salmoninarum (R. salmoninarum) provoca la enfermedad bacteriana renal
(BKD, del inglés Bacterial Kidney Disease), que afecta principalmente a salmónidos y cuyo
diagnóstico y tratamiento resulta muy complicado (Wiens y Kaattari, 1999; Padrós y Furones,
2002; Ghittino et al., 2003). Por otra parte, los problemas originados por bacterias lácticas son
debidos principalmente a las infecciones de la trucha por L. garvieae, Streptococcus iniae,
Carnobacterium piscicola y Vagococcus salmoninarum, así como a las infecciones del
rodaballo causadas por Streptococcus parauberis. Conviene destacar que en la actualidad las
infecciones causadas por L. garvieae, denominadas lactococosis, son unas de las de mayor
importancia para la acuicultura debido a las pérdidas que ocasionan en el cultivo de la trucha y
otras especies acuícolas de agua dulce (Ghittino et al., 2003; Vendrell et al., 2006). En este
sentido, aunque actualmente se están ensayando en campo diversas vacunas, el nivel y el
periodo de protección que confieren son limitados (Padrós y Furones, 2002).
Tradicionalmente se han empleado antibióticos como agentes terapéuticos y, en algunos
casos, en los tratamientos profilácticos de las ictiopatologías citadas anteriormente; no obstante,
cada vez existe una mayor reticencia a su empleo, no sólo por parte de las agencias sanitarias
sino también por las propias piscifactorías y los consumidores, debido a los efectos
perjudiciales derivados de su uso indiscriminado, entre los que destacan la aparición y la
transferencia de resistencias microbianas, lo que conlleva un alto riesgo de incremento del
número de epizootías causadas por microorganismos resistentes a estos compuestos
antimicrobianos. Entre sus posibles repercusiones también se incluyen las alteraciones de las
relaciones ecológicas entre bacterias, humanos, animales y su medio ambiente, las reacciones
adversas de los residuos de antibióticos en los manipuladores de los alimentos, los efectos
toxicológicos y tecnológicos derivados de la presencia de residuos de antibióticos en los
alimentos y la contaminación medioambiental (Angulo, 2000; Defoirdt et al., 2007). En este
sentido, la creciente preocupación por el empleo de antibióticos en acuicultura ha llevado a su
prohibición como promotores de crecimiento en la UE y al desarrollo de regulaciones cada vez
más restrictivas no sólo en la UE sino también en EE.UU., Canadá y otros países
industrializados (Gatlin et al., 2007).
Por lo tanto, cada vez es mayor el interés por la investigación y el desarrollo de
metodologías alternativas, que no sólo resulten eficaces para el control de las ictiopatologías
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Beneficiario COLFUTURO 2011
sino que, además, sean seguras, respetuosas con el medio ambiente y cuya aplicación resulte
sencilla y rentable económicamente. En este contexto, está adquiriendo una creciente relevancia
el empleo de probióticos/prebióticos, vacuna e inmunoestimulantes (e.g., ácidos orgánicos,
extractos de plantas y cofactores) como sustitutos de la quimioterapia para el biocontrol de
microorganismos patógenos (Gatesoupe, 1999; Verschuere et al., 2000; Irianto y Austin, 2002;
Balcázar et al., 2006; Farzanfar, 2006; Gatlin et al., 2007). En lo que respecta a los probióticos,
Fuller los definió en 1989 como “microorganismos vivos que en forma de suplementos
alimentarios afectan beneficiosamente al hospedador animal mediante una mejora de su
equilibrio intestinal” (Fuller, 1989). En una definición más amplia, los probióticos para la
acuicultura se consideran como cultivos microbianos vivos que ejercen un efecto beneficioso en
el hospedador mediante: (i) la modificación de su microbiota y/o la de su medio ambiente; (ii)
el incremento de la eficiencia en la asimilación del alimento y/o de su valor nutritivo; (iii) la
mejora de la respuesta del hospedador a las enfermedades; y/o (iv) el incremento de la calidad
del medio ambiente acuático en el que se desarrolla el hospedador. Con base en esta definición,
los probióticos pueden incluir cultivos microbianos que: (i) previenen la proliferación de
microorganismos patógenos en el tracto intestinal de los animales acuáticos, en las superficies
de las piscifactorías y en el ambiente de cultivo; (ii) aseguran un aprovechamiento óptimo del
alimento mediante su ayuda a la digestión (estimulación del crecimiento); (iii) mejoran la
calidad del agua; y/o (iv) estimulan el sistema inmune del hospedador (Verschuere et al., 2000).
La primera aplicación de los probióticos en acuicultura se remonta a mediados de la década
de los 80 del pasado siglo, no habiendo cesado desde entonces el creciente interés por su
empleo (Chabrillón et al., 2007). Históricamente, los probióticos se han asociado a la ganadería
y la medicina humana, limitándose su empleo a bacterias Gram-positivas, concretamente
bacterias lácticas (principalmente Lactobacillus spp. y Streptococcus spp.) y Bifidobacterium
spp.; sin embargo, desde hace unos años se ha propuesto la utilización en acuicultura de
cultivos probióticos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, bacteriófagos, levaduras y
algas unicelulares (Verschuere et al., 2000; Irianto y Austin, 2002). En este contexto, la mayoría
de los probióticos propuestos para su empleo en acuicultura pertenecen al grupo de las bacterias
lácticas (principalmente Lactobacillus spp., Carnobacterium spp., Enterococcus spp.,
Lactococcus spp., Pediococcus spp. y, en menor medida, Streptococcus thermophilus) y a los
géneros Bifidobacterium, Bacillus, Vibrio y Pseudomonas (Austin et al., 1995; Robertson et al.,
2000; Verschuere et al., 2000; Chabrillón et al., 2007; Dimitroglou et al., 2010; Nayak, 2010;
Ringø et al., 2010).A este respecto, aunque las bacterias lácticas no constituyen la microbiota
10
Beneficiario COLFUTURO 2011
intestinal predominante de los peces, que está representada por los géneros Photobacterium,
Pseudomonas y Vibrio (peces marinos) y Aeromonas, Plesiomonas, Enterobacteriaceae,
Bacteroides, Fusobacterium y Eubacterium (peces de agua dulce), algunos géneros de este
grupo, principalmente Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus y,
en menor medida, Vagococcus, Carnobacterium, Leuconostoc, Aerococcus y Weisella, forman
parte de la microbiota intestinal de muchos peces cultivados, especialmente de los de agua
dulce (Ringø y Gatesoupe, 1998; Ringø y Holzapfel, 2000; Ringø et al., 2000; Irianto y Austin,
2002; Austin, 2006; Campos et al., 2006; Gatesoupe, 2008; Desriac et al., 2010; Mansfield et
al., 2010; Ringø et al., 2010), lo que avala su empleo como probióticos para la acuicultura
(Verschuere et al., 2000; Chabrillón et al., 2007; Gatesoupe, 2008; Merrifield et al., 2010). En
este contexto, numerosos estudios ponen de manifiesto la eficacia in vitro e in vivo de la
aplicación de bacterias lácticas como probióticos en la acuicultura de peces y, aunque en menor
medida, crustáceos y moluscos (Balcázar et al., 2006a, b; Farzanfar, 2006; Verschere et al.,
2000; Vine et al., 2006; Gatesoupe, 2008; Ninawe y Selvin, 2009; Merrifield et al., 2010; Prado
et al., 2010; Dimitroglou et al., 2011). En lo que respecta a la acuicultura continental y marina
de peces, la mayoría de los estudios realizados hasta la fecha hacen referencia al empleo de
bacterias lácticas (principalmente de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus,
Enterococcus, Streptococcus y Carnobacterium) como probióticos de salmónidos, entre los que
se incluyen el salmón del Atlántico (Salmo salar), la trucha arcoíris (O. mykiss) y la trucha
común (Salmo trutta), así como de, aunque en menor medida, otras especies de relevancia para
la acuicultura mediterránea como, por ejemplo, la lubina (Dicentrarchus labrax), la dorada
(Sparus aurata), el rodaballo (S. maximus), el lenguado (Solea solea y Solea senegalensis), la
anguila (Anguilla anguilla) y la tilapia (Oreochromis niloticus) (para una revisión de la
literatura reciente ver Balcázar et al., 2006a; Farzanfar, 2006; Verschere et al., 2000; Vine et al.,
2006; Gatesoupe, 2008; Merrifield et al., 2010; Dimitroglou et al., 2011). No obstante, a pesar
de los numerosos estudios realizados, conviene destacar que, hasta la fecha, en la UE sólo está
autorizado (desde 2009) el empleo de un microorganismo (P. acidilactici CNCM MA18/5M,
bacteria láctica registrada comercialmente como Bactocell®) como aditivo zootécnico para la
acuicultura, concretamente para la mejora de la supervivencia y productividad de salmónidos y
camarones.
Desde hace tiempo se conoce que, además de su función tecnológica, las bacterias lácticas
ejercen efectos beneficiosos para la salud de los animales y el hombre y, además, se
caracterizan por su actividad antimicrobiana frente a diversos microorganismos patógenos de
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Beneficiario COLFUTURO 2011
importancia en clínica humana y veterinaria (Rolfe, 2000¸ Cintas et al., 2001; Cleveland et al.,
2001; Irianto, 2002; Deegan et al., 2006; Balcázar et al., 2004). A este respecto, sus principales
mecanismos de antagonismo microbiano son la competencia por los nutrientes del sustrato y la
formación de ácidos orgánicos (principalmente ácido láctico), con el consiguiente descenso del
pH; no obstante, las bacterias lácticas también pueden inhibir el desarrollo de un amplio rango
de microorganismos patógenos de los peces, al tener la capacidad de secretar otras sustancias
antimicrobianas entre las que se incluyen el etanol, dióxido de carbono, diacetilo,
diacetaldehído, peróxido de hidrógeno y otros metabolitos del oxígeno, benzoato, isómeros D
de los aminoácidos, reuterina y otros compuestos no proteicos de pequeño tamaño molecular y,
por
último,
un
grupo
heterogéneo
de
sustancias
antimicrobianas
(antibacterianas,
principalmente frente a bacterias Gram-positivas, y, en algunos casos, antifúngicas) de
naturaleza peptídica o proteica y de síntesis ribosomal denominadas bacteriocinas (Cintas et al.,
2001; Fimland et al., 2005; Cotter et al., 2005). Dado que la seguridad e inocuidad de las
bacterias lácticas se ha aceptado durante mucho tiempo, y en la actualidad la mayoría (e.g.,
Lactococcus lactis) se consideran microorganismos seguros por la EFSA (status QPS, del inglés
Qualified Presumption of Safety) (EFSA, 2005a,b; EFSA, 2007), aparte de su aplicación como
probióticos para el ser humano y los animales, también se ha sugerido su utilización y/o la de
sus metabolitos como “bioconservantes” de los alimentos, para que, formando parte de un
sistema de “barreras”, permitan garantizar su calidad higiénico-sanitaria y seguridad e
incrementar su vida útil (Cintas et al., 2001; Cleveland et al., 2001; Deegan et al., 2006).
De forma general, independientemente del tipo de microorganismos utilizados, los
tratamientos probióticos en acuicultura pueden considerarse como: (i) métodos de biocontrol,
ya que permiten la introducción de microorganismos que mediante diferentes mecanismos
posibilitan que los microorganismos patógenos puedan ser eliminados o reducidos en número
en el ambiente acuícola y/o (ii) probióticos sensu stricto, ya que favorecen que el hospedador se
encuentre en un adecuado estado inmune para combatir al microorganismo patógeno
(Chabrillón y Moriñigo, 2007). En este sentido, los principales mecanismos por los que los
probióticos ejercen su efecto beneficioso incluyen los siguientes: (i) supresión de
microorganismos patógenos mediante exclusión competitiva mediada por la producción de
compuestos antimicrobianos bacteriostáticos o bactericidas (bacteriocinas, ácidos orgánicos,
peróxido de hidrógeno, lisozima, amonio, diacetilo, etc.) y sideróforos (e.g., de hierro), por la
competencia por los nutrientes y energía disponibles y/o por la competencia por los lugares de
adhesión del intestino u otras superficies mucosas; (ii) mejora de la nutrición del hospedador
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Beneficiario COLFUTURO 2011
debida al suministro de nutrientes (e.g., ácidos grasos, vitaminas y aminoácidos esenciales) y/o
al favorecimiento de la digestión (e.g., producción de lipasas y proteasas); (iii) mejora de la
respuesta inmune del hospedador (e.g., activación de la respuesta humoral, incremento de la
actividad fagocítica, etc.), y (iv) mejora de la calidad del agua de cultivo (e.g., conversión de
materia orgánica en CO2, reducción de los niveles de amonio o nitritos, etc.) (Verschuere et al.,
2000; Balcázar et al., 2006).
Por otra parte, la selección y el desarrollo de probióticos aplicables comercialmente en
acuicultura constituye un proceso multidisciplinar que incluye diferentes etapas en las que
resultan necesarias la investigación básica y la aplicada, así como diversos ensayos a escalas
piloto y real y estudios de viabilidad económica (Verschuere et al., 2000). En este sentido, y de
forma general, el desarrollo de probióticos seguros y eficaces incluye las siguientes fases: (i)
adquisición o aislamiento de probióticos potenciales, preferentemente procedentes del
hospedador en el que se pretenden emplear o del ambiente acuático en el que deben ejercer su
efecto probiótico; (ii) evaluación in vitro de su actividad antimicrobiana frente a los
microorganismos patógenos que se pretenden controlar mediante ensayos en medios sólidos y
líquidos; (iii) identificación y filiación taxonómica; (iv) evaluación de su seguridad in vitro
(ausencia de patogenicidad); (v) evaluación de su capacidad para sobrevivir en el ambiente
acuático y durante el tránsito por el tracto gastrointestinal del hospedador (e.g., resistencia a las
sales biliares, pH bajo y proteasas), así como de su capacidad para colonizar el intestino o una
superficie externa del hospedador, mediante su adherencia a las células epiteliales y mucosas, y
prevenir el establecimiento de bacterias potencialmente patógenas; (vi) evaluación in vivo de su
seguridad y sus efectos probióticos en el hospedador, entre los que se incluyen su efecto en el
crecimiento (estado nutricional) y la tasa de supervivencia del hospedador y en el sistema
inmune, así como ensayos en los que el hospedador se infecta experimentalmente con el
patógeno que se pretende controlar; (vii) evaluación de sus características tecnológicas, tales
como su resistencia y viabilidad bajo condiciones de crecimiento y almacenamiento estándar y
tras los procesos industriales empleados generalmente (e.g., sensibilidad al oxígeno, producción
de ácido, velocidad de crecimiento, liofilización, extrusión, etc.); (viii) caracterización
microbiológica y metagenómica del efecto de su empleo en la estructura y dinámica
poblacional de la microbiota del hospedador al que se adicionen como probióticos y de su
medio acuático, y, por último, (ix) análisis de costes y beneficios (Gómez-Gil et al., 2000;
Verschuere et al., 2000; Nikoskelainen et al., 2001; Spanggaard et al., 2001; Irianto y Austin,
2002; Vine et al., 2004; Balcázar et al., 2006). Por otra parte, en los últimos años se está
13
Beneficiario COLFUTURO 2011
destacando la importancia y el interés de la evaluación del empleo de prebióticos como
complementos alimenticios promotores de la salud de las especies de interés en acuicultura; sin
embargo, su aplicación en este campo está aún en una fase preliminar y, hasta la fecha, ha sido
poco evaluada. A este respecto el término “prebiótico” hace referencia a sustancias o productos
no digeribles como, por ejemplo, fructanos de cadena larga (inulina) y corta o fructooligosacáridos (FOS), transgalacto-oligosacáridos y manano-oligosacáridos, que: (i) sirven de
sustrato para bacterias beneficiosas del tracto gastrointestinal y estimulan su crecimiento o
actividad metabólica; (ii) modifican favorablemente la microflora intestinal, y, por último, (iii)
ejercen efectos beneficiosos en el hospedador, tanto a nivel sistémico como intestinal (Gibson y
Roberfroid, 1995; Gatlin et al., 2007). Conviene destacar que la inclusión de prebióticos en la
dieta de las especies de acuicultura puede llevarse a cabo de forma independiente o
conjuntamente con los cultivos de bacterias probióticas, esto es, en forma de preparaciones
simbióticas. De forma general, la administración de probióticos se lleva a cabo mediante su
adición a los piensos comerciales, bien una vez finalizado su proceso de elaboración (dado que
los microorganismos se inactivan generalmente por las condiciones de procesamiento
industrial) o en el momento de suministrarse a los peces; no obstante, diversos estudios
demuestran una mayor eficacia cuando se adicionan directamente al agua de cultivo de los
sistemas cerrados (fases larvaria y de alevinaje) o semicerrados (fase de engorde) de
recircularización empleados en las modernas piscifactorías, o cuando se incorporan al agua de
cultivo del alimento vivo, suministrado generalmente durante las fases larvaria y de alevinaje
(e.g., A. franciscana, A. salina y B. plicatilis), con el objetivo de encapsularlos al mismo y
protegerlos de su inactivacion (bioencapsulación), favorieciendo por tanto su ingestión a dosis
elevadas por las especies acuícolas a las que se suministre dicho alimento vivo “enriquecido”
con la(s) especie(s) microbiana(s) de interés (Vine et al., 2006; Dimitroglou et al., 2010;
Merrifield et al., 2010).
A continuación, se describen los objetivos de este trabajo de investigación, que se encuadra
en la línea de investigación iniciada en 2007 por el Grupo de Seguridad y Calidad de los
Alimentos por Bacterias Lácticas, Bacteriocinas y Probióticos (grupo SEGABALBP),
integrante del Grupo Investigador UCM-920193, Departamento de Nutrición, Bromatología y
Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria (UCM), la cual tiene como objetivo global
la utilización de bacterias lácticas de origen acuático como probióticos en el contexto de una
acuicultura sostenible. A este respecto, la finalidad global de esta línea de investigación es el
desarrollo de una estrategia sostenible, alternativa o complementaria a la quimioterapia y la
14
Beneficiario COLFUTURO 2011
vacunación, para la prevención y el control de las ictiopatologías de mayor relevancia que se
producen, especialmente durante las fases larvaria y de alevinaje, durante el cultivo intensivo de
la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y el rodaballo (Scophthalmus maximus), que
representan actualmente dos de las especies acuícolas de mayor relevancia económica para la
acuicultura continental y marina españolas, respectivamente.
La estrategia propuesta, basada en el empleo como probióticos de bacterias lácticas
productoras de bacteriocinas (bacteriocinogénicas) autóctonas de la trucha arcoíris y el
rodaballo, sus ambientes acuícolas (agua y vegetación de los tanques de cultivo), el alimento
vivo (en el caso del rodaballo) y los piensos comerciales (en el caso de la trucha arcoíris)
empleados para su alimentación, permitiría, además, mejorar la productividad animal y la
calidad y seguridad de los productos comercializados, así como minimizar el deterioro
medioambiental del medio acuático de las piscifactorías. En trabajos previos (Araujo et al.,
2001a,b,c), se procedió al aislamiento y filiación taxonómica de la microbiota autóctona de la
trucha arcoíris durante todo su ciclo biológico; esto es, desde la eclosión de los huevos hasta la
comercialización de las truchas (aprox., 1 año de vida), así como de los piensos empleados para
su alimentación y de sus ambientes acuáticos (agua de salida de los tanques y vegetación).
Asimismo, en estos trabajos previos se evaluó la actividad antimicrobiana de las bacterias
lácticas frente a los microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos causantes de las
ictiopatologías de mayor relevancia para el cultivo intensivo de la trucha arcoíris (e.g.,
Streptococcus iniae, Lactococcus garvieae, Yersinia ruckerii, Vibrio campbelli y Aeromonas
salmonicida). Posteriormente, se seleccionaron 75 cepas, que se identificaron como
Lactococcus lactis subesp. lactis (en adelante L. lactis) y se procedió a su tipificación
molecular, con el objetivo de identificar y seleccionar las más ubícuas y con un mayor y más
potente espectro de acción antimicrobiana frente a L. garvieae y otros ictiopatógenos de la
trucha arcoíris.
Este trabajo de investigación tiene como objetivos globales la evaluación de la seguridad in
vitro de la citada colección de 75 cepas de L. lactis aisladas previamente por SEGABALBP de
la trucha arcoíris y su ambiente acuícola, así como la selección de las cepas potencialmente
seguras para su posterior caracterización como probióticos para el desarrollo de una acuicultura
sostenible de la trucha arcoíris y, probablemente, otras especies acuícolas de relevancia
comercial. Conviene mencionar que aunque actualmente no existen directrices nacionales o
internacionales específicas sobre la evaluación de microorganismos probióticos para su empleo
en acuicultura, para la planificación y el desarrollo de los propuestos objetivos en este trabajo se
15
Beneficiario COLFUTURO 2011
han tenido en cuenta las recomendaciones internacionales generales para la evaluación del
empleo de probióticos en los alimentos, como las que se recogen en el documento Guidelines
for the Evaluation of Probiotics in Food, preparado por una Comisión Conjunta de Expertos de
la FAO y la OMS (FAO/WHO, 2002). Asimismo, en este trabajo se han considerado diversos
documentos comunitarios publicados por, entre otros, el Comité Científico de Nutrición Animal
(SCAN) de la European Food Safety Authority (EFSA) acerca del concepto Qualified
Presumption of Safety (QPS), de la evaluación de la seguridad de los microorganismos
empleados en los alimentos y piensos, de su identificación y filiación taxonómica y de su
resistencia a los antibióticos empleados en medicina humana y veterinaria (EFSA, 2005a,b,c;
EFSA 2007; EFSA, 2008; EFSA, 2012). Por todo ello, los objetivos de este trabajo de
investigación fueron los siguientes:
 Objetivo 1. Evaluación in vitro de la seguridad de las 75 cepas de L. lactis aisladas de
trucha arcoíris y su ambiente acuícola.
La especie L. lactis goza del estatus QPS por lo que, de acuerdo con la EFSA (EFSA, 2008,
EFSA, 2012), para la evaluación de la seguridad in vitro de las cepas de esta especie que
pretendan emplearse como aditivos zootécnicos únicamente es necesario evaluar su resistencia
a antibióticos de relevancia en acuicultura y en medicina humana y veterinaria, con el objeto de
descartar las cepas que muestren resistencias adquiridas y transmisibles; no obstante, en este
trabajo se empleó un protocolo de evaluación de la seguridad más exhaustivo, desarrollado
previamente por SEGABALBP (Muñoz-Atienza et al., 2012), en el que se incluyen los
siguientes objetivos:
 Subobjetivo 1.1. Evaluación fenotípica de la presencia de factores de virulencia.
 Subobjetivo 1.1.1. Evaluación de la actividad hemolítica.
 Subobjetivo 1.1.2. Evaluación de la actividad proteolítica.
 Subobjetivo 1.1.3. Evaluación de la actividad mucinolítica.

Subojetivo 1.2. Evaluación fenotípica y genotípica de la sensibilidad/resistencia a
diversos antibióticos empleados en acuicultura y medicina humana y veterinaria.
16
Beneficiario COLFUTURO 2011
 Subobjetivo 1.2.1. Determinación mediante el método de microdilución en placa
de las concentraciones mínimas inhibidoras (CMI).
 Subobjetivo 1.2.2. Determinación mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) de la presencia de genes de resistencia.
 Subobjetivo 1.3.
Evaluación
fenotípica
de
diversas
actividades
enzimáticas
perjudiciales.
 Subobjetivo 1.3.1. Evaluación de la desconjugación de sales biliares.
 Subobjetivo 1.3.2. Evaluación de la producción de aminas biógenas.
 Subobjetivo 1.3.2.1. Detección de la producción de aminas biógenas en
medios de cultivo diferenciales.
 Subobjetivo 1.3.2.2. Determinación mediante PCR de la presencia de los
genes involucrados en la síntesis de aminas biógenas.
 Objetivo 2. Selección de las cepas de L. lactis potencialmente seguras para su posterior
caracterización como probióticos y/o biocontroladores para el desarrollo de una
acuicultura sostenible.
II. MATERIAL Y MÉTODOS
17
Beneficiario COLFUTURO 2011
II.1. EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE LA PRESENCIA DE FACTORES DE
VIRULENCIA DE LAS CEPAS DE Lactococcus lactis AISLADAS DE LA TRUCHA
ARCOIRIS Y DE SU AMBIENTE ACUÍCOLA
La evaluación de la seguridad in vitro de la colección de 75 cepas de L. lactis aisladas de
trucha arcoíris y su ambiente acuícola (Araujo et al., 2001a,b,c) (Tabla II.1) se llevó a cabo
mediante un procedimiento desarrollado previamente por SEGABALBP (Muñoz-Atienza et al.,
2012), de acuerdo con la metodología que se describe a continuación.
II.1.1. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA
Para evaluar su actividad hemolítica, las 75 cepas de L. lactis aisladas de trucha arcoíris y
su ambiente acuícola se inocularon en caldo MRS y se incubaron a 32ºC en aerobiosis durante
16 horas. Posteriormente, se sembraron mediante la técnica de siembra por estría en placas (20
ml) de agar Columbia (Oxoid, Ltd., Basingstoke, Reino Unido) suplementado con 5% (v/v) de
sangre de caballo (Biomériux®).
Después de su incubación a 37°C durante 24 h, las placas que presentaban zonas de
hemólisis (hemólisis ) alrededor de las colonias fueron consideradas positivas. Como controles
positivos se utilizaron las cepas Enterococcus faecalis SDP10 y P4.
II.1.2. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
Para evaluar su actividad proteolítica, las 75 cepas de L. lactis se inocularon en caldo MRS y
se incubaron a 32ºC en aerobiosis durante 16 horas. Posteriormente, se sembraron mediante la
técnica de siembra por estría en placas (20 ml) de agar Todd-Hewitt (Oxoid) con gelatina al 3%
(p/v)
y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Finalizada la incubación, las placas se
mantuvieron a 4°C durante 5 h. La presencia de un halo transparente (hidrólisis de la gelatina)
alrededor de las estrías de inoculación se consideró indicativa de la actividad proteolítica
(gelatinasa). Como controles positivos se emplearon las cepas E. faecalis SDP10 Y P4.
Tabla II.1. Identificación, origen y fase de desarrollo de aislamiento de la colección de 75
cepas de L. lactis aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola.
18
Beneficiario COLFUTURO 2011
Cepas
Origen
Fase de
desarrollo (días
tras la eclosión)
LT1
LT2
LT3
LT4
LT5
LT6
LT7
LT8
LT9
LT10
LT11
LT12
LT13
LT14
LT15
LT16
LT17
LT18
LT19
LT20
LT21
LT22
LT23
LT24
LT25
LT26
LT27
LT28
LT29
LT30
LT31
LT32
LT33
LT34
LT35
LT36
LT37
LT38
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Agua
Agua
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (90)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
II.1.3. ACTIVIDAD MUCINOLÍTICA
19
Beneficiario COLFUTURO 2011
Cepas
Origen
Fase de
desarrollo (días
tras la eclosión)
LT39
LT40
LT41
LT42
LT43
LT44
LT45
LT46
LT47
LT48
LT49
LT50
LT51
LT52
LT53
LT54
LT55
LT56
LT57
LT58
LT59
LT60
LT61
LT62
LT63
LT64
LT65
LT66
LT67
LT68
LT69
LT70
LT71
LT72
LT73
LT74
LT75
Agua
Agua
Agua
Agua
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Intestino
Intestino
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Intestino
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Vegetación
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (300)
Alevín (300)
Alevín (300)
Alevín (300)
Adulto (450)
Adulto (450)
Adulto (450)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
Adulto (540)
La actividad mucinolítica de las 75 cepas de L. lactis se determinó empleando el método en
placas descrito por Zhou et al. (2001). En primer lugar, estas cepas se inocularon en caldo MRS
y se incubaron a 32ºC en aerobiosis durante 16 horas. Posteriormente, se sembraron 10 µl en
placas (20 ml) de medio de cultivo mínimo anaeróbico (medio B) con la siguiente composición:
triptona (7,5 g/l), casitona (caseína hidrolizada 7,5 g/l), extracto de levadura (30 g/l), extracto
de carne (5,0 g/l), NaCl (5 g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4 (0,5 g/l), cisteína-HCl (0,5 g/l),
resarzurina (0,002 g/l), mucina (HGM 0,5%) y agarosa (Sigma-Aldrich, tipo I-A) (1,5%, p/v);
pH, 7,2. Finalizada la incubación de las placas a 37°C en anaerobiosis durante 72 h se realizó
una tinción con Amido black (0,1%, p/v; Merck) en ácido acético 3,5 M durante 30 min. A
continuación, las placas se lavaron con ácido acético 1,2 M para, en el caso de que existiera
actividad mucinolítica, visualizar la aparición de un halo de decoloración (lisis de la mucina)
alrededor de las estrías de inoculación. Como control positivo se empleó un homogeneizado de
heces frescas de caballo, perro y gato.
II.2.
EVALUACIÓN FENOTÍPICA Y GENOTÍPICA DE LA SENSIBILIDAD/
RESISTENCIA DE Lactococcus lactis FRENTE A LOS PRINCIPALES ANTIBIÓTICOS
EMPLEADOS EN ACUICULTURA, MEDICINA HUMANA Y VETERINARIA
II.2.1. DETERMINACIÓN MEDIANTE EL MÉTODO DE MICRODILUCIÓN EN
PLACA DE LAS CONCENTRACIONES MÍNIMAS INHIBITORIAS (CMI)
La Concentración Mínima Inhibidora (CMI) de los antibióticos establecidos por la EFSA
(Tabla II.2) (EFSA, 2008b y 2012) se determinó mediante el método de microdilución en placa,
considerando en todos los ensayos las disposiciones y los puntos de corte o breakpoints
establecidos por la EFSA (2008b y 2012). Para la realización de estos ensayos, se
resuspendieron un número variable de colonias individuales de las 75 cepas de L. lactis,
desarrolladas previamente en agar MRS a 32ºC durante 32 h, en solución salina (0.85% NaCl,
p/v) estéril hasta una turbidez de 1 según la escala McFarland (aprox., 3 × 108 ufc/ml). A
continuación, las suspensiones bacterianas se diluyeron (1/1.000) en caldo LSM (90% IST; 10%
MRS) (Klare et al., 2007) y, seguidamente, se adicionaron 50 ó 100 μl de las suspensiones
bacterianas a cada pocillo de las placas microtituladoras de 96 pocillos de fondo redondo
(Nunclon™ surface, Nunc™, Dinamarca). Estas placas se sellaron con una lámina de plástico y
se incubaron a 37°C durante 24 horas. Finalizadas las incubaciones, se determinaron las CMI
20
Beneficiario COLFUTURO 2011
como la menor concentración de antibiótico que inhibía el crecimiento bacteriano,
determinándose que una cepa es resistente cuando esta CMI es superior a la establecida como
punto de corte por la EFSA, y sensible cuando este valor es igual o inferior (EFSA, 2008b)
(Tabla II.1).
Tabla II.2. Puntos de corte o breakpoints (mg/l) establecidos para determinar la susceptibilidad
(sensibilidad/resistencia) de L. lactis frente a diversos antibióticosª. Fuente: EFSA (2008b, 2012).
L. lactis
AMP
VAN
GEN
STR
ERY
CHL
TET
KAN
CLI
Q+D
2
4
32
32
1
8
4
64
1
4
ªAbreviaturas: AMP, ampicilina; VAN, vancomicina; GEN, gentamicina; STR, estreptomicina; ERY,
eritromicina; CHL, cloranfenicol; TET, tetraciclina; KAN, kanamicina; CLI, clindamicina; Q+D,
quinupristina+dalfopristina.
II.2.2. DETECCIÓN MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR) DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS
En las cepas en las que se detectaron resistencias adquiridas mediante el método de
microdilución en placa (CMI mayor que el punto de corte establecido por la EFSA), así como
en aquéllas en las que los valores de CMI resultaron iguales a los correspondientes puntos de
corte, se evaluó también la presencia de los determinantes genéticos que confieren resistencia
transmisible a los antibióticos respectivos, empleando para ello la técnica de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). De forma general, las reacciones de PCR se realizaron en
mezclas de reacción de 25 ó 50 l utilizando 150-250 ng de ADN genómico purificado
(InstaGene Matrix, Biorad™), desoxinucleótidos (0,2 mM), cebadores (0,7 M) y 1 U de la
enzima MyTaq™ Mix (Bioline).
Con el objetivo de optimizar las condiciones de las reacciones de PCR, se emplearon
primero termocicladores de gradiente (MJ MiniTM Personal Thermal Cycler, Bio-Rad
Laboratories) y, posteriormente, termocicladores “convencionales” (Techgene, Techne Ltd.).
En todas las experiencias, las muestras se sometieron a un ciclo inicial de desnaturalización
(97°C, 2 min), seguido de 30 ciclos de desnaturalización, hibridación y elongación a los
tiempos y temperaturas apropiados en cada caso, seguido de una elongación final de los
productos amplificados (72°C, 7 min) (Tabla II.3).
21
Beneficiario COLFUTURO 2011
En la Tabla II.3 se muestran las cepas empleadas como control positivo para cada reacción
de PCR, empleándose en todos los caso las cepa L. lactis BB24 como control negativo.
Las parejas de oligonucleótidos específicos de los genes que codifican resistencia transmisible a
kanamicina (acc y aph3”), estreptomicina (aad), tetraciclina (tetK, tetL, tetM, tetB/P, tetO, tetQ,
tetS, tetT, tetW), vancomicina (vanA, vanB, vanC1, vanC2/C3), quinupristina+dalfopristina
(vatD) y clindamincina (lnuA, lnuB) se muestran en la Tabla II.3. Los productos de
amplificación obtenidos (amplicones) se sometieron a electroforesis en geles de agarosa (1-2%,
p/v; D1 Low EEO Agarose, Pronadisa) a 90 V durante 60 min, empleando, como agente de
tinción no tóxico (en sustitución del bromuro de etidio), GelRed (Biotium), y se analizaron
empleando el equipo Gel-Doc 2000, con el soporte informático de análisis de imagen Quantity
One (Bio-Rad Laboratories).
II.3. EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE DIVERSAS ACTIVIDADES ENZIMATICAS
PERJUDICIALES EN LAS CEPAS DE Lactococcus lactis
II.3.1. EVALUACIÓN DE LA DESCONJUGACIÓN DE SALES BILIARES
La capacidad de las 75 cepas de L. lactis para desconjugar las sales biliares
(taurodeoxicolato) se determinó empleando la metodología descrita por Noriega et al. (2006).
En primer lugar, estas cepas se inocularon en caldo MRS y se incubaron a 37ºC en aerobiosis
durante 16 horas. Posteriormente, se inocularon 10l de los cultivos en placas de MRS
suplementado con L-cisteína (0.05%, p/v; Merck) y taurodeoxicolato (0,5%, p/v; SigmaAldrich). Finalizadas las incubaciones de las placas a 37°C en anaerobiosis durante 72 h, la
aparición de halos opacos (por precipitación de los ácidos biliares) alrededor de las colonias se
consideró como un resultado positivo. Como controles positivos se utilizaron homogeneizados
de heces frescas de gato, perro y ternero.
22
Beneficiario COLFUTURO 2011
Tabla II.3. Condiciones de PCR y oligonucleótidos específicos para la detección de los determinantes genéticos transmisibles que
confieren resistencia a diversos antibióticos de relevancia en acuicultura y medicina humana y veterinaria.
Antibiótico
Gen
Cebadores
acc
aacF
aacR
Kanamicina
aph3"
Estreptomicina
aad(E)
tet(K)
tet(L)
tet(M)
tetB(P)
Tetraciclina
tet(O)
tet(Q)
tet(S)
tet(T)
tet(W)
vanA
vanB
Vancomicina
vanC1
vanC2/C3
QuinupristinaDalfopristina
vatD
lnuA
Clindamicina
Secuencia del cebador 5´-3´
GAGCAATAAGGGCATACCAAAAATC 95 °C ,30s; 55 °C ,20s;
72 °C, 2min.
CCGTGCATTTGTCTTAAAAAACTGG
Referencia
CC9
Donabedian et al.
(2003)
95 °C ,30s; 60 °C ,20s;
72 °C , 2min.
292
CC9
Liu et al. (2009)
GCAGAACAGGATGAACGTATTCG 95 °C ,30s; 55 °C ,20s;
72 °C, 2min.
ATCAGTCGGAACTATGTCCC
369
CC9
Klare et al. (2007)
95 °C ,30s; 50 °C ,20s;
72 °C , 2min.
352
C1570
95 °C , 30s; 53 °C,
20s; 72 °C , 2min.
385
CC9
95 °C , 30s; 55 °C,
20s; 72 °C ,2min.
401
CC9
95 °C por 30s, 46 °C,
20s; 72 °C , 2min.
169
-
GCCGATGTGGATTGCGAAAA
aph-3"R
GCTTGATCCCCAGTAAGTCA
aad E I
Tamaño
cepa control
amplicón (pb)
500
aph-3"F
aad EII
Condiciones de PCR
tet KI
CAATACCTACGATATCTA
tet KII
TTGACGTGTCTTTGGTTCA
tet LI
TGGTCCTATCTTCTACTCATTC
tet LII
TTCCGATTTCGGCAGTAC
tet MI
GGTGAACATCATAGACACGC
tet MII
tetB (P)- Fw
CTTGTTCGAGTTCCAATGC
AAAACTTATTATATTATAGTG
tetB (P)- Rv
TGGAGTATCAATAATATTCAC
tet OI
AGCGTCAAAGGGGAATCACTATCC
tet OII
CGGCGGGGTTGGCAAATA
tetQ- Fw
AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG
tetQ- Rv
CGGAGTGTCAATGATATTGCA
tetS- Fw
ATCAAGATATTAAGGAC
tetS- Rv
TTCTCTATGTGGTAATC
tetT- Fw
AAGGTTTATTATATAAAAGTG
tetT- Rv
AGGTGTATCTATGATATTTAC
tetW- Fw
GAGAGCCTGCTATATGCCAGC
tetW- Rv
GGGCGTATCCACAATGTTAAC
vanA-36F
TTGCTCAGAGGAGCATGACG
vanA-992R
TCGGGAAGTGCAATACCTGC
vanB-23F
TTA TCT TCG GCG GTT GCT CG
vanB-1016R
GC5C AAT GTA ATC AGG CTG TC
C1
CCTACCTATTGTTTGTGGAA
C2
CTTCCGCCATCATAGCT
D1
CTCCTACGATTCTCTTG
D2
CGAGCAAGACCTTTAAG
vatD1
GCTCAATAGGACCAGGTGTA
vatD2
TCCAGCTAACATGTATGGCG
Klare et al . (2007)
95 °C ,30s;55 °C ,
20s,72 °C, 2min.
1.723
-
95 °C ,30s; 63 °C ,20s;
72 °C ,2min.
169
-
95 °C , 30s;55 °C ,20s;
72 °C x 2min.
573
-
95 °C , 30s; 46 °C ,
20s; 72 °C ,2min.
169
-
95 °C, 30s; 64 °C ,20s;
72 °c , 2min.
1187
-
95 °C ,30s; 65 °C ,
20s; 72 °C ,2min.
957
RC714
95 °C , 30s; 62 °C,
20s; 72 °C ,2min.
994
RC714
95 °C, 30s; 51 °C ,20s;
72 °C , 2min.
822
CM65; CM66 Liu et al . (2009)
95 °C ,30s; 49 °C, 20s;
72 °C, 2min.
439
CM65; CM66
95 °C , 30s; 60 °C ,
20s; 72 °C , 2min.
272
-
lnuA1 GGTGGCTGGGGGGTAGATGTATTAACTGG 95 °C , 30s; 57 °C ,
lnuA2 GCTTCTTTTGAAATACATGGTATTTTTCGA 20s; 72 °C , 2min.
323
C1570
Lina et al . (1999)
CCTACCTATTGTTTGTGGAA
95 °C ,30s; 54 °C, 20s;
Bozdogan et al .
941
72 °C , 2min.
(1999)
lnuB2
ATAACGTTACTCTCCTATTTC
Cepas control: Cepa Complejo Clonal asociado a hospital (CC9), E. faecium 3Er1; E. faecalis C1570; E. faecium RC714; E. caseiflavus CM65 y CM66
lnuB
lnuB1
Aminov et al.
(2001)
23
Beneficiario COLFUTURO 2011
II.3.2. EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE AMINAS BIÓGENAS.
En las 75 cepas con potencial probiótico se evaluó la producción de aminas biógenas
empleando dos metodologías: (1) desarrollo de las cepas bacterianas en un medio de cultivo
diferencial (Bover-Cid, Holzapfel, 1999) para estimular la descarboxilación y el consiguiente
viraje de color del medio debido al cambio de pH , y (2) determinación mediante PCR de la
presencia de los genes involucrados en la síntesis de aminas biógenas en las cepas que
mostraron un resultado positivo en las pruebas fenotípicas.
II.3.2.1. Detección de la producción de aminas biógenas en medios de cultivo diferenciales
La capacidad de las 75 cepas de L. lactis de producir aminas biógenas (histidina, tiramina,
putrescina y/o cadaverina) se determinó, en primer lugar, según el procedimiento descrito por
Bover-Cid y Holzapfel (1999), basado en su desarrollo en medios de cultivo diferenciales
semisólidos que contienen bromocresol púrpura como indicador del pH y el aminoácido
precursor de la amina biógena a evaluar (histidina, tirosina, ornitina o lisina, respectivamente)
(Sigma). En primer lugar, con el objeto de estimular la actividad enzimática, las cepas se
inocularon en medio MRS (Oxoid) con 0,1% del aminoácido precursor y 0,005% de piridoxal5-fosfato (Sigma) y se desarrollaron a 37ºC durante 24h. Una vez inducida la actividad
enzimática tras 5 transferencias consecutivas en este medio, los cultivos se sembraron por
agotamiento en un medio semisólido compuesto por triptona (0,5%) (Sigma), extracto de
levadura (0,5%) (Pronadisa), extracto de carne (0,5%) (Merck), cloruro sódico (0,25%)
(Merck), glucosa (0,05%) (Panreac), Tween 80® (0,1%) (Panreac), MgSO4 (0,02%) (Merck),
MnSO4 (0,005%) (Merck), FeSO4 (0,004%) (Applichem), citrato amónico (0,2%) (Merck),
tiamina (0,001%) (Fluka), K2PO4 (0,2%) (Merck), CaCO3 (0,01%) (Fluka), piridoxal-5-fosfato
(0,005%) (Sigma), aminoácido (1%), bromocresol (0,006%) (Sigma) y agar (2%) (Pronadisa),
con el pH ajustado a 5.3. Paralelamente, se prepararon placas control que no contenían el
aminoácido precursor. Las placas problema y control inoculadas se incubaron a 37ºC en
aerobiosis y anaerobiosis durante 4 días. Finalizadas las incubaciones, la producción de aminas
biógenas se detectó por el viraje del color del medio de amarillo a violeta debido a su
alcalinización como consecuencia de la descarboxilación del correspondiente aminoácido
precursor. Como control positivo de la producción de histamina, putrescina y cadaverina se
utilizó la cepa Lactobacillus sp. ATCC30a (Colección Americana de Cultivos Tipo) y, como
controles de la producción de tiramina, se emplearon las cepas E. faecium GM29 y NV52.
24
Beneficiario COLFUTURO 2011
II.3.2.2. Determinación mediante PCR de la presencia de los genes involucrados en la
síntesis de aminas biógenas
La técnica de PCR (sección II.2.2) se empleó para evaluar la presencia en las 75 cepas de
L. lactis de los genes que codifican las enzimas responsables de la producción de aminas
biógenas (histidina descarboxilasa, hdc; tirosina descarboxilasa, tdc; ornitina descarboxilasa,
odc, y lisina descarboxilasa, ldc), empleando las condiciones de reacción descritas por Landete
et al. (2007) y las parejas de cebadores específicos para cada gen (Tabla II.4).
Tabla II.4. Condiciones de PCR y oligonucleótidos degenerados para la detección de los determinantes genéticos que codifican
la histidina descarboxilasa (HDC), tirosina descarboxilasa (TDC), ornitina descarboxilasa (ODC) y lisina descarboxilasa
(LDC).
tamaño
(pb)
Condiciones de PCR
Primer
secuencia (5´-3´)
Referencia
CL1
CCWGGWAAWATWGGWAATGGWTA
94 °C, 30 s; 48 °C, 30 s;
Le Jeune et al.
hdc
458
JV17HC
AGACCATACACCATAACCTTG
72 °C, 2 min
(1995)
TD5
CAAATGGAAGAAGAAGTAGG
95 °C, 45 s; 48 °C, 45 s;
tdc
1.100 Coton et al. (2004)
TD2
ACATAGTCAACCATRTTGAA
72 °C, 1 min
3
GTNTTYAAYGCNGAYAARACNTAYTTYGT 95 °C, 30 s; 52 °C, 30 s;
Marcobal et al.
odc
1.446
16
TACRCARAATACTCCNGGNGGRTANGG
72 °C, 2 min
(2004)
CAD1-F
TTYGAYWCNGCNTGGGTNCCNTAYAC
1.098
95 °C, 30 s; 53 °C, 30 s;
De las Rivas et al.
CAD1-R
CCRTGDATRTCNGTYTCRAANCCNGG
ldc
72 °C, 2 min
(2006)
CAD2-F
CAYRTNCCNGGNCAYAA
1.185
CAD2-R
GGDATNCCNGGNGGRTA
*Símbolos de los nucleótidos incluidos en las posiciones con degeneración: K (G o T), R (A o G), W (A o T), Y (C o T), S (C o G), M (A o C),
D (A, G o T) e I (A, G, C o T).
Gen
II.3.2.2.1. Detección de la presencia del gen que codifica la histidina descarboxilasa (HDC).
La histamina es el producto de la descarboxilación de la histidina por la enzima histidina
descarboxilasa (HDC), codificada por el gen hdc, que se amplificó empleando la pareja de
cebadores CL1-JV17HC (Le Jeune et al., 1995) (Tabla II.4). Como control positivo de
amplificación se empleó la cepa Lactobacillus sp. ATCC30a.
II.3.2.2.2. Detección de la presencia del gen que codifica la tirosina descarboxilasa (TDC).
25
Beneficiario COLFUTURO 2011
La tiramina es el producto de la descarboxilación de la tirosina por la enzima tirosina
descarboxilasa (TDC), codificada por el gen tdc, que se amplificó empleando la pareja de
cebadores TD5-TD2 (Coton et al., 2004) (Tabla II.4). Como controles positivos de
amplificación se emplearon Enterococcus faecium GM29 y NV52.
II.3.2.2.3. Detección de la presencia del gen que codifica la ornitina descarboxilasa (ODC).
La putrescina es el producto de la descarboxilación de la ornitina por la enzima ornitina
descarboxilasa (ODC), codificada por el gen odc, que se amplificó empleando la pareja de
cebadores 3-16 (Marcobal et al., 2004) (Tabla II.4). Como control positivo de amplificación se
empleó la cepa Lactobacillus sp. ATCC30a.
II.3.2.2.4. Detección de la presencia del gen que codifica la lisina descarboxilasa (LDC).
La cadaverina es el producto de la descarboxilación de la lisina por la enzima lisina
descarboxilasa (LDC), codificada por el gen ldc, que se amplificó empleando las parejas de
cebadores CAD2-F-CAD2-R y CAD2-F-CAD2-R (De las Rivas et al., 2006) (Tabla II.4).
Como control positivo de amplificación se empleó la cepa Lactobacillus sp. ATCC30a.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
26
Beneficiario COLFUTURO 2011
La seguridad de los probióticos es un aspecto de gran relevancia que preocupa tanto a los
autoridades competentes como a los consumidores (Franz et al., 2010; Sanders et al., 2010;
Salminen y von Wright, 2012), A este respecto, la EFSA ha elaborado y actualizado
recientemente una lista de los microorganismos con estatus QPS, entre los que se incluyen la
especie L. lactis, proporcionando así un sistema genérico de asesoramiento de la seguridad de
los microorganismos introducidos deliberadamente en la alimentación, no sólo animal sino
también humana. Este calificativo se establece principalmente con base en cuatro pilares: (i)
establecimiento de la identidad taxonómica; (ii) cuerpo de conocimiento; (iii) posible
patogenicidad, y (iv) empleo final, lo que permite que cualquier microorganismo cuya identidad
se pueda determinar inequívocamente, y se garantice su pertenencia a un grupo QPS, se pueda
emplear como aditivo zootécnico con el único requerimiento de demostrar la ausencia de
determinantes genéticos transmisibles de resistencia a antibióticos (EFSA, 2005a, 2005b, 2007,
2008, 2011; Franz et al., 2010; Donohue y Gueimonde, 2012; Salminen y von Wright, 2012). A
este respecto, en trabajos previos se procedió a la identificación y filiación taxonómica
inequívocas de las 75 cepas de L. lactis aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola
(Araujo et al., 2001a,b,c) evaluadas en este trabajo para determinar su seguridad in vitro.
Conviene destacar que aunque los lactococos, principalmente L. lactis subesp. lactis y L. lactis
subesp. cremoris, han sido consumidos durante mucho tiempo por el hombre a través de los
productos lácteos, y, por lo tanto, tienen una larga historia de consumo seguro, se han descrito
en la literatura algunos casos de endocarditis, septicemia, neumonitis necrotizante artritis
séptica y abscesos cerebrales y hepáticos cutos agentes etiológicos se identificaron como L.
lactis (Casalta y Montel, 2008; Salminen y von Wright, 2012; von Wright, 2012). A este
respecto, resulta relevante mencionar que, en la práctica totalidad de los casos descritos, los
pacientes afectados tenían factores de predisposición como enfermedad subyacente, sistema
inmune inmunocomprometido y elevada edad; asimismo, considerando la baja incidencia de las
infecciones causadas por L. lactis, teniendo además en cuenta las elevadas dosis a las que se
ingieren en los productos lácteos, los extremadamente raros casos indivduales descritos no
deben considerarse como una indicación de la patogenicidad de L. lactis. Además, no puede
descartarse que en muchas de estas infecciones el agente causal no fuese L. lactis sino L.
garvieae, que es una especie que puede resultar patógena no sólo para el hombre sino también
para los peces y otros animales (Casalta y Montel, 2008; Salminen y von Wright, 2012; von
Wright, 2012). Por otra parte, se ha sugerido que L. lactis pudo ser el agente causal de la muerte
27
Beneficiario COLFUTURO 2011
masiva de más de 3.000 aves acuáticas en el sur de España durante el periodo septiembrenoviembre de 1998 (Goyache et al., 2001); no obstante, en este estudio no se pudo demostrar
inequívocamente la involucración de L. lactis en este brote, aunque se sugirió que estos
animales podrían actuar como reservorios de estos microorganismos. Considerando lo
anteriormente expuesto, en este trabajo se evaluó la seguridad in vitro de la citada colección de
75 cepas de L. lactis aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola, empleando para ello un
protocolo de evaluación de la seguridad, desarrollado previamente por SEGABALBP (MuñozAtienza et al., 20132), que es más exhaustivo que el propuesto por la EFSA para las cepas de L.
lactis (EFSA, 2005, 2007, 2008, 2011, 2012)
III.1.
EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE LA PRESENCIA DE FACTORES DE
VIRULENCIA DE LAS CEPAS DE Lactococcus lactis AISLADAS DE LA TRUCHA
ARCOÍRIS Y SU AMBIENTE ACUÍCOLA
III.1.1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA
Las bacterias patógenas tienen la capacidad de producir una gran variedad de proteínas que
contribuyen a su capacidad para colonizar y causar enfermedades en el hospedador, entre las
que destacan las hemolisinas (alfa, beta, gamma y delta), que pueden degradar sus tejidos
locales para convertirlos en nutrientes para las bacterias (Howe et al., 1996). Aunque se han
descrito cepas de bacterias lácticas, principalmente de los géneros Enterococcus y
Streptococcus, así como de las especies L. lactis y L. garvieae que poseen actividad hemolítica
(Chow et al., 1993; Gilmore et al., 1994; Bolotin et al., 1999; Eaton y Gasson, 2001; Ogier y
Serror, 2008; Franz et al., 2010), conviene destacar que ninguna de las 75 cepas de L. lactis
aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola evaluadas en este trabajo mostró este fenotipo
asociado a la patogenicidad bacteriana mediante el ensayo de hemólisis en placa (Figura 3.1).
Aunque esta prueba resulta ser útil, económica y de gran fiabilidad, resulta conveniente
determinar por PCR, especialmente en las cepas positivas, la presencia de los determinantes
génicos cylL y cylB que, entre otros, están involucrados en síntesis de la citolisina/hemolisina
(Chow et al., 1993).
28
Beneficiario COLFUTURO 2011
C+1
c-
1
C+2
Figura 3.1. Determinación fenotípica de la actividad hemolítica de cultivos de L. lactis LT75 (1) en
placas de agar sangre. Como controles positivos (C+) (zona transparente por la lisis de los eritrocitos)
se emplearon E. faecalis P4 (C+1) y E. faecalis SDP10 (C+2) y, como control negativo (C-), se utilizó
E. faecalis P36.
III.1.2 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
La gelatinasa es una metaloendopeptidasa extracelular capaz de degradar sustratos como la
gelatina, los fragmentos insolubles del colágeno, la cadena β de la insulina, la hemoglobina, la
sustancia vasoconstrictora endotelina-1, la fibrina polimerizada y otros péptidos bioactivos de
los tejidos del hospedador, mejorando así la migración y difusión bacteriana por los tejidos
dañados (Waters et al., 2003). Además, la gelatinasa provee de nutrientes a la bacteria
degradando el tejido del hospedador y presenta algún tipo de función en la formación de
biopelículas. A este respecto, conviene destacar que ninguna de las 75 cepas de L. lactis
aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola mostró actividad proteolítica (gelatinasa)
(Figura 3.2), que representa uno de los factores de virulencia característicos del género
Enterococcus y que, hasta la fecha, no ha sido descrito en L. lactis.
29
Beneficiario COLFUTURO 2011
c+
c-
4
3
1
2
Figura 3.2. Determinación fenotípica de la actividad proteolítica de L. lactis LT71 (1), LT72 (2),
LT74 (3) y LT75 (4) en placas de Todd-Hewit con gelatina. Como control positivo (C+) (zona de
turbidez por hidrólisis de la gelatina) se empleó E. faecalis P4 y, como control negativo (C-), se utilizó
L. lactis BB24.
III.1.3. ACTIVIDAD MUCINOLÍTICA
Una de las barreras intestinales es el epitelio gastrointestinal, que está recubierto de una capa
de mucus compuesta por mucinas (glicoconjugados compuestos de un núcleo de proteína unido
a cadenas de hidratos de carbono) que desempeña un importante papel al evitar que las
bacterias patógenas se adhieran al tracto gastrointestinal. Algunas bacterias tienen una actividad
proteolítica que provoca la degradación de la mucina y, por tanto, les permite adherirse más
fácilmente a la mucosa intestinal produciendo enfermedad, por lo que para la selección de un
microorganismo probiótico debe tenerse en cuenta que no tenga actividad mucinolítica. A este
respecto, es importante destacar que ninguna de las 75 cepas de L. lactis aisladas de trucha
arcoíris y su ambiente acuícola evaluadas en este trabajo mostró actividad mucinolítica (Figura
3.3).
30
Beneficiario COLFUTURO 2011
c+
1
Figura 3.3. Determinación fenotípica de la actividad mucinolítica de L. lactis LT46 (1) en placas
de agar B con mucina. Como control positivo (C+) (zona transparente por hidrólisis de la mucina) se
empleó un homogeneizado de heces frescas de gato.
III.2.
EVALUACIÓN
FENOTÍPICA
Y
GENOTÍPICA
DE
LA
SENSIBILIDAD/RESISTENCIA DE L. lactis A LOS PRINCIPALES ANTIBIÓTICOS
EMPLEADOS EN ACUICULTURA Y MEDICINA HUMANA Y VETERINARIA
En los últimos años, la resistencia a uno o varios antibióticos (multi-resistencia) en las
bacterias lácticas ha motivado un gran interés y preocupación, ya que estos microorganismos,
incluidos los lactococos, pueden actuar como reservorios de genes de resistencia a antibióticos,
que, posteriormente, pueden transferirse a otras bacterias, tanto ambientales como comensales
y/o patógenas del hombre y/o los peces y otros animales (Bernardeau et al., 2008; Casalta y
Montel, 2008). En este contexto, queda destacar que existen dos tipos de resistencia a
antibióticos: la intrínseca y la adquirida. La resistencia intrínseca (también denominada
resistencia natural) es inherente a cada especie bacteriana; sin embargo, la resistencia adquirida
aparece cuando una cepa sensible a un determinado antibiótico se convierte en resistente debido
a, por ejemplo, una mutación cromosómica (resistencia adquirida no transmisible) o a la
adquisición de un gen de resistencia que puede propagarse a otras cepas de la misma o diferente
especie mediante transferencia horizontal (resistencia adquirida transmisible). A este respecto,
como se mencionó anteriormente, la EFSA ha actualizado recientemente los criterios utilizados
para la evaluación de microorganismos resistentes a antibióticos de importancia clínica y
31
Beneficiario COLFUTURO 2011
veterinaria (EFSA, 2008b, 2011, 2012), estableciendo la obligatoriedad de que, antes de
comercializar como probiótico una cepa perteneciente a una especie con el estatus QPS, resulta
necesario demostrar la ausencia de genes de resistencia a antibióticos (resistencia transmisible).
III.2.1. DETERMINACIÓN MEDIANTE EL MÉTODO DE MICRODILUCIÓN EN
PLACA DE LAS CMI DE LOS ANTIBIÓTICOS
En la Tabla III.1 y Figura 3.4 se muestran los resultados de la susceptibilidad
(sensibilidad/resistencia) de las 75 cepas de L. lactis aisladas de trucha arcoíris y su ambiente
acuícola, determinada por el método de microdilución en placa para los 11 antibióticos
estipulados por la EFSA (2008, 2012).
Tabla III.1 Sensibilidad/resistencia de 75 cepas de Lactococcus lactis frente a los principales
antibióticos empleados en acuicultura, medicina humana y veterinariaa.
Cepas
LT1
LT2
LT3
LT4
LT5
LT6
LT7
LT8
LT9
LT10
LT11
LT12
LT13
LT14
LT15
LT16
LT17
LT18
LT19
LT20
LT21
LT22
LT23
LT24
AMP
1
0.25
≤0,125
1
0.25
0.5
0.25
1
0.5
0.5
1
0.5
1
0.5
1
0.25
0.25
0.5
0.5
0.5
1
0.5
1
0.25
VAN
1
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
>32
≤0,5
>32
>32
GEN
8
≤2
16
8
4
≤2
16
64
8
32
64
16
64
32
64
32
16
16
32
16
16
16
8
16
STR
64
≤4
8
64
32
32
16
64
8
32
64
16
64
32
64
32
16
16
32
16
16
16
8
16
ERY
1
≤0,125
0.5
1
≤0,125
≤0,125
≤0,125
1
≤0,125
≤0,125
1
≤0,125
1
≤0,125
1
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
32
Beneficiario COLFUTURO 2011
CHL
4
2
2
4
2
2
2
4-2
4-2
4
≤1
2
4-2
≤1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
TET
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
2
≤0,5
2
1
KAN
128
≤4
8
128
16
16
8
64
≤4
8
128
≤4
128
8
128
16
≤4
≤4
≤4
≤4
16
≤4
16
≤4
CLIN Q+D
2
2
≤0,25 ≤0,25
0.5
1
2
1
0.5
2
≤0,25
1
≤0,25
1
1
2
≤0,25
1
≤0,25
1
2
2
≤0,25 0.5
1
1
1
1
≤0,25
1
≤0,25
2
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
Tabla III.1 (continuación)
Ce pas
LT25
LT26
LT27
LT28
LT29
LT30
LT31
LT32
LT33
LT34
LT35
LT36
LT37
LT38
LT39
LT40
LT41
LT43
LT44
LT45
LT46
LT47
LT48
LT49
LT50
LT51
LT52
LT53
LT54
LT55
LT56
LT57
LT58
LT59
LT60
LT61
LT62
LT63
LT64
LT65
LT66
LT67
LT68
LT69
LT70
LT71
LT72
LT73
LT74
LT75
AMP
0,5
0,25
0,5
0,5
0,25
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
1
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,25
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,25
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0,5
1
0,25
0,5
0,25
0,25
0,5
0,25
0,25
1
0,5
0,5
0,25
1
0,25
VAN
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
1
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
1
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
1
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
GEN
32
32
16
16
32
16
32
32
16
32
32
16
16
64
32
16
16
16
16
32
16
16
4
≤2
4
4
≤2
8
8
≤2
≤2
≤2
≤2
≤2
≤2
>128
16
≤2
≤2
≤2
≤2
8
8
8
8
≤2
≤2
≤2
8
8
STR
32
32
16
16
32
16
32
32
16
32
32
16
16
64
32
16
16
16
16
32
16
16
16
16
16
32
32
16
16
8
32
32
16
16
8
32
64
16
16
8
8
32
16
32
64
16
16
32
64
64
ERY
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
1
≤0,125
0,25
0,25
0,25
0,25
≤0,125
0,25
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
0,25
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
1
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
≤0,125
1
≤0,125
≤0,125
≤0,125
1
≤0,125
CHL
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
≤1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
≤1
2
2
2
≤1
2
2
4
2
2
≤1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
TET
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
>32
≤0,5
>32
>32
>32
>32
>32
>32
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
>32
4
≤0,5
≤0,5
≤0,5
>32
≥32
>32
≤0,5
≤0,5
>32
≤0,5
≤0,5
>32
≤0,5
>32
≤0,5
>32
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
≤0,5
KAN
≤4
≤4
≤4
≤4
32
≤4
8
16
8
≤4
8
≤4
8
128-64
16
≤4
8
16
8
8
8
≤4
16
16
8
16
16
4
≤4
≤4
8
8
8
≤4
≤4
≤4
128
≤4
8
≤4
8
16
8
32
128
8
16
8
64
16
CLIN Q+D
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
2
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
1
≤0,25
2
≤0,25
1
≤0,25
1
2
2
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
4
≤0,25
1
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
4
≤0,25
4
≤0,25
1
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
4
≤0,25
2-1
≤0,25
2
≤0,25
2
2
2
≤0,25
2
≤0,25
2
≤0,25
1
≤0,25
2
≤0,25
1
≤0,25
2
≤0,25
2
2
2
0,5
1
≤0,25
1
≤0,25
1
1
1
≤0,25
1
ͣLos valores de CMI destacados en color rojo son superiores a los puntos de corte establecidos por la
EFSA (2008b, 2012), mientras que los señalados en amarillo se encuentran en el punto de corte .
33
Beneficiario COLFUTURO 2011
De los resultados obtenidos se dedujo lo siguiente (Tabla III.1):
 30 de las 75 cepas de L. lactis (40,0%) mostraron resistencia adquirida a uno o más
antibióticos.
 9 de las 75 cepas de L. lactis (12,0%) presentaron multi-resistencia adquirida (a dos o
más antibióticos).
 14 de las 75 cepas de L. lactis (21,3%) mostraron resistencia adquirida a la tetraciclina.
 11 de las 75 cepas de L. lactis (14,7%) mostraron resistencia adquirida a la
estreptomicina.
 8 de las 75 cepas de L. lactis (10,7%) mostraron resistencia adquirida a la kanamicina.
 6 de las 75 cepas de L. lactis (8,0%) mostraron resistencia adquirida a la clindamicina.
 6 de las 75 cepas de L. lactis (8,0%) mostraron resistencia adquirida a la gentamicina.
 3 de las 75 cepas de L. lactis (4,0%) mostraron resistencia adquirida a la vancomicina.
 Ninguna de las 75 cepas de L. lactis presentó resistencia adquirida a la ampicilina,
eritromicina, el cloranfenicol y la quinupristina+dalfopistrina.
Figura 3.4. Porcentajes de sensibilidad/resistencia de las 75 cepas de L. lactis frente a los
principales antibióticos empleados en acuicultura y medicina humana y veterinaria. Otros
antibióticos incluyen la ampicilina, la eritromicina, el cloranfenicol y la quinupristina+dalfopistrina.
34
Beneficiario COLFUTURO 2011
Uno de los inconvenientes del método de microdilución en placa empleado para la
determinación de las CMI a los antibióticos es que no existe una cepa reconocida como control
positivo estándar. Asimismo, la elección del medio de crecimiento constituye uno de los puntos
críticos para la fiabilidad de los resultados de estos ensayos (Hummel et al., 2007; Klare et al.,
2007); a este respecto, L. lactis tiende a ser exigente en cuanto a las condiciones atmosféricas,
de temperatura, acidez y de suplementación de nutrientes (principalmente hidratos de carbono)
requeridos para su crecimiento. Conviene destacar que el medio de cultivo LSM y las
condiciones de crecimiento empleadas en este trabajo para la determinación de las CMI
resultaron ser adecuados, ya que permitieron el crecimiento de las 75 cepas de L. lactis a
evaluar y, por tanto, la determinación de su susceptibilidad a los antibióticos analizados.
Aunque, como se mencionó anteriormente, el género Lactococcus tiene una larga historia de
consumo seguro para el ser humano y de no mostrar patogenicidad (status QPS), se ha descrito
que algunas cepas de lactococos pueden contener plásmidos movilizables y, por lo tanto,
realizar
intercambio de material genético mediante conjugación intra e inter-genéricos
(Hummel et al., 2007); por lo tanto, existe el potencial de propagación horizontal de la
resistencia a los antibióticos. En consecuencia, y teniendo en cuenta que la determinación de las
CMI no es suficiente para distinguir entre resistencias adquiridas transmisibles y no
transmisibles (EFSA, 2008b), en el caso de las cepas en las que se encontraron resistencias
adquiridas
(a vancomicina, gentamicina, estreptomicina, tetraciclina, kanamicina y/o
clindamicina) por el método de microdilución en placa (Tabla III.1), se realizaron, además,
diversas experiencias de PCR para determinar la presencia de los correspondientes genes de
resistencia. Asimismo, para las cepas en las que su CMI coincidió con el punto de corte para el
correspondiente antibiótico, también se empleó la técnica de PCR con el objeto de asegurar,
presuntivamente, la ausencia de los respectivos genes de resistencia.
III.2.2.
DETECCIÓN
MEDIANTE
PCR
DE
GENES
DE
RESISTENCIA A
ANTIBIÓTICOS
Con el objeto de identificar las cepas con resistencia adquirida transmisible a la kanamicina,
se determinó mediante PCR la presencia de los genes acc y aph 3”. Las cepas evaluadas fueron
L. lactis LT1, LT4, LT8, LT11, LT13, LT15, LT38, LT62, LT70 y LT74, empleando, como
control positivo, E. faecium 3Er1 CC9 (Complejo Clonal Asociado a Hospital), y, como control
35
Beneficiario COLFUTURO 2011
negativo, L. lactis BB24. Ninguna de las cepas evaluadas amplificó los dos genes evaluados (no
se muestran los resultados).
En lo que respecta a la resistencia adquirida transmisible a la estreptomicina, se determinó
mediante PCR la presencia del gen add. Las cepas evaluadas fueron L. lactis LT1, LT4, LT8,
LT11, LT13, LT15, LT38, LT64, LT70, LT74 y LT75, utilizando como control positivo E.
faecium 3Er1 CC9 (Complejo Clonal Asociado a Hospital), y, como control negativo, L. lactis
BB24. Ninguna de las cepas evaluadas amplificó el gen add (no se muestran los resultados).
La evaluación de la resistencia a la vancomicina se realizó mediante la amplificación por
PCR de los genes vanA, vanB, vanC1 y vanC2/C3. Las cepas evaluadas por PCR fueron L.
lactis LT21, LT23 y LT24, empleando como control positivo para la amplificación de vanA, E.
faecium RC714 y para el gen vanC2/C3 las cepas Enterococcus casseliflavus CM65 y CM66.
Debido a la falta de disponibilidad, no se empleó ningún control positivo para la amplificación
de vanB y vanC1, y, en todos los casos, se utilizó como control negativo L. lactis BB24. La
cepa LT23 fue la única que amplificó el gen vanB (Figura 3.5). Ninguna de las cepas evaluadas
amplificó los genes vanA, vanC1 y vanC2/C3 (no se muestran los resultados).
M
994 pb
1
2
3
C+
C-
Figura 3.5. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR (994 pb)
correspondiente al gen vanB que codifica la resistencia a la vancomicina
empleando el ADN genómico de las cepas L. lactis LT21 (1), LT23 (2) y LT24
(3). Como control positivo (C+) se empleó el ADN genómico de E. faecium
RC714 y, como control negativo (C-), se utilizó L. lactis BB24. M, marcador de
tamaño molecular 2000-bp Hyperladder II (Bioline).
Para
la
determinación
de
la
resistencia
adquirida
transmisible
a
la
quinupristina+dalfopristina, se evaluó mediante PCR la presencia del gen vatD. Las cepas
36
Beneficiario COLFUTURO 2011
evaluadas fueron L. lactis LT48, LT53, LT54 y LT58. Debido a la falta de disponibilidad, no se
empleó ninguna cepa como control positivo, y, como control negativo, se utilizó L. lactis BB24.
Ninguna de las cepas evaluadas amplificó el gen vatD (no se muestran los resultados).
Con el objeto de identificar las cepas con resistencia adquirida transmisible a la
clindamicina se se evaluó mediante PCR la presencia de los genes lnuA y lnuB. Las cepas
evualuadas fueron L. lactis LT1, LT4, LT11, LT38, LT62 y
LT70. Debido a la falta de
disponibilidad, no se empleó ninguna cepa como control positivo, y, en ambos caso, se utilizó
como control negativo L. lactis BB24. Ninguna de las cepas evaluadas amplificó el gen vatD
(no se muestran los resultados).
En lo que respecta a la resistencia adquirida transmisible a la estreptomicina, se determinó
mediante PCR la presencia de los genes tetK, tetL, tetM, tetB/P, tetQ, tetT y tetO (Tabla III.2;
Figuras 3.6, 3.7, 3.8 y 3.9). Las cepas evaluadas fueron L. lactis LT38, LT40, LT41, LT42,
LT43, LT44, LT45, LT46, LT53, LT54, LT58, LT59, LT60, LT63, LT66, LT68, LT70, LT76. Las
cepas empleadas como control positivo fueron E. faecalis C1570 (tetK+) y E. faecium CC9
(tetL+ y tetM+). Debido a la falta de disponibilidad, no se empleó ninguna cepa como control
positivo para tetB/P, tetQ, tetT y tetO, y, en todos los casos, se utilizó como control negativo L.
lactis BB24.
Tabla III.2. Evaluación mediante PCR de la presencia de genes de resistencia a la tetraciclina (tetK, tetL, tetM, tetB/P,tetQ, tetT y
tetO ) en las 18 cepas de L. lactis que mostraron resistencia a este antibiótico mediante el método de microdilución en placa
(CMI).
Gen LT38 LT40 LT41 LT42 LT43 LT44 LT45 LT46 LT53 LT54 LT58 LT59 LT60 LT63 LT66 LT68 LT70 LT76
tetK
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
telL
+
tetM
tetB/P tetQ
tetT
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
tetO
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
En las cepas L. lactis LT38, LT41, LT42, LT43, LT44, LT46, LT53, LT54, LT58, LT59, LT60,
LT63 y LT68 se detectó la presencia de tetK. En la cepa LT53 se amplificó tetL. En las cepas
LT38, LT41, LT42, LT43, LT44, LT46, LT53, LT54, LT59, LT60, LT63 y LT66 se demostró la
presencia de tetT. Las cepas LT38, LT40, LT41, LT42, LT43, LT44, LT46, LT53, LT54, LT59,
LT60, LT63 y LT66 amplificaron tetO. En ninguna de las cepas evaluadas se detectó la
presencia de los genes de resistencia tetM, tet B/P y tetQ.
37
Beneficiario COLFUTURO 2011
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
17
C+
352 pb
Figura 3.6. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR (352 pb) correspondiente al
gen tetK que codifica la resistencia a la tetraciclina empleando el ADN genómico de las cepas L.
lactis LT38 (1), LT40 (2), LT41 (3), LT42 (4), LT43 (5), LT44 (6), LT45 (7), LT46 (8), LT53 (9),
LT54 (10), LT58 (11), LT59 (12), LT60 (13), LT63 (14), LT66 (15), LT68 (16) y LT70 (17). Como
control positivo (C+) se empleó el ADN genómico de E. faecalis C1570 y, como control negativo (C-),
se utilizó L. lactis BB24. M, marcador de tamaño molecular 2000-bp Hyperladder II (Bioline).
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 C+
C-
385 pb
Figura 3.7. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR (385 pb)
correspondiente al gen tetL que codifica la resistencia a la tetraciclina empleando el
ADN genómico de las cepas L. lactis LT38 (1), LT40 (2), LT41 (3), LT42 (4), LT43 (5),
LT44 (6), LT45 (7), LT46 (8), LT53 (9), LT54 (10), LT58 (11), LT59 (12), LT60 (13),
LT63 (14), LT66 (15), LT68 (16) y LT70 (17). Como control positivo (C+) se empleó el
ADN genómico de Cepa Complejo Clonal asociado a hospital (CC9) E. faecium 3Erl y,
como control negativo (C-), se utilizó L. lactis BB24. M, marcador de tamaño molecular
2000-bp Hyperladder II (Bioline).
38
Beneficiario COLFUTURO 2011
1
M
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17
C-
169 pb
Figura 3.8. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR (169 pb) correspondiente
al gen tetT que codifica la resistencia a la tetraciclina empleando el ADN genómico de las
cepas L. lactis LT38 (1), LT40 (2), LT41(3), LT42 (4), LT43 (5), LT44 (6), LT45 (7), LT46 (8),
LT53 (9), LT54 (10), LT58 (11), LT59 (12), LT60 (13), LT63 (14), LT66 (15), LT68 (16) y
LT70 (17). En estos ensayos, debido a la falta de disponibilidad, no se empleó ninguna cepa
como control positivo y, como control negativo (C-), se utilizó el ADN genómico de L. lactis
BB24. M, marcador de tamaño molecular 2000-bp Hyperladder II (Bioline)
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
11
12 13 14 15 16
17
C-
1723 pb
Figura 3.9. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR (1723 pb) correspondiente al
gen tetO que codifica la resistencia a la tetraciclina empleando el ADN genómico de L. lactis LT38
(1), LT40 (2), LT41(3), LT42 (4), LT43 (5), LT44 (6), LT45 (7), LT46 (8), LT53 (9), LT54 (10),
LT58 (11), LT59 (12), LT60 (13), LT63 (14), LT66 (15), LT68 (16) y LT70 (17). En estos ensayos,
debido a la falta de disponibilidad, no se empleó ninguna cepa como control positivo y, como
control negativo (C-), se utilizó el ADN genómico de L. lactis BB24. M, marcador de tamaño
molecular 2000-bp Hyperladder II (Bioline).
39
Beneficiario COLFUTURO 2011
Conviene destacar que las bacterias lácticas albergan frecuentemente plásmidos de
diversos tamaños, habiéndose descrito que algunos de ellos codifican los determinantes
genéticos que confieren resistencia a diversos antibióticos en L. lactis, Lactobacillus spp. y
Enterococcus spp. (Gevers et al., 2003). A este respecto, la mayoría de los estudios se han
realizado con Enterococcus spp., dado que estas bacterias causan numerosas y graves
infecciones en el ser humano (Hummel et al., 2007; Ogier y Serror, 2008; Franz et al., 2010).
No obstante, diversos estudios han descrito la presencia en L. lactis de resistencias adquiridas
transmisibles a diversos antibióticos, entre los que se incluyen la tetraciclina, cloranfenicol,
clindamicina estreptomicina, estreptograminas y lincosamidas (Flórez et al., 2008; Walther et
al., 2008). Conviene destacar que, en este trabajo, sólo se detectaron resistencias adquiridas
transmisibles a la vancomicina (vanB; L. lactis LT23) y a la tetraciclina (tetK, tetL, tetT y/o
tetO). A este respecto, en 15 de las 18 cepas de L. lactis (83,3%) evaluadas por mostrar
resistencia adquirida frente a la tetraciclina, mediante el método de microdilución en placa
(CMI) (Tabla III.1) se detectó la presencia de uno o varios de estos genes (Tabla III.2; Figs. 3.6.
a 3.9). Asimismo, resulta relevante mencionar que, de estas 15 cepas, todas a excepción de tres
amplificaron dos o más de los genes de resistencia a la tetraciclina descritos hasta la fecha (tetT
y tetO, 1 cepa; tetK, tetT y tetO, 10 cepas; tetK, tetT, tetO y tetL; 1 cepa). Conviene destacar
que sólo se detectaron genes de resistencia a antibióticos (tetK, tetT y tetO) en una de las cepas
(L. lactis LT54) evaluadas por presentar valores de CMI iguales a los puntos de corte
establecidos por la EFSA (2008b, 2012).
III.3. EVALUACIÓN FENOTÍPICA DE DIVERSAS ACTIVIDADES ENZIMATICAS
PERJUDICIALES EN LAS CEPAS DE Lactococcus lactis
III.3.1. EVALUACIÓN DE LA DESCONJUGACIÓN DE SALES BILIARES
Uno de los efectos deseados en un probiótico es la habilidad de resistir a las sales biliares
del intestino, lo que puede depender de su capacidad para hidrolizar las sales biliares (actividad
hidrolasa de las sales biliares, BSH). Las sales biliares son sintetizadas en el hígado, a partir del
colesterol, y se secretan en forma conjugada con la glicina o la taurina al duodeno, donde
facilitan la absorción de las grasas para su posterior entrada en la circulación entero-hepática.
Durante este proceso, las sales biliares pueden experimentar dos modificaciones importantes
llevadas a cabo por la microbiota intestinal: (i) la desconjugacion de las sales biliares primarias
por las enzimas hidrolasas-BSH, lo que resulta en la liberación de residuos aminoácidos, y (ii)
40
Beneficiario COLFUTURO 2011
la
formación
de
ácidos
biliares
desconjugados
(principalmente
ácidos
cólico
y
quenodeoxicólico), que, posteriormente, pueden ser dehidroxilados a ácidos biliares
secundarios (deoxicólico y litocólico, respectivamente) (Noriega et al, 2006). Por este motivo,
la presencia de enzimas hidrolasas-BSH en los probióticos hace que éstos sean más tolerantes a
las sales biliares, lo que también ayuda a reducir los niveles de colesterol sanguíneo en el
hospedador.
La desconjugación de las sales biliares ha sido incluida hace algún tiempo por la
Organización Mundial de la Salud como una de las principales actividades que debe tener un
microorganismo probiótico humano (FAO/WHO, 2002). Con el fin de que las bacterias
utilizadas como probióticos tengan un efecto beneficioso para la salud, éstos deben superar
barreras biológicas en el tracto gastrointestinal, tales como los ácidos del estómago y la bilis del
intestino (Lankaputhra y Shah, 1995¸ Nikoskelainen et al. 2001, Kimoto et al., 2002; Balcazar
et al., 2008). Asimismo, la adaptación a altas concentraciones de ácidos biliares podría ser una
herramienta valiosa para incrementar la habilidad de los microorganismos probióticos para
sobrevivir en el tracto gastrointestinal (Patel et al., 2010). A este respecto, Kimoto et al., (2002)
estudiaron la tolerancia a la bilis de Lacotococcus spp. demostrando que algunas de las cepas
evaluadas mostraban tolerancia a elevadas concentraciones de bilis, por lo que se seleccionaron
como probióticos potenciales.
3
2
4
1
Figura 3.10. Determinación fenotípica de la desconjugación de las sales biliares por L. lactis LT7
(1), LT9 (2), LT10 (3) y LT11 (4) en placas de MRS suplementado con L-cisteína y
taurodeoxicolato. Como controles positivos se emplearon heces frescas de perro (C1+) y gato (C2+).
41
Beneficiario COLFUTURO 2011
Conviene destacar que ninguna de las 75 cepas de L. lactis aisladas de trucha arcoíris y su
ambiente acuícola evaluadas en este trabajo mostró capacidad para desconjugar las sales
biliares evaluadas en este trabajo (taurodeoxicolato) (figura 3.10). Sin embargo, esto no quiere
decir que en las pruebas in vivo las cepas de L. lactis seleccionadas no sean capaces de
sobrevivir en el tracto gastrointestinal de la trucha arcoíris, ya que se ha demostrado que los
resultados de los ensayos in vitro e in vivo pueden ser contradictorios (Burbank et al., 2012).
III.3.2. EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE AMINAS BIÓGENAS
1
2
Las aminas biógenas son bases
orgánicas de bajo tamaño molecular que aparecen en
diversos alimentos como el pescado, el queso, el vino, los embutidos curados y otros productos
fermentados, y que ejercen efectos fisiológicos moderadamente graves que se manifiestan como
cuadros alérgicos (Coton, et al., 2010). La presencia de estos compuestos en los alimentos
puede ser debida a la descarboxilación de los aminoácidos por enzimas microbianas, producidas
por bacterias lácticas u otros microorganismos, y en alimentos no fermentados (principalmente
el pescado) son producidas por microrganismos indeseables y son indicativas de su deterioro
(Halász et al., 1994; ten Brink et al., 1990). La histamina y la tiramina han sido muy estudiadas
debido a sus efectos tóxicos derivados de sus propiedades vasoactivas y psicoactivas. A este
respecto, la histamina ha sido reconocida como la causa de la intoxicación por escómbridos
(intoxicación histamínica), mientras que la tiramina está relacionada con migrañas y crisis
hipertensivas en pacientes tratados con el inhibidor de la enzima monoamino-oxidasa (MAO).
En lo que respecta a la putrescina y la cadaverina, su problemática radica en que potencian los
efectos de otras aminas biógenas (especialmente histamina y tiramina) y/o dificultan su
detoxificación en el organismo (Vidal-Carou, 1990; Silla, 1996; Landete et al., 2007). La
capacidad de los microorganismos para descarboxilar los aminoácidos precursores de estas
aminas biógenas ha sido descrita principalmente en Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp.,
enterococos y algunas otras bacterias lácticas, entre las que se incluyen L. lactis y otros
lactococos (Landete et al., 2007; Bunková et al., 2009; Ladero et al., 2011)). Por lo tanto,
resulta conveniente proceder a la detección de las cepas productoras de estas sustancias con el
objeto de descartarlas para su empleo como probióticos. A este respecto, actualmente se dispone
de diversas metodologías cualitativas y cuantitativas, tanto fenotípicas como genotípicas, para
la determinación de la producción de aminas biógenas, entre las que se incluyen los ensayos en
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Beneficiario COLFUTURO 2011
placas de cultivo, la cromatografía líquida de alta presión (HPLC, del inglés High Pressure
Liquid Chromatography), la cromatografía gas-líquido y la cromatografía en capa fina (TLC,
del inglés Thin-Layer Chromatography) y la técnica de PCR (García-Moruno et al., 2005). En
este trabajo se compararon dos metodologías: (1) un ensayo fenotípico (medios de cultivo
diferenciales), y (2) un ensayo genotípico (PCR), con el objetivo de evaluar para las 75 cepas
de L. lactis aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola la producción de aminas biógenas
(histamina, tiramina, putrescina y cadaverina) y la presencia de los genes que codifican la
síntesis de las correspondientes enzimas descarboxilasas, respectivamente.
En lo que respecta a la evaluación fenotípica de la producción de histamina, tiramina,
putrescina y cadaverina por las 75 cepas de L. lactis, se obtuvieron los siguientes resultados:
 18 de las las 75 cepas de L. lactis (24%) produjeron, presumiblemente, una de las
aminas biógenas evaluadas.
 7 de las 75 cepas de L. lactis (9,3%) produjeron presumiblemente tiramina (Figura 3.11).
 7 de las 75 cepas de L. lactis (9,3%) produjeron presumiblemente cadaverina (no se
muestran los resultados).
 3 de las 75 cepas de L. lactis (4,0%) produjeron presumiblemente histamina (no se
muestran los resultados).
 1 de las 75 cepas de L. lactis (1,3%) produjeron presumiblemente putrescina (no se
muestran los resultados).
 Ninguna de las 75 cepas de L. lactis (0%) produjeron dos o más aminas biógenas.
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1
4
2
5
3
6
9
8
10
C-
C+
7
Figura 3.11. Determinación fenotípica de la producción de tiramina por las cepas L. lactis LT24
(1), LT25 (2), LT26 (3), LT29 (4), LT10 (5), LT18 (6), LT37 (7), LT33 (8), LT39 (9) y LT36 (10).
Como control positivo (C+) (viraje del color del medio de amarillo a violeta) se empleó E. faecium
GM29 (C+) y, como control negativo (C-), se empleó Lactobacillus sp ATCC30a.
En cuanto a la evaluación fenotípica de la producción de aminas biógenas producidas
por bacterias se puede decir que las técnicas convencionales de cultivo tienen la desventaja de
ser tediosas y, además, poco fiables ya que pueden dar resultados falsos positivos (Landete et
al., 2007), debido a la formación de otros compuestos alcalinos (Bover-Cid et al., 1999). Por
este motivo, en este trabajo también se realizó la evaluación por PCR de la presencia de los
genes que codifican las enzimas descarboxilasas que dan lugar a la producción de las aminas
biógenas evaluadas. La técnica de PCR tiene varias ventajas, como la rapidez, sensibilidad,
simplicidad, así como la detección de los genes específicos, por lo que, en principio, los
resultados son más fiables que los obtenidos con los métodos tradicionales de cultivo. A este
respecto, conviene destacar que, sorprendentemente, de las 18 cepas que mostraron capacidad
de producir alguna de las aminas biógenas evaluadas en este trabajo, tan sólo una cepa (L. lactis
LT12) amplificó uno de los genes que codifican las enzimas descarboxilasas, concretamente el
gen tdc que codifica la tirosina descarboxilasa (TDC) (Figura 3.12).
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M
1
2
3
4
5 6
7
8
9
10 11
12 13 14
15 16 C+1 C+2 C1100 pb
Figura 3.12. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR (1100 pb)
correspondiente al gen que codifica la enzima tirosina descarboxilasa (tdc), empleando los
cebadores TD5/TD2 y el ADN genómico de L. lactis LT3 (1), LT10 (2), LT11 (3), LT12 (4),
LT14 (5), LT33 (6), LT54 (7) y otras cepas de L. lactis no incluidas en este estudio (8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15 y 16). Como controles positivos se empleó ADN genómico de las cepas E.
faecium GM29 (C+1) y E. faecium NV52 (C+2) y, como control negativo (C-), se utilizó
Lactobacillus sp ATCC30a.
Considerando estos resultados, es necesario proceder a la realización de estudios
complementarios para determinar si se trata realmente de falsos positivos de la técnica
fenotípica basada en el empleo de medios de cultivo diferenciales, o, por el contrario, son
realemnete cepas productoras de estas aminas biógenas que presentan mutaciones en la
secuencia nucleotídica de los correspondientes genes, lo que impide su amplificación por PCR
empleando los oligonucleótidos descritos en este trabajo, que no son específicos para L. lactis.
III.4. SELECCIÓN DE LAS CEPAS DE Lactococcus lactis AISLADAS DE TRUCHA
ARCOIRIS Y SU AMBIENTE ACUICOLA POTENCIALMENTE SEGURAS PARA SU
POSTERIOR
CARACTERIZACIÓN
COMO
PROBIÓTICOS
PARA
EL
DESARROLLO DE UNA ACUICULTURA SOSTENIBLE
Con base en los resultados de la evaluación de la seguridad in vitro de las 75 cepas de L.
lactis aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola, seleccionadas por su espectro de
actividad antimicrobiana frente a L. garviae y otros ictiopatógenos de relevancia para el cultivo
intensivo de esta especie acuícola, solamente 15 cepas (Tabla III.3), lo que representa un 20%
de las cepas evaluadas, pueden considerarse potencialmente seguras para el hombre, los peces y
otros animales y el medio ambiente, ya que no mostraron actividad hemolítica, proteolítica o
mucinolítica, no desconjugaron las sales biliares (taurodeoxicolato), no produjeron aminas
biógenas y no presentaron resistencia adquirida (transmisible o no transmisible) a ninguno de
los antibióticos de relevancia para la acuicultura, medicina humana y veterinaria evaluados en
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Beneficiario COLFUTURO 2011
este trabajo y especificados por la EFSA. No obstante, resulta necesario completar la
evaluación de su seguridad in vitro, así como demostrar fehacientemente la ausencia de
patogenicidad in vivo frente a diversas líneas celulares y las especies animales en las que se
pretenden emplear como probióticos para el desarrollo de una acuicultura sostenible. Conviene
destacar que las 15 cepas de L. lactis consideradas potencialmente seguras con base en los
resultados obtenidos en este trabajose aislaron de intestino de trucha arcoíris y vegetación y
agua de salida de los tanques de cultivo durante todo el ciclo biológico de esta especie acuícola
(desde alevines a ejemplares adultos).
Finalmente, los resultados obtenidos demuestran la utilidad del protocolo de evaluación de
la seguridad in vitro propuesto, ya que, a pesar del estatus QPS de la especie L. lactis, la
mayoría de las cepas aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola durante todo su ciclo
biológicono pueden considerarse seguras para su aplicación como probióticos en la acuicultura.
Asimismo, este protocolo podría resultar de validez para la evaluación de la seguridad in vitro
del empleo como probióticos de otras especies de bacterias lácticas de relevancia para la
acuicultura, tanto continental como marina.
Tabla III.3. Identificación, origen y fase de
desarrollo de las 15 cepas de L. lactis aisladas de
trucha arcoíris y su ambiente acuícola
seleccionadas por su seguridad in vitro.
Cepas
Origen
Fase de desarrollo (días
tras la eclosión)
LT2
LT7
LT9
LT18
LT27
LT28
LT30
Intestino
Vegetación
Vegetación
Agua
Agua
Agua
Agua
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
Alevín (30)
LT36
LT37
LT47
Intestino
Agua
Vegetación
Alevín (240)
Alevín (240)
Alevín (240)
LT49
Intestino
Alevín (300)
LT55
LT64
LT65
LT72
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Vegetación
Intestino
Agua
46
Vegetación
Adulto (450)
Adulto (450)
Adulto (450)
Adulto (450)
IV. CONCLUSIONES
PRIMERA. Ninguna de las 75 cepas de Lactococcus lactis aisladas de trucha arcoíris y su
ambiente acuícola evaluadas en este trabajo mostró actividad hemolítica, proteolítica o
mucinolítica, ni tampoco capacidad para la desconjugación de sales biliares (taurodeoxicolato).
SEGUNDA. 30 de las las 75 cepas de L. lactis (40,0%) mostraron resistencia adquirida a uno o
más antibióticos, y, de éstas, 9 cepas (12,0%) presentaron multirresistencia adquirida (a dos o
más antibióticos). En lo que respecta a las resistencias identificadas en este trabajo, las más
frecuentes fueron a tetraciclina (16 cepas; 21,3%) y, en menor medida, estreptomicina (11
cepas; 14,7%), kanamicina (8 cepas; 10,7%), clindamicina (6 cepas; 8,0%), gentamicina (6
cepas; 8,0%) y, por último, vancomicina (3 cepas, 4,0%). Ninguna de las 75 cepas de L. lactis
presentó resistencia adquirida a ampicilina, eritromicina, cloranfenicol y quinupristina+
dalfopistrina.
TERCERA. Únicamente se detectaron resistencias adquiridas transmisibles a la vancomicina
(vanB; L. lactis LT23) y a la tetraciclina (tetK, tetL, tetT y/o tetO). En 15 de las 18 cepas de L.
lactis (83,3%) evaluadas por mostrar resistencia adquirida frente a la tetraciclina mediante el
método de microdilución en placa (CMI) se detectó la presencia de uno o varios de estos genes.
De estas 15 cepas, todas a excepción de tres amplificaron dos o más de los genes de resistencia
a la tetraciclina descritos hasta la fecha (tetT y tetO, 1 cepa; tetK, tetT y tetO, 10 cepas; tetK,
tetT, tetO y tetL; 1 cepa). Tan sólo se detectaron genes de resistencia a antibióticos (tetK, tetT y
tetO) en una de las cepas (L. lactis LT54) evaluadas por presentar valores de CMI iguales a los
puntos de corte establecidos por la EFSA.
CUARTA. 18 de las 75 cepas de L. lactis (24%) produjeron, presumiblemente, una o más
aminas biógenas, y, de éstas, ninguna cepa produjo, dos o más aminas biógenas. En lo que
respecta a la producción de cada amina biógena, las más frecuentes fueron tiramina (7cepas;
9,3%), cadaverina (7cepas; 9,3%), histamina (3 cepas; 4,0%), y, por último, putrescina (1 cepa;
1,3%). Sorprendentemente, de las 18 cepas que mostraron capacidad de producir alguna de las
aminas biógenas evaluadas en este trabajo, tan sólo una cepa (L. lactis LT12) amplificó uno de
los genes que codifican las enzimas descarboxilasas, concretamente el gen tdc que codifica la
tirosina descarboxilasa (TDC).
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QUINTA. De las 75 cepas de L. lactis aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola
evaluadas en este trabajo, seleccionadas por su espectro de actividad antimicrobiana frente a L.
garviae y otros ictiopatógenos de relevancia para el cultivo intensivo de esta especie acuícola,
solamente 15 cepas (20%) pueden considerarse potencialmente seguras para el hombre, los
peces, otros animales y el medio ambiente, ya que no mostraron actividad hemolítica,
proteolítica o mucinolítica, no desconjugaron las sales biliares (taurodeoxicolato), no
produjeron aminas biógenas y no mostraron resistencia adquirida (transmisible o no
transmisible) a ninguno de los antibióticos de relevancia para la acuicultura, medicina humana y
veterinaria evaluados en este trabajo y especificados por la EFSA. No obstante, resulta
necesario completar la evaluación de su seguridad in vitro, así como demostrar fehacientemente
la ausencia de patogenicidad in vivo frente a diversas líneas celulares y las especies animales en
las que se pretenden emplear como probióticos para el desarrollo de una acuicultura sostenible.
SEXTA. Los resultados obtenidos demuestran la utilidad del protocolo de evaluación de la
seguridad in vitro propuesto, ya que, a pesar del estatus QPS de la especie L. lactis, la mayoría
de las cepas aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola durante todo su ciclo biológico
no pueden considerarse seguras para su aplicación como probióticos para la acuicultura.
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62
Beneficiario COLFUTURO 2011
VI. APÉNDICES
VI.1. LISTADO DE TABLAS
Tabla II.1. Identificación, origen y fase de desarrollo de aislamiento de la colección de 75
cepas de L. lactis aisladas de trucha arcoíris y su ambiente acuícola…………………………..17
Tabla II.2. Puntos de corte o breakpoints (mg/l) establecidos para determinar la susceptibilidad
(sensibilidad/resistencia)
de
Lactococcus
lactis
frente
a
diversos
antibióticos…………………………………………….………………………………………..19
Tabla II.3. Condiciones de PCR y oligonucleótidos específicos para la detección de los
determinantes genéticos transmisibles que confieren resistencia a diversos antibióticos de
relevancia en acuicultura y medicina humana y veterinaria…………………………………....21
Tabla II.4. Condiciones de PCR y oligonucleótidos degenerados para la detección de los
determinantes genéticos que codifican la histidina descarboxilasa (HDC), tirosina
descarboxilasa
(TDC),
ornitina
descarboxilasa
(ODC)
y
lisina
descarboxilasa
(LDC)…………………………………………………………………………………………...23
Tabla III.1. Sensibilidad/resistencia de 75 cepas de Lactococcus lactis frente a los principales
antibióticos empleados en acuicultura, medicina humana y veterinaria………………………..30
Tabla III.2. Evaluación mediante PCR de la presencia de genes de resistencia a la tetraciclina
(poner genes) en las 18 cepas de L. lactis que mostraron resistencia a este antibiótico mediante
el método de microdilución en placa (CMI)……………………………………………………35
Tabla III.3. Identificación, origen y fase de desarrollo de las 15 cepas de L. lactis aisladas de
trucha arcoíris y su ambiente acuícola seleccionadas por su seguridad in vitro………………..44
63
Beneficiario COLFUTURO 2011
VI.2. LISTADO DE FIGURAS
Figura 3.1. Determinación fenotípica de la actividad hemolítica de cultivos de Lactococcus
lactis LT75 (1) en placas de agar sangre………………………………………………………..27
Figura 3.2. Determinación de la actividad proteolítica de Lactococcus lactis LT71 (1), LT72
(2), LT73 (3), LT74 (4) y LT75 (5)..............................................................................................28
Figura 3.3. Determinación fenotípica de la actividad mucinolítica de L. lactis LT46 (1) en
placas de agar B con mucina……………………………………………………………………29
Figura 3.4. Porcentajes de sensibilidad/resistencia de las 75 cepas de cepas Lactococcus lactis
frente a los principales antibióticos empleados en acuicultura y medicina humana y
veterinaria.....................................................................................................................................33
Figura 3.5. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR (994bp) correspondiente al
gen vanB que codifica la resistencia a la vancomicina, empleando el ADN genómico de
Lactococcus lactis LT21 (1), LT23 (2) y LT24 (3)……………………………………………..34
Figura 3.6. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR correspondiente al gen tetK
que codifica la resistencia a la tetraciclina, empleando el ADN genómico de las cepas de
Lactococcus lactis LT38 (1), LT40 (2), LT41 (3), LT42 (4), LT43 (5), LT44 (6), LT45 (7), LT46
(8), LT53 (9), LT54 (10), LT58 (11), LT59 (12), LT60 (13), LT63 (14), LT66 (15), LT68 (16) y
LT70 (17)………………………………………………………………………………………..36
Figura 3.7. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR correspondiente al gen tetL que
codifica la resistencia a la tetraciclina empleando el ADN genómico de las cepas de Lactococcus lactis
LT38 (1), LT40 (2), LT41 (3), LT42 (4), LT43 (5), LT44 (6), LT45 (7), LT46 (8), LT53 (9),
LT54 (10), LT58 (11), LT59 (12), LT60 (13), LT63 (14), LT66 (15), LT68 (16) y LT70
(17)……………………………………………………………………………………………...36
64
Beneficiario COLFUTURO 2011
Figura 3.8. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR correspondiente al gen tetT
que codifica la resistencia a la tetraciclina empleando el ADN genómico de las cepas de
Lactococcus lactis LT38 (1), LT40 (2), LT41 (3), LT42 (4), LT43 (5), LT44 (6), LT45 (7), LT46
(8), LT53 (9), LT54 (10), LT58 (11), LT59 (12), LT60 (13), LT63 (14), LT66 (15), LT68 (16) y
LT70 (17)………………………………………………………………………………………..37
Figura 3.9. . Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR correspondiente al gen tetO
que codifica la resistencia a la tetraciclina empleando el ADN genómico de las cepas de
Lactococcus lactis LT38 (1), LT40 (2), LT41 (3), LT42 (4), LT43 (5), LT44 (6), LT45 (7), LT46
(8), LT53 (9), LT54 (10), LT58 (11), LT59 (12), LT60 (13), LT63 (14), LT66 (15), LT68 (16) y
LT70 (17)……………………………………………………………………………………….37
Figura 3.10. Determinación fenotípica de la desconjugación de las sales biliares en L. lactis
LT7 (1), LT9 (2), LT10 (3) y LT11 (4) en placas de MRS suplementado con L-cisteína y
taurodeoxicolato………………………………………………………………………………...39
Figura 3.11. Determinación fenotípica de la producción de tiramina por cepas de Lactococcus
lactis LT24 (1), LT25 (2), LT26 (3), LT29 (4), LT10 (5), LT18 (6), LT37 (7), LT33 (8), LT39
(9) y LT36 (10).............................................................................................................................41
Figura 3.12. Electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR correspondiente al gen que
codifica la enzima tirosina descarboxilasa (tdc), empleando los cebadores TD5/TD2 y el ADN
genómico de Lactococcus lactis LT3 (1), LT10 (2), LT11 (3), LT12 (4) LT14 (5), LT33 (6),
LT54 (7) y otras cepas de L. lactis no incluidas en este estudio (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y
16)……………………………………………………………………………………………….42
65
Beneficiario COLFUTURO 2011